JP6624916B2 - Method for producing pigment stem cells - Google Patents
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Description
本発明は、多能性幹細胞から色素幹細胞を製造する方法、及び色素幹細胞からメラノサイトを製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing pigment stem cells from pluripotent stem cells and a method for producing melanocytes from pigment stem cells.
メラノサイトは、発生過程において神経堤に由来し、メラニンを産生する細胞である。メラノサイトは、皮膚においては表皮の基底層及び毛球に存在し、皮膚や毛髪にメラニンを供給する。メラノサイトによるメラニン合成が低下又は消失することや、メラノサイトが消失することにより、眼皮膚白皮症（アルビニズム）や尋常性白斑など、先天性又は後天性の色素異常症が発症することが知られている。しかし、メラノサイトは分化の過程や機能において、未知の部分が多い。 Melanocytes are cells that are derived from neural crest during development and produce melanin. Melanocytes are present in the basal layer of the epidermis and the hair bulb in the skin and supply melanin to the skin and hair. It is known that the melanin synthesis by melanocytes decreases or disappears, and that the melanocytes disappear, causing congenital or acquired pigmentary dysplasia such as ocular skin albinism (albinism) and vitiligo vulgaris. I have. However, melanocytes have many unknowns in the process and function of differentiation.
従ってメラノサイトは、眼皮膚白皮症や尋常性白斑などの色素異常症の病態解析若しくは治療法開発研究、又は化粧品開発などの分野で高いニーズがある。しかし、メラノサイトの単離培養には高度な技術を要し、また成人から単離されたメラノサイトでは増殖能が低いなどの問題がある。そのため、メラノサイトを単離及び培養維持する技術が求められている。 Therefore, melanocytes have a high need in the field of pathological analysis or treatment development research of pigmentation disorders such as ocular skin albinism and vitiligo vulgaris, and development of cosmetics. However, there is a problem that melanocytes isolated from adults require a high level of technology for isolation and cultivation, and the melanocytes isolated from adults have low proliferation ability. Therefore, there is a need for a technique for isolating and maintaining culture of melanocytes.
近年、Fzd4、Fzd7及びCD34をマーカータンパク質とすることで、C57BL/6マウスの皮膚組織から、メラノサイトに分化可能な幹細胞を分離する方法が報告された（特許文献１）。しかし、皮膚組織由来の幹細胞は、供給元に限りがあるため、大量調製の点で問題がある。またヒト生体内において、色素幹細胞が同定されたとの報告はなく、マウスと同じように皮膚組織から色素幹細胞を分離できるかについては、不明である。 In recent years, there has been reported a method of separating stem cells capable of differentiating into melanocytes from skin tissues of C57BL / 6 mice by using Fzd4, Fzd7 and CD34 as marker proteins (Patent Document 1). However, stem cells derived from skin tissue have a problem in terms of large-scale preparation because of a limited supply source. Further, there has been no report that pigment stem cells have been identified in a human body, and it is unknown whether pigment stem cells can be separated from skin tissue in the same manner as in mice.
一方で、人工多能性幹細胞（iPS細胞）や胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から、メラノサイトを製造する方法が報告されている（特許文献２、非特許文献１、２）。しかし、多能性幹細胞からメラノサイトを製造するには２０〜４０日程度の日数を要し、効率も低い。また多能性幹細胞から色素幹細胞に分化誘導する方法については、報告がされていない。 On the other hand, methods for producing melanocytes from pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) have been reported (Patent Document 2, Non-Patent Documents 1 and 2). . However, it takes about 20 to 40 days to produce melanocytes from pluripotent stem cells, and the efficiency is low. Further, there is no report on a method for inducing differentiation from pluripotent stem cells into pigment stem cells.
本発明は、多能性幹細胞から色素幹細胞を製造する方法を提供すること、及び多能性幹細から誘導可能な色素幹細胞を提供することを課題とする。また、色素幹細胞からメラノサイトを製造する方法を提供することも課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing pigment stem cells from pluripotent stem cells, and to provide pigment stem cells that can be derived from pluripotent stem cells. Another object is to provide a method for producing melanocytes from pigment stem cells.
本発明者らは、多能性幹細胞から胚様体を形成させ、胚様体をメラノサイトへの分化誘導をする条件下で一定期間培養し、その後分化誘導を中止してメラノサイト維持培養条件下で培養することで、メラノサイトへ分化可能な細胞を製造できることを発見した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。 The present inventors formed embryoid bodies from pluripotent stem cells, cultured the embryoid bodies for a certain period of time under conditions for inducing differentiation into melanocytes, and then stopped differentiation induction, and then under the conditions of melanocyte maintenance culture. It was discovered that cells capable of differentiating into melanocytes can be produced by culturing. The present inventors have conducted further studies based on these findings, and as a result, completed the present invention.
