JP6625370B2 - Composition for improving algae culture density and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、藻類の培養密度を向上させるための組成物およびその利用に関する。 The present invention relates to a composition for improving the culture density of algae and its use.
化石燃料に代わる燃料として、バイオマス由来の燃料、いわゆるバイオ燃料（例えば、バイオエタノール、バイオディーゼル等）が期待されている。 As a fuel that replaces fossil fuels, biomass-derived fuels, so-called biofuels (eg, bioethanol, biodiesel, etc.) are expected.
バイオ燃料の原料となる糖類（例えば、デンプン）や油脂等のバイオマスの多くは、植物が光合成を行うことによって産生される。このため、光合成を活発に行い、糖類または油脂を細胞内に蓄積する能力を有する植物は、バイオマスの生産手段として利用可能である。現在、バイオマスを生産するために、主に、トウモロコシやダイズが利用されている。トウモロコシやダイズは、食料や飼料としても利用されている。このため、バイオ燃料の大幅な増産によって引き起こされる、食料および飼料の価格の高騰が問題視されている。 Most of biomass such as saccharides (eg, starch) and oils and fats as raw materials for biofuels are produced by plants performing photosynthesis. For this reason, plants capable of actively performing photosynthesis and accumulating sugars or fats and oils in cells can be used as a means for producing biomass. At present, corn and soybeans are mainly used to produce biomass. Corn and soybeans are also used as food and feed. Therefore, rising prices of food and feed caused by a large increase in production of biofuels have been regarded as a problem.
そこで、トウモロコシやダイズに代わるバイオマス生産手段として、藻類によるバイオマス生産が注目されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。藻類によるバイオマス生産は、食料や飼料と競合しない、大量に増殖させることができる、等の利点がある。 Therefore, as a means of producing biomass instead of corn and soybean, biomass production by algae has attracted attention (for example, see Patent Documents 1 and 2). Biomass production by algae has advantages such as not competing with food and feed, and being able to grow in large quantities.
例えば、藻類の一種であるクラミドモナスについて、細胞壁が欠損した変異体あるいは細胞壁が薄くなる変異体が知られている（ｃｗ１５，ｃｗ９２等）。これらの変異体は、ＤＮＡを外部から細胞内へ導入する際に都合のよい性質であるため、遺伝子導入実験では広く使われている。また細胞が壊れやすいため、細胞内容物の回収が容易という意味でバイオマスの生産性を高めることから、これらの変異体を利用したバイオマス生産について報告されている。例えば、特許文献３には、クラミドモナスにおける細胞壁が欠損した変異体を用いて油脂を生産させる技術が記載されている。また、非特許文献１には、細胞壁変異（ｃｗ１５）に加え、デンプン合成遺伝子の欠損を有しているクラミドモナスは、油脂からなる油滴が細胞外へ放出されることが報告されている。非特許文献２には、クラミドモナスの細胞壁変異体（ｃｗ１５）において、デンプン合成の遺伝子を破壊することで油脂の生産性が高まることが報告されている。また、クラミドモナス細胞壁の変異に関するレポートとして、非特許文献３が知られている。 For example, with respect to Chlamydomonas, a kind of algae, mutants in which the cell wall is deficient or in which the cell wall is thinner are known (cw15, cw92, etc.). These mutants have properties that are advantageous when introducing DNA into cells from the outside, and are therefore widely used in gene transfer experiments. In addition, biomass production using these mutants has been reported because the cells are fragile and enhance the biomass productivity in the sense that the cell contents can be easily recovered. For example, Patent Literature 3 describes a technique for producing an oil or fat using a mutant of Chlamydomonas in which the cell wall is defective. Non-Patent Document 1 reports that Chlamydomonas, which has a starch synthesis gene deficiency in addition to the cell wall mutation (cw15), releases oil droplets composed of oils and fats outside the cells. Non-Patent Document 2 reports that in a cell wall mutant of Chlamydomonas (cw15), the productivity of fats and oils is increased by disrupting the starch synthesis gene. Non-Patent Document 3 is known as a report on mutation of Chlamydomonas cell wall.
また、藻類の一種であるクロレラを材料として、生産したデンプンを細胞外へ放出させ、続いてエタノール発酵を行う技術も報告されている（特許文献４）。さらに、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることによって、デンプンの産生能を向上させる技術も報告されている（特許文献５）。 In addition, a technique has been reported in which chlorella, which is a kind of algae, is used as a material to release the produced starch outside of cells, followed by ethanol fermentation (Patent Document 4). Furthermore, a technique has been reported in which the starch production ability is improved by increasing the concentration of glutathione in the chloroplast of algae (Patent Document 5).
しかし、特許文献１〜５、非特許文献１〜３に記載される藻類を用いたバイオマスの生産技術では、生産性の面で問題がある。特に、特許文献５においては、藻の培養密度が上がらず、光合成産物の生産性が上がりきらないという問題点がある。 However, the biomass production technology using algae described in Patent Literatures 1 to 5 and Non-Patent Literatures 1 to 3 has a problem in productivity. In particular, Patent Document 5 has a problem that the culture density of algae does not increase, and the productivity of photosynthetic products cannot be increased.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、バイオマスの生産性を向上させ得る藻類およびその利用を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to provide an algae capable of improving biomass productivity and use thereof.
本発明者らは、上記課題を解決することを目的として検討を重ねた結果、グルタチオン存在下で藻類を培養した際に、グルタチオン非存在下で培養された藻類よりも高い培養密度まで藻類が増殖することを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have repeatedly studied for the purpose of solving the above problems, and as a result, when algae are cultured in the presence of glutathione, the algae grow to a higher culture density than the algae cultured in the absence of glutathione. And completed the present invention.
すなわち、本発明に係る組成物は、藻類の培養密度を向上させるために、グルタチオンを含むことを特徴としている。 That is, the composition according to the present invention is characterized by containing glutathione in order to improve the culture density of algae.
本発明に係る方法は、藻類の培養密度を向上させるために、グルタチオン非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類をグルタチオン存在下で培養する工程を包含することを特徴としている。 The method according to the present invention is characterized in that it includes a step of culturing algae in the presence of glutathione to a culture density higher than the maximum value of the culture density in the absence of glutathione in order to improve the culture density of algae. .
本発明に係る製造方法は、バイオマスを製造するために、本発明に係る組成物を含む培養液中で培養された藻類を用いることを特徴としており、グルタチオン非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで培養された藻類を回収する工程を包含することが好ましい。 The production method according to the present invention is characterized by using algae cultured in a culture solution containing the composition according to the present invention, for producing biomass, from the maximum culture density in the absence of glutathione Preferably, the method further includes a step of collecting algae cultured to a high culture density.
本発明に係るバイオマスは、上記製造方法によって得られたものであることを特徴としている。 The biomass according to the present invention is characterized by being obtained by the above production method.
本発明に係る組成物は、藻類の培養密度を向上させることができる。そして、本発明が適用された藻類は、その培養密度の最大値が向上しているので、培養物容積あたりの藻類の収穫量が増加し、より多くのバイオマスを供給することができる。それゆえ、本発明に係るバイオマスの製造方法によれば、従来よりも安価に、多量のバイオマスを藻類から効率よく製造することできる。 The composition according to the present invention can improve the culture density of algae. And since the maximum value of the culture density of the algae to which the present invention is applied is improved, the yield of the algae per culture volume is increased, and more biomass can be supplied. Therefore, according to the method for producing biomass according to the present invention, a large amount of biomass can be efficiently produced from algae at a lower cost than before.
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されず、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to this, and can be implemented in embodiments with various modifications within the described range. In addition, all of the academic documents and patent documents described in this specification are incorporated herein by reference. Unless otherwise specified in this specification, “A to B” representing a numerical range means “A or more and B or less”.
〔１．本発明に係る組成物〕
本発明は、藻類の培養密度を向上させるための組成物（以下、「本発明の組成物」と称する。）を提供する。本発明に係る組成物は、未処理の藻類の培養密度の最大値を向上させるための組成物であり、藻類の培養密度を向上させるために用いられれば、グルタチオンまたはその誘導体を含んでいればよく、その他の構成は限定されない。本発明の組成物に含まれるグルタチオンは、還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」ともいう。）または酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」ともいう。）のどちらか一方であってもＧＳＨおよびＧＳＳＧの両方であってもよいが、ＧＳＨが好ましく用いられる。グルタチオンの誘導体としては、ホモグルタチオン、カルボキシプロピルグルタチオン、ジカルボキシエチルグルタチオン等が挙げられる。
[1. Composition according to the present invention)
The present invention provides a composition for improving the culture density of algae (hereinafter, referred to as “composition of the present invention”). The composition according to the present invention is a composition for improving the maximum value of the culture density of untreated algae, and if used to improve the culture density of algae, contains glutathione or a derivative thereof. Well, other configurations are not limited. Glutathione contained in the composition of the present invention may be any of reduced glutathione (hereinafter, also referred to as “GSH”) and oxidized glutathione (hereinafter, also referred to as “GSSG”), even if it is either GSH or GSSG. Both may be used, but GSH is preferably used. Derivatives of glutathione include homoglutathione, carboxypropyl glutathione, dicarboxyethyl glutathione, and the like.
