JP6623551B2 - Information processing apparatus, information processing system and information processing method - Google Patents
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Description
本技術は、蛍光標識サンプルから得られる蛍光情報の処理を行う情報処理装置に関する。より詳しくは、蛍光標識サンプルから得られる蛍光情報に基づいて、蛍光検出の感度に関する情報を得る情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法に関する。 The present technology relates to an information processing device that processes fluorescence information obtained from a fluorescent label sample. More specifically, the present invention relates to an information processing apparatus, an information processing system, and an information processing method for obtaining information on the sensitivity of fluorescence detection based on fluorescence information obtained from a fluorescent label sample.
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。 In recent years, with the development of analytical methods, biological microparticles such as cells and microorganisms, microparticles such as microbeads are passed through the flow channel, and the microparticles are individually measured or measured in the flowing step. Techniques for analyzing and sorting the microparticles that have been collected are being developed.
このような微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析、分取を行う分析手法である。 As a typical example of such a technique for analyzing or collecting microparticles, technical improvement of an analysis technique called flow cytometry is rapidly progressing. Flow cytometry is a method of detecting the fluorescence and scattered light emitted from each microparticle by irradiating the microparticles to be analyzed in a fluid in a state aligned in a fluid and irradiating the microparticles with laser light etc. This is an analysis method for analyzing and sorting fine particles.
フローサイトメトリーなどに代表される微小粒子の解析では、分析対象となる微小粒子にレーザーなどの光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する光学的手法が多く用いられている。そして、検出された光学的情報をもとに、解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析が行われる。 In the analysis of microparticles represented by flow cytometry and the like, an optical method of irradiating microparticles to be analyzed with laser light or the like and detecting fluorescence or scattered light emitted from the microparticles is often used. . Then, based on the detected optical information, a histogram is extracted by an analysis computer and software, and analysis is performed.
微小粒子の光学的解析においては、実際に被検対象となる微小粒子の光学的測定の前に、その精度等の検証や装置の動作確認・標準化等のために、クオリティーコントロール（ＱＣ：Quality Control）を行う場合がある。このクオリティーコントロールにおいては、通常、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数のビーズ（３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等）等が用いられている。 In the optical analysis of microparticles, quality control (QC: Quality Control) is performed to verify the accuracy and confirm the operation and standardization of the equipment before optical measurement of the microparticles to be actually inspected. ). In this quality control, a plurality of beads (three peak beads, six peak beads, eight peak beads, etc.) labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities are usually used.
複数の蛍光色素間で測定を行う際に、蛍光補正を行う技術として、例えば、特許文献１には、フローサイトメーターによって得られた蛍光標識被験細胞の二次元相関図から当該蛍光標識被験細胞に関する蛍光集団の重心値を算出し、重心値に該当する蛍光標識被験細胞の蛍光値と所定の行列式を用いて蛍光値の補正計算を行うようなプログラムを開発することにより、複数の蛍光色素間や、複数のレーザー光を用いて蛍光の測定を行う際にも蛍光補正が可能であり、また、被験細胞の測定処理が終了した後でも試料の再調製を行うことなく蛍光補正を実施することが可能な技術が開示されている。 As a technique for performing fluorescence correction when performing measurement between a plurality of fluorescent dyes, for example, Patent Literature 1 discloses a technique relating to the fluorescence-labeled test cells from a two-dimensional correlation diagram of the fluorescence-labeled test cells obtained by a flow cytometer. By developing a program that calculates the center of gravity of the fluorescent population and performs a correction calculation of the fluorescence using the predetermined matrix and the fluorescence of the fluorescently labeled test cells corresponding to the center of gravity, a plurality of fluorescent dyes can be calculated. In addition, it is possible to perform fluorescence correction when measuring fluorescence using multiple laser beams, and to perform fluorescence correction without re-preparing the sample even after the measurement processing of the test cells is completed. Is disclosed.
微小粒子の光学的解析におけるクオリティーコントロールにおいて、複数のピークを有するビーズを使用する場合、複数ピークの自動認識が必要である。複数ピークの自動認識に誤認が生じると、クオリティーコントロールを正確に行うことができず、装置の標準化等にも過誤が生じる可能性がある。 When beads having a plurality of peaks are used in quality control in optical analysis of microparticles, automatic recognition of a plurality of peaks is required. If erroneous recognition occurs in automatic recognition of a plurality of peaks, quality control cannot be performed accurately, and errors may occur in standardization of the apparatus.
そこで、本技術では、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号を自動認識する際に、その精度を高める技術を提供することを主目的とする。 In view of the above, an object of the present technology is to provide a technology for improving the accuracy of automatically recognizing a fluorescent signal from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescent intensities.
本願発明者らは、前記の目的を解決するために鋭意研究を行った結果、サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識することで、自動認識の精度向上に成功し、本技術を完成させるに至った。 The inventors of the present application have conducted intensive studies to solve the above-described object, and as a result, by recognizing the intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample, the accuracy of the automatic recognition is improved. We succeeded in improving the technology and completed this technology.
即ち、本技術では、まず、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部を備える情報処理装置を提供する。
本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることができ、更に、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることもできる。
また、本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含むサンプルを用いることも可能である。
前記情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することもできる。
前記情報処理部では、前記最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなすこともできる。この際、前記閾値は、前記サンプル内の前記蛍光色素が有する前記蛍光強度の種類に基づき決定することもできる。
前記情報処理部では、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識することもできる。この場合、前記クラスタリングは、ｋ平均法を用いて実施することができる。
前記情報処理部では、前記強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することもできる。この際、前記情報処理部は、前記中央絶対偏差の一定数倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去することもできる。
本技術に係る情報処理装置で算出可能な前記蛍光検出部の感度に関する情報としては、蛍光強度と粒子数による直線度及び／又は蛍光検出感度が挙げられる。
That is, in the present technology, first, a plurality of fluorescence intensities are obtained based on a fluorescence signal from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample. Provided is an information processing apparatus including an information processing unit that recognizes an intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities and calculates information on the sensitivity of the fluorescence detection unit.
As the sample that can be used in the present technology, a sample containing a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having at least three or more different fluorescent intensities can be used, and further, at least six or more different fluorescent intensities can be used. A sample containing a plurality of particles labeled with a fluorescent dye can also be used.
Further, as the sample that can be used in the present technology, a sample containing particles labeled with at least two or more different fluorescent dyes can also be used.