即ち、本発明は以下の通りのものである。
[１] 以下の(a)、(b)及び(c)の工程を含む、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法。
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程
[２] 工程(b)が、多能性幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニスト、幹細胞因子（SCF）、エンドセリン-3（ET-3）、cAMP誘導剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含有する培地中で培養することにより行われる、[１]に記載の方法。
[３] 培地中にさらにBMP4を含有する、[２]に記載の方法。
[４] Wntシグナル経路アゴニストがCHIR99021又はWnt 3Aである、[２]又は[３]に記載の方法。
[５] 工程(b)の培養を２〜４週間行う、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６] 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７] 多能性幹細胞がヒト由来である、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８] [１]〜[７]のいずれかに記載の方法により得られる色素幹細胞。
[９] 下記の特徴(A)〜(H)を有する色素幹細胞。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Fzd4、Fzd7及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H) チロシナーゼの発現は有さない
[１０] [８]または[９]に記載の色素幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニストの存在下で培養する工程を含む、メラノサイトの製造方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for producing pigmented stem cells from pluripotent stem cells, comprising the following steps (a), (b) and (c).
(a) Step of forming embryoid bodies by suspension culture from pluripotent stem cells
(b) culturing the cells obtained in step (a) under conditions that induce melanocyte differentiation until cells containing spindle-shaped, black-brown granules begin to appear.
(c) a step of culturing the cells obtained in step (b) under conditions for maintaining the melanocytes
[2] In the step (b), the pluripotent stem cells are treated with a Wnt signaling pathway agonist, stem cell factor (SCF), endothelin-3 (ET-3), a cAMP inducer and basic fibroblast growth factor (bFGF). The method according to [1], wherein the method is carried out by culturing in a medium containing the medium.
[3] The method according to [2], wherein the medium further contains BMP4.
[4] The method of [2] or [3], wherein the Wnt signaling pathway agonist is CHIR99021 or Wnt 3A.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the culturing in step (b) is performed for 2 to 4 weeks.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the pluripotent stem cells are ES cells or iPS cells.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the pluripotent stem cells are human.
[8] A pigment stem cell obtained by the method according to any one of [1] to [7].
[9] A pigment stem cell having the following characteristics (A) to (H).
(A) derived from pluripotent stem cells
(B) has the ability to differentiate into melanocytes
(C) Self-replicating ability
(D) expresses Fzd4, Fzd7 and CD34
(E) Cell morphology is round or polygonal, cytoplasm is abundant, and nucleus is located almost in the center
(F) Does not differentiate into keratinocytes even when cultured in the presence of keratinocyte growth factor
(G) Cryopreservable
(H) No tyrosinase expression
[10] A method for producing melanocytes, comprising a step of culturing the pigment stem cells according to [8] or [9] in the presence of a Wnt signaling pathway agonist.
本発明の色素幹細胞は、メラノサイトへと分化させる効率が非常に高く、活発な増殖力を有し、長期の継代培養や凍結解凍を繰り返して培養することが可能で、質的にも同様に安定して維持されるものである。この色素幹細胞を用いることで、メラノサイトを容易かつ安定に量的制限なく得ることができる。 The pigment stem cells of the present invention have a very high efficiency of differentiating into melanocytes, have a vigorous proliferative power, and can be repeatedly cultured by long-term subculture or freeze-thaw. It is maintained stably. By using the pigment stem cells, melanocytes can be easily and stably obtained without quantitative limitation.
本発明の色素幹細胞やメラノサイトは、眼皮膚白皮症、尋常性白斑、老人性色素斑などの色素異常症の病態解析に用いることができ、またこれらの色素異常症の治療用医薬品又は美白用化粧品の開発において、スクリーニングに用いることができる。 The pigment stem cells and melanocytes of the present invention can be used for the pathological analysis of dyschromia such as ocular skin albinism, vitiligo vulgaris, and senile pigment spots, and can also be used as a medicament or a whitening agent for treating these dyschromia. In the development of cosmetics, it can be used for screening.
特に、色素異常症の患者由来のヒトiPS細胞から製造した色素幹細胞は、メラノサイトの表現型についての病態解析や治療薬開発にとって有用である。iPS細胞の段階、又は色素幹細胞の段階で遺伝子操作を容易に行うことが可能であるため、このような色素幹細胞を製造する方法は、再生医療にとっても有用である。 In particular, pigment stem cells produced from human iPS cells derived from a patient with dyschromia are useful for analyzing the pathology of melanocyte phenotype and developing therapeutic agents. Since genetic manipulation can be easily performed at the iPS cell stage or the pigment stem cell stage, such a method for producing pigment stem cells is also useful for regenerative medicine.
本発明は、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法（以下、「本発明の製法」ともいう。）を提供する。本発明の製法は、以下の(a)ないし(c)の工程を含む。
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程
The present invention provides a method for producing pigmented stem cells from pluripotent stem cells (hereinafter, also referred to as “the production method of the present invention”). The production method of the present invention includes the following steps (a) to (c).
(a) Step of forming embryoid bodies by suspension culture from pluripotent stem cells
(b) culturing the cells obtained in step (a) under conditions that induce melanocyte differentiation until cells containing spindle-shaped, black-brown granules begin to appear
(c) a step of culturing the cells obtained in step (b) under conditions for maintaining the melanocytes
幹細胞とは、自己複製能と分化した細胞をつくる能力を併せもった細胞を意味する。
多能性幹細胞とは、in vitroで培養することが可能で、かつ三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、iPS細胞またはES細胞である。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能であり、人工多能性幹細胞の作製方法としては、例えばCell, 131(5): 861-872 (2007)やCell, 126(4): 663-676 (2006)に記載の方法が挙げられる。
Stem cells refer to cells that have both the ability to self-renew and the ability to produce differentiated cells.