ＧＳＨは、当業者によく知られているように、酸化されやすい性質を有する。したがって、本発明の組成物に、グルタチオンとしてＧＳＨを含ませると、通常、該組成物には、ＧＳＳＧが少なからず含まれている。つまり、本発明の組成物には、グルタチオンとして、ＧＳＨとＧＳＳＧとが混合した状態で含まれていてもよい。 GSH has a susceptibility to oxidation, as is well known to those skilled in the art. Therefore, when GSH is contained as glutathione in the composition of the present invention, the composition usually contains a considerable amount of GSSG. That is, the composition of the present invention may contain GSH and GSSG in a mixed state as glutathione.
本発明の組成物は、グルタチオンとしてＧＳＨを含有させ、その保存時もしくは使用時に、該ＧＳＨをＧＳＳＧに酸化させる形態とすることができる。また、藻類に投与後に、ＧＳＨがＧＳＳＧに酸化される形態としてもよい。 The composition of the present invention can contain GSH as glutathione and oxidize the GSH to GSSG during storage or use. In addition, after administration to algae, GSH may be oxidized to GSSG.
なお、ＧＳＨをＧＳＳＧに酸化する方法は特に限定されない。例えば、空気酸化により、ＧＳＨをＧＳＳＧに容易に変換することができる。また、従来公知のあらゆる人為的な方法で、ＧＳＨをＧＳＳＧに変換してもよい。 The method of oxidizing GSH to GSSG is not particularly limited. For example, GSH can be easily converted to GSSG by air oxidation. Further, GSH may be converted to GSSG by any conventionally known artificial method.
本発明の組成物は、藻類のための培地または培養液として用いられる。グルタチオンまたはその誘導体を含ませる培地または培養液の構成は特に限定されず、従来公知の藻類培養に用いられている培地または培養液の構成を適宜使用することができる。藻類のための培地または培養液としては、ＴＡＰ培地やＨＳＭ培地等が知られており、これらを好適に用いることができる。 The composition of the present invention is used as a medium or culture solution for algae. The structure of the medium or culture solution containing glutathione or a derivative thereof is not particularly limited, and a conventionally known structure of a medium or culture solution used for algae culture can be appropriately used. As a medium or a culture solution for algae, a TAP medium, an HSM medium, and the like are known, and these can be suitably used.
本発明の組成物の適用対象である「藻類」としては、種々のバイオマスを生成可能な藻類であれば、特に限定されない。このような藻類としては、例えば、緑藻植物門の緑藻綱に分類される微細藻類が挙げられ、さらに具体的には、緑藻綱のクラミドモナス属に属するクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・モエブシイ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・ユーガメタス（Chlamydomonas eugametos）、クラミドモナス・セグニス（Chlamydomonas segnis）等；緑藻綱のドナリエラ属に属するドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、ドナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）等；緑藻綱のセネデスムス属に属するセネデスムス・アキュマナタス（Scenedesmus acumunatus）、セネデスムス・ジモルファス（Scenedesmus dimorphus）、セネデスムス・ジシフォルミス（Scenedesmus disciformis）、セネデスムス・オヴァルテルマス（Scenedesmus ovaltermus）、緑藻綱のドナリエラ属に属するドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、ドナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）等；緑藻綱のクロレラ属に属するクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）等；緑藻綱のヘマトコッカス属に属するヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）等；緑藻綱のクロロコックム属に属するクロロコックム・リトラエ（Chlorococcum littorale）等；緑藻綱または黄緑色藻綱のボトリオコッカス属に属するボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）等；緑藻綱のコリシスチス属に属するコリシスチス・マイナー（Choricystis minor）等；緑藻綱のシュードコリシスチス属に属するシュードコリシスチス・ エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）等；珪藻綱のアンフォーラ属に属するアンフォーラ（Amphora sp.）等；珪藻綱のニッチア属に属するニッチア・アルバ（Nitzschia alba）、ニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）、ニッチア・ラエビス（Nitzschia laevis）等；渦鞭毛藻綱のクリプセコディニウム属に属するクリプセコディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）等；ミドリムシ綱のミドリムシ属に属するユーグレナ・グラチリス（Euglena gracilis）、ユーグレナ・プロキシマ（Euglena proxima）等；繊毛虫門のゾウリムシ属に属するミドリゾウリムシ（Paramecium bursaria）等；藍藻門のシネココッカス属に属するシネココッカス・アクアティリス（Synechococcus aquatilis）、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）等；藍藻門スピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、スピルリナ・スブサルサ（Spirulina subsalsa）等；藍藻門のプロクロロコッカス属に属するプロクロロコッカス・マリウス（Prochlorococcus marinus）等；藍藻門のオーシスチス属に属するオーシスチス・ポリモルファ（Oocystis polymorpha）等；等が例示される。 The “algae” to which the composition of the present invention is applied are not particularly limited as long as the algae can produce various biomass. Examples of such algae include microalgae classified into the class of green alga of the phylum Chlorophyceae, and more specifically, Chlamydomonas reinhardtii and Chlamydomonas moebushii belonging to the genus Chlamydomonas of the class of green algae. (Chlamydomonas moewusii), Chlamydomonas eugametos, Chlamydomonas segnis (Chlamydomonas segnis), etc .; primolecta); Scenedesmus acumunatus (Scenedesmus acumunatus), Scenedesmus dimorphus (Scenedesmus dimorphus), Scenedesmus disciformis (Scenedesmus disciformis), -Ovartermas (Scenedesmus ovaltermus), Dunaliella salina (Dunaliella salina) belonging to the genus Donaliella of the green algae class, Dunaliella teriolecta (Dunaliella tertiolecta), Dunaliella primolecta (Dunaliella primolecta), etc .; Chlorella vulgaris, Chlorella pyrenoidosa, etc .; Haematococcus pluvialis belonging to the genus Haematococcus of the green algae class; Chlorococcum littorale, etc .; Botryococcus braunii belonging to the genus Botryococcus of the class Green or Yellow-green Algae; Choricystis minor belonging to the genus Coricystis of the Green Algae; Choricystis minor of the Green Algae; Pseudochoricystis ellipsoidea belonging to the genus Pseudochoricystis ellipsoidea, etc .; Amphora sp. Belonging to the genus Amphora of the diatomaceae, etc .; Nitzschia alba, Nichia closterium belonging to the genus Nichia of the diatomaceae (Nitzschia closterium), Nitzschia laevis and the like; Crypthecodinium cohnii and the like belonging to the genus Crypsecodinium of the Dinoflagellate class; gracilis), Euglena proxima, etc .; Paramecium bursaria, etc. belonging to the genus Paramecium of the ciliate phylum; elongatus); Spirulina platensis (Spirulina platensis) belonging to the genus Spirulina; Spirulina subsalsa; etc .; Prochlorococcus marinus (Prochlorococcus marinus) belonging to the genus Prochlorococcus of the cyanobacterium; Oocystis polymorpha belonging to the genus Acistis, and the like.
藻類の培養では、培養密度（単位体積あたりの培地または培養液における藻類の細胞数、細胞体積または細胞重量）が上昇するにつれて、培養槽表層に存在する細胞による“日陰効果”によって培養槽深層に到達する光が減衰されるので、培養中の藻類の光合成産物の生産能力が一定の値で頭打ちになる。特許文献５には、γ−グルタミルシステインシンセターゼで形質転換された藻類が開示されており、特許文献５に記載の藻類は、野生型と比較して培養密度が小さく維持されるため、光の利用効率が高く、同じ光量（明るさ）であっても、同一種の野生型藻類と比べて、より多くの光合成産物を生産または蓄積させることができる。 In the culture of algae, as the culture density (algal cell number, cell volume or cell weight in the medium or culture medium per unit volume) increases, the “shade effect” of the cells existing on the surface of the culture tank deepens the culture tank. Since the light that reaches is attenuated, the production capacity of the photosynthetic products of the algae in culture peaks at a constant value. Patent Literature 5 discloses an algae transformed with γ-glutamylcysteine synthetase, and the algae described in Patent Literature 5 has a lower culture density than a wild type, and Even with high utilization efficiency and the same amount of light (brightness), it is possible to produce or accumulate more photosynthetic products than wild-type algae of the same species.
