JP6633978B2 - Test kit and test method - Google Patents
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Description
本発明は、被検出物質の検出感度に優れる検査キット及び該検査キットを用いた検査方法に関する。 The present invention relates to a test kit having excellent detection sensitivity for a target substance and a test method using the test kit.
血液、尿、唾液等に含まれる生体成分や薬物の分析は病態分析や治療経過の判定に重要であり、抗体の持つ特異的反応性を利用して、抗原等の被検出物質を検出する簡便な体外診断キットや携帯用診断キットの重要性が高まっている。特に、ウィルスや細菌等の病原体検査キットが広く用いられている。 Analysis of biological components and drugs contained in blood, urine, saliva, etc. is important for disease state analysis and judgment of the course of treatment, and simple detection of substances to be detected, such as antigens, using the specific reactivity of antibodies The importance of in vitro and portable diagnostic kits is increasing. Particularly, kits for testing pathogens such as viruses and bacteria are widely used.
このような検査キットではイムノクロマトグラフ法が用いられている。このような方法では、試薬中に被検出物質と特異的に結合する物質等を標識微粒子に固定化した標識試薬を有する試薬部と、標識試薬を捕捉できる物質を固定化した反応部とを単一のクロマトグラフ媒体上に有する装置を用いる。このような装置では、試料を試薬部に接触させ、試料とともに試薬部中の標識試薬をクロマトグラフ媒体上で毛細管現象により移動させ、反応部で捕捉させることによって被検出物質を検出する。標識試薬中に含まれる標識微粒子としては、金等の貴金属の微粒子が用いられており、金等の貴金属の表面プラズモン共鳴による発色現象を利用して抗原等の被検出物質の有無の判断を行っている。 In such a test kit, an immunochromatography method is used. In such a method, a reagent section having a labeling reagent in which a substance or the like that specifically binds to a substance to be detected in the reagent is immobilized on labeled microparticles, and a reaction section in which a substance capable of capturing the labeling reagent is immobilized are simply included. An apparatus having one chromatographic medium is used. In such an apparatus, a substance to be detected is detected by bringing a sample into contact with a reagent part, moving the labeled reagent in the reagent part together with the sample on a chromatographic medium by capillary action, and capturing the substance in a reaction part. As the labeled fine particles contained in the labeling reagent, fine particles of a noble metal such as gold are used, and the presence or absence of a substance to be detected such as an antigen is determined by utilizing the color phenomena caused by surface plasmon resonance of the noble metal such as gold. ing.
このような検査キットでは目視により発色の有無を判断できるため簡便であるものの、色調の差により陰性・陽性の判断を行うため誤判断も多く、検出感度を向上させる手法が求められている。
このような検出感度を向上させる方法として、特許文献１には、蛍光発光する微粒子を標識微粒子として用いる検出方法が提案されている。
しかしながら、このような検出方法でも、検出感度の向上が不充分であったり、また、蛍光発光させる際に照射する紫外線によって、検査キットに含まれる試薬部等の劣化や被検出物質の変質が生じ、検出感度が低下してしまうという問題があった。
Such a test kit is simple because it can visually determine the presence or absence of color development, but there are many erroneous determinations because negative / positive determinations are made based on a difference in color tone, and a method for improving detection sensitivity is required.
As a method for improving such detection sensitivity, Patent Document 1 proposes a detection method using fluorescent fine particles as labeled fine particles.
However, even with such a detection method, the improvement of the detection sensitivity is insufficient, and the ultraviolet rays irradiated at the time of fluorescent emission cause deterioration of the reagent portion and the like included in the test kit and deterioration of the substance to be detected. However, there is a problem that the detection sensitivity is reduced.
本発明は、被検出物質の検出感度に優れる検査キット及び該検査キットを用いた検査方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a test kit having excellent detection sensitivity for a substance to be detected and a test method using the test kit.
本発明は、基材上に、被検出物質と特異的に結合する結合物質が標識微粒子に固定化された標識試薬を含有する試薬保持部、及び、被検出物質と特異的に結合する試験用捕捉物質が固定化されたテスト部を有し、前記標識微粒子は、貴金属からなる微粒子であり、前記テスト部は、アップコンバージョン材料を含有する検査キットである。
以下に本発明を詳述する。
The present invention provides a reagent holding unit containing a labeling reagent, in which a binding substance that specifically binds to a substance to be detected is immobilized on labeled microparticles on a substrate, and a test for specifically binding to the substance to be detected. There is a test part on which a capture substance is immobilized, the labeled fine particles are fine particles made of a noble metal, and the test part is a test kit containing an up-conversion material.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明者らは、鋭意検討の結果、イムノクロマトグラフ法を用いた検査キットにおいて、標識微粒子として貴金属からなる微粒子を用いるとともに、テスト部にアップコンバージョン材料を含有させることによって、赤外線等の長波長の光に反応して可視光線を発光させることができるとともに、表面プラズモン共鳴によって発光現象を増幅させることができるため、検出感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have conducted intensive studies and found that in a test kit using an immunochromatography method, while using fine particles made of a noble metal as the labeled fine particles, and by including an up-conversion material in the test portion, long wavelengths such as infrared rays were obtained. The present inventors have found that it is possible to emit visible light in response to light, and that the luminescence phenomenon can be amplified by surface plasmon resonance, so that detection sensitivity can be improved, and the present invention has been completed.
本発明の検査キットは、基材上に、被検出物質と特異的に結合する結合物質が標識微粒子に固定化された標識試薬を含有する試薬保持部、及び、被検出物質と特異的に結合する試験用捕捉物質が固定化されたテスト部を有する。 The test kit of the present invention comprises, on a substrate, a reagent holding unit containing a labeling reagent in which a binding substance that specifically binds to a substance to be detected is immobilized on labeled microparticles, and specifically binds to the substance to be detected. And a test part on which a test capture substance to be tested is immobilized.
本発明の検査キットの一例を図１に示す。また、本発明の検査キットに試料が添加された際のテスト部での反応の一例を図２に、コントロール部での反応の一例を図３に示す。
検査キット１は、試料添加部２、試薬保持部３、基材４、吸収部７とからなり、基材４は、テスト部５とコントロール部６を有する構成となっている。また、試薬保持部３は、被検出物質８と特異的に結合する結合物質１１が標識微粒子１０に固定化された標識試薬９を含有する。テスト部５は、アップコンバージョン材料１３を含有し、被検出物質８と特異的に結合する試験用捕捉物質１２が固定化された構成となっている。また、コントロール部６は、アップコンバージョン材料１３を含有し、標識試薬９を捕捉する参照用捕捉物質１４が固定化された構成となっている。
One example of the test kit of the present invention is shown in FIG. FIG. 2 shows an example of a reaction in the test section when a sample is added to the test kit of the present invention, and FIG. 3 shows an example of a reaction in the control section.