Pluripotent stem cells refer to stem cells that can be cultured in vitro and have the ability to differentiate into three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm). Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic tumor cells (EC cells), and embryonic germ stem cells (EG cells). It is not limited to these. Preferably, they are iPS cells or ES cells. Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se, and as a method for producing induced pluripotent stem cells, for example, Cell, 131 (5): 861-872 (2007) and Cell, 126 (4 ): 663-676 (2006).
多能性幹細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類由来の細胞、及びヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の色素幹細胞やメラノサイトが、ヒトの色素異常症の病態解析又は治療法開発などの目的で用いられる場合には、ヒト由来の多能性幹細胞が好ましい。 Examples of pluripotent stem cells include, but are not limited to, cells derived from rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and cells derived from primates such as humans, monkeys, orangutans, and chimpanzees. When the pigment stem cells or melanocytes of the present invention are used for the purpose of analyzing the pathology of human pigment disorders or developing therapeutic methods, human-derived pluripotent stem cells are preferred.
本発明の色素幹細胞やメラノサイトがヒトの再生医療用途に用いられる場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人又はHLAの型が同一若しくは実質的に同一である他人由来のiPS細胞が好ましい。 When the pigment stem cells or melanocytes of the present invention are used for regenerative medicine in humans, iPS cells derived from the patient or others having the same or substantially the same type of HLA are used from the viewpoint that rejection does not occur. preferable.
多能性幹細胞としてiPS細胞を用いる場合には、iPS細胞は自体公知の方法により体細胞から製造してもよいし、既に樹立されているiPS細胞を用いてもよい。 When iPS cells are used as pluripotent stem cells, the iPS cells may be produced from somatic cells by a method known per se, or iPS cells already established may be used.
あるいは、多能性幹細胞は、ヒトの遺伝子疾患の原因となる突然変異、特に皮膚の遺伝子疾患の原因となる突然変異を有していてもよい。 Alternatively, the pluripotent stem cells may have a mutation that causes a human genetic disease, especially a mutation that causes a genetic disease of the skin.
本明細書において「色素幹細胞」とは、メラノサイトへ分化可能な幹細胞を意味し、以下の性質(A)〜(H)により特徴付けられる。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Frizzled-4(Fzd4)、Frizzled-7(Fzd7)及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない
As used herein, the term “pigment stem cell” means a stem cell that can be differentiated into melanocytes, and is characterized by the following properties (A) to (H).
(A) derived from pluripotent stem cells
(B) has the ability to differentiate into melanocytes
(C) Self-replicating ability
(D) expressing Frizzled-4 (Fzd4), Frizzled-7 (Fzd7) and CD34
(E) Cell morphology is round or polygonal, cytoplasm is abundant and nucleus is located almost in the center
(F) Does not differentiate into keratinocytes even when cultured in the presence of keratinocyte growth factor
(G) Cryopreservable
(H) No tyrosinase expression
メラノサイト（色素細胞やメラニン細胞とも呼ばれる）とは、チロシナーゼ活性があり、メラニンを産生する細胞であって、メラニン合成のための細胞内小器官（メラノソーム）を有する、形態学的には樹枝状の細胞でその樹状突起の形状は環境によって変化する細胞を意味する。 Melanocytes (also called pigment cells and melanocytes) are cells that have tyrosinase activity and produce melanin, have organelles (melanosomes) for melanin synthesis, and are morphologically dendritic. The shape of a dendrite in a cell means a cell that changes depending on the environment.
工程(a)の多能性幹細胞から胚様体を形成する工程は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、多能性幹細胞を、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)などの増殖因子を添加していない非接着培養皿上に播種して、浮遊培養する方法により行うことができるが、これに限定されない。これらの方法は、例えば上記特許文献２、非特許文献１などに開示されている。 The step of forming an embryoid body from the pluripotent stem cells in step (a) can be performed by a method known per se, for example, multiplying pluripotent stem cells with basic fibroblast growth factor (bFGF) or the like. The method can be performed by a method of inoculating a seed on a non-adhesive culture dish to which no factor is added and performing a suspension culture, but is not limited thereto. These methods are disclosed in, for example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 1 described above.
浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味する。本発明の浮遊培養に用いることができる培地として、例えば霊長類ES/iPS細胞用培地（REPROCELL社製）が挙げられるが、多能性幹細胞を培養することが可能な培地であれば、浮遊培養に用いることができる。 Suspension culture means culturing a target cell or cell mass without adhering it to the bottom of an incubator. Examples of a medium that can be used for the suspension culture of the present invention include a medium for primate ES / iPS cells (manufactured by REPROCELL). Can be used.
工程(a)で使用される培地としては、例えば、ダルベッコ改変最小必須培地（DMEM）、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが挙げらるが、これらに限定されない。多能性幹細胞の生存率を上昇させるため、Rho結合キナーゼ（ROCK）の阻害剤（例えば、Y-27632、Fasudil）又はミオシンの阻害剤（例えば、ブレビスタチン）を添加してもよい。 Examples of the medium used in step (a) include Dulbecco's Modified Minimum Essential Medium (DMEM), DMEM / F12 or DME culture medium (these culture mediums further include penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, Essential amino acids, β-mercaptoethanol, etc. can be included as appropriate.) Or a commercially available culture solution [eg, a culture solution for primate ES cell culture (a culture solution for primate ES / iPS cells, Reprocell), serum-free Medium (mTeSR, Stemcell Technology)] and the like, but are not limited thereto. To increase the viability of pluripotent stem cells, an inhibitor of Rho-linked kinase (ROCK) (eg, Y-27632, Fasudil) or an inhibitor of myosin (eg, blebbistatin) may be added.