The information processing unit calculates an intensity center of a fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group based on an intensity center of a maximum fluorescence intensity group having a maximum intensity and a fluorescence intensity ratio of the sample among a plurality of fluorescence intensities. You can also.
The information processing unit may calculate the particle ratio of the maximum fluorescence intensity group to the entire sample, and when the particle ratio is equal to or less than the threshold, the fluorescence intensity group having the second highest intensity may be regarded as the maximum fluorescence intensity group. At this time, the threshold value may be determined based on the type of the fluorescence intensity of the fluorescent dye in the sample.
The information processing unit calculates a first center intensity for the plurality of fluorescence intensity groups based on the plurality of detected fluorescence intensities, and repeatedly performs clustering based on the first center intensity to obtain the plurality of fluorescence intensities. May be specified, and a fluorescence intensity range other than the maximum fluorescence intensity group may be recognized based on the maximum fluorescence intensity having the maximum intensity and the ratio of the particles among the plurality of groups. In this case, the clustering can be performed using a k-means method.
The information processing unit calculates a central intensity value and a central particle number for each of the intensity ranges, obtains a central absolute deviation from the central intensity value and the central particle number, and removes a unique fluorescent intensity based on the central absolute deviation. You can also. At this time, the information processing section may set a range of a constant multiple of the central absolute deviation to remove a specific fluorescence intensity not included in the range.
The information on the sensitivity of the fluorescence detection unit that can be calculated by the information processing apparatus according to the present technology includes linearity based on fluorescence intensity and the number of particles and / or fluorescence detection sensitivity.
本技術では、次に、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルに光を照射する光照射部と、
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部と、
を備える情報処理システムを提供する。
In the present technology, next, a light irradiation unit that irradiates light to a sample composed of a plurality of particles labeled with a fluorescent dye having different fluorescence intensities,
A fluorescence detection unit that detects a fluorescence signal from the sample,
Information processing for acquiring a plurality of fluorescence intensities based on the fluorescence signal, recognizing an intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample, and calculating information on the sensitivity of the fluorescence detection unit; Department and
An information processing system comprising:
本技術では、更に、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理工程を行う情報処理方法を提供する。 In the present technology, further, a plurality of fluorescence intensities are obtained based on a fluorescence signal from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and a plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample are obtained. To provide an information processing method for performing an information processing step of recognizing an intensity range for each of the fluorescence intensities and calculating information on the sensitivity of the fluorescence detection unit.
本技術によれば、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号を自動認識する際に、その精度を向上させることができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
According to the present technology, it is possible to improve the accuracy of automatically recognizing a fluorescent signal from a sample including a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescent intensities.
Note that the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present technology.
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．情報処理装置１
（１）情報処理部１１
２．情報処理システム１０
（１）情報処理部１１
（２）光照射部１２
（３）蛍光検出部１３
（４）分取部１４
３．情報処理方法
Hereinafter, a preferred embodiment for carrying out the present technology will be described with reference to the drawings. The embodiment described below shows an example of a typical embodiment of the present technology, and the scope of the present technology is not construed as being narrow. The description will be made in the following order.
1. Information processing device 1
(1) Information processing unit 11
2. Information processing system 10
(1) Information processing unit 11
(2) Light irradiation unit 12
(3) Fluorescence detector 13
(4) Sorting unit 14
3. Information processing method
＜１．情報処理装置１＞
本技術に係る情報処理装置１は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理装置であって、少なくとも情報処理部１１を備える。本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能な微小粒子の光学的解析を行う装置の一例としては、フローサイトメーターが挙げられる。図１は、本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
<1. Information processing device 1>
The information processing device 1 according to the present technology is an information processing device that can be used when performing optical analysis of fine particles, and includes at least an information processing unit 11. An example of a device that can use the information processing device 1 according to the present technology to perform optical analysis of fine particles is a flow cytometer. FIG. 1 is a schematic conceptual diagram schematically illustrating an example of a flow cytometer that can use the information processing device 1 according to the present technology.
本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターでは、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。 In a flow cytometer that can use the information processing device 1 according to the present technology, analysis of fine particles is performed by detecting optical information obtained from fine particles aligned in a line in a flow cell (flow path P). And sorting can be performed.
流路Ｐは、フローサイトメーターに予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップなどをフローサイトメーターに設置して解析又は分取を行うことも可能である。 Although the flow channel P may be provided in the flow cytometer in advance, a commercially available flow channel P or a disposable chip provided with the flow channel P may be installed in the flow cytometer to perform analysis or fractionation. It is possible.
流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、後述する図７に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路Ｐも、フローサイトメーターに用いることができる。 The form of the flow path P is not particularly limited, and can be designed freely. For example, it is not limited to a flow path P formed in a substrate T such as a two-dimensional or three-dimensional plastic or glass as shown in FIG. 1, but may be used in a conventional flow cytometer as shown in FIG. Flow path P can also be used for a flow cytometer.
また、前記流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、フローサイトメーターに用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターにより好適に用いることができる。 In addition, the width, depth, and cross-sectional shape of the flow channel P are not particularly limited as long as they can form a laminar flow, and can be freely designed. For example, a microchannel having a channel width of 1 mm or less can be used for the flow cytometer. In particular, a microchannel having a channel width of about 10 μm or more and about 1 mm or less can be suitably used by a flow cytometer that can use the information processing device 1 according to the present technology.
（１）情報処理部１１
情報処理部１１では、蛍光検出部の感度に関する情報（以下、「感度情報」ともいう）の算出が行われる。感度情報の算出は、以下の手順で行われる。
(1) Information processing unit 11
The information processing section 11 calculates information on the sensitivity of the fluorescence detection section (hereinafter, also referred to as “sensitivity information”). The calculation of the sensitivity information is performed in the following procedure.
［蛍光強度の取得］
まず、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得する。蛍光信号は、例えば、後述するフローサイトメーターの蛍光検出部において検出された光学的情報を、電気的信号（電圧パルス）に変換し、変換された電気的信号をアナログ−デジタル変換したものを用いることができる。
[Acquisition of fluorescence intensity]
First, a plurality of fluorescence intensities are obtained based on fluorescence signals from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities. As the fluorescence signal, for example, a signal obtained by converting optical information detected by a fluorescence detection unit of a flow cytometer described later into an electric signal (voltage pulse) and performing an analog-to-digital conversion of the converted electric signal is used. be able to.