The test kit 1 includes a
本発明の検査キット１を用いた検査方法では、試料添加部２に試料が添加されると、試料の移動方向に沿って試料が上流側から下流側に移動して、まずは、試薬保持部３まで移動する。その後、試薬保持部３に含まれる標識試薬９とともにテスト部５まで試料が移動する。試料中に被検出物質８が含まれている場合、標識試薬９は結合物質１１によって被検出物質８と結合する。図２に示すように、テスト部５には被検出物質８と特異的に結合する試験用捕捉物質１２が固定化されているため、被検出物質８と結合した標識試薬９はテスト部５において捕捉される。一方、試料中に被検出物質８が含まれていない場合、標識試薬９は被検出物質８とは結合せず、テスト部５では捕捉されない。その後、試料は、更にコントロール部６まで移動する。図３に示すように、コントロール部６には標識試薬９を捕捉する参照用捕捉物質１４が固定化されているため、被検出物質８と結合していない標識試薬９や、被検出物質８と結合しているもののテスト部５では捕捉されなかった標識試薬９は、コントロール部６において捕捉される。また、基材上を移動した過剰な試料は、吸収部７において吸収される。
従って、テスト部５において捕捉された標識試薬９の有無を確認することで、試料に被検出物質８が含まれているか否かを判定することができる。また、テスト部５にはアップコンバージョン材料１３が含まれているため、標識試薬９に含まれる標識微粒子１０との相乗効果により、テスト部が強い発光現象を示すため、検出感度を向上させることができる。
In the test method using the test kit 1 of the present invention, when a sample is added to the
Therefore, by checking the presence or absence of the
上記基材としては、試料が付与された際に、毛細管現象によって標識試薬をテスト部まで速やかに拡散・移動させることができる材質であれば特に限定されないが、例えば、例えば、セルロース、ニトロセルロース等のセルロース修飾体、ナイロン、ポリエチレン、ろ紙、ガラス繊維等が挙げられる。特に、多孔性膜、繊維状膜であることが好ましく、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリエチレン膜、ガラス繊維膜、ろ紙等の多孔性膜又は繊維状膜であることが好ましい。 The substrate is not particularly limited as long as it is a material capable of rapidly diffusing and moving the labeling reagent to the test portion by capillary action when the sample is applied, for example, cellulose, nitrocellulose, etc. Modified cellulose, nylon, polyethylene, filter paper, glass fiber and the like. In particular, a porous film or a fibrous film is preferable, and a porous film or a fibrous film such as a nitrocellulose film, a nylon film, a polyethylene film, a glass fiber film, and a filter paper is preferable.
上記基材は、更に毛細管現象を促進させる物質を含有していてもよい。
上記毛細管現象を促進させる物質としては、基材上での被検出物質の移動に影響がなく、標識試薬の発色に影響しない物質であれば特に限定されないが、基材の表面張力を低下させ、親水性を付与する物質が好ましく、例えば、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤が挙げられる。
The substrate may further contain a substance that promotes capillary action.
The substance that promotes the capillary action is not particularly limited as long as it does not affect the movement of the substance to be detected on the substrate and does not affect the coloring of the labeling reagent. A substance that imparts hydrophilicity is preferable, and examples thereof include surfactants such as an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant.
上記試薬保持部は、被検出物質と特異的に結合する結合物質が標識微粒子に固定化された標識試薬を保持したものである。
なお、本発明において、「固定化」とは試料が付与されて膨潤状態になった場合にも、結合物質や試験用捕捉物質等が標識微粒子や基材等の担体から脱離することがなく、移動しないように配置された状態をいう。
また、「保持」とは乾燥状態では移動しないが、試料が付与されて湿潤状態になった場合には標識試薬が移動可能となるように配置された状態をいう。
The reagent holding section holds a labeling reagent in which a binding substance that specifically binds to a substance to be detected is immobilized on labeled microparticles.
In the present invention, `` immobilization '' means that even when the sample is applied and becomes swollen, the binding substance or the test capture substance does not detach from the carrier such as the labeled fine particles or the substrate. , Means a state where they are arranged so as not to move.
The term "holding" refers to a state in which the labeling reagent is not moved in a dry state, but is arranged so as to be movable in a wet state after a sample is applied.
本発明において、結合物質としては、例えば、抗原と抗原に対する抗体、ホルモンとホルモンに対して特異的に結合する抗体等の受容体、レクチンとレクチン結合性糖類等のように特異的に結合する結合対が存在するものであれば特に限定されず、具体的には、抗原、抗体、レクチン、レクチン結合性糖類、ホルモン、ホルモン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体等が挙げられる。
また、上記被検出物質と上記結合物質との組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体、レクチンとレクチン結合性糖類、ホルモンとホルモン受容体、サイトカインとサイトカイン受容体等の組み合わせが挙げられる。
特に、本発明の検査キットは、抗原やホルモンの検出に有用であり、結合物質としては、抗原に対する抗体やホルモンに対して特異的に結合する抗体等の抗体であることが好ましい。
なお、抗体としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよく、キメラ抗体、Ｆａｂ抗体、（Ｆａｂ）２抗体等の形態であってもよい。
In the present invention, examples of the binding substance include antigen-to-antigen antibodies, hormone-to-receptors such as antibodies specifically binding to hormones, and lectin-binding binding such as lectin-binding saccharides. There is no particular limitation as long as a pair exists, and specific examples include antigens, antibodies, lectins, lectin-binding saccharides, hormones, hormone receptors, cytokines, cytokine receptors, and the like.
Examples of the combination of the substance to be detected and the binding substance include a combination of an antigen and an antibody, a lectin and a lectin-binding saccharide, a hormone and a hormone receptor, and a combination of a cytokine and a cytokine receptor.
In particular, the test kit of the present invention is useful for detecting an antigen or a hormone, and the binding substance is preferably an antibody such as an antibody to the antigen or an antibody that specifically binds to the hormone.
The antibody may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a chimeric antibody, a Fab antibody, a (Fab) 2 antibody, or the like.
上記抗原と抗原に対する抗体の組み合わせとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス、マイコプラズマ、風疹ウィルス等の抗原と、これらに対する抗体との組み合わせが挙げられる。 Examples of the combination of the antigen and the antibody against the antigen include a combination of an antigen such as hepatitis B virus, hepatitis C virus, HIV, influenza virus, adenovirus, rotavirus, mycoplasma, and rubella virus, and an antibody thereto. Can be
上記レクチンとレクチン結合性糖類の組み合わせとしては、ガレクチンとガラクトース鎖、Ｃ−型レクチンとＣ−型レクチン結合性糖類、セレクチンとシアリルＬｅＸ構造を有するセレクチン結合性糖類、分子中にコラーゲン様構造をもつマンノースに特異性を示すレクチン群とマンノース鎖含有糖類、グリコサミノグリカンに親和性を有するアネキシンとグリコサミノグリカン鎖含有糖類、コンカナバリンＡ等の豆科レクチンと豆科レクチン結合性糖類、リシンとリシン結合性糖類との組み合わせが挙げられる。 Examples of the combination of the lectin and the lectin-binding saccharide include galectin and a galactose chain, C-type lectin and a C-type lectin-binding saccharide, selectin and a selectin-binding saccharide having a sialyl LeX structure, and a collagen-like structure in the molecule. Lectins and mannose chain-containing saccharides that exhibit specificity to mannose, annexins and glycosaminoglycan chain-containing saccharides that have an affinity for glycosaminoglycans, legume lectins and legume lectin-binding saccharides such as concanavalin A, lysine and Combinations with lysine-binding saccharides can be mentioned.