培養開始時の多能性幹細胞の培地中の密度は、特に限定されないが、例えば約8000〜9000細胞/mlとすることができる。 The density of the pluripotent stem cells in the medium at the start of the culture is not particularly limited, but may be, for example, about 8000 to 9000 cells / ml.
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養は、胚様体が形成されるのに十分な期間行えばよいが、通常、約２週間程度で胚様体が形成される。 The culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. CO 2 concentration is preferably about 2-5%. The culture may be performed for a period of time sufficient to form an embryoid body, but usually, an embryoid body is formed in about two weeks.
工程（ｂ）の培養は、培養皿上に播種し、接着培養により行うことができる。基礎培地には、工程(a)と同様の培地を用いることができる。培養皿は、細胞接着因子等でコートされていてもよい（例えば、フィブロネクチンコート、ラミニンコート）。 The culture in the step (b) can be performed by seeding on a culture dish and performing adhesion culture. As the basal medium, the same medium as in step (a) can be used. The culture dish may be coated with a cell adhesion factor or the like (for example, fibronectin coat, laminin coat).
一実施態様において、工程(b)の培養は、胚様体を分散してフィブロネクチンでコートした培養皿に播種し、接着培養することで行うことができる。 In one embodiment, the culture in step (b) can be performed by dispersing the embryoid bodies, inoculating the culture dish coated with fibronectin, and performing adherent culture.
工程(b)のメラノサイトへの分化誘導は、自体公知の方法により行うことができ、例えばメラノサイトへの分化に必要な因子を胚様体に接触させることにより行うことができる。 The induction of differentiation into melanocytes in the step (b) can be performed by a method known per se, for example, by bringing a factor necessary for differentiation into melanocytes into contact with an embryoid body.
メラノサイトへの分化に必要な因子としては、Wntシグナル経路アゴニスト、幹細胞因子（SCF）、エンドセリン-3（ET-3)、cAMP誘導剤及び塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)などを挙げることができるが、これらに限定されない。好適なWntシグナル経路アゴニストとしては、Wntファミリーに属するタンパク質（例えば、Wnt 1、Wnt 3A、Wnt 7A）や、グリコーゲン合成酵素-3β（GSK-3β）の阻害剤であるCHIR99021、ケンパウロンなどが挙げられる。また、コレラ毒素のようにcAMPの合成を誘導する因子、又はdbcAMPのようにcAMPと同様の機能を有する因子などを、cAMP誘導剤として用いることができる。さらにBMPシグナル経路アゴニスト（例えばBMP2、BMP4、BMP7）を培地に添加してもよい。 Factors required for melanocyte differentiation include Wnt signaling pathway agonists, stem cell factor (SCF), endothelin-3 (ET-3), cAMP inducer, and basic fibroblast growth factor (bFGF). Can, but is not limited to. Suitable Wnt signaling pathway agonists include proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt 1, Wnt 3A, Wnt 7A), CHIR99021 which is an inhibitor of glycogen synthase-3β (GSK-3β), kenpaullone and the like. . In addition, a factor that induces cAMP synthesis, such as cholera toxin, or a factor that has the same function as cAMP, such as dbcAMP, can be used as a cAMP inducer. Further, a BMP signaling pathway agonist (eg, BMP2, BMP4, BMP7) may be added to the medium.
好適な実施態様において、工程(b)は、Wntシグナル経路アゴニスト、SCF、ET-3、cAMP誘導剤及びbFGFを含む培地中で胚様体を培養することにより行うことができる。 In a preferred embodiment, step (b) can be performed by culturing the embryoid body in a medium containing a Wnt signaling pathway agonist, SCF, ET-3, a cAMP inducer and bFGF.
別の好適な実施態様において、工程(b)は、CHIR99021、SCF、ET-3、BMP4、dbcAMP及びbFGFを含む培地中で胚様体を培養することにより行うことができる。 In another preferred embodiment, step (b) can be performed by culturing the embryoid body in a medium containing CHIR99021, SCF, ET-3, BMP4, dbcAMP and bFGF.
これらの因子の濃度は、組み合わせ等により変化する場合があるが、メラノサイトへの分化誘導可能な濃度であればよい。典型的には、CHIR99021の濃度は3μM、SCFの濃度は50ng/mL、ET-3の濃度は100nM、bFGFの濃度は4ng/mL、dbcAMPの濃度は500μM、BMP4の濃度は25ng/mLである。 The concentrations of these factors may vary depending on the combination or the like, but may be any concentrations at which differentiation into melanocytes can be induced. Typically, the concentration of CHIR99021 is 3 μM, the concentration of SCF is 50 ng / mL, the concentration of ET-3 is 100 nM, the concentration of bFGF is 4 ng / mL, the concentration of dbcAMP is 500 μM, and the concentration of BMP4 is 25 ng / mL. .
これらの因子がタンパク質である場合には、当該因子の細胞との接触は、当該因子を細胞の培養培地に直接添加する他、当該因子を産生する細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することもできる。 When these factors are proteins, the contact of the factors with the cells can be performed by directly adding the factors to the cell culture medium or by co-culturing using the cells that produce the factors as feeder cells. it can.