特許文献６には、グルタチオン供与によって植物の収穫指数を向上させる技術が記載されている。また、特許文献７には、植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼで形質転換して植物の収穫指数を向上させる技術が開示されている。なお、「植物の収穫指数」とは、植物全体の重さに対する収穫物の重さの割合であり、植物個体の全バイオマス量に対する収穫物のバイオマス量の割合である。 Patent Literature 6 describes a technique for improving the harvest index of a plant by donating glutathione. Patent Document 7 discloses a technique for improving the harvest index of a plant by transforming with a plant-derived γ-glutamylcysteine synthetase. The “plant harvest index” is the ratio of the weight of the harvest to the weight of the entire plant, and is the ratio of the biomass amount of the harvest to the total biomass amount of the individual plant.
単位面積あたりの植物の収穫量は土壌の栄養状態によって決定され、面積あたりの植物の収穫量はある特定の値で頭打ちとなることは、当該分野における技術常識である（例えば、Crop Sci. (2003) Vol.43: 2206-2211参照）。そのため、通常、植物を育成する場合には、適切な間隔で苗や苗木を植栽したり、間引いたりして、個体の植栽密度（単位面積あたりに植栽した個体数）が高まらないようにする。つまり、植栽密度を上げることで単位面積あたりの収穫量は向上するが、その効果は一定の植栽密度で飽和する。「植物の収穫指数を向上させる」とは、グルタチオンを投与しない条件と比較して植物の収穫指数を向上させることであり、単位面積あたりの植物の収穫量を最大限得られるように最適化した従来の標準的な施肥条件であっても、植物の、全バイオマス量に対する収穫物のバイオマス量の割合を増加させる、ということである。なお、「植物の収穫指数の向上」が「植物の生長速度」と何ら関係のない事象であることもまた、当該分野における技術常識である（例えば、Science (1999) Vol. 286: 1960-1962；Plant and Cell Physiology (2005) Vol. 46 (8):1175-1189；Plant Physiology (1987) Vol. 84: 1126-1131；Annals of Botany (1979) Vol. 43: 305-318参照）。 It is common knowledge in the art that the yield of plants per unit area is determined by the nutrient status of the soil, and the yield of plants per area peaks at a certain value (for example, Crop Sci. 2003) Vol.43: 2206-2211). Therefore, when growing plants, planting seedlings and seedlings at appropriate intervals or thinning out the planting density of individuals (the number of individuals planted per unit area) is usually not increased. To That is, although the yield per unit area is improved by increasing the planting density, the effect is saturated at a certain planting density. `` Improve plant yield index '' is to improve the plant yield index compared to the condition without glutathione administration, optimized to maximize the yield of plant per unit area That is, even under conventional standard fertilization conditions, the ratio of the biomass amount of the crop to the total biomass amount of the plant is increased. It is also a common technical knowledge in the art that “improvement of plant harvest index” is an event that has nothing to do with “plant growth rate” (for example, Science (1999) Vol. 286: 1960-1962). Plant and Cell Physiology (2005) Vol. 46 (8): 1175-1189; Plant Physiology (1987) Vol. 84: 1126-1131; Annals of Botany (1979) Vol. 43: 305-318).
上述したように、グルタチオンの供与と植物由来のγ−グルタミルシステインシンセターゼでの形質転換とは、植物に対して同様の効果を生じさせている（特許文献６および７）。特許文献５には、γ−グルタミルシステインシンセターゼで形質転換された藻類が開示されており、特許文献５に記載の藻類はその培養密度が減少していることから、藻類に対するグルタチオンの供与はその培養密度を低減させることが予想された。しかし、予想に反して、グルタチオン存在下で藻類を培養した際に、グルタチオン非存在下で培養された（すなわち、グルタチオン存在下で培養されていない）藻類（以下、「未処理の藻類」ともいう。）の培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類が増殖することがわかった。未処理の藻類の培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類が増殖することができるなどということは、上記従来知られているグルタチオンの機能からは全く予測できないものである。 As described above, the provision of glutathione and the transformation with γ-glutamylcysteine synthetase derived from a plant produce similar effects on plants (Patent Documents 6 and 7). Patent Document 5 discloses an algae transformed with γ-glutamylcysteine synthetase, and the algae described in Patent Document 5 has a reduced culture density. It was expected that the culture density would be reduced. However, unexpectedly, when algae were cultured in the presence of glutathione, the algae cultured in the absence of glutathione (that is, not cultured in the presence of glutathione) (hereinafter, also referred to as “untreated algae”) .) Was found to grow to a culture density higher than the maximum value of the culture density. The fact that algae can grow to a culture density higher than the maximum culture density of untreated algae cannot be predicted at all from the function of glutathione known in the art.
本発明の組成物に還元型グルタチオンを含ませる場合、該組成物に含まれる還元型グルタチオンの量は藻類の増殖を抑制しない限り特に限定されないが、例えば、クラミドモナスの場合、１００μＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、より好ましくは１００μＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．２５ｍＭ〜５ｍＭ、なおさらに０．５ｍＭ〜２．５ｍＭであることが好ましい。 When reducing glutathione is contained in the composition of the present invention, the amount of reduced glutathione contained in the composition is not particularly limited as long as it does not inhibit the growth of algae.For example, in the case of Chlamydomonas, the amount is 100 μM to 10 mM. It is more preferably 100 μM to 5 mM, further preferably 0.25 mM to 5 mM, and still more preferably 0.5 mM to 2.5 mM.
本発明の組成物に酸化型グルタチオンを含ませる場合、該組成物に含まれる酸化型グルタチオンの量は、還元型グルタチオンを含ませる場合よりも少ないことが好ましい。具体的には、例えば、クラミドモナスの場合、５０μＭ〜５ｍＭであることが好ましく、より好ましくは５０μＭ〜２．５ｍＭ、さらに好ましくは０．１２５ｍＭ〜２．５ｍＭ、なおさらには０．２５ｍＭ〜１．２５ｍＭであることが好ましい。 When oxidized glutathione is contained in the composition of the present invention, the amount of oxidized glutathione contained in the composition is preferably smaller than that in the case where reduced glutathione is contained. Specifically, for example, in the case of Chlamydomonas, it is preferably 50 μM to 5 mM, more preferably 50 μM to 2.5 mM, still more preferably 0.125 mM to 2.5 mM, and still more preferably 0.25 mM to 1.25 mM. It is preferable that
なお、上述した濃度範囲は、あくまで特定の期間、特定の量の溶液でクラミドモナスに投与する場合の好適な範囲であり、対象とする藻類の種類や培養期間および培養液量を変更する場合には、より高濃度またはより低濃度のグルタチオンであっても適用可能性があるといえる。 Note that the above-described concentration range is a suitable range when administering to Chlamydomonas in a specific amount of a solution for a specific period of time, and when changing the type of algae or the culture period and the amount of the culture solution to be treated, It can be said that even higher or lower concentrations of glutathione are applicable.
本発明の趣旨は、グルタチオン存在下で藻類を培養した際に、未処理の藻類の培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類が増殖することを見出したことにあり、それ以外の限定を意図していない。それゆえ、本発明は、上述した濃度範囲に限られるものではないことを念のため付言しておく。 The gist of the present invention is to find that when culturing algae in the presence of glutathione, the algae grow to a culture density higher than the maximum value of the culture density of the untreated algae. Not intended. Therefore, it should be noted that the present invention is not limited to the above-described concentration range.
さらに、本発明の組成物には、他の補助剤を適宜配合することができる。そのような補助剤として、例えばアルキル硫酸エステル類，アルキルスルホン酸塩，アルキルアリールスルホン酸塩，ジアルキルスルホコハク酸塩等の陰イオン界面活性剤、高級脂肪族アミンの塩類等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル，ポリオキシエチレングリコールアシルエステル，ポリオキシエチレングリコール多価アルコールアシルエステル，セルロース誘導体等の非イオン界面活性剤、ゼラチン，カゼイン，アラビアゴム等の増粘剤、増量剤、結合剤等が挙げられる。 Further, other auxiliaries can be appropriately added to the composition of the present invention. Examples of such an auxiliary include anionic surfactants such as alkyl sulfates, alkyl sulfonates, alkyl aryl sulfonates, and dialkyl sulfosuccinates; and cationic surfactants such as salts of higher aliphatic amines. Nonionic surfactants such as polyoxyethylene glycol alkyl ether, polyoxyethylene glycol acyl ester, polyoxyethylene glycol polyhydric alcohol acyl ester, and cellulose derivatives; thickeners such as gelatin, casein, and gum arabic; Agents and the like.
必要に応じて、例えば安息香酸，ニコチン酸，ニコチン酸アミド，ピペコリン酸等を、本発明の組成物の所望の効果を損なわない限度において、製剤中に配合することもできる。また、従来公知の栄養成分を、製剤中に配合してもよい。 If necessary, for example, benzoic acid, nicotinic acid, nicotinamide, pipecolic acid and the like can be incorporated in the preparation as long as the desired effects of the composition of the present invention are not impaired. Conventionally known nutrients may be incorporated into the preparation.