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルとしては、例えば、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることができ、更に、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることもできる。より具体的には、例えば、３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等の複数のピークを有するビーズ等が挙げられる。 As a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescent intensities, for example, a sample including a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having at least three or more different fluorescent intensities can be used, Furthermore, a sample containing a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having at least six or more different fluorescent intensities can also be used. More specifically, for example, beads having a plurality of peaks such as 3-peak beads, 6-peak beads, and 8-peak beads are exemplified.
また、本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含むサンプルを用いることも可能である。本技術で使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridininchlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、 Cy3、Cy5、Cy7等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。 Further, as the sample that can be used in the present technology, a sample containing particles labeled with at least two or more different fluorescent dyes can also be used. Examples of fluorescent dyes usable in the present technology include, for example, Cascade Blue, Pacific Blue, Fluorescein isothiocyanate (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidium iodide (PI), Texas red (TR), Peridininchlorophyll protein (PerCP), Allophycocyanin ( APC), 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), Cy3, Cy5, Cy7 and the like can be used alone or in combination of two or more.
［強度範囲の認識］
次に、サンプルの蛍光強度割合に基づいて、取得した複数の蛍光強度にそれぞれに対する強度範囲を認識する。例えば、８ピークビーズを用いてフローサイトメーターのクオリティーコントロールを行う場合、８ピークのそれぞれの集団の強度範囲を認識する。８ピークビーズから取得した蛍光強度について、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果の一例を図２に示す。図２の横軸は蛍光強度を、縦軸は粒子数を表す（以下同様）。
[Recognition of intensity range]
Next, based on the fluorescence intensity ratio of the sample, an intensity range for each of the plurality of acquired fluorescence intensities is recognized. For example, when quality control of a flow cytometer is performed using 8-peak beads, the intensity range of each population of 8 peaks is recognized. FIG. 2 shows an example of the result of recognizing the intensity range of each of the eight peaks in the fluorescence intensity obtained from the eight peak beads. The horizontal axis in FIG. 2 represents the fluorescence intensity, and the vertical axis represents the number of particles (the same applies hereinafter).
より具体的には、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定することができる。 More specifically, a first central intensity for the plurality of fluorescence intensity groups is calculated based on the plurality of detected fluorescence intensities, and clustering is repeatedly performed based on the first central intensity to thereby obtain the plurality of fluorescence intensities. Population can be identified.
前記クラスタリングは、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。 The clustering can be performed using, for example, a k-means method.
強度範囲の認識が、図２のように正常に認識されれば、後述する感度情報の算出を精度よく行うことができるが、強度範囲の認識が正常に認識されないと、感度情報の算出にも誤算が生じ、装置の動作確認や標準化が適切に行えないという問題がある。例えば、サンプル中に８ピークビーズ以外に、前測定サンプルがキャリーオーバーとして残っていたり、異物の混入等があると、これらを１つのピークとして認識してしまう場合がある。例えば、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認された例を図１１に示す。また、１つの集団を２つ以上の集団として認識してしまう場合もある。例えば、最大ピークを２つの集団として誤認した例を図１２に示す。更に、キャリーオーバーとビーズのピークとを、１つのピークとして認識してしまう場合もある。例えば、キャリーオーバーとビーズの最大ピークとを１つの集団として誤認された例を図１３に示す。これらの誤認を防止する方法の例を以下に示す。なお、本技術において、下記の誤認防止方法（ａ）〜（ｃ）は、１種又は２種以上の自由に組み合わせて用いることができる。また、誤認防止方法（ａ）〜（ｃ）を２種以上組み合わせる場合は、その順番も自由に設定することができる。 If the recognition of the intensity range is normally performed as shown in FIG. 2, the sensitivity information described later can be accurately calculated. However, if the recognition of the intensity range is not normally recognized, the calculation of the sensitivity information is also performed. There is a problem that an erroneous calculation occurs and the operation check and standardization of the device cannot be performed properly. For example, if a sample to be measured is left as a carryover or a foreign substance is mixed in the sample in addition to the 8-peak beads, these may be recognized as one peak. For example, FIG. 11 shows an example in which carryover is erroneously recognized as the maximum peak. In some cases, one group is recognized as two or more groups. For example, FIG. 12 shows an example in which the maximum peak is misidentified as two groups. Further, the carryover and the peak of the beads may be recognized as one peak. For example, FIG. 13 shows an example in which carry-over and the maximum peak of beads are mistaken as one group. An example of a method for preventing these misperceptions will be described below. In the present technology, the following false recognition prevention methods (a) to (c) can be used alone or in combination of two or more. In addition, when two or more of the misrecognition prevention methods (a) to (c) are combined, the order can be freely set.
（ａ）最大蛍光強度集団の誤認防止方法
図１１に示すように、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されるのを防止するために、最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす方法が挙げられる。
(A) Method for Preventing Misidentification of Maximum Fluorescence Intensity Population As shown in FIG. 11, in order to prevent carryover from being erroneously recognized as the maximum peak, the particle ratio of the maximum fluorescence intensity population to the entire sample is calculated, and is not more than the threshold value. In the case of (1), there is a method in which the fluorescence intensity group having the second highest intensity is regarded as the maximum fluorescence intensity group.
例えば、８ピークビーズの場合、１つの蛍光強度集団の粒子比率は、理論上、１００／８＝１２．５％である。ここで、クラスタリングにより最大蛍光強度集団として認識された粒子のサンプル全体に対する比率が、１２．５％を大きく下回る場合には、その集団は、キャリーオーバーである可能性が高い。そこで、予め、粒子比率の閾値を設定しておき、最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率が閾値以下の場合には、その集団は排除した上で、二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす。そして、この最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することで、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されるのを防止することができる。 For example, in the case of 8-peak beads, the particle ratio of one fluorescence intensity population is theoretically 100/8 = 12.5%. Here, when the ratio of the particles recognized as the maximum fluorescence intensity group by the clustering to the entire sample is significantly lower than 12.5%, the group is highly likely to be carry-over. Therefore, a threshold value of the particle ratio is set in advance, and when the particle ratio of the maximum fluorescence intensity group to the entire sample is equal to or less than the threshold value, the group is excluded and the fluorescence intensity group having the second highest intensity is set. Consider the maximum fluorescence intensity population. Then, by calculating the intensity center of the fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group based on the intensity center of the maximum fluorescence intensity group and the fluorescence intensity ratio of the sample, the carryover is prevented from being erroneously recognized as the maximum peak. can do.