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。工程（b）の培養は、図２で示されるような紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで行われるが、典型的な期間としては、約２〜４週間であり、好ましくは１４〜２１日間である。また、工程(c)で用いる「工程(b)により得られた細胞」には、黒褐色の顆粒を含有する細胞、及び／又は培地中に存在する他の種類の細胞が含まれ得る。 The culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. CO 2 concentration is preferably about 2-5%. The culture in step (b) is performed until cells containing spindle-shaped, black-brown granules as shown in FIG. 2 begin to appear, but a typical period is about 2 to 4 weeks, preferably 14 to 21 days. The “cells obtained in step (b)” used in step (c) may include cells containing black-brown granules and / or other types of cells present in the medium.
工程(c)で用いられるメラノサイトの維持培養培地は、メラノサイトの成長、増殖および生存に必要な栄養素を含む培地であり、例えば成長因子を添加したMedium 254培地（Invitrogen社）、又はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とMCDB-201を混合した培地が挙げられるが、メラノサイトを維持培養できる培地であれば、これらに限定されない。 The melanocyte maintenance culture medium used in step (c) is a medium containing nutrients necessary for the growth, proliferation and survival of melanocytes, such as Medium 254 medium (Invitrogen) supplemented with growth factors, or Dulbecco's modified Eagle medium Examples include a medium in which (DMEM) and MCDB-201 are mixed, but the medium is not limited thereto as long as the medium can maintain and culture melanocytes.
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。工程（c）の培養は、７〜２８日間、好ましくは７〜１４日間行う。 The culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. CO 2 concentration is preferably about 2-5%. The culturing in step (c) is performed for 7 to 28 days, preferably for 7 to 14 days.
工程(c)により得られた細胞が色素幹細胞であることの確認は、目視による形態観察により行うことができる。より正確を期すために、Fzd4、Fzd7又はCD34などの色素幹細胞マーカーのmRNAやタンパク質の発現レベルを、自体公知の方法により測定することで確認してもよい。 Confirmation that the cells obtained in the step (c) are pigment stem cells can be performed by visual morphological observation. For more accuracy, the expression level of mRNA or protein of a pigment stem cell marker such as Fzd4, Fzd7 or CD34 may be confirmed by measuring the expression level by a method known per se.
このようにして得られる色素幹細胞は、以下の性質(A)〜(H)を有することを特徴とする。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Frizzled-4(Fzd4)、Frizzled-7(Fzd7)及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない
従って、本発明はまた、上記(A)ないし(H)の特徴を有する色素幹細胞（以下、「本発明の色素幹細胞」という。）を提供する。前記特許文献１に開示されるような、皮膚組織から単離された従来公知の色素幹細胞は、メラノサイトだけでなく、ケラチノサイト（角化細胞とも呼ばれ、ケラチンを産生し、皮膚組織においては表皮細胞の大部分を占める細胞）を含む多様な細胞種に分化可能なより未分化なステージの細胞であるのに対し、本発明の色素幹細胞は、少なくとも既知の分化誘導条件下においてケラチノサイトへの分化能力を有さず、よりメラノサイト方向へ分化ステージが進んだ細胞である点で、新規な細胞であり、なおかつ自己複製能を保持しているため、大量増幅させた後、分化誘導を行うことにより、より迅速に大量のメラノサイトを供給することが可能である。しかも、多能性幹細胞から分化誘導可能であるため、皮膚組織からの煩雑な単離工程を経ることなく、迅速かつ簡便に作製することができる。
The pigment stem cells thus obtained are characterized by having the following properties (A) to (H).
(A) derived from pluripotent stem cells
(B) has the ability to differentiate into melanocytes
(C) Self-replicating ability
(D) expresses Frizzled-4 (Fzd4), Frizzled-7 (Fzd7) and CD34
(E) Cell morphology is round or polygonal, cytoplasm is abundant and nucleus is located almost in the center
(F) Does not differentiate into keratinocytes even when cultured in the presence of keratinocyte growth factor
(G) Cryopreservable
(H) No tyrosinase expression Therefore, the present invention also provides a pigment stem cell having the above-mentioned characteristics (A) to (H) (hereinafter, referred to as “the pigment stem cell of the present invention”). Conventionally known pigment stem cells isolated from skin tissue as disclosed in Patent Document 1 include not only melanocytes but also keratinocytes (also called keratinocytes, which produce keratin, and epidermal cells in skin tissues). Of the undifferentiated stage, which is capable of differentiating into various cell types including the chromosome stem cells of the present invention, whereas the pigment stem cells of the present invention have the ability to differentiate into keratinocytes at least under known differentiation-inducing conditions. Is a novel cell in that it has a more advanced differentiation stage in the direction of melanocytes, and has a self-renewal ability. It is possible to supply large quantities of melanocytes more quickly. In addition, since differentiation can be induced from pluripotent stem cells, it can be rapidly and simply prepared without going through a complicated isolation step from skin tissue.
本明細書において「自己複製能を有する」とは、少なくとも9継代、上記(A)ないし(H)の特徴を保持しつつ、増殖速度が維持されていることを意味する。 As used herein, "having the ability to self-replicate" means that the growth rate is maintained while maintaining the characteristics (A) to (H) for at least 9 passages.