なお、本明細書において、用語「藻類バイオマス」とは、藻類が光合成による炭素固定等によって産生する物質を含む藻類による生産物を指し、具体的には、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂、色素（例えば、カロテノイド）等のバイオマスおよびそれらの派生物（二次代謝産物等）を指す。なお、光合成による炭素固定とは、光エネルギーに由来する化学エネルギーを利用した炭素化合物の代謝全般を指す。従って、代謝系に取り込まれる炭素の由来は、二酸化炭素等の無機化合物に限らず、酢酸等の有機化合物も含まれる。すなわち、「藻類バイオマス」には、光合成に依存することなく藻類が従属栄養的に合成する種々の化合物も含まれる。 In this specification, the term “algal biomass” refers to a product of algae including a substance produced by algae by carbon fixation by photosynthesis, and specifically includes, for example, saccharides (eg, starch), oils and fats. , Pigments (eg, carotenoids), and their derivatives (secondary metabolites, etc.). Note that carbon fixation by photosynthesis refers to the overall metabolism of carbon compounds using chemical energy derived from light energy. Therefore, the origin of carbon incorporated into the metabolic system is not limited to inorganic compounds such as carbon dioxide, but also includes organic compounds such as acetic acid. That is, “algal biomass” also includes various compounds that are heterotrophically synthesized by algae without depending on photosynthesis.
通常、藻類の細胞内での藻類バイオマスの生産または蓄積を誘導するためには、窒素飢餓条件下で藻類を培養することが必要である。従属栄養条件（酢酸などの炭素源がある場合）において窒素飢餓状態とした場合、藻類は、増殖期にわずかに細胞内に藻類バイオマスを蓄積し、また定常期に藻類バイオマスを蓄積するが、細胞外ではほとんど藻類バイオマスが検出されない。また、従属栄養条件において窒素飢餓状態としない場合、藻類は、増殖期にほんのわずか細胞内に藻類バイオマスを蓄積するが、定常期にはさらにその蓄積は低下し、細胞外ではほとんど検出されない。一方、独立栄養条件（光合成による二酸化炭素固定に依存して増殖する条件）では、藻類では、窒素飢餓時の藻類バイオマス蓄積誘導に要する光量は、従属栄養条件の場合よりも多く必要となる。 Usually, in order to induce the production or accumulation of algal biomass in algal cells, it is necessary to culture the algae under nitrogen-starved conditions. Under nitrogen-starved conditions under heterotrophic conditions (when there is a carbon source such as acetic acid), algae accumulate algal biomass slightly in the cells during the growth phase, and accumulate algal biomass during the stationary phase. Almost no algal biomass is detected outside. In addition, when not nitrogen-starved under heterotrophic conditions, algae accumulate algal biomass only slightly in cells during the growth phase, but the accumulation further decreases in the stationary phase, and is hardly detected outside the cells. On the other hand, under autotrophic conditions (proliferation dependent on carbon dioxide fixation by photosynthesis), in algae, the amount of light required to induce the accumulation of algal biomass during nitrogen starvation is higher than in heterotrophic conditions.
本発明の組成物は、有効成分であるグルタチオンまたはその誘導体を単独で含んでいてもよいが、上述したように、それぞれの藻類に適用可能な剤形、例えば液剤，固形剤，粉剤，乳剤，底床添加剤等の剤形で用いることが好ましい。そのような製剤は、それぞれの分野で、製剤学上適用することが可能な公知の担体成分、製剤用補助剤等を、本発明の組成物の作用効果が損なわれない限度において、有効成分であるグルタチオンまたはその誘導体に適宜配合し既知の方法で製造することができる。 The composition of the present invention may contain the active ingredient glutathione or a derivative thereof alone, but as described above, a dosage form applicable to each algae, such as a liquid, a solid, a powder, an emulsion, Preferably, it is used in a dosage form such as a bottom floor additive. Such preparations include known carrier components, auxiliaries for preparation, and the like, which can be applied pharmaceutically in each field, as active ingredients as long as the effects of the composition of the present invention are not impaired. It can be produced by a known method by appropriately mixing it with a certain glutathione or a derivative thereof.
なお、細胞中のグルタチオンの濃度を調べることにより、本発明の組成物が適用された藻類であるか否かを簡便に調べることができるので、本発明の組成物が適用された藻類を、本発明の組成物が適用されていない方法で得られた藻類と明確に区別できる。細胞中のグルタチオンの濃度を調べる方法以外にも、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いて遺伝子発現パターンを比較することによっても調べることができる。具体的には、グルタチオンまたはその誘導体の存在下で培養した藻類の遺伝子発現パターンを予め調べ、他の方法で培養された藻類のそれと比較して、グルタチオンまたはその誘導体が提供された場合に特有の発現パターンを特定しておく。そして、調査対象の藻類の遺伝子発現パターンを調べ、上記発現パターンと比較することにより、本発明の組成物が適用された藻類であるか否かを簡便に調べることができる。例示した方法（すなわち、藻類を鑑定する方法）は単独で行ってもよいし、複数を組み合わせて行ってもよい。複数を組み合わせて行うことにより、本発明の組成物が適用された藻類と、それ以外の方法で得られた藻類とをより明確に区別することができる。 In addition, by examining the concentration of glutathione in the cells, it is possible to easily examine whether the composition of the present invention is an algae to which the composition of the present invention has been applied. It can be clearly distinguished from algae obtained by a method to which the composition of the invention has not been applied. In addition to the method of examining the concentration of glutathione in a cell, it can be examined, for example, by comparing gene expression patterns using a DNA microarray or the like. Specifically, the gene expression pattern of algae cultured in the presence of glutathione or a derivative thereof is examined in advance, and compared with that of an algae cultured by another method, a characteristic characteristic of glutathione or a derivative thereof provided is provided. The expression pattern is specified. Then, by examining the gene expression pattern of the alga to be investigated and comparing it with the above expression pattern, it can be easily examined whether or not the alga to which the composition of the present invention has been applied. The exemplified method (that is, the method for identifying algae) may be performed alone or in combination. By performing the combination of a plurality of algae, the algae to which the composition of the present invention has been applied can be more clearly distinguished from the algae obtained by other methods.
このように、本発明は、藻類の培養密度を向上させるための、グルタチオンまたはその誘導体を含む組成物を提供し、同時に、上記組成物を調製するためのグルタチオンまたはその誘導体の使用を提供する。 Thus, the present invention provides a composition comprising glutathione or a derivative thereof for improving the culture density of algae, and at the same time, provides the use of glutathione or a derivative thereof for preparing the composition.
〔２．本発明に係る方法〕
本発明は、本発明に係る藻類の培養密度を向上させる方法（以下、「本発明の方法」と称する。）を提供する。本発明の方法は、未処理の藻類の培養密度の最大値を向上させるための方法であり、上記最大値よりも高い培養密度での藻類の培養を実現することができる。本発明の方法は、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類をグルタチオンまたはその誘導体の存在下で培養する工程を少なくとも含んでいればよく、その他の条件、工程等の構成は限定されない。なお、本発明の方法に用いられるグルタチオンまたはその誘導体については、「１．本発明に係る組成物」の項で説明したので、ここでは省略する。
[2. Method according to the present invention)
The present invention provides a method for improving the culture density of algae according to the present invention (hereinafter, referred to as “method of the present invention”). The method of the present invention is a method for improving the maximum value of the culture density of untreated algae, and can achieve the cultivation of algae at a culture density higher than the maximum value. The method of the present invention may include at least a step of culturing an algae in the presence of glutathione or a derivative thereof to a culture density higher than the maximum value of the culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof, and other conditions. The configuration of the steps and the like is not limited. Glutathione or a derivative thereof used in the method of the present invention has been described in the section “1. Composition according to the present invention”, and will not be described here.
本明細書において、本発明の方法が適用されて得られた藻類を本発明の藻類という。本発明の藻類は、未処理の藻類の培養密度の最大値よりも高い培養密度での培養されている。したがって、本発明の藻類は、通常推奨される条件で培養された場合よりも高い培養密度での培養が可能であることから、培養密度を測定することにより、本発明の方法が適用されていない方法で得られた藻類と明確に区別することができる。また、遺伝子発現解析や代謝物解析の結果に基づいて、本発明の藻類を、本発明の方法が適用されていない方法で得られた藻類と明確に区別することができる。 In this specification, the algae obtained by applying the method of the present invention are referred to as the algae of the present invention. The algae of the present invention have been cultured at a density higher than the maximum density of untreated algae. Therefore, since the algae of the present invention can be cultured at a higher culture density than when cultured under generally recommended conditions, the method of the present invention is not applied by measuring the culture density. It can be clearly distinguished from algae obtained by the method. Also, based on the results of gene expression analysis and metabolite analysis, the algae of the present invention can be clearly distinguished from algae obtained by a method to which the method of the present invention has not been applied.