図１１に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、この最大蛍光強度集団の誤認防止方法（前記閾値は６％に設定）を用いて、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図３に示す。 For the fluorescence intensities obtained from the eight peak beads shown in FIG. 11, the result of re-recognizing the intensity range of each of the eight peaks using the method for preventing misidentification of the maximum fluorescence intensity group (the threshold is set to 6%) Is shown in FIG.
なお、前記閾値については、用いられる蛍光強度の種類に基づき設定することができる。例えば、８ピークビーズの場合の閾値としては、６％以下に設定するのが好ましい。また、６ピークビーズの場合の閾値としては、８％以下に設定するのが好ましい。更に、３ピークビーズの場合の閾値としては、１６％以下に設定するのが好ましい。 The threshold value can be set based on the type of the used fluorescence intensity. For example, the threshold value for 8-peak beads is preferably set to 6% or less. In addition, it is preferable to set the threshold value in the case of 6 peak beads to 8% or less. Further, the threshold value for three peak beads is preferably set to 16% or less.
（ｂ）１つの集団を２つ以上の集団として誤認するのを防止する方法
それぞれの集団の強度範囲は、例えば、１つの集団の強度中心を算出し、これを基準として、サンプルの蛍光強度割合に基づき、他の集団の強度中心を算出することができる。例えば、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することができる。
(B) Method for Preventing One Group from Being Misidentified as Two or More Groups The intensity range of each group is calculated, for example, by calculating the center of intensity of one group, and using this as a reference, the fluorescence intensity ratio of the sample. , The intensity center of another group can be calculated. For example, the intensity centers of the fluorescence intensity groups other than the maximum fluorescence intensity group can be calculated based on the intensity center of the maximum fluorescence intensity group having the maximum intensity among the plurality of fluorescence intensities and the fluorescence intensity ratio of the sample.
より具体的には、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識することができる。例えば、８ピークビーズの場合、それぞれの集団の蛍光強度割合は予め決まっているため、最大ピークの強度中心が定まれば、最大ピーク以外の強度中心は、前記割合から算出することができる。 More specifically, a first central intensity for the plurality of fluorescence intensity groups is calculated based on the plurality of detected fluorescence intensities, and clustering is repeatedly performed based on the first central intensity to thereby obtain the plurality of fluorescence intensities. Of the plurality of populations, and a fluorescence intensity range other than the maximum fluorescence intensity population can be recognized based on the maximum fluorescence intensity having the maximum intensity and the ratio of the particles among the plurality of populations. For example, in the case of 8-peak beads, the fluorescence intensity ratio of each population is determined in advance, so if the intensity center of the maximum peak is determined, the intensity centers other than the maximum peak can be calculated from the ratio.
このように、１つの集団の強度中心を算出し、これを基準として、サンプルの蛍光強度割合に基づき、他の集団の強度中心を算出することで、１つの集団を２つ以上の集団として誤認するのを防止することができる。 As described above, the intensity center of one group is calculated, and the intensity center of the other group is calculated based on the fluorescence intensity ratio of the sample based on the calculated intensity center, whereby one group is misidentified as two or more groups. Can be prevented.
図１２に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識して、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図４に示す。 For the fluorescence intensities obtained from the eight peak beads shown in FIG. 12, the fluorescence intensity ranges other than the maximum fluorescence intensity population are recognized based on the maximum fluorescence intensity and the ratio of the particles, and the intensity ranges of the respective populations of the eight peaks are recognized. FIG. 4 shows the corrected result.
（ｃ）キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止する方法
ピークが近いと、同一のピークとして誤認される場合がある。これを防止するために、中央絶対偏差（ＭＡＤ：median absolute deviation）を導入することができる。中央絶対偏差を用いることで、極端な値を排除することができる。より具体的には、強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することで、キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止することができる。
(C) Method of Preventing Carryover and Another Peak from Being Misidentified as One Peak If the peaks are close, they may be misidentified as the same peak. To prevent this, a median absolute deviation (MAD) can be introduced. Extreme values can be eliminated by using the central absolute deviation. More specifically, the central intensity value and the number of central particles are calculated for each of the intensity ranges, the central absolute deviation is calculated from the central intensity value and the number of central particles, and the specific fluorescent intensity is removed based on the central absolute deviation. This can prevent the carryover and another peak from being erroneously recognized as one peak.
例えば、図５に示すように、得られた蛍光強度について、評価軸、リファレンス軸で中央値（Median）と中央絶対偏差を求め下記の数式（１）を用いて楕円を作成する（図５Ｂ参照）。この楕円を逸脱した蛍光強度については、集団から除去する。このように、中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することで、キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止することができる。 For example, as shown in FIG. 5, for the obtained fluorescence intensity, a median (Median) and a median absolute deviation are obtained on the evaluation axis and the reference axis, and an ellipse is created using the following equation (1) (see FIG. 5B). ). The fluorescence intensity deviating from the ellipse is removed from the population. As described above, by removing the unique fluorescence intensity based on the central absolute deviation, it is possible to prevent carryover and another peak from being erroneously recognized as one peak.
中央絶対偏差の何倍（数式中「ａ」）を範囲に設定するかについては、本技術の効果を損なわない範囲で自由に設定することができるが、例えば、中央絶対偏差の７．４１３倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去することができる。因みに、この７．４１３において、標準偏差σと中央絶対偏差MADの一般的な関係式σ≒1.4826×MADを用い、5σをばらつきの範囲と考え、求めた。 The number of times (“a” in the formula) of the central absolute deviation can be set freely within a range that does not impair the effect of the present technology. For example, 7.413 times the central absolute deviation. , And specific fluorescence intensity not included in the range can be removed. By the way, in this 7.413, 5σ was considered as the range of the variation by using a general relational expression σ ≒ 1.4826 × MAD of the standard deviation σ and the central absolute deviation MAD.
図１３に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、中央絶対偏差の７．４１３倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去した上で、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図６に示す。 The fluorescence intensity obtained from the 8-peak beads shown in FIG. 13 is set to 7.413 times the central absolute deviation, and after removing the unique fluorescence intensity not included in the range, the intensity range of the population of each of the 8 peaks is removed. FIG. 6 shows the result of re-recognition of.