「類円形」とは、円形に類する形状を意味する。類円形には、円形の形状は元より、楕円形状や、円形と近似できる形状も含まれる。また、多角形には、特に四角形〜八角形と近似できる形状が含まれるが、角がとれている場合もある。 “Similar circle” means a shape similar to a circle. Similar circles include not only circular shapes but also elliptical shapes and shapes that can be approximated to circular shapes. The polygon includes a shape that can be approximated particularly as a quadrangle to an octagon, but may have a corner.
「細胞質が豊富」であるとは、例えば、核／細胞質比（Ｎ／Ｃ比）が１／３以下、好ましくは１／３〜１／４程度であることを意味する。Ｎ／Ｃ比は、細胞の核の容積を細胞質容積で割った値として算出することができる。また、本発明の色素幹細胞は、核がほぼ中央部に位置することでも特徴づけられる。 "Abundant in cytoplasm" means that, for example, the nucleus / cytoplasm ratio (N / C ratio) is 1/3 or less, preferably about 1/3 to 1/4. The N / C ratio can be calculated as the nucleus volume of a cell divided by the cytoplasmic volume. The pigment stem cells of the present invention are also characterized in that the nucleus is located substantially at the center.
「凍結保存可能である」とは、凍結解凍後もメラノサイト分化能及び自己複製能が維持されることを意味する。 “Cryopreservable” means that melanocyte differentiation ability and self-renewal ability are maintained even after freeze-thaw.
本発明の色素幹細胞は、自体公知の方法により凍結することが可能である。凍結方法としては、例えば凍結保存液にジメチルスルホキシド、グリセロールなどの凍結保護剤を添加し、細胞を急速に凍結する方法が挙げられるが、これに限定されない。凍結保存は、市販品、例えばセルバンカー１プラス(タカラバイオ)を用いて行うこともできる。 The pigment stem cells of the present invention can be frozen by a method known per se. Examples of the freezing method include, but are not limited to, a method in which a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide or glycerol is added to a cryopreservation solution to rapidly freeze the cells. Cryopreservation can also be performed using a commercially available product, for example, Cell Banker 1 Plus (Takara Bio).
本発明はまた、色素幹細胞からのメラノサイトの製造方法を提供する。 The present invention also provides a method for producing melanocytes from pigment stem cells.
色素幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、特に限定されないが、例えば工程(b)について上述した方法と同様の方法により行うことができる。 Induction of differentiation from pigment stem cells to melanocytes is not particularly limited, but can be performed, for example, by the same method as described above in step (b).
典型的には、色素幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、色素幹細胞をWntシグナル経路アゴニストの存在下で１週間以上培養することにより行う。 Typically, differentiation induction from pigment stem cells to melanocytes is performed by culturing pigment stem cells in the presence of a Wnt signaling pathway agonist for one week or more.
色素幹細胞から誘導された細胞がメラノサイトであることの確認は、目視による形態観察により行うことができる。より正確を期すために、チロシナーゼ活性の測定、遠心分離によるペレットの観察、透過電子顕微鏡による観察、又はSRY(sex-determining region Y)-box 10（SOX10）、小眼球症関連転写因子（MITF）若しくはチロシナーゼ（TYR）などのメラノサイトマーカーの発現レベルを測定する方法、などの自体公知の方法により行うことができる。これらの方法は、例えば特許文献２、非特許文献１などに開示されている。 Confirmation that the cells derived from the pigment stem cells are melanocytes can be performed by visual morphological observation. For more accuracy, measurement of tyrosinase activity, observation of pellet by centrifugation, observation by transmission electron microscope, or SRY (sex-determining region Y) -box 10 (SOX10), microphthalmia-associated transcription factor (MITF) Alternatively, it can be performed by a method known per se, such as a method of measuring the expression level of a melanocyte marker such as tyrosinase (TYR). These methods are disclosed in, for example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 1.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ 色素幹細胞の製造
ヒトiPS細胞を非接着培養皿上に播種し（50〜200細胞/ml）、霊長類ES/iPS細胞用培地中で２週間培養することで、胚様体を形成させた。その後胚様体をフィブロネクチンでコートした接着培養皿上に播種し、3μM CHIR99021（Stemgent）、50 ng/ml SCF（R＆D）、100 nM ET-3（American Peptide Company）、500μM dbcAMP（Sigma）、50 nM TPA(12-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート（Sigma）、4 ng/ml bFGF（Wako）、100 μM L-アスコルビン酸（Sigma）、0.05 μM デキサメタゾン（Sigma）、1 mg/ml リノール酸-ウシ血清（Sigma）、及び1Xインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム（Sigma）を加えたメラノサイト維持培地（Medium 254培地（Invitrogen社製）にHuman Melanocyte Growth Supplement（HMGS）（Invitrogen社製）を添加した培地）で培養し、メラノサイトへの分化を誘導した。この間、２〜３日に一度培地を交換した。分化誘導をしてから１４日後に、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が顕微鏡観察により認められたため分化誘導を中止し、分化誘導因子を含んでいないメラノサイト維持培地に切り替えて細胞を培養した。分化誘導を中止してから７日後に、培地中に色素幹細胞が認められた。
Example 1 Production of Pigment Stem Cells Human iPS cells were seeded on a non-adherent culture dish (50 to 200 cells / ml), and cultured in a primate ES / iPS cell culture medium for 2 weeks to form an embryoid body. I let it. Thereafter, the embryoid bodies were seeded on an adherent culture dish coated with fibronectin, and 3 μM CHIR99021 (Stemgent), 50 ng / ml SCF (R & D), 100 nM ET-3 (American Peptide Company), 500 μM dbcAMP (Sigma), 50 μM nM TPA (12-tetradecanoylphorbol 13-acetate (Sigma), 4 ng / ml bFGF (Wako), 100 μM L-ascorbic acid (Sigma), 0.05 μM dexamethasone (Sigma), 1 mg / ml linoleic acid Human melanocyte growth supplement (HMGS) (Invitrogen) was added to a melanocyte maintenance medium (Medium 254 medium (Invitrogen)) supplemented with bovine serum (Sigma) and 1X insulin-transferrin-sodium selenite (Sigma). The medium was exchanged once every two to three days during this period.On the 14th day after the induction of differentiation, cells containing spindle-shaped, black-brown granules were observed by microscopic observation. Recognized After induction of differentiation, the cells were cultured by switching to a melanocyte maintenance medium containing no differentiation-inducing factor, and 7 days after stopping the induction of differentiation, pigment stem cells were observed in the medium.