なお、本発明の藻類は、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで培養された藻類を回収することによって得られる。すなわち、本発明の方法は、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで培養された藻類を回収する工程をさらに包含してもよい。 The algae of the present invention can be obtained by collecting algae cultured to a culture density higher than the maximum culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof. That is, the method of the present invention may further include a step of collecting algae cultured to a culture density higher than the maximum culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof.
本発明に係る方法は、藻類の培養密度を測定する工程を含んでもよい。この場合、藻類の培養密度を測定する方法としては特に限定されないが、例えば、単位培養液量あたりの藻類の細胞数を計測する方法、単位培養液量あたりの藻類の細胞体積を計測する方法、単位培養液量あたりの藻類の細胞重量を計測する方法、等を挙げることが出来る。 The method according to the present invention may include a step of measuring the culture density of the algae. In this case, the method for measuring the culture density of the algae is not particularly limited, for example, a method for measuring the number of algae cells per unit culture solution amount, a method for measuring the algal cell volume per unit culture solution amount, A method of measuring the cell weight of algae per unit culture volume can be used.
本発明の方法では、藻類が、グルタチオンまたはその誘導体を常に吸収し得る条件で提供されてもよいし、培養期間を通して、間欠的にグルタチオンまたはその誘導体を吸収し得る条件で提供されてもよい。 In the method of the present invention, the algae may be provided under conditions capable of constantly absorbing glutathione or a derivative thereof, or may be provided under conditions capable of intermittently absorbing glutathione or a derivative thereof throughout the culture period.
間欠的にグルタチオンまたはその誘導体が提供されることにより、グルタチオンまたはその誘導体の使用量を低減させることができる。それゆえ、藻類の培養コストを低減することができる。なお、間欠的にグルタチオンまたはその誘導体が提供される場合、一定の間隔で提供されることが好ましいが、これに限定されず、不定の間隔で提供されてもよい。 By providing glutathione or a derivative thereof intermittently, the amount of glutathione or a derivative thereof can be reduced. Therefore, the cost of culturing algae can be reduced. When glutathione or a derivative thereof is provided intermittently, it is preferably provided at regular intervals, but is not limited thereto, and may be provided at irregular intervals.
また、グルタチオンまたはその誘導体が提供される間隔は特に限定されず、提供されるグルタチオンまたはその誘導体の濃度、投与対象となる藻類、及びグルタチオンまたはその誘導体が提供される時期等に応じて決定すればよい。 The interval at which glutathione or a derivative thereof is provided is not particularly limited, and may be determined according to the concentration of glutathione or a derivative thereof provided, algae to be administered, and the timing at which glutathione or a derivative thereof is provided. Good.
このように、本発明は、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類をグルタチオンまたはその誘導体の存在下で培養する工程を包含する、藻類の培養密度を向上させるための方法を提供する。すなわち、本発明は、藻類の培養密度を向上させるためのグルタチオンまたはその誘導体または上記組成物の使用を提供するといえる。 Thus, the present invention provides an algal culture density that includes the step of culturing an algae in the presence of glutathione or a derivative thereof to a culture density higher than the maximum value of the culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof. Provide a way to improve. That is, it can be said that the present invention provides use of glutathione or a derivative thereof or the above-mentioned composition for improving the culture density of algae.
〔３．本発明に係るバイオマスの製造方法〕
本発明は、バイオマスの製造方法を提供する。本発明に係るバイオマスの製造方法は（以下、「本発明の製造方法」と称する。）、本発明の組成物を含む培養液中で培養された藻類（本発明の組成物が適用された藻類）を用いてバイオマスを製造する方法である。
[3. Method for producing biomass according to the present invention)
The present invention provides a method for producing biomass. The method for producing biomass according to the present invention (hereinafter referred to as “the method for producing the present invention”) includes algae cultured in a culture solution containing the composition of the present invention (algae to which the composition of the present invention is applied). ) Is used to produce biomass.
本明細書において、上記「バイオマス」とは、光合成による炭素固定によって産生される物質を含む藻類による生産物、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂、色素（例えば、カロテノイド）等を意図し、「藻類バイオマス」とも言い換えられる。 In the present specification, the term "biomass" means a product by algae including a substance produced by carbon fixation by photosynthesis, for example, sugars (for example, starch), oils and fats, pigments (for example, carotenoids), It is also called "algal biomass".
本発明の製造方法では、藻類の細胞内において藻類バイオマスの生産または蓄積を誘導する手法は、特に限定されない。例えば、本発明の製造方法では、藻類の細胞内における藻類バイオマスの生産または蓄積を誘導するために上記藻類に対して光を照射する、光照射工程を含んでいてもよい。 In the production method of the present invention, a method for inducing the production or accumulation of algal biomass in algal cells is not particularly limited. For example, the production method of the present invention may include a light irradiation step of irradiating the algae with light to induce production or accumulation of algal biomass in the cells of the algae.
通常、藻類の細胞内への藻類バイオマスの蓄積を誘導するためには、窒素飢餓条件下にすることが必要であり、かつ、藻類バイオマスの著しい蓄積を促すためには２００μＥ／ｍ２／秒以上の光量の光を照射することが必要である。本発明の製造方法では、特に光量を調節せずとも藻類バイオマスの蓄積を誘導することが可能であるが、好ましくは藻類に対して、１０００μＥ／ｍ２／秒以下、より好ましくは５００μＥ／ｍ２／秒以下、さらに好ましくは４００μＥ／ｍ２／秒以下、３００μＥ／ｍ２／秒以下、２００μＥ／ｍ２／秒以下、１５０μＥ／ｍ２／秒以下、１００μＥ／ｍ２／秒以下、８０μＥ／ｍ２／秒以下の光量の光を照射することが好ましい。本発明に係る藻類は、未処理の藻類に比べて少ない光量でも、細胞内にて藻類バイオマスを産生させることができる点で優れる。なお、照射する光量の下限は特に限定されないが、例えば、４０μＥ／ｍ２／秒以上が現実的に設定できる。 Usually, in order to induce the accumulation of algal biomass in the cells of algae, it is necessary to carry out nitrogen starvation conditions, and to promote remarkable accumulation of algal biomass, 200 μE / m 2 / sec or more is required. It is necessary to irradiate an amount of light. In the production method of the present invention, it is possible to induce the accumulation of algal biomass without adjusting the amount of light. However, the algal biomass is preferably not more than 1000 μE / m 2 / sec, more preferably 500 μE / m 2. / Sec or less, more preferably 400 μE / m 2 / sec or less, 300 μE / m 2 / sec or less, 200 μE / m 2 / sec or less, 150 μE / m 2 / sec or less, 100 μE / m 2 / sec or less, 80 μE / m or less It is preferable to irradiate light with a light amount of 2 / sec or less. The algae according to the present invention are excellent in that algal biomass can be produced in cells with a smaller amount of light than untreated algae. The lower limit of the amount of light to be irradiated is not particularly limited, but for example, 40 μE / m 2 / sec or more can be set realistically.
上述した範囲の光を照射するための光照射装置として、特別な光照射装置を必要としない。例えば、太陽光；太陽光を鏡、光ファイバー、フィルター、メッシュ等で質的および量的に調節を加えた光；白熱灯、蛍光灯、水銀ランプ、発光ダイオード等の人工光を用いることができる。また、照射する光は、一般的な藻類の光合成に好適な波長域の光を用いることができ、例えば、４００ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましい。 No special light irradiation device is required as a light irradiation device for irradiating light in the above-described range. For example, sunlight; light obtained by qualitatively and quantitatively controlling sunlight with a mirror, an optical fiber, a filter, a mesh, or the like; artificial light such as an incandescent lamp, a fluorescent lamp, a mercury lamp, or a light-emitting diode can be used. The light to be irradiated may be light in a wavelength range suitable for general photosynthesis of algae, and is preferably, for example, 400 nm to 700 nm.
上記光照射工程は、窒素飢餓条件下において行ってもよい。上記「窒素飢餓条件」とは、無機態窒素の含有量が窒素原子換算で０．００１重量％より少ない培養液中で培養することをいう。特に限定されないが、光照射工程を窒素飢餓条件下において行う場合は、窒素を含有していない培養液として、例えば、標準のＴＡＰ培地から窒素源を除いたＴＡＰ Ｎ−ｆｒｅｅ培地を好適に用いることができる。一実施形態において、本発明の組成物が適用された藻類を、窒素飢餓条件下（ＴＡＰ Ｎ−ｆｒｅｅ培地中）で培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。 The light irradiation step may be performed under nitrogen starvation conditions. The “nitrogen starvation condition” refers to culturing in a culture solution in which the content of inorganic nitrogen is less than 0.001% by weight in terms of nitrogen atoms. Although not particularly limited, when the light irradiation step is performed under nitrogen-starved conditions, for example, a TAP N-free medium obtained by removing a nitrogen source from a standard TAP medium is preferably used as a nitrogen-free culture medium. Can be. In one embodiment, the accumulation of starch into cells can be induced by culturing the algae to which the composition of the present invention has been applied under nitrogen starvation conditions (in TAP N-free medium).