［感度情報の算出］
前記で認識された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲に基づいて、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する。本技術に係る情報処理装置１で算出可能な前記蛍光検出部の感度に関する情報としては、蛍光強度と粒子数による直線度（Linearity）や蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）が挙げられる。以下、８ピークビーズを用いた場合の各感度情報の算出方法の一例を説明する。
[Calculation of sensitivity information]
Information on the sensitivity of the fluorescence detection unit is calculated based on the intensity ranges for each of the plurality of fluorescence intensities recognized above. Examples of the information on the sensitivity of the fluorescence detection unit that can be calculated by the information processing device 1 according to the present technology include linearity based on fluorescence intensity and the number of particles and fluorescence detection sensitivity (MESF: Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes). . Hereinafter, an example of a method of calculating each sensitivity information in the case of using 8-peak beads will be described.
（ａ）定義
Dim1：最小ピーク
Dim2：下から2番目のピーク
Dim3：下から3番目のピーク
・
・
・
Dim8：最大ピーク
MFI : mean fluorescence intensity（平均蛍光シグナル強度の最高値と最低値を1及び0に換算した値）
ME2〜ME8 : Dim2〜Dim8のリファレンスMESF値
MESF：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes（一粒子当りの蛍光分子数）
(A) Definition
Dim1: Minimum peak
Dim2: second peak from bottom
Dim3: Third peak from bottom
・
・
Dim8: Maximum peak
MFI: mean fluorescence intensity (the value obtained by converting the maximum and minimum values of the average fluorescence signal intensity into 1 and 0)
ME2 to ME8: Reference MESF values of Dim2 to Dim8
MESF: Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes (number of fluorescent molecules per particle)
Dim1〜Dim8の平均値：MFI1〜MFI8
MFI1〜MFI8のLog値：LogMFI1〜LogMFI8
Dim1〜Dim8のリファレンス値：ME1〜ME8
ME2〜ME8のLog値：LogME2〜LogME8
Dim1の計算されたMESF値：MESF
Average value of Dim1 to Dim8: MFI1 to MFI8
Log value of MFI1 to MFI8: LogMFI1 to LogMFI8
Reference value of Dim1 to Dim8: ME1 to ME8
Log value of ME2 to ME8: LogME2 to LogME8
Calculated MESF value of Dim1: MESF
（ｂ）直線度（Linearity）
LogMFI2〜LogMFI8とLogME2〜LogME8を用いてR2（決定係数）を求め、直線度（Linearity）とする。直線度は、１００％に近いほど良い。
(B) Linearity
Seeking R 2 (coefficient of determination) using LogMFI2~LogMFI8 and LogME2～LogME8, and straightness (Linearity). The linearity is better the closer to 100%.
（ｃ）蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）
〔１〕LogMFI2〜LogMFI8とLogME2〜LogME8を用いて回帰直線を求め、その直線の傾きをa、切片をbとする。
〔２〕下記数式（２）を用いて、蛍光検出感度（ＭＥＳＦ）を求める。
(C) Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes (MESF)
[1] A regression line is obtained using LogMFI2 to LogMFI8 and LogME2 to LogME8, and the slope of the line is a and the intercept is b.
[2] Calculate the fluorescence detection sensitivity (MESF) using the following equation (2).
蛍光検出感度（ＭＥＳＦ）は、Dim1のリファレンス値（通常は０）に近いほど良い。 The closer the fluorescence detection sensitivity (MESF) is to the reference value of Dim1 (usually 0), the better.
＜２．情報処理システム１０＞
本技術に係る情報処理システム１０は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理システムであって、少なくとも情報処理部１１、光照射部１２、蛍光検出部１３を備える。また、必要に応じて、分取部１４等を備えることも可能である。本技術に係る情報処理システム１０を用いることが可能な微小粒子の光学的解析を行う装置の一例としては、フローサイトメーターが挙げられる。図７は、本技術に係る情報処理システム１０を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
<2. Information processing system 10>
An information processing system 10 according to the present technology is an information processing system that can be used when performing optical analysis of microparticles, and includes at least an information processing unit 11, a light irradiation unit 12, and a fluorescence detection unit 13. Moreover, it is also possible to provide the sorting part 14 etc. as needed. An example of an apparatus for performing optical analysis of microparticles that can use the information processing system 10 according to the present technology includes a flow cytometer. FIG. 7 is a schematic conceptual diagram schematically illustrating an example of a flow cytometer that can use the information processing system 10 according to the present technology.
（１）情報処理部１１
情報処理部１１では、後述する蛍光検出部によって取得された蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関する情報を算出する。詳細は、前述した情報処理装置１の情報処理部１１と同一のため、ここでは説明を割愛する。
(1) Information processing unit 11
The information processing unit 11 acquires a plurality of fluorescence intensities based on a fluorescence signal acquired by a fluorescence detection unit described later, and recognizes an intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample. , Calculating information on the sensitivity of the detection unit. The details are the same as those of the information processing unit 11 of the information processing apparatus 1 described above, and the description is omitted here.
（２）光照射部１２
光照射部１２では、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルへの光の照射が行われる。光照射部１２から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、または、半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
(2) Light irradiation unit 12
In the light irradiation unit 12, light is irradiated to a sample including a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities. The type of light emitted from the light irradiating unit 12 is not particularly limited. However, in order to surely generate fluorescence or scattered light from particles, light having a constant light direction, wavelength, and light intensity is desirable. As an example, a laser, an LED, and the like can be given. When a laser is used, its type is not particularly limited, but may be an argon ion (Ar) laser, a helium-neon (He-Ne) laser, a die (dye) laser, a krypton (Cr) laser, a semiconductor laser, or a semiconductor laser. One or more solid-state lasers combined with a wavelength conversion optical element can be used in any combination.
（３）蛍光検出部１３
蛍光検出部１３では、サンプルからの蛍光信号の検出が行われる。本技術に用いることができる蛍光検出部１３は、サンプルからの蛍光信号の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
(3) Fluorescence detector 13
The fluorescence detector 13 detects a fluorescence signal from the sample. The type of the fluorescence detection unit 13 that can be used in the present technology is not particularly limited as long as a fluorescence signal from a sample can be detected, and a known photodetector can be freely selected and used. For example, a fluorometer, a scattered light meter, a transmitted light meter, a reflected light meter, a diffracted light meter, an ultraviolet spectrometer, an infrared spectrometer, a Raman spectrometer, a FRET meter, a FISH meter, etc. Various kinds of spectrum measuring devices, so-called multi-channel photodetectors in which a plurality of photodetectors are arranged in an array, and the like can be used alone or in any combination of two or more.