実施例１における、メラノサイトへの分化誘導をしてから１４日後の細胞の形態を図２に示す。また、実施例１で製造した色素幹細胞の代表的な形態を、図３〜図４に示す。図３の細胞では、類円形の形態が、図４の細胞では角がとれている形態も観察されたが、六角形〜八角形の形態が観察された。 FIG. 2 shows the morphology of cells 14 days after the induction of differentiation into melanocytes in Example 1. 3 and 4 show typical forms of the pigment stem cells produced in Example 1. FIG. In the cells of FIG. 3, an almost circular shape was observed, and in the cells of FIG. 4, horned shapes were also observed, but hexagonal to octagonal shapes were observed.
実施例２ 色素幹細胞の遺伝子解析
培養色素幹細胞からトライゾール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNAを 回収し、Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) にてcDNAへ 逆転写した。生成したcDNAを用いてLightCycler 480 Probe (Roche) および各遺伝子プライマー(lifetechnology) を使用し、Light cycler 480II(Roche) にてリアルタイム RT-PCRを実施した。結果を図６、９、１０に示す。
Example 2 Gene Analysis of Pigmented Stem Cells RNA was collected from cultured pigmented stem cells using Trizol, chloroform, and isopropanol, and reversely transcribed into cDNA using Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). Real-time RT-PCR was performed using LightCycler 480 Probe (Roche) using the generated cDNA and Light cycler 480II (Roche) using each gene primer (lifetechnology). The results are shown in FIGS.
図６より、色素幹細胞はFzd4、Fzd7 及びCD34を発現していることが認められた。また、図９より未分化マーカーであるNANOG及びOCT4、並びに図１０よりメラノサイト特異的マーカーであるSOX10、MITF及びTYRはほとんど認められなかった。 From FIG. 6, it was confirmed that the pigment stem cells expressed Fzd4, Fzd7, and CD34. In addition, the undifferentiated markers NANOG and OCT4 were hardly recognized in FIG. 9, and the melanocyte-specific markers SOX10, MITF and TYR were hardly recognized in FIG.
実施例３ 色素幹細胞の継代培養
100%コンフルエントに達した色素幹細胞を0.5×TrypLE Select(Gibco)にて剥がしたあと血清を含む培地で失活させ、800rpm 22℃ 5分遠心分離で沈殿させた。上清を吸引後メラノサイト維持培地で懸濁し、ファイブロネクチンコートディッシュに播種した。培養は、37℃ 5% CO2環境下で行った。
Example 3 Subculture of Pigment Stem Cells
The pigmented stem cells that reached 100% confluence were detached with 0.5 × TrypLE Select (Gibco), inactivated with a serum-containing medium, and precipitated by centrifugation at 800 rpm at 22 ° C. for 5 minutes. After aspirating, the supernatant was suspended in a melanocyte maintenance medium and seeded on a fibronectin-coated dish. The culture was performed at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment.
図５は、実施例３による色素幹細胞の増殖曲線を示す。 FIG. 5 shows a proliferation curve of the pigment stem cells according to Example 3.
実施例１で製造した色素幹細胞は、少なくとも、分化能については9継代、増殖については9継代維持されることが認められた。 It was confirmed that the pigment stem cells produced in Example 1 were maintained for at least 9 passages for differentiation ability and 9 passages for proliferation.
実施例４ 色素幹細胞の凍結保存
実施例１で製造した色素幹細胞を、セルバンカー１プラス(タカラバイオ)を用いて凍結した。凍結した細胞を急速解凍後、実施例３の継代培養と同様にメラノサイト維持培地中で培養することで、色素幹細胞が増殖することを確認した。また、この細胞を実施例５と同様に培養することで、メラノサイトへ分化することを確認した。凍結解凍後の色素幹細胞の生存率を図７に示す。
Example 4 Cryopreservation of pigment stem cells The pigment stem cells produced in Example 1 were frozen using Cell Banker 1 Plus (Takara Bio). After rapid thawing of the frozen cells, the cells were cultured in a melanocyte maintenance medium in the same manner as in the subculture of Example 3, whereby it was confirmed that the pigment stem cells proliferated. Further, it was confirmed that the cells were cultured in the same manner as in Example 5 to differentiate into melanocytes. FIG. 7 shows the survival rate of the pigment stem cells after freeze-thawing.