上記ホルモンとホルモン受容体の組み合わせとしては、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、成長ホルモン、副腎皮質ホルモン、チロトロピン、プロラクチン等の下垂体ホルモン、トリヨードサイロニン、サイロキシン、サイログロブリン等の甲状腺ホルモン、アルドステロン、コルチゾール等の副腎皮質ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、エストロゲン、テストステロン、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ｈＰＬ）等の性腺ホルモン、インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン等の膵・消化管ホルモン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、レニン、エンケファリン、エリスロポエチン、ソマトスタチン等のホルモンと、これらに対する抗体等の受容体との組み合わせが挙げられる。 As a combination of the above hormones and hormone receptors, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, growth hormone, adrenocortical hormone, thyrotropin, pituitary hormones such as prolactin, triiodothyronine, thyroxine, thyroid hormones such as thyroglobulin, aldosterone, Adrenocortical hormones such as cortisol, gonadal hormones such as human chorionic gonadotropin (hCG), estrogen, testosterone, human placental lactogen (hPL), pancreatic / gastrointestinal hormones such as insulin, C-peptide, glucagon, gastrin, calcitonin, Examples include combinations of hormones such as parathyroid hormone (PTH), renin, enkephalin, erythropoietin, somatostatin, and receptors such as antibodies against these hormones.
上記サイトカインとサイトカイン受容体との組み合わせとしては、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子等と、これらに対する抗体等の受容体との組み合わせが挙げられる。 Examples of the combination of the cytokine and the cytokine receptor include interferon, interleukin, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, and the like, and a combination of a receptor such as an antibody thereto. No.
上記標識試薬に用いられる標識微粒子は、貴金属からなる微粒子である。
上記標識微粒子が貴金属からなる微粒子であることにより、表面プラズモン共鳴を発現させることができる。そのため、上記テスト部において、上記標識試薬が被検出物質を介して捕捉された場合、テスト部が標識試薬によって表面プラズモン共鳴による電場増強場となることからテスト部に含まれるアップコンバージョン材料の発光強度が著しく増強される。従って、テスト部の表面プラズモン共鳴前後での発光強度を比較することで、試料中の被検出物質の有無を確認することができる。
上記貴金属としては、金、銀、白金等が挙げられ、なかでも、金が好ましく用いられる。
The labeled fine particles used for the labeling reagent are fine particles made of a noble metal.
When the labeled fine particles are fine particles made of a noble metal, surface plasmon resonance can be expressed. Therefore, in the test section, when the labeling reagent is captured via the substance to be detected, the test section becomes an electric field enhanced field by surface plasmon resonance due to the labeling reagent, so that the emission intensity of the up-conversion material included in the test section is increased. Is significantly enhanced. Therefore, the presence or absence of the substance to be detected in the sample can be confirmed by comparing the emission intensity before and after the surface plasmon resonance of the test portion.
Examples of the noble metal include gold, silver, platinum and the like, and among them, gold is preferably used.
上記標識微粒子の平均粒子径は、好ましい下限が１ｎｍ、より好ましい下限が２．５ｎｍ、好ましい上限が１００ｎｍ、より好ましい上限が８０ｎｍである。 As for the average particle diameter of the labeled fine particles, a preferable lower limit is 1 nm, a more preferable lower limit is 2.5 nm, a preferable upper limit is 100 nm, and a more preferable upper limit is 80 nm.
上記標識微粒子の表面プラズモン共鳴波長は、標識微粒子を構成する貴金属の種類及び標識微粒子の平均粒子径により調整可能であり、好ましい下限が３５０ｎｍ、より好ましい下限が４００ｎｍ、好ましい上限が８００ｎｍ、より好ましい上限が７５０ｎｍである。 The surface plasmon resonance wavelength of the labeled microparticles can be adjusted by the type of noble metal constituting the labeled microparticles and the average particle diameter of the labeled microparticles, with a preferred lower limit of 350 nm, a more preferred lower limit of 400 nm, a preferred upper limit of 800 nm, and a more preferred upper limit. Is 750 nm.
上記試薬保持部は、試料を付与されて標識試薬が後述するテスト部まで移動可能となる構成であればよく、上記基材上に標識試薬を直接保持させて構成されていてもよく、標識試薬を保持させた部材をクロマトグラフィ基材上に積層することによって構成されていてもよい。 The reagent holding section may be configured so that the sample is applied and the labeling reagent can move to a test section described later, and may be configured by directly holding the labeling reagent on the base material. May be configured by laminating a member holding the above on a chromatography substrate.
本発明の検査キットは、更に、上記試薬保持部の下流側に、被検出物質と特異的に結合する試験用捕捉物質が固定化されたテスト部を有する。
上記テスト部を有することにより、試料中に被検出物質が含まれていた場合には、上記試薬保持部に付与された試料中に含まれる被検出物質と標識試薬とが結合した状態でテスト部まで移動することで、テスト部において被検出物質を介して標識試薬が捕捉される。上記標識試薬は表面プラズモン共鳴を発現する標識微粒子を含むものであるため、試料中に被検出物質が含まれていた場合には、標識試薬を捕捉することでテスト部が表面プラズモン共鳴による電場増強場となり、テスト部に含まれるアップコンバージョン材料の発光強度が著しく増強される。一方、試料中に被検出物質が含まれていない場合には、テスト部において標識試薬が捕捉されないため、テスト部の発光強度は大きくは変化しない。従って、テスト部の表面プラズモン共鳴前後での発光強度を比較することで、試料中の被検出物質の有無を判定することができる。また、テスト部と後述するコントロール部の発光強度を比較することによっても、試料中の被検出物質の有無を判定することができる。
The test kit of the present invention further includes a test section on the downstream side of the reagent holding section, on which a test capture substance that specifically binds to the substance to be detected is immobilized.
By having the test section, when the test substance is contained in the sample, the test section is attached in a state where the test substance and the labeling reagent contained in the sample attached to the reagent holding section are combined. The labeling reagent is captured via the substance to be detected in the test section by moving to the position. Since the above-mentioned labeling reagent contains labeled fine particles that express surface plasmon resonance, if the sample contains a substance to be detected, by capturing the labeling reagent, the test section becomes an electric field enhancement field due to surface plasmon resonance. The luminous intensity of the up-conversion material included in the test section is significantly enhanced. On the other hand, when the substance to be detected is not contained in the sample, the labeling reagent is not captured in the test section, so that the emission intensity of the test section does not change significantly. Therefore, the presence or absence of the substance to be detected in the sample can be determined by comparing the emission intensities of the test portion before and after surface plasmon resonance. Also, the presence or absence of the substance to be detected in the sample can be determined by comparing the emission intensity of the test section with that of the control section described later.
上記被検出物質と上記試験用捕捉物質の組み合わせとしては、上記被検出物質と上記標識試薬を構成する上記結合物質との組み合わせと同様のものが挙げられる。 Examples of the combination of the target substance and the capture substance for test include the same combinations as the combination of the target substance and the binding substance constituting the labeling reagent.
本発明の検査キットにおいて、上記テスト部は、更に、アップコンバージョン材料を含有する。
アップコンバージョン材料を含有することで、標識微粒子の表面プラズモン共鳴による光の吸収量の増加との相乗効果により、テスト部において強い発光を発現し、被検出物質の検出感度をより向上させることができる。
上記テスト部は、上記試験用捕捉物質と上記アップコンバージョン材料とを上記基材上に直接固定化することによって構成されていてもよく、上記基材上に上記試験用捕捉物質を固定化し、更にアップコンバージョン材料を含有する薄膜等を積層することによって構成されていてもよい。
In the test kit of the present invention, the test section further contains an up-conversion material.
By containing the up-conversion material, a synergistic effect with an increase in the amount of light absorbed by the surface plasmon resonance of the labeled fine particles can be used to generate strong light emission in the test section, thereby improving the detection sensitivity of the target substance. .