また、本技術に係る情報処理システム１０における蛍光検出部１３の設置箇所は、サンプルからの蛍光信号の検出ができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば図１及び図７に示すように、流路Ｐを挟んで光照射部１２と逆側に配置することが好ましい。蛍光検出部１３を、流路Ｐを挟んで光照射部１２と逆側に配置することで、光照射部１２や蛍光検出部１３をより自由な構成で配置させることができるからである。また例えば、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、流路Ｐを基準に光照射部１２と同じ側や９０度側面の側に蛍光検出部１３を配置してもかまわない。 In addition, the location of the fluorescence detection unit 13 in the information processing system 10 according to the present technology is not particularly limited as long as a fluorescence signal from a sample can be detected, and can be freely designed. For example, as shown in FIGS. 1 and 7, it is preferable to arrange the light emitting unit 12 on the opposite side of the flow path P. By arranging the fluorescence detection unit 13 on the opposite side of the light irradiation unit 12 with the flow path P interposed therebetween, the light irradiation unit 12 and the fluorescence detection unit 13 can be arranged with a more flexible configuration. Further, for example, since the fluorescence is also emitted in a direction different from the incident direction of the irradiation light, the fluorescence detection unit 13 may be arranged on the same side as the light irradiation unit 12 or on the side of the 90-degree side with respect to the flow path P. I don't care.
（４）分取部１４
分取部１４では、前記蛍光検出部１３により検出された蛍光信号、又は、前記情報処理部１１で解析された粒子の解析結果に基づいて、粒子の分取が行われる。例えば、分取部１４では、光学的情報から解析された粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、粒子の分取を行うことができる。
(4) Sorting unit 14
The sorting unit 14 sorts the particles based on the fluorescence signal detected by the fluorescence detecting unit 13 or the analysis result of the particles analyzed by the information processing unit 11. For example, the sorting unit 14 can sort the particles downstream of the flow path P based on the analysis result such as the size, shape, and internal structure of the particles analyzed from the optical information.
より具体的には、図７に示すように、例えば、所定の振動数で振動する振動素子１４１ａなどを用いて、流路Ｐの全体若しくは一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１４１ａは特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴の大きさを調整し、試料を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。 More specifically, as shown in FIG. 7, for example, by applying vibration to the whole or a part of the flow path P using a vibrating element 141 a vibrating at a predetermined frequency, the discharge of the flow path P is performed. Droplets are generated from the outlet. In this case, the vibration element 141a to be used is not particularly limited, and a known element can be freely selected and used. As an example, a piezoelectric vibrating element or the like can be given. Further, by adjusting the amount of liquid sent to the flow path P, the diameter of the discharge port, the frequency of the vibrating element, and the like, the size of the droplet can be adjusted to generate a droplet containing a fixed amount of the sample. it can.
次に、発生した液滴に、解析された粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電する（図７中符号１４１ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１４１ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。 Next, the generated droplets are charged with positive or negative charges based on the analysis results of the analyzed size, shape, internal structure, and the like of the particles (see reference numeral 141b in FIG. 7). Then, the path of the charged droplet is changed to a desired direction by the counter electrode 141c to which the voltage is applied, and the charged droplet is collected.
＜３．情報処理方法＞
本技術に係る情報処理方法は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理方法であって、少なくとも情報処理工程を行う方法である。情報処理工程で行う具体的な情報処理方法は、前述した情報処理装置１の情報処理部１１が行う方法と同一である。以下、本技術に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れの一例について、図８〜１０を参照しながら説明する。なお、図８〜１０は、８ピークビーズを用いた場合である。
<3. Information processing method>
The information processing method according to the present technology is an information processing method that can be used when performing optical analysis of fine particles, and is a method that performs at least an information processing step. The specific information processing method performed in the information processing step is the same as the method performed by the information processing unit 11 of the information processing apparatus 1 described above. Hereinafter, an example of the flow of information processing using the information processing method according to the present technology will be described with reference to FIGS. 8 to 10 show the case where 8-peak beads were used.
［第１実施形態］
図８は、第１実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。
[First Embodiment]
FIG. 8 is a flowchart illustrating a flow of information processing using the information processing method according to the first embodiment.
（１）１次初期センター値の設定（Ｓ１）
まず、１次初期センター値を８点決める。各１次初期センター値は、任意の値に設定することができるが、例えば、レンジを８等分した点に設定することができる。
(1) Setting of primary initial center value (S1)
First, eight primary initial center values are determined. Each primary initial center value can be set to an arbitrary value. For example, it can be set to a point obtained by dividing the range into eight equal parts.
（２）クラスタリング（Ｓ２）
前記で設定した１次初期センター値各々について、クラスタリングを繰り返し行う。クラスタリングの方法としては、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。
(2) Clustering (S2)
Clustering is repeated for each of the primary initial center values set above. As a clustering method, for example, k-means can be used.
（３）クラスタリング回数及び結果の判定（Ｓ３）
クラスタリングを繰り返し、その回数が１００回に到達した場合、又は、クラスタリングの結果が前回と変化がない場合には、次の工程へと移行する。クラスタリングの結果が前回と変化しており、かつ、その回数が１００回に満たない場合には、再度、クラスタリングを繰り返す。なお、本実施形態では回数の基準を１００回としているが、クラスタリングの回数の上限については、目的に応じて自由に設定することができる。
(3) Judgment of clustering frequency and result (S3)
If clustering is repeated and the number of times reaches 100, or if the result of clustering has not changed from the previous time, the process proceeds to the next step. If the result of the clustering has changed from the previous time and the number of times is less than 100, the clustering is repeated again. In the present embodiment, the reference of the number of times is set to 100, but the upper limit of the number of times of clustering can be set freely according to the purpose.
（４）最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）
次に、クラスタリングの結果、最大蛍光強度集団（最大ピーク）と認識された集団の粒子比率の算出を行う。算出した粒子比率が閾値以下の場合、下記Ｓ５へ移行する。算出した粒子比率が閾値を超える場合、下記Ｓ５をとばして、下記Ｓ６へ移行する。
(4) Calculation of maximum fluorescence intensity group (maximum peak) particle ratio (S4)
Next, as a result of the clustering, the particle ratio of the group recognized as the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) is calculated. If the calculated particle ratio is equal to or smaller than the threshold, the process proceeds to S5 below. If the calculated particle ratio exceeds the threshold, the process skips S5 below and shifts to S6 below.