また、光照射工程は、独立栄養条件下において行ってもよい。ここで、上記「独立栄養条件」とは、二酸化炭素以外に炭素源を供給しないで培養する条件をいう。具体的には、例えば、本発明の組成物が適用された藻類を、ＨＳＭ培養液中で、大気を送気しつつ光照射する方法によって培養することによって、光照射工程を独立栄養条件下において行うことができる。なお、二酸化炭素の供給源としては、大気に限定されず、火力発電所や製鉄所等の煙道中に含まれる二酸化炭素を活用して、大気より高い濃度で二酸化炭素を培地へ送り込み、生産性を高めることも可能である。 The light irradiation step may be performed under autotrophic conditions. Here, the “autotrophic condition” refers to a condition for culturing without supplying a carbon source other than carbon dioxide. Specifically, for example, by culturing the algae to which the composition of the present invention has been applied in a HSM culture solution by irradiating light while feeding air, the light irradiation step can be performed under autotrophic conditions. It can be carried out. The supply source of carbon dioxide is not limited to the atmosphere, and it uses carbon dioxide contained in flues of thermal power plants and steel mills to send carbon dioxide at a higher concentration than the atmosphere to the culture medium, thereby improving productivity. Can also be increased.
独立栄養条件下では、培養容器の底部付近から、二酸化炭素または二酸化炭素を含む気体を送る（通気する）。二酸化炭素の水中での拡散速度は、大気中と比べて極度に遅い。それゆえ、培地を攪拌することが望ましい。培地を攪拌することによって、藻類に対して光をムラ無く照射することも可能となる。二酸化炭素は水中で陰イオンとなるため、培地の緩衝能が弱いと、通気により培地が酸性側に傾き、二酸化炭素の溶解度が低下し、光合成に利用されにくくなる。それゆえ、培地にはｐＨが中性付近またはアルカリ性側に保たれる緩衝能があることが好ましい。かかる培地としては、従来公知のＨＳＭ培地等が好ましく例示される。 Under autotrophic conditions, carbon dioxide or a gas containing carbon dioxide is sent (vented) from near the bottom of the culture vessel. The diffusion rate of carbon dioxide in water is extremely slow as compared to that in the atmosphere. Therefore, it is desirable to stir the medium. By stirring the medium, it is possible to irradiate the algae with light evenly. Since carbon dioxide becomes an anion in water, if the buffering capacity of the medium is weak, the medium is inclined to the acidic side by aeration, the solubility of carbon dioxide is reduced, and the carbon dioxide is hardly used for photosynthesis. Therefore, it is preferable that the medium has a buffering capacity that keeps the pH near neutral or alkaline. As such a medium, a conventionally known HSM medium and the like are preferably exemplified.
一実施形態において、本発明の製造方法は、本発明の方法が適用されて得られた藻類（本発明の藻類）が用いられ、この場合、本実施形態の製造方法は、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで藻類を本発明の組成物の存在下で培養する工程を包含し、グルタチオンまたはその誘導体の非存在下における培養密度の最大値よりも高い培養密度まで培養された藻類を回収する工程および回収した藻類から藻類バイオマスを回収する工程をさらに包含することが好ましい。なお、本発明の藻類については、「２．本発明に係る方法」の項で説明したので、ここでは省略する。 In one embodiment, the production method of the present invention uses an algae obtained by applying the method of the present invention (algae of the present invention). In this case, the production method of the present embodiment uses glutathione or a derivative thereof. Culturing the algae in the presence of the composition of the present invention to a culture density higher than the maximum of the culture density in the absence of the composition, wherein the algal density is higher than the maximum of the culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof. It is preferable that the method further includes a step of collecting algae cultured to a culture density and a step of collecting algal biomass from the collected algae. The algae of the present invention have been described in the section of “2. Method according to the present invention”, and will not be described here.
本発明の製造方法は、本発明の組成物が適用された藻類または本発明の藻類を用いてバイオマスの製造を行うので、藻類バイオマスの蓄積の誘導および藻類バイオマスの回収の両方を、従来技術と比較して、容易に、効率よく行うことができる。それゆえ、本発明の製造方法によれば、従来よりも安価にて、バイオマスを藻類から効率よく製造することできる。 The production method of the present invention performs biomass production using the algae to which the composition of the present invention is applied or the algae of the present invention. In comparison with this, it can be performed easily and efficiently. Therefore, according to the production method of the present invention, biomass can be efficiently produced from algae at a lower cost than before.
このように、本発明は、グルタチオンもしくはその誘導体または上記組成物を含む培養液中で培養された藻類を用いる、バイオマスの製造方法を提供する。すなわち、本発明は、このような製造方法を実行するための、グルタチオンもしくはその誘導体または上記組成物と、バイオマスの製造に用いる藻類とを備えた、バイオマスを製造するためのキットを提供するといえる。また、本発明は、バイオマスを製造するためのグルタチオンもしくはその誘導体または上記組成物あるいは上記キットの使用を提供するといえる。 Thus, the present invention provides a method for producing biomass using algae cultured in a culture solution containing glutathione or a derivative thereof or the above composition. That is, it can be said that the present invention provides a kit for producing biomass, which comprises glutathione or a derivative thereof or the above-mentioned composition, and an algae used for producing biomass, for performing such a production method. It can also be said that the present invention provides use of glutathione or a derivative thereof, or the above composition or the above kit, for producing biomass.
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されず、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されず、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Hereinafter, examples will be shown, and embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following embodiments, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various changes can be made within the scope shown in the claims. The technical aspects of the present invention also relate to embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means. Included in the target range.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
〔実施例１〕
クラミドモナス・ラインハルディＣＣ５０３株（クラミドモナスセンター、米国、デューク大学より分譲を受けた）を、ｐＨ７のトリス−酢酸−リン酸培地（ＴＡＰ培地；ＮＨ４Ｃｌ（４００ｍｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（５６ｍｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０８ｍｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（５０ｍｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２２ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（１１．４ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（５．１ｍｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．６ｍｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１．６ｍｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（１．１ｍｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２−ＥＤＴＡ（２Ｈ２Ｏ）（５０ｍｇ／Ｌ）、Ｔｒｉｓ（２４２０ｍｇ／Ｌ）、ＫＯＨ（１６ｍｇ／Ｌ）； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54, 1665-1669参照）を用いて、２４℃、１７μＥ／ｍ２／秒の条件下で５日間培養した。この培養物１５ｍＬより集めた細胞を、０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭ 還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含むＴＡＰ培地６０ｍＬに再懸濁した。この懸濁液を、２４℃、１００μＥ／ｍ２／秒の条件下で６〜１４日間培養し、時間経過に伴う細胞（粒子）密度の変化を測定した。
[Example 1]
Chlamydomonas line Hull di CC503 strain (Chlamydomonas Center, United States, underwent from sale Duke University), pH 7 Tris - acetate - phosphate medium (TAP medium; NH 4 Cl (400mg / L ), KH 2 PO 4 (56mg / L), K 2 HPO 4 (108mg / L), MgSO 4 · 7H 2 O (100mg / L), CaCl 2 · 2H 2 O (50mg / L), ZnSO 4 · 7H 2 O (22mg / L), H 3 BO 3 (11.4mg / L ), MnCl 2 · 4H 2 O (5.1mg / L), CoCl 2 · 6H 2 O (1.6mg / L), CuSO4 · 5H 2 O (1.6mg / L), (NH 4) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O (1.1mg / L), FeSO 4 · 7H 2 O (5mg / L), Na 2 -EDTA (2H 2 O) ( 0mg / L), Tris (2420mg / L), KOH (16mg / L);.... Proc Natl Acad Sci USA, 54, using a reference 1665-1669), 24 ℃, the 17μE / m 2 / sec The cells were cultured under the conditions for 5 days. Cells collected from 15 mL of this culture were resuspended in 60 mL of TAP medium containing 0 mM, 1 mM, 5 mM, or 10 mM reduced glutathione (GSH). This suspension was cultured for 6 to 14 days under the conditions of 24 ° C. and 100 μE / m 2 / sec, and the change in cell (particle) density with time was measured.