The test section may be configured by directly immobilizing the test capture substance and the up-conversion material on the substrate, immobilizing the test capture substance on the substrate, It may be configured by laminating a thin film or the like containing an up-conversion material.
上記アップコンバージョン材料としては、特に限定されないが、ランタノイドを含有する物質で構成されているものが挙げられる。
上記ランタノイドを含有する物質としては、例えば、ランタノイドの酸化物、ハロゲン化物等が挙げられる。上記ハロゲン化物としては、フッ化物が好ましい。
The above-mentioned up-conversion material is not particularly limited, and examples thereof include a material composed of a substance containing a lanthanoid.
Examples of the lanthanoid-containing substance include lanthanoid oxides and halides. The halide is preferably a fluoride.
上記ランタノイドとしては、所定の範囲内の波長の光により励起されてアップコンバージョン発光することが可能な希土類元素であれば特に限定されるものではなく、例えば、エルビウム（Ｅｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、プラセオジウム（Ｐｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、ネオジウム（Ｎｄ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ユウロピウム（Ｅｕ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、サマリウム（Ｓｍ）、セリウム（Ｃｅ）等が挙げられる。これらのランタノイドは、単独で使用されてもよく、２種以上が併用されてもよい。
なかでも、得られる波長が可視光線であるエルビウム、ホルミウム、ツリウム、イッテルビウムからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。更に、１００００ｃｍ−１付近に強い吸収を有するイッテルビウムと、イッテルビウムからのエネルギー移動を受けて発光し、その得られる波長が可視光域であるエルビウム、ホルミウム及びツリウムからなる群より選択される少なくとも１種との組み合わせが好ましい。
The lanthanoid is not particularly limited as long as it is a rare earth element which can be excited by light having a wavelength within a predetermined range and emits up-conversion light. For example, erbium (Er), holmium (Ho), Examples include praseodymium (Pr), thulium (Tm), neodymium (Nd), gadolinium (Gd), europium (Eu), ytterbium (Yb), samarium (Sm), and cerium (Ce). These lanthanoids may be used alone or in combination of two or more.
Among them, at least one selected from the group consisting of erbium, holmium, thulium, and ytterbium, whose wavelength is visible light, is preferable. Furthermore, at least one selected from the group consisting of erbium, holmium, and thulium, which emits light by receiving energy transfer from ytterbium and ytterbium having a strong absorption at about 10,000 cm −1 , and obtains a wavelength in a visible light region. Is preferred.
また、上記テスト部は、更に上記ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素又はその化合物を含有していてもよい。
上記ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素の化合物は、酸化物又はハロゲン化物であることが好ましい。
上記ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素としては、上記ランタノイド以外の希土類元素が挙げられ、その化合物としては上記ランタノイド以外の希土類元素の酸化物、ハロゲン化物等が挙げられる。
上記ランタノイド以外の希土類元素としては、例えば、イットリウム（Ｙ）、スカンジウム（Ｓｃ）等が挙げられる。上記ランタノイド以外の希土類元素の化合物としては、例えば、イットリウム及びスカンジウムの酸化物又はハロゲン化物等が挙げられる。
なかでも、ランタノイド間のエネルギー移動に関して高い効率が期待でき発光効率の向上が期待できることから、イットリウム、イットリウムの酸化物又はイットリウムのハロゲン化物を含むことが好ましい。イットリウムの酸化物としては、Ｙ２Ｏ３が好ましく、イットリウムのハロゲン化物としては、ＮａＹＦ４が好ましい。
Further, the test section may further contain an element having a similar ionic radius or a structure at the time of crystallization as the lanthanoid, or a compound thereof.
The compound of the element having an ionic radius similar to that of the lanthanoid and a structure at the time of crystallization is preferably an oxide or a halide.
Examples of the element having an ionic radius and a structure at the time of crystallization similar to those of the lanthanoid include rare earth elements other than the lanthanoid, and examples of the compound include oxides and halides of the rare earth elements other than the lanthanoid.
Examples of the rare earth element other than the lanthanoid include yttrium (Y) and scandium (Sc). Examples of the rare earth compound other than the lanthanoid include yttrium and scandium oxides and halides.
Among them, yttrium, an oxide of yttrium, or a halide of yttrium is preferable because high efficiency can be expected with respect to energy transfer between lanthanoids and improvement in luminous efficiency can be expected. As an oxide of yttrium, Y 2 O 3 is preferable, and as a halide of yttrium, NaYF 4 is preferable.
上記テスト部は、上記ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素の化合物として、Ｙ２Ｏ３又はＮａＹＦ４を含有し、上記ランタノイドとして、エルビウム、ホルミウム及びツリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種と、イッテルビウムとを含有することが好ましい。 The test section contains Y 2 O 3 or NaYF 4 as a compound of an element having a similar ionic radius or structure during crystallization as the lanthanoid, and is selected from the group consisting of erbium, holmium and thulium as the lanthanoid. It is preferable to contain at least one of the above and ytterbium.
上記アップコンバージョン材料の形状は特に限定されないが、例えば、微粒子形状であるアップコンバージョン材料微粒子が挙げられ、なかでも、ランタノイド含有微粒子であることが好ましい。
上記ランタノイド含有微粒子は、上記ランタノイドと上記ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素を含有することが好ましい。
The shape of the up-conversion material is not particularly limited, and examples thereof include fine particles of an up-conversion material in the form of fine particles. Among them, lanthanoid-containing fine particles are preferable.
The lanthanoid-containing fine particles preferably contain the lanthanoid and an element having a similar ionic radius and structure at the time of crystallization to the lanthanoid.
上記アップコンバージョン材料微粒子の平均粒子径は、好ましい下限が５ｎｍ、より好ましい下限が７．５ｎｍ、好ましい上限が２５０ｎｍ、より好ましい上限が２００ｎｍである。 The average particle diameter of the fine particles of the up-conversion material is preferably 5 nm in a lower limit, 7.5 nm in a more preferable lower limit, 250 nm in a preferable upper limit and 200 nm in a more preferable upper limit.
本発明の検査キットは、更に、上記標識試薬を捕捉する参照用捕捉物質が固定化されたコントロール部を有することが好ましい。
本発明の検査キットが上記コントロール部を有する場合、試薬保持部、テスト部及びコントロール部は基材上にこの順に配置される。
It is preferable that the test kit of the present invention further has a control section on which a reference capture substance for capturing the labeling reagent is immobilized.
When the test kit of the present invention has the above-mentioned control section, the reagent holding section, the test section and the control section are arranged on the base material in this order.
上記コントロール部は、更に、アップコンバージョン材料を含有することが好ましい。
上記コントロール部が、アップコンバージョン材料を含有することにより、テスト部とコントロール部との発光強度を比較することで、検出感度をより向上させることができる。
上記アップコンバージョン材料としては、上記テスト部において例示したものと同様のものが挙げられる。
The control section preferably further contains an up-conversion material.
By including the up-conversion material in the control section, the detection sensitivity can be further improved by comparing the emission intensity of the test section with that of the control section.
Examples of the up-conversion material include the same materials as those exemplified in the test section.