（５）最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）
前記で算出した最大蛍光強度集団（最大ピーク）の粒子比率が閾値以下の場合、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されている可能性が高いため、最大から２番目を最大蛍光強度集団（最大ピーク）としてみなす。
(5) Change of maximum fluorescence intensity group (maximum peak) (S5)
If the particle ratio of the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) calculated above is equal to or less than the threshold value, the carryover is likely to be erroneously recognized as the maximum peak. Regard as
（６）２次初期センター値の設定（Ｓ６）
Ｓ３又はＳ５で認識された最大蛍光強度集団（最大ピーク）と、リファレンス値を基に、他の７点の２次初期センター値を設定する。
(6) Setting of secondary initial center value (S6)
Based on the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) recognized in S3 or S5 and the reference value, the secondary initial center values of the other seven points are set.
（７）クラスタリング（Ｓ７）
前記で設定した２次初期センター値各々について、再度、クラスタリングを繰り返し行う。クラスタリングの方法としては、前記Ｓ２と同様に、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。
(7) Clustering (S7)
Clustering is repeated again for each of the secondary initial center values set above. Clustering can be performed using, for example, a k-means method or the like, similarly to S2.
（８）クラスタリング回数及び結果の判定（Ｓ８）
クラスタリングを繰り返し、その回数が１００回に到達した場合、又は、クラスタリングの結果が前回と変化がない場合には、次の工程へと移行する。クラスタリングの結果が前回と変化しており、かつ、その回数が１００回に満たない場合には、再度、クラスタリングを繰り返す。なお、本実施形態では回数の基準を１００回としているが、クラスタリングの回数の上限については、前記Ｓ３と同様に、目的に応じて自由に設定することができる。
(8) Judgment of clustering frequency and result (S8)
If clustering is repeated and the number of times reaches 100, or if the result of clustering has not changed from the previous time, the process proceeds to the next step. If the result of the clustering has changed from the previous time and the number of times is less than 100, the clustering is repeated again. In the present embodiment, the reference of the number of times is set to 100, but the upper limit of the number of times of clustering can be freely set according to the purpose as in S3.
（９）特異な蛍光強度を除去（Ｓ９）
それぞれのピークにおいて、評価軸（Ｘ軸）、リファレンス軸（Ｙ軸）で中央値（Median）と中央絶対偏差（ＭＡＤ：median absolute deviation）を求め、前記数式（１）を用いて楕円を作成する（図５Ｂ参照）。この楕円を逸脱した蛍光強度については、集団から除去する。
(9) Removal of unique fluorescence intensity (S9)
At each peak, a median (Median) and a median absolute deviation (MAD) are obtained on the evaluation axis (X-axis) and the reference axis (Y-axis), and an ellipse is created using the above equation (1). (See FIG. 5B). The fluorescence intensity deviating from the ellipse is removed from the population.
（１０）各集団の強度範囲を認識（Ｓ１０）
前記Ｓ９において、特異な蛍光強度を除去した上で、各集団の強度範囲を認識する。
(10) Recognize the intensity range of each group (S10)
In step S9, after removing the unique fluorescence intensity, the intensity range of each population is recognized.
（１１）感度情報の算出（Ｓ１１）
Ｓ１〜Ｓ１０までの工程を経て認識された各集団の強度範囲に基づいて、蛍光検出部の感度に関する情報（直線度（Linearity）や蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）等）を算出する。
(11) Calculation of sensitivity information (S11)
Based on the intensity range of each population recognized through the steps from S1 to S10, information on the sensitivity of the fluorescence detection unit (Linearity, Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes (MESF), etc.) is calculated. I do.
［第２実施形態］
図９は、第２実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。第２実施形態は、２回目のクラスタリング（Ｓ７・Ｓ８）後に、特異な蛍光強度を除去する工程（Ｓ９）を行わない例である。各工程の詳細は、前記第１実施形態と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
[Second embodiment]
FIG. 9 is a flowchart illustrating a flow of information processing using the information processing method according to the second embodiment. The second embodiment is an example in which after the second clustering (S7 and S8), the step (S9) for removing the unique fluorescence intensity is not performed. Since the details of each step are the same as those in the first embodiment, the description is omitted here.
例えば、Ｓ５工程を行うことで、最大蛍光強度集団（最大ピーク）が正確に認識されており、特異な蛍光強度が最大ピークより高い部分にしか存在しない場合等には、Ｓ９工程を行わなくても、強度範囲について精度の高い認識が可能である。 For example, when the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) is accurately recognized by performing the step S5 and the specific fluorescence intensity exists only in a portion higher than the maximum peak, the step S9 is not performed. Also, highly accurate recognition of the intensity range is possible.
なお、図示しないが、特異な蛍光強度を除去する工程（Ｓ９）は、１回目のクラスタリング（Ｓ２・Ｓ３）後に行い、初期段階で特異な蛍光強度を除去しておくことも可能である。 Although not shown, the step of removing the unique fluorescence intensity (S9) may be performed after the first clustering (S2 · S3), and the unique fluorescence intensity may be removed at an initial stage.
［第３実施形態］
図１０は、第３実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。第３実施形態は、１回目のクラスタリング（Ｓ２・Ｓ３）後に、最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）と最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）を行わない例である。各工程の詳細は、前記第１実施形態と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
[Third embodiment]
FIG. 10 is a flowchart illustrating a flow of information processing using the information processing method according to the third embodiment. The third embodiment is an example in which the calculation of the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) particle ratio (S4) and the change of the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) (S5) are not performed after the first clustering (S2 · S3). It is. Since the details of each step are the same as those in the first embodiment, the description is omitted here.
例えば、前測定がなくキャリーオーバーが存在しないと考えられる場合や、キャリーオーバーが存在したとしても、キャリーオーバーから得られる蛍光強度が、最大ピークより高い領域にないと考えられる場合には、最大蛍光強度集団（最大ピーク）の誤認の発生確率は低いと考えられる。このような場合には、最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）と最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）を行わなくても、強度範囲について精度の高い認識が可能である。 For example, if there is no previous measurement and it is considered that there is no carryover, or if there is carryover and the fluorescence intensity obtained from carryover is not in the region higher than the maximum peak, the maximum fluorescence It is considered that the probability of occurrence of false recognition of the intensity group (maximum peak) is low. In such a case, highly accurate recognition of the intensity range can be achieved without calculating the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) particle ratio (S4) and changing the maximum fluorescence intensity group (maximum peak) (S5). It is possible.