実施例５ メラノサイトへの分化誘導
実施例１で製造した色素幹細胞を、3μM CHIR99021(stemgent)を添加したメラノサイト維持培地（メラノサイト分化培地）中で培養することで、メラノサイトへ分化させた。得られたメラノサイトの形態を図８に示す。
Example 5 Induction of Differentiation into Melanocytes The pigment stem cells produced in Example 1 were differentiated into melanocytes by culturing them in a melanocyte maintenance medium (melanocyte differentiation medium) supplemented with 3 μM CHIR99021 (stemgent). FIG. 8 shows the morphology of the obtained melanocytes.
実施例６ メラノサイトの遺伝子解析、評価
培養メラノサイトからトライゾール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNAを回収し、Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) にてcDNAへ逆転写した。生成したcDNAを用いてLightCycler 480 Probe (Roche) および各遺伝子プライマー(lifetechnology) を使用し、Light cycler 480II(Roche) にてリアルタイム RT-PCRを実施した。結果を図９、１０に示す。
Example 6 Gene Analysis and Evaluation of Melanocytes RNA was recovered from cultured melanocytes using Trizol, chloroform and isopropanol, and reversely transcribed into cDNA using Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). Real-time RT-PCR was performed using LightCycler 480 Probe (Roche) using the generated cDNA and Light cycler 480II (Roche) using each gene primer (lifetechnology). The results are shown in FIGS.
実施例７ ケラチノサイトへの分化誘導
色素幹細胞を特許文献１を倣い、表皮角化細胞培地（HumediaKG2 クラボウ社）に増殖用添加剤（HumediaKG クラボウ社）を添加した培地（ケラチノサイト分化培地）にて、３７℃、５％CO2の条件で２週間培養した。培養液は２〜３日毎に新鮮な培地に交換した。２週間培養後、細胞を4％パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、CK14抗体にて蛍光免疫染色を実施したところ染色されなかった。結果を図１２に示す。
Example 7 Induction of Differentiation into Keratinocytes Pigment stem cells were cultured in a medium (keratinocyte differentiation medium) obtained by adding a growth additive (HumediaKG Kurabo) to an epidermal keratinocyte medium (HumediaKG2 Kurabo) according to Patent Document 1. The cells were cultured for 2 weeks at 5 ° C and 5% CO 2 . The culture medium was replaced with a fresh medium every 2-3 days. After culturing for 2 weeks, the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution and subjected to fluorescent immunostaining with the CK14 antibody, but no staining was observed. FIG. 12 shows the results.
本発明の色素幹細胞は、ケラチノサイトへの分化が誘導されないことから、特許文献１のメラノサイトやケラチノサイトへの高い分化能をもつ幹細胞と比べ、分化が進んだ細胞であることが示唆された。 Since the differentiation into keratinocytes was not induced in the pigment stem cells of the present invention, it was suggested that the pigment stem cells had advanced differentiation as compared with the stem cells having high differentiation potential into melanocytes and keratinocytes of Patent Document 1.
以上により、多能性幹細胞を分化誘導することでメラノサイトへの分化能、自己複製能を有し、凍結保存可能な新規の色素幹細胞が得られた。 As described above, a novel pigment stem cell having the ability to differentiate into melanocytes and the ability to self-renew by inducing the differentiation of pluripotent stem cells and being cryopreservable was obtained.
本発明の色素幹細胞やメラノサイトは、眼皮膚白皮症、尋常性白斑などの色素異常症の病態解析に用いることが可能であり、またこれらの色素異常症の治療用医薬品又は美白用化粧品の開発において、スクリーニングに用いることが可能である。また本発明の製法、色素幹細胞やメラノサイトは、再生医療へ応用されることが期待される。 The pigment stem cells and melanocytes of the present invention can be used for the pathological analysis of pigmentation disorders such as ocular skin albinism and vitiligo vulgaris, and the development of pharmaceuticals or whitening cosmetics for treating these pigmentary disorders. Can be used for screening. Further, the production method, pigment stem cells and melanocytes of the present invention are expected to be applied to regenerative medicine.
Claims (7)
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程 A method for producing a pigment stem cell from a pluripotent stem cell, comprising the following steps (a), (b) and (c).
(a) Step of forming embryoid bodies by suspension culture from pluripotent stem cells
(b) culturing the cells obtained in step (a) under conditions that induce melanocyte differentiation until cells containing spindle-shaped, black-brown granules begin to appear
(c) a step of culturing the cells obtained in step (b) under conditions for maintaining the melanocytes
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Fzd4、Fzd7及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない Pigment stem cells having the following characteristics (A) to (H).
(A) derived from pluripotent stem cells
(B) has the ability to differentiate into melanocytes
(C) Self-replicating ability
(D) expresses Fzd4, Fzd7 and CD34
(E) Cell morphology is round or polygonal, cytoplasm is abundant and nucleus is located almost in the center
(F) Does not differentiate into keratinocytes even when cultured in the presence of keratinocyte growth factor
(G) Cryopreservable
(H) No tyrosinase expression
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