試料の状態（細胞数（細胞密度））を詳細に解析するために、フローサイトメトリーを使用した。具体的には、各試料に４８８ｎｍの励起光を照射し、６００ｎｍ付近の蛍光強度を測定した。かかる６００ｎｍ付近の蛍光は、クロロフィルの蛍光に相当する。細胞の密度を測定するための内部標準として、ベックマン・コールター製の蛍光性微粒子（商品名：Flow count）を共存させ、４８８ｎｍの励起光により発する５２５ｎｍ〜７００ｎｍの蛍光を、クロロフィルの上記蛍光と同時に測定した。結果を図１に示す。 Flow cytometry was used to analyze the state of the sample (cell number (cell density)) in detail. Specifically, each sample was irradiated with 488 nm excitation light, and the fluorescence intensity around 600 nm was measured. Such fluorescence near 600 nm corresponds to the fluorescence of chlorophyll. As an internal standard for measuring the cell density, fluorescent fine particles (trade name: Flow count) manufactured by Beckman Coulter are coexistent, and the fluorescence of 525 nm to 700 nm emitted by the excitation light of 488 nm is simultaneously emitted with the fluorescence of chlorophyll. It was measured. The results are shown in FIG.
示されるように、１ｍＭ ＧＳＨの存在下において、培養初期の増殖速度が向上していることがわかった。また、１ｍＭ ＧＳＨの存在下で１４日間培養することによって、細胞密度が未処理区（０ｍＭ ＧＳＨ）よりも約３０％向上することがわかった。さらに、５ｍＭ ＧＳＨの存在下では、培養初期の立ち上がりが遅れるものの、１４日間培養することによって細胞密度が約３０％向上することがわかった。また、５ｍＭ ＧＳＨの存在下での立ち上がりは、未処理区の細胞密度が最大値に達するまで抑えられており、その後の増殖速度は、１ｍＭ ＧＳＨの存在下での対数増殖期の増殖速度よりも向上していた。なお、１０ｍＭ ＧＳＨの存在下では、培養期間にわたって増殖がほとんど見られなかった（結果は示さず）。 As shown, it was found that in the presence of 1 mM GSH, the growth rate at the initial stage of culture was improved. It was also found that culturing for 14 days in the presence of 1 mM GSH improved the cell density by about 30% compared to the untreated group (0 mM GSH). Further, it was found that in the presence of 5 mM GSH, the cell density was improved by about 30% by culturing for 14 days, although the rise of the initial stage of the culture was delayed. The rise in the presence of 5 mM GSH was suppressed until the cell density in the untreated group reached the maximum value, and the growth rate thereafter was lower than that in the logarithmic growth phase in the presence of 1 mM GSH. Had improved. In the presence of 10 mM GSH, almost no proliferation was observed over the culture period (results not shown).
〔実施例２〕
ＣＣ５０３株を、ｐＨ７のＴＡＰ培地を用いて、２４℃、１７μＥ／ｍ２／秒の条件下で４日間培養した。この培養物４５ｍＬより集めた細胞を、０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭ ＧＳＨを含むＴＡＰ培地６０ｍＬに再懸濁した。この懸濁液を、２４℃、１００μＥ／ｍ２／秒の条件下で６〜１４日間培養し、時間経過に伴う細胞（粒子）密度の変化を測定した。結果を図２に示す。
[Example 2]
The CC503 strain was cultured in a TAP medium at pH 7 at 24 ° C. under the conditions of 17 μE / m 2 / sec for 4 days. Cells collected from 45 mL of this culture were resuspended in 60 mL of TAP medium containing 0 mM, 1 mM, 5 mM or 10 mM GSH. This suspension was cultured for 6 to 14 days under the conditions of 24 ° C. and 100 μE / m 2 / sec, and the change in cell (particle) density with time was measured. FIG. 2 shows the results.
示されるように、１ｍＭ ＧＳＨの存在下において、培養初期の増殖速度が向上していることがわかった。また、１ｍＭ ＧＳＨの存在下で６日間培養することによって、細胞密度が未処理区（０ｍＭ ＧＳＨ）よりも約２５％向上することがわかった。さらに、５ｍＭ ＧＳＨの存在下では、培養初期に細胞密度が低下するものの、６日間培養することによって細胞密度が未処理区（０ｍＭ ＧＳＨ）よりも向上していた。また、５ｍＭ ＧＳＨの存在下での細胞密度の上昇は、未処理区の細胞密度が最大値に達するまで抑えられており、その後の増殖速度は、１ｍＭ ＧＳＨの存在下での対数増殖期の増殖速度よりも向上していた。なお、１０ｍＭ ＧＳＨの存在下では、培養期間にわたって増殖がほとんど見られなかった（結果は示さず）。 As shown, it was found that in the presence of 1 mM GSH, the growth rate at the initial stage of culture was improved. In addition, it was found that by culturing in the presence of 1 mM GSH for 6 days, the cell density was improved by about 25% as compared with the untreated group (0 mM GSH). In addition, in the presence of 5 mM GSH, although the cell density decreased in the initial stage of the culture, the cell density was improved by culturing for 6 days as compared with the untreated group (0 mM GSH). The increase in cell density in the presence of 5 mM GSH was suppressed until the cell density in the untreated section reached the maximum value, and the growth rate thereafter was increased in the logarithmic growth phase in the presence of 1 mM GSH. Speed was better than. In the presence of 10 mM GSH, almost no proliferation was observed over the culture period (results not shown).
このように、本発明の組成物で藻類を処理した場合、未処理の藻類の培養密度の最大値よりも高い培養密度まで培養することができる。また、本発明の組成物は、藻類の対数増殖期の増殖速度を向上させることができる。すなわち、本発明の組成物を用いれば、藻類の培養密度および増殖のタイミングを適宜調整することができる。 As described above, when algae are treated with the composition of the present invention, the algae can be cultured to a culture density higher than the maximum culture density of the untreated algae. In addition, the composition of the present invention can improve the growth rate of algae in the logarithmic growth phase. That is, by using the composition of the present invention, the culture density and the timing of proliferation of algae can be appropriately adjusted.
〔実施例３〕
次に、緑藻であるHaematococcus（ヘマトコッカス）に対する、グルタチオン添加効果を確認した。ヘマトコッカスはアスタキサンチン等のカロテノイドを細胞内に蓄積することが知られている。
[Example 3]
Next, the effect of adding glutathione to Haematococcus, a green alga, was confirmed. Hematococcus is known to accumulate carotenoids such as astaxanthin in cells.
国立環境研究所より分譲を受けたHaematococcus NIES-144株を、細胞密度が２．１８×１０５細胞／ｍＬとなるまで培養した（前培養）。これを、最終濃度２５０μＭのＧＳＨを含む２×ダイゴＩＭＫ液体培地に、細胞密度が０．９１×１０４細胞／ｍＬとなるように接種した。対照実験として、同様に前培養した細胞を、ＧＳＨを含まない２×ダイゴＩＭＫ液体培地に接種した。２×ダイゴＩＭＫ液体培地は、海産微細藻類培養用として日本製薬（株）によって製造され、和光純薬工業（株）よって販売されている粉末状の培地成分の混合物を、推奨される標準的な濃度の２倍となるように精製水に溶解し、孔径が０．４μｍ以下であるフィルターを用いてろ過滅菌したものである。培養は、２２℃において、日周期（明期/暗期を１２時間ずつ、明期の光量が２０μＥ／ｍ２／ｓ）を与える条件で行った。培養物は、細胞の沈降を防ぐ目的で毎日１５分間だけ振とうした以外は、静置した。 The Haematococcus NIES-144 strain obtained from the National Institute for Environmental Studies was cultured until the cell density reached 2.18 × 10 5 cells / mL (preculture). This was inoculated into a 2 × Daigo IMK liquid medium containing GSH at a final concentration of 250 μM so that the cell density was 0.91 × 10 4 cells / mL. As a control experiment, similarly pre-cultured cells were inoculated into 2 × Daigo IMK liquid medium without GSH. 2 × Daigo IMK liquid medium is manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. for culturing marine microalgae, and is a mixture of powdered medium components sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. It is dissolved in purified water so as to have a concentration twice as high and sterilized by filtration using a filter having a pore size of 0.4 μm or less. The cultivation was performed at 22 ° C. under the condition of giving a circadian cycle (light period / dark period each 12 hours, light period light intensity 20 μE / m 2 / s). The culture was allowed to stand except for shaking for only 15 minutes daily to prevent sedimentation of the cells.
培養開始から５５日後に、培養物１ｍＬから細胞を遠心分離によって回収し、５０μＬとなるように細胞を再懸濁し、細胞の密度および粒径を測定した。この測定には、バイオラッド社製セルカウンターＴＣ−２０を使用した。また、同じ培養物を顕微鏡下での観察に供した。 55 days after the start of the culture, cells were collected from 1 mL of the culture by centrifugation, the cells were resuspended to 50 μL, and the cell density and particle size were measured. For this measurement, a cell counter TC-20 manufactured by Bio-Rad was used. The same culture was used for observation under a microscope.