上記コントロール部を有することにより、テスト部では捕捉されない標識試薬がコントロール部において捕捉されて、コントロール部が表面プラズモン共鳴による電場増強場となることからコントロール部に含まれるアップコンバージョン材料の発光強度が著しく増強される。試料中に被検出物質が含まれていない場合、標識試薬はテスト部では捕捉されないため、テスト部の発光強度は大きくは変化しないが、コントロール部の発光強度を確認することで、標識試薬がテスト部を通過して、検査が正常に行われたことを確認することができる。また、試料中に被検出物質が含まれている場合には、標識試薬は被検出物質と結合して、テスト部において捕捉されるが、被検出物質とは結合せずに残ったもの等、一部の標識試薬はコントロール部において捕捉されるため、テスト部とコントロール部の発光強度の差や、被検出物質を含まない試料を添加した際のコントロール部との発光強度の差を確認することで、検出精度をより向上させることができる。 By having the control section, the labeling reagent not captured in the test section is captured in the control section, and since the control section becomes an electric field enhancement field by surface plasmon resonance, the luminescence intensity of the up-conversion material contained in the control section is remarkable. Be strengthened. If the analyte does not exist in the sample, the labeling reagent is not captured in the test section, so the luminescence intensity of the test section does not change significantly.However, by confirming the luminescence intensity of the control section, the labeling reagent can be tested. Section, it can be confirmed that the inspection has been performed normally. If the sample contains the target substance, the labeling reagent binds to the target substance and is captured in the test section, but remains without binding to the target substance. Because some labeling reagents are captured in the control section, check the difference in luminescence intensity between the test section and the control section, and the difference in luminescence intensity between the control section when a sample containing no analyte is added. Thus, the detection accuracy can be further improved.
上記標識微粒子と結合する参照用捕捉物質としては、上記標識試薬中の結合物質と結合する物質が挙げられる。例えば、上記結合物質が抗体である場合には抗体に対応した抗原や該抗体を捕捉可能な他の抗体等を用いることができる。 Examples of the reference capturing substance that binds to the labeled fine particles include a substance that binds to the binding substance in the labeling reagent. For example, when the binding substance is an antibody, an antigen corresponding to the antibody, another antibody capable of capturing the antibody, or the like can be used.
また、上記コントロール部は、アップコンバージョン材料としてランタノイドを含有する物質を含むことが好ましく、更に、ランタノイドと類似のイオン半径や結晶化時の構造を有する元素を含有することが好ましい。 The control section preferably contains a substance containing a lanthanoid as an up-conversion material, and further preferably contains an element having a similar ionic radius and a structure at the time of crystallization as the lanthanoid.
上記コントロール部は、上記参照用捕捉物質を基材上に固定化した構成であってもよく、上記参照用捕捉物質と上記アップコンバージョン材料とを基材上に固定化した構成であってもよく、また、上記参照用捕捉物質を基材上に固定化し、更に上記アップコンバージョン材料を含有する部材を積層した構成であってもよい。 The control unit may have a configuration in which the reference capture substance is immobilized on a substrate, or may have a configuration in which the reference capture substance and the upconversion material are immobilized on a substrate. Alternatively, the reference capturing substance may be immobilized on a substrate, and a member containing the upconversion material may be further laminated.
また、本発明の検査キットは、上記試薬保持部、テスト部、コントロール部の他に、上記試薬保持部の上流側に位置し、試料を添加するための試料添加部や、上記コントロール部の下流側に位置し、毛細管現象によって移動してきた過剰な試料を吸収するための吸収部等を有していてもよい。 In addition, the test kit of the present invention, in addition to the reagent holding unit, the test unit, and the control unit, is located on the upstream side of the reagent holding unit, a sample adding unit for adding a sample, and downstream of the control unit. May be provided on the side, for absorbing an excessive sample that has moved by capillary action.
上記試料添加部は、試料を吸収するとともに、速やかに試薬保持部に試料を移動させるような性質を有するものであれば特に限定されず、例えば、セルロース、ニトロセルロース等のセルロース修飾体、ナイロン、ポリエチレン、ろ紙、ガラス繊維等が挙げられる。 The sample addition section is not particularly limited as long as it absorbs the sample and has a property of quickly moving the sample to the reagent holding section.For example, cellulose, a modified cellulose such as nitrocellulose, nylon, Examples include polyethylene, filter paper, and glass fiber.
上記吸収部は、過剰の試料を迅速に吸収することができる材料であればよく、例えば、ろ紙、ガラス繊維等が挙げられる。 The absorbing section may be made of any material that can quickly absorb an excessive sample, and examples thereof include filter paper and glass fiber.
本発明の検査キットを作製する方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法により作製することができる。
まず、標識微粒子に被検出物質と特異的に結合する結合物質を固定化し、標識試薬を作製する。次いで、上記標識試薬を基材に保持する、又は、上記標識試薬を保持した部材を基材上に貼付すること等によって試薬保持部を作製する。更に、基材上であって、試薬保持部に試料が付与された際に毛細管現象によって標識試薬が移動する位置に、アップコンバージョン材料を含有し、更に、被検出物質と特異的に結合する試験用捕捉物質が固定化されたテスト部を作製する。その後、基材上であって、試薬保持部と共にテスト部を挟むような位置に、アップコンバージョン材料を含有し、更に、標識試薬を捕捉する参照用捕捉物質が固定化されたコントロール部を作製する。
The method for producing the test kit of the present invention is not particularly limited, but for example, it can be produced by the following method.
First, a binding substance that specifically binds to a substance to be detected is immobilized on the labeled fine particles to prepare a labeling reagent. Next, a reagent holding unit is prepared by holding the labeling reagent on a substrate, or attaching a member holding the labeling reagent on the substrate. Further, a test for containing an up-conversion material at a position on the substrate where the labeling reagent moves by capillary action when the sample is applied to the reagent holding unit, and further specifically binds to the substance to be detected. A test part on which a capturing substance for use is immobilized is prepared. Thereafter, a control section containing the up-conversion material and further immobilizing a reference capturing substance for capturing the labeling reagent is prepared at a position on the base material that sandwiches the test section together with the reagent holding section. .
上記標識微粒子に被検出物質と特異的に結合する結合物質を固定化する方法としては、標識微粒子の表面に結合物質を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する標識微粒子の表面に化学結合させる方法が挙げられる。 Examples of a method for immobilizing a binding substance that specifically binds to a substance to be detected to the labeled fine particles include a method of physically adsorbing the binding substance on the surface of the labeled fine particles and a method of chemically bonding to the surface of the labeled fine particles having a functional group. There is a method to make it.
上記試薬保持部を作製する方法としては、基材上に標識試薬を含有する懸濁液を塗布し乾燥させる方法や、多孔質膜等に標識試薬を含有する懸濁液を塗布し乾燥して得られた部材を基材上に貼り合わせて積層する方法等が挙げられる。また、上記標識試薬を含有する懸濁液は、安定化・感度向上のために、更に、牛血清アルブミン、カゼイン等を含有していてもよい。 As a method of preparing the reagent holding unit, a method of coating and drying a suspension containing a labeling reagent on a base material, or a method of applying and drying a suspension containing a labeling reagent on a porous membrane or the like and drying. A method of laminating the obtained members on a base material and laminating them is exemplified. Further, the suspension containing the above-mentioned labeling reagent may further contain bovine serum albumin, casein and the like for stabilization and improvement of sensitivity.