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部を備える情報処理装置。
（２）
前記サンプルは、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む（１）記載の情報処理装置。
（３）
前記サンプルは、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む（２）記載の情報処理装置。
（４）
前記サンプルは、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含む（１）から（３）のいずれかに記載の情報処理装置。
（５）
前記情報処理部は、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する（１）から（４）のいずれかに記載の情報処理装置。
（６）
前記情報処理部は、前記最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす（５）記載の情報処理装置。
（７）
前記閾値は、前記サンプル内の前記蛍光色素が有する前記蛍光強度の種類に基づき決定される（６）記載の情報処理装置。
（８）
前記情報処理部は、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識する（５）から（７）のいずれかに記載の情報処理装置。
（９）
前記クラスタリングは、ｋ平均法を用いて実施される（８）記載の情報処理装置。
（１０）
前記情報処理部は、前記強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去する（５）から（９）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１１）
前記情報処理部は、前記中央絶対偏差の一定数倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去する（１０）記載の情報処理装置。
（１２）
前記蛍光検出部の感度に関する情報は、蛍光強度と粒子数による直線度及び／又は蛍光検出感度である（１）から（１１）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１３）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルに光を照射する光照射部と、
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部と、
を備える情報処理システム。
（１４）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理工程を行う情報処理方法。
In addition, the present technology may have the following configurations.
(1)
Obtaining a plurality of fluorescence intensities based on fluorescence signals from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and intensities for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on a fluorescence intensity ratio of the sample. An information processing apparatus including an information processing unit that recognizes a range and calculates information on the sensitivity of the fluorescence detection unit.
(2)
The information processing apparatus according to (1), wherein the sample includes a plurality of particles labeled with at least three or more types of fluorescent dyes having different fluorescent intensities.
(3)
The information processing apparatus according to (2), wherein the sample includes a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having at least six or more different fluorescent intensities.
(4)
The information processing apparatus according to any one of (1) to (3), wherein the sample includes particles labeled with at least two or more different fluorescent dyes.
(5)
The information processing unit calculates an intensity center of a fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group based on an intensity center of a maximum fluorescence intensity group having a maximum intensity among a plurality of fluorescence intensities and a fluorescence intensity ratio of the sample ( The information processing apparatus according to any one of (1) to (4).
(6)
The information processing unit according to (5), wherein the information processing unit calculates a particle ratio of the maximum fluorescence intensity group to the entire sample, and regards the fluorescence intensity group having the second highest intensity as the maximum fluorescence intensity group if the particle ratio is equal to or less than a threshold. apparatus.
(7)
The information processing apparatus according to (6), wherein the threshold is determined based on a type of the fluorescence intensity of the fluorescent dye in the sample.
(8)
The information processing unit calculates a first center intensity for the plurality of fluorescence intensity groups based on the detected plurality of fluorescence intensities, and repeatedly performs clustering based on the first center intensity to obtain the plurality of fluorescence intensities. (5) to (7), based on the ratio of the particles and the maximum fluorescence intensity having the maximum intensity among the plurality of populations, and identifying a fluorescence intensity range other than the maximum fluorescence intensity group. An information processing apparatus according to claim 1.
(9)
The information processing device according to (8), wherein the clustering is performed using a k-means method.
(10)
The information processing unit calculates a central intensity value and a central particle number for each of the intensity ranges, obtains a central absolute deviation from the central intensity value and the central particle number, and removes a unique fluorescent intensity based on the central absolute deviation. The information processing apparatus according to any one of (5) to (9).
(11)
The information processing apparatus according to (10), wherein the information processing section sets a range of a constant multiple of the central absolute deviation and removes a unique fluorescence intensity not included in the range.
(12)
The information processing apparatus according to any one of (1) to (11), wherein the information on the sensitivity of the fluorescence detection unit is linearity based on fluorescence intensity and the number of particles and / or fluorescence detection sensitivity.
(13)
A light irradiation unit that irradiates light to a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities,
A fluorescence detection unit that detects a fluorescence signal from the sample,
An information processing unit for acquiring a plurality of fluorescence intensities based on the fluorescence signal, recognizing an intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample, and calculating information on the sensitivity of the detection unit; When,
An information processing system comprising:
(14)
Obtaining a plurality of fluorescence intensities based on fluorescence signals from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and intensities for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on a fluorescence intensity ratio of the sample. An information processing method for performing an information processing step of recognizing a range and calculating information on sensitivity of a fluorescence detection unit.
１ 情報処理装置
１１ 情報処理部
１０ 情報処理システム
１２ 光照射部
１３ 蛍光検出部
１４ 分取部
Reference Signs List 1 information processing device 11 information processing unit 10 information processing system 12 light irradiation unit 13 fluorescence detection unit 14 sorting unit
Claims (12)
該情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理装置。 Obtaining a plurality of fluorescence intensities based on fluorescence signals from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and intensities for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on a fluorescence intensity ratio of the sample. An information processing unit that recognizes the range and calculates information about the sensitivity of the fluorescence detection unit ,
The information processing unit calculates a particle ratio for the entire sample of the maximum fluorescence intensity group having the maximum intensity among the plurality of fluorescence intensities,
If the particle ratio exceeds a preset threshold, calculate the intensity center of the fluorescence intensity range of the maximum fluorescence intensity group,
When the particle ratio is equal to or less than the threshold value, the intensity center of the fluorescence intensity range is calculated by regarding the fluorescence intensity group having the second highest intensity as the maximum fluorescence intensity group,
An information processing apparatus for calculating an intensity center of a fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group based on a fluorescence intensity ratio of the sample, with the recognized intensity center as a reference .
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関
する情報を算出する情報処理部と、
を備え、
該情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理システム。 A light irradiation unit that irradiates light to a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities,
A fluorescence detection unit that detects a fluorescence signal from the sample,
An information processing unit for acquiring a plurality of fluorescence intensities based on the fluorescence signal, recognizing an intensity range for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on the fluorescence intensity ratio of the sample, and calculating information on the sensitivity of the detection unit; When,
Equipped with a,
The information processing unit calculates a particle ratio for the entire sample of the maximum fluorescence intensity group having the maximum intensity among the plurality of