細胞の粒径のヒストグラムを使用して、細胞が真球であるとの仮定の下に総細胞体積を算出した。結果を表１に示す。培養液当たりの総細胞体積は、ＧＳＨ無添加条件（対照区）が７４２．６（μｍ３／ｍＬ）であったのに対して、ＧＳＨを添加した場合には２１８４．９３（μｍ３／ｍＬ）となっていた。このように、ＧＳＨ添加によって総細胞体積が上昇し、細胞密度が上昇していることがわかった。 Using a histogram of cell size, the total cell volume was calculated assuming that the cells were spherical. Table 1 shows the results. Total cell volume per culture, whereas GSH absence of addition (control) was 742.6 (μm 3 / mL), 2184.93 in case of adding GSH ([mu] m 3 / mL ). Thus, it was found that the addition of GSH increased the total cell volume and the cell density.
また、培養物を顕微鏡下にて観察したところ、細胞内に赤色色素（アスタキサンチン）が蓄積していることがわかった（図３）。図中の格子の間隔は５０μｍである。また、顕微鏡画像を取得し、画像解析ソフト（Image J）を用いて、赤みの定量を行った。画像のＲＧＢの各チャンネルをスプリットし、ＲＥＤチャンネルからグレースケール画像を得た。画像の白黒を反転させた後、細胞の画像面積内のグレー値の平均を算出し、同時に細胞の画像面積の算出を行った。得られたＲＥＤチャンネルの値に細胞の画像面積を乗じ、アスタキサンチンの生産量を見積もった。数値が大きいほど細胞の赤みが濃いことをあらわす。２５０μＭ/ｍＬのＧＳＨ添加によってアスタキサンチンの生産量が上昇していることが分かった（表２）。 When the culture was observed under a microscope, it was found that red pigment (astaxanthin) had accumulated in the cells (FIG. 3). The grid spacing in the figure is 50 μm. In addition, a microscope image was obtained, and redness was quantified using image analysis software (Image J). The RGB channels of the image were split, and a grayscale image was obtained from the RED channel. After inverting the black and white of the image, the average of the gray values within the image area of the cell was calculated, and at the same time, the image area of the cell was calculated. The amount of astaxanthin produced was estimated by multiplying the obtained RED channel value by the cell image area. The higher the value, the deeper the redness of the cell. It was found that the addition of 250 μM / mL of GSH increased astaxanthin production (Table 2).
〔実施例４〕
上述した以外の藻類であってもグルタチオンの添加によってバイオマスの生産性が向上することを確認した。具体的には、クラミドモナス以外の藻類として、Scenedesmus（セネデスムス）を用いた。
[Example 4]
It was confirmed that the addition of glutathione improves the productivity of biomass even for algae other than those described above. Specifically, Scenedesmus (Senedesmus) was used as an algae other than Chlamydomonas.
セネデスムスＮＩＥＳ−２２７２株（国立環境研究所より分譲）を、公知のＴＡＰ液体培地へ播種し、１０μＥ／ｍ２／秒の連続光下で振とう培養し、定常期に達した段階で細胞を遠心分離法により回収した（前培養）。次いで、この回収した細胞を、最終濃度が５００μＭ、１００μＭ、１μＭとなるように還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を添加した、公知のＹＰＤ液体培地へ、細胞密度が４．０×１０４細胞／ｍＬになるように再懸濁し、マグネティックスターラーで撹拌しながら暗所にて培養した。培養温度を３０℃とした。 Senedesmus NIES-2272 strain (available from the National Institute for Environmental Studies) was inoculated into a known TAP liquid medium, cultured with shaking under continuous light of 10 μE / m 2 / s, and the cells were centrifuged at the stage of reaching the stationary phase. The cells were collected by a separation method (preculture). Next, the collected cells were transferred to a known YPD liquid medium to which reduced glutathione (GSH) was added to a final concentration of 500 μM, 100 μM, and 1 μM to a cell density of 4.0 × 10 4 cells / mL. Then, the cells were resuspended and cultured in a dark place while stirring with a magnetic stirrer. The culture temperature was 30 ° C.
コントロールとして、ＧＳＨを添加していないＹＰＤ液体培地を用いて同様に培養した。培養開始７２時間後の培養液の一部から細胞を回収し、デンプンの定量試験に供した。試料の状態（細胞数（細胞密度））を詳細に解析するために、フローサイトメトリーを実施した。具体的には、それぞれの試料に４８８ｎｍの励起光を照射し、６００ｎｍ付近の蛍光強度を測定した。かかる６００ｎｍ付近の蛍光は、クロロフィルの蛍光に相当する。細胞の密度を測定するための内部標準として、ベックマン・コールター製の蛍光性微粒子（商品名：Flow count）を共存させ、４８８ｎｍの励起光により発する５２５ｎｍ〜７００ｎｍの蛍光を、クロロフィルの蛍光と同時に測定した。回収したデンプン粒に対してアミログルカナーゼ処理を行い、さらにグルコーステストワコー（和光純薬工業社製）を使用して培養液あたりのデンプンの定量を行った。結果を図４に示す。 As a control, the same culture was performed using a YPD liquid medium to which GSH was not added. Cells were collected from a part of the culture solution 72 hours after the start of the culture, and subjected to a starch quantitative test. In order to analyze the state of the sample (cell number (cell density)) in detail, flow cytometry was performed. Specifically, each sample was irradiated with 488 nm excitation light, and the fluorescence intensity around 600 nm was measured. Such fluorescence near 600 nm corresponds to the fluorescence of chlorophyll. As an internal standard for measuring cell density, fluorescent microparticles (trade name: Flow count) manufactured by Beckman Coulter are coexistent, and 525-700 nm fluorescence emitted by 488 nm excitation light is measured simultaneously with chlorophyll fluorescence. did. The collected starch granules were subjected to amyloglucanase treatment, and the amount of starch per culture solution was quantified using Glucose Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). FIG. 4 shows the results.
図４の（ａ）は、セネデスムスを暗所で７２時間培養したときの細胞数（細胞密度）を示し、図４の（ｂ）は、セネデスムスを暗所で７２時間培養したときの培養液あたりのデンプン生産量を示す。培養開始から７２時間後において、グルタチオン施用区（５００μＭ ＧＳＨ、１００μＭ ＧＳＨ、１μＭ ＧＳＨ）でのセネデスムスの細胞数（細胞密度）が、対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ）を比較して向上していることがわかった（図４の（ａ））。また、培養液あたりのデンプン生産量も、対照区（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて向上していることがわかった（図４の（ｂ））。 FIG. 4 (a) shows the number of cells (cell density) when Senedesmus was cultured in the dark for 72 hours, and FIG. 4 (b) shows the number of cells per culture when Senedesmus was cultured in the dark for 72 hours. Shows the starch production. 72 hours after the start of the culture, it was found that the number of cells (cell density) of Senedesmus in the glutathione-applied section (500 μM GSH, 100 μM GSH, 1 μM GSH) was improved as compared to the control section (control). ((A) of FIG. 4). In addition, it was found that the amount of starch production per culture solution was improved as compared with the control (control) (FIG. 4 (b)).
なお、本実施例では、セネデスムスを暗黒条件下で培養しており、これは従属栄養条件（有機物を栄養源としかつ光を照射しない条件下での培養）での培養である。すなわち、本発明によるバイオマス生産性の向上には、光合成を必ずしも必要としないことが明らかとなった。 In this example, Senedesmus is cultured under dark conditions, which is culture under heterotrophic conditions (culture under the condition that organic matter is used as a nutrient source and light is not irradiated). That is, it has been clarified that photosynthesis is not necessarily required for improving biomass productivity according to the present invention.
本発明によれば、従来よりも安価に、バイオマスを藻類から効率よく製造することができる。バイオマスは、バイオ燃料の原料として利用が期待されている。このため、本発明は、エネルギー産業等の広範な産業において利用可能性がある。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, biomass can be efficiently manufactured from algae at lower cost than before. Biomass is expected to be used as a raw material for biofuels. For this reason, the present invention has applicability in a wide range of industries such as the energy industry.
Claims (4)
上記培養密度は単位体積あたりの培地または培養液における藻類の細胞体積である、組成物。 A composition for improving the culture density of algae, comprising glutathione or a derivative thereof ,
A composition wherein the culture density is the cell volume of algae in a medium or culture per unit volume .
上記培養密度は単位体積あたりの培地または培養液における藻類の細胞体積である、藻類の培養密度を向上させる方法。 Comprising culturing the algae in the presence of glutathione or a derivative thereof to a culture density higher than the maximum value of the culture density in the absence of glutathione or a derivative thereof ,
A method for improving the algal culture density, wherein the culture density is a cell volume of the alga in a medium or a culture solution per unit volume .
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