上記基材上に上記テスト部を作製する方法としては、例えば、被検出物質と特異的に結合する試験用捕捉物質を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥させて試験用捕捉物質を固定化し、更に、アップコンバージョン材料を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥させる方法や、上記試験用捕捉物質を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥させて固定化し、更に、多孔質膜等にアップコンバージョン材料を含有する溶液を塗布・含浸させて得られた部材を基材上の上記試験用捕捉物質が塗布された部位上に貼り付ける方法等が挙げられる。
また、上記試験用捕捉物質を固定化した後、牛血清アルブミン、ゼラチンカゼイン等のタンパク質等のブロッキング剤を用いてブロッキングすることが好ましい。
As a method of preparing the test portion on the substrate, for example, a solution containing a test capture substance that specifically binds to the substance to be detected is applied to the substrate and dried to obtain a test capture substance. Immobilized, further, a method of applying and drying the solution containing the up-conversion material on the substrate, or immobilizing by applying and drying the solution containing the test capture substance on the substrate, A method in which a member obtained by applying and impregnating a solution containing an up-conversion material to a porous membrane or the like is attached to a portion of a substrate on which the above-described test capturing substance has been applied is attached.
Further, it is preferable that after the test capture substance is immobilized, blocking is performed using a blocking agent such as a protein such as bovine serum albumin and gelatin casein.
上記基材上に上記コントロール部を作製する方法としては、例えば、参照用捕捉物質を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥させて参照用捕捉物質を固定化し、更に、アップコンバージョン材料を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥する方法、上記参照用捕捉物質を含有する溶液を基材上に塗布して乾燥させて固定化し、更に、多孔質膜等にアップコンバージョン材料を含有する溶液を塗布・含浸させて得られた部材を基材上の上記参照用捕捉物質が塗布された部位上に貼り付ける方法等が挙げられる。 As a method of producing the control portion on the substrate, for example, a solution containing a reference capture substance is applied to the substrate and dried to immobilize the reference capture substance, and further, an up-conversion material is used. A method containing a solution containing the reference capture substance and a solution containing the reference capture substance, applied to the substrate, dried and fixed, and further containing an up-conversion material in a porous membrane or the like. And a method in which a member obtained by applying and impregnating a solution to be applied is attached to a portion of the substrate on which the reference capturing substance has been applied.
また、試料が添加された際の上記試薬保持部の上流側に更に多孔質膜等を貼り付けること等により試料添加部を作製してもよく、また、上記コントロール部の下流側に更に多孔質膜等を貼り付けること等により吸収部を作製してもよい。 Further, a sample addition section may be prepared by further attaching a porous membrane or the like to the upstream side of the reagent holding section when the sample is added, or a further porous section may be formed downstream of the control section. The absorbing section may be manufactured by attaching a film or the like.
本発明の検査キットに、試料を添加することによって、試料中の被検出物質の有無を確認することができる。
上記試料としては、例えば、血液、血清、血漿、唾液、汗、尿、乳汁、胸水、粘膜、髄液、腹腔液、羊水あるいは糞便などのような生理学的な流体、発酵ブロス、細胞培養又は化学反応混合物などから得たものであってもよい。また、生物学的流体又は生理学的流体の他に、他の液体サンプル、例えば水、食品の製造検定サンプル又は水質あるいは土壌検査サンプルなどであってもよい。
これらの試料を適宜緩衝液などで希釈して用いることもできるし、濃縮、ろ過、熱処理、凍結融解、抽出操作、妨害成分の不活性又は標識試薬の添加等の前処理を行うこともできる。
本発明の検査キットを用いる検査方法もまた、本発明の１つである。
By adding a sample to the test kit of the present invention, the presence or absence of the substance to be detected in the sample can be confirmed.
Examples of the sample include physiological fluids such as blood, serum, plasma, saliva, sweat, urine, milk, pleural effusion, mucous membrane, cerebrospinal fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid or feces, fermentation broth, cell culture or chemical. It may be obtained from a reaction mixture or the like. In addition to biological or physiological fluids, other liquid samples, such as water, food production test samples or water or soil test samples, may be used.
These samples may be appropriately diluted with a buffer or the like, or may be subjected to pretreatment such as concentration, filtration, heat treatment, freeze-thawing, extraction operation, inactivation of interfering components or addition of a labeling reagent.
A test method using the test kit of the present invention is also one of the present invention.
本発明によれば、被検出物質の検出感度に優れる検査キット及び該検査キットを用いた検査方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the test kit excellent in the detection sensitivity of a to-be-detected substance and the test method using the said test kit can be provided.
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
（実施例１）
（１）標識試薬保持部材の作製
金コロイド懸濁液（シグマアルドリッチ社製、平均粒子径４０ｎｍ）をリン酸緩衝液により、固形分濃度が２．５重量％となるように希釈した。得られた金コロイドリン酸緩衝液懸濁液１ｍＬと、α−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、ｈＣＧという）に対するモノクローナル抗体（ＡＲＩＳＴＡ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ Ｉｎｃ．社製）をリン酸緩衝液で１００μｇ／ｍＬに希釈して得られた抗体希釈液１ｍＬとを混合し２時間撹拌した。その後、２０分間遠心分離を行い、未反応の抗体を除去した。次いで、牛血清アルブミンを０．１重量％含有するリン酸緩衝液を加え、標識試薬溶液を作製した。
得られた標識試薬溶液３００μｌに１０重量％トレハロース水溶液３００μＬと蒸留水１．８ｍＬを添加し、ガラス繊維パッド（厚さ１ｍｍ、幅５ｍｍ、長さ２０ｍｍ）に均一になるように添加し、真空乾燥により乾燥させ、標識試薬保持部材を作製した。
(Example 1)
(1) Preparation of Labeling Reagent Holding Member A colloidal gold suspension (manufactured by Sigma-Aldrich Co., Ltd., average particle size: 40 nm) was diluted with a phosphate buffer to a solid concentration of 2.5% by weight. The obtained colloidal gold phosphate buffer suspension (1 mL) and a monoclonal antibody against α-human chorionic gonadotropin (hereinafter referred to as hCG) (manufactured by ARISTA BIOLOGICALS Inc.) were diluted to 100 μg / mL with a phosphate buffer. 1 mL of the antibody diluent thus obtained was mixed and stirred for 2 hours. Thereafter, centrifugation was performed for 20 minutes to remove unreacted antibodies. Next, a phosphate buffer solution containing 0.1% by weight of bovine serum albumin was added to prepare a labeling reagent solution.
300 μL of a 10% by weight trehalose aqueous solution and 1.8 mL of distilled water are added to 300 μL of the obtained labeling reagent solution, and the mixture is uniformly added to a glass fiber pad (1 mm thick, 5 mm wide, 20 mm long), and dried under vacuum. To prepare a labeling reagent holding member.
（２）アップコンバージョン材料微粒子及びアップコンバージョン材料含有分散液の作製
櫛形ポリカルボン酸（無水マレイン酸共重合体、マリアリムＡＦＢ−１５２１、重量平均分子量５００００）を０．１重量％添加した水溶液に硝酸イットリウム２．９８ｇ（０．０５１９モル％）、硝酸イッテルビウム０．８３ｇ（０．０１５４モル％）、硝酸エレビウム０．０９ｇ（０．００１７モル％）を溶解させて金属イオン溶液１５０ｇを作製した。
同様に櫛形ポリカルボン酸を０．１重量％添加した水溶液５０ｇに水酸化カリウム２．８１ｇを溶解させてアルカリ溶液を作製した。攪拌しながら金属イオン溶液にアルカリ溶液を徐々に添加することで水酸化物微粒子を析出させた（アルカリ溶液添加後の櫛形ポリカルボン酸の濃度は０．１重量％）。
その後、遠心分離装置（日立工機社製、ＣＲ２１Ｎ）及び純水を添加して超音波分散による洗浄を数回繰り返した後、１重量％となるように純水を添加し、分散することで水酸化物微粒子分散液を得た。
得られた水酸化物微粒子分散液を遠心分離装置を用いて回収し、８０℃、２４時間の条件において乾燥させた。その後、焼成炉（アドバンテック社製、ＫＭ−４２０）を用いて１０００℃、１時間の条件において大気雰囲気下で焼成処理を行い、平均一次粒子径が８０ｎｍのランタノイド含有酸化物微粒子の粉体を得た。
Ｘ線回析装置により、ランタノイド含有酸化物微粒子がＹ２Ｏ３を含有することを確認した。
(2) Preparation of Up-Conversion Material Fine Particles and Up-Conversion Material-Containing Dispersion Yttrium nitrate in an aqueous solution containing 0.1% by weight of comb-shaped polycarboxylic acid (maleic anhydride copolymer, Marialim AFB-1521, weight average molecular weight: 50,000) was added. 2.98 g (0.0519 mol%), 0.83 g (0.0154 mol%) of ytterbium nitrate, and 0.09 g (0.0017 mol%) of erbium nitrate were dissolved to prepare 150 g of a metal ion solution.
Similarly, 2.81 g of potassium hydroxide was dissolved in 50 g of an aqueous solution to which 0.1% by weight of comb-shaped polycarboxylic acid was added to prepare an alkaline solution. Hydroxide fine particles were precipitated by gradually adding an alkali solution to the metal ion solution with stirring (the concentration of the comb-shaped polycarboxylic acid after the addition of the alkali solution was 0.1% by weight).
Thereafter, a centrifugal separator (manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd., CR21N) and pure water were added, and washing by ultrasonic dispersion was repeated several times. Then, pure water was added to 1% by weight and dispersed. A hydroxide fine particle dispersion was obtained.
The obtained hydroxide fine particle dispersion was recovered using a centrifugal separator, and dried at 80 ° C. for 24 hours. Thereafter, a baking treatment is performed in a baking furnace (KM-420, manufactured by Advantech Co., Ltd.) at 1000 ° C. for 1 hour in an air atmosphere to obtain a powder of lanthanoid-containing oxide fine particles having an average primary particle diameter of 80 nm. Was.
An X-ray diffraction apparatus confirmed that the lanthanoid-containing oxide fine particles contained Y 2 O 3 .
得られたランタノイド含有酸化物微粒子１ｇとエタノール（和光純薬工業社製、試薬特級）９９ｇ、ジルコニアビーズ（ニッカトー社製、直径５０μｍ）４００ｇを混合し、ビーズミル（アイメックス社製、ＲＭＢバッチ式ビーズミル）を用いて２０００ｒｐｍ、２時間の条件において解砕処理を行った。処理後、メッシュフィルターを用いてジルコニアビーズを分離し、１重量％のランタノイド含有酸化物微粒子を含有するアップコンバージョン材料含有分散液を得た。 1 g of the obtained lanthanoid-containing oxide fine particles, 99 g of ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, special grade) and 400 g of zirconia beads (manufactured by Nikkato Co., Ltd., diameter: 50 μm) were mixed, and the mixture was mixed with a bead mill (RMB batch type bead mill manufactured by AIMEX). The crushing treatment was performed under the conditions of 2000 rpm and 2 hours. After the treatment, the zirconia beads were separated using a mesh filter to obtain a dispersion containing an up-conversion material containing 1% by weight of lanthanoid-containing oxide fine particles.
（３）テスト部及びコントロール部の作製
基材としてニトロセルロースシート（ミリポア社製、厚さ１ｍｍ、幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍ）を用いた。
基材の端から長さ方向に２０ｍｍの位置に、α−ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬとなるようにトリス塩酸緩衝液に溶解したテスト部用溶液を幅１ｍｍの直線状に塗布した。また、テスト部用溶液を塗布した位置から更に長さ方向に１０ｍｍの位置に、抗マウスＩｇＧ抗体を２．０ｍｇ／ｍＬとなるようにトリス塩酸緩衝液に溶解したコントロール部用溶液を幅１ｍｍの直線状に塗布した。その後、３０℃で３０分間乾燥させた。更に、上記基材上の上記テスト部用溶液及び上記コントロール部用溶液が塗布された部分に、（２）で得られたアップコンバージョン材料含有分散液を塗布し、３０℃で３０分間乾燥させてテスト部及びコントロール部を作製した。
(3) A nitrocellulose sheet (manufactured by Millipore, thickness 1 mm,
A test part solution in which a monoclonal antibody against α-hCG was dissolved in Tris-HCl buffer to a concentration of 2.0 mg / mL was applied linearly to a position 1 mm wide at a position 20 mm in the length direction from the edge of the base material. . Further, at a
（４）試料添加部の作製
カラス繊維不織布（厚さ１ｍｍ、幅５ｍｍ、長さ２０ｍｍ）を非イオン性界面活性剤水溶液に含浸した後、３０℃で２４時間乾燥し、試料添加部を作製した。
(4) Preparation of Sample Addition Section A crow fiber nonwoven fabric (thickness 1 mm,
（５）検査キットの作製
上記基材上の上記テスト部の上流側に上記標識試薬保持部材が上記基材と１０ｍｍ重なるように貼り合わせて、試薬保持部を作製した。更に、上記試薬保持部の上流側に上記試薬添加部が上記試薬保持部と１０ｍｍ重なるように貼り合わせた。その後、上記コントロール部の下流側に吸収部としてガラス繊維不織布を上記基材と１０ｍｍ重なるように貼り合わせて、図１に示す構成を有する検査キットを作製した。
(5) Preparation of Test Kit The labeling reagent holding member was attached to the upstream side of the test section on the base material so as to overlap the base material by 10 mm to prepare a reagent holding section. Further, the above-mentioned reagent adding portion was attached to the upstream side of the above-mentioned reagent holding portion such that the reagent adding portion overlapped with the reagent holding portion by 10 mm. Thereafter, a glass fiber nonwoven fabric as an absorbing portion was attached to the downstream side of the control portion so as to overlap the base material by 10 mm, thereby producing an inspection kit having the configuration shown in FIG.
（実施例２）
（２）アップコンバージョン材料微粒子及びアップコンバージョン材料含有分散液の作製を以下の通りとした以外は実施例１と同様にして検査キットを作製した。
(Example 2)
(2) An inspection kit was prepared in the same manner as in Example 1, except that the preparation of the fine particles of the upconversion material and the dispersion containing the upconversion material was as follows.
（２）アップコンバージョン材料微粒子及びアップコンバージョン材料含有分散液の作製
オレイン酸１１．１３ｇ、トリオクチルホスフィン１０．３９ｇ、オクタデセン４６．０３ｇの混合溶媒中に酢酸イットリウム０．４０ｇ、酢酸イッテルビウム０．１３ｇ、酢酸エルビウム０．０１３ｇを溶解することで金属イオン含有溶液を作製した。また、メタノール１５ｇ中に水酸化ナトリウム０．１５ｇ、フッ化アンモニウム０．３９ｇを溶解し得られた溶液を、作製後すぐに金属イオン含有溶液に投入することによって反応前駆体溶液を作製した。
真空下において５０℃で１５分間撹拌しながら加熱することによって反応前駆体溶液からメタノールを揮発除去し、その後、窒素雰囲気下において更に３１５℃で６０分間撹拌しながら加熱することによって溶液中に微粒子を析出させた。
更に、室温まで冷却後、エタノール２５ｇを加え微粒子を沈降させ、遠心分離機を用いて微粒子を回収した。回収した微粒子をトルエン２５ｇ中に再分散させた後、再度エタノール２５ｇを加えて再凝集させ、遠心分離器による回収を行う洗浄を数回繰り返すことで平均粒子径が４０ｎｍのランタノイド含有フッ化物微粒子を得た。
Ｘ線回析装置により、ランタノイド含有フッ化物微粒子が、ＮａＹＦ４を含有することを確認した。
その後、再度トルエン中に分散させることで１重量％のランタノイド含有フッ化物微粒子を含有するアップコンバージョン材料含有分散液を得た。
(2) Preparation of Upconversion Material Fine Particles and Upconversion Material-Containing Dispersion In a mixed solvent of 11.13 g of oleic acid, 10.39 g of trioctylphosphine, and 46.03 g of octadecene, 0.40 g of yttrium acetate, 0.13 g of ytterbium acetate, A metal ion-containing solution was prepared by dissolving 0.013 g of erbium acetate. Further, a solution obtained by dissolving 0.15 g of sodium hydroxide and 0.39 g of ammonium fluoride in 15 g of methanol was immediately added to a solution containing metal ions to prepare a reaction precursor solution.
The methanol was volatilized and removed from the reaction precursor solution by heating under stirring at 50 ° C. for 15 minutes under vacuum, and then the particles were added to the solution by heating under stirring at 315 ° C. for 60 minutes under a nitrogen atmosphere. Was deposited.
Furthermore, after cooling to room temperature, 25 g of ethanol was added to precipitate the fine particles, and the fine particles were collected using a centrifuge. After re-dispersing the collected fine particles in 25 g of toluene, 25 g of ethanol is added again to cause reaggregation, and washing by collecting with a centrifugal separator is repeated several times to obtain lanthanoid-containing fluoride fine particles having an average particle diameter of 40 nm. Obtained.
The X-ray diffractometer confirmed that the lanthanoid-containing fluoride fine particles contained NaYF 4 .
Thereafter, the dispersion was again dispersed in toluene to obtain a dispersion containing an up-conversion material containing 1% by weight of lanthanoid-containing fluoride fine particles.
（実施例３）
金コロイド懸濁液として（シグマアルドリッチ社製：平均粒子径２０ｎｍ）を用いた以外は実施例１と同様にして検査キットを作製した。
(Example 3)
A test kit was prepared in the same manner as in Example 1, except that a gold colloid suspension (Sigma-Aldrich: average particle diameter: 20 nm) was used.
（実施例４）
金コロイド懸濁液として（シグマアルドリッチ社製：平均粒子径８０ｎｍ）を用いた以外は実施例１と同様にして検査キットを作製した。
(Example 4)
A test kit was prepared in the same manner as in Example 1, except that a gold colloid suspension (Sigma-Aldrich: average particle diameter: 80 nm) was used.
（実施例５）
コントロール部を作製せずテスト部のみを作製した以外は実施例１と同様にして検査キットを作製した。
(Example 5)
An inspection kit was prepared in the same manner as in Example 1 except that only the test part was prepared without preparing the control part.
（比較例１）
（３）テスト部及びコントロール部の作製において、アップコンバージョン材料含有分散液を塗布しなかった以外は実施例１と同様にして検査キットを作製した。
(Comparative Example 1)
(3) A test kit was prepared in the same manner as in Example 1 except that the dispersion containing the upconversion material was not applied in the preparation of the test section and the control section.
（評価）
実施例及び比較例で得られた検査キットについて、以下のようにして、検出感度を評価した。
(Evaluation)
For the test kits obtained in the examples and comparative examples, the detection sensitivity was evaluated as follows.
（１）試料添加前の発光強度の測定
実施例及び比較例で得られた検査キットに赤外線発生装置（ＴＨＯＲＬＡＢＳ社製、Ｌ９８０Ｐ３００Ｊ）を用いて波長９８０ｎｍ、出力３００ｍＷの条件で赤外線を照射し、得られた蛍光発光のスペクトルを蛍光分光光度計（日立ハイテク社製、Ｕ−２７００）を用いて測定した。
(1) Measurement of emission intensity before sample addition The test kits obtained in the Examples and Comparative Examples were irradiated with infrared rays using an infrared ray generator (L980P300J, manufactured by THORLABS) under the conditions of a wavelength of 980 nm and an output of 300 mW. The spectrum of the obtained fluorescence emission was measured using a fluorescence spectrophotometer (U-2700, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation).
（２）試料の調製
ｈＣＧ濃度がそれぞれ０ｍＩＵ／ｍＬ、５ｍＩＵ／ｍＬ、５０ｍＩＵ／ｍＬ、１００ｍＩＵ／ｍＬの試料を作製した。
(2) Preparation of Samples Samples having hCG concentrations of 0 mIU / mL, 5 mIU / mL, 50 mIU / mL, and 100 mIU / mL were prepared.
（３）クロマトグラフ処理
調製した試料１００μＬを検査キットの試料添加部に滴下した。
２０分間経過後、（１）試料添加前の発光強度の測定と同様にしてテスト部における発光強度を測定した。なお、試料添加前のスペクトルの最大強度を１として、試料添加後のスペクトルの最大強度の相対値を算出して、発光強度を評価した。
加えて、目視におけるテスト部及び各試料濃度においてのコントロール部の発光のライン読取の可否について、”◎”（はっきりと読み取り可能）、”○”（読み取り可能）、”△”（ラインがぼやけるも読み取り可能）、”×”（読み取り不可能）で評価した。
(3) Chromatographic treatment 100 μL of the prepared sample was dropped into the sample addition section of the test kit.
After a lapse of 20 minutes, the luminescence intensity in the test section was measured in the same manner as (1) the measurement of the luminescence intensity before the sample was added. The maximum intensity of the spectrum before addition of the sample was set to 1, and the relative value of the maximum intensity of the spectrum after addition of the sample was calculated to evaluate the emission intensity.
In addition, regarding the readability of the line of the light emission of the test part and the control part at each sample concentration visually, “◎” (clearly readable), “○” (readable), “△” (line is blurred) (Readable) and "x" (Readable).
本発明によれば、被検出物質の検出感度に優れる検査キット及び該検査キットを用いた検査方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the test kit excellent in the detection sensitivity of a to-be-detected substance and the test method using the said test kit can be provided.
１ 検査キット
２ 試料添加部
３ 試薬保持部
４ 基材
５ テスト部
６ コントロール部
７ 吸収部
８ 被検出物質
９ 標識試薬
１０ 標識微粒子
１１ 結合物質
１２ 試験用捕捉物質
１３ アップコンバージョン材料
１４ 参照用捕捉物質
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1
Claims (8)
前記テスト部は、アップコンバージョン材料を含有することを特徴とする検査キット。 A reagent holding unit containing a labeling reagent in which a binding substance that specifically binds to the target substance is immobilized on the labeled microparticles, and a test capture substance that specifically binds to the target substance are immobilized on the substrate. The labeled fine particles are fine particles made of a noble metal,
The test kit, wherein the test section contains an up-conversion material.
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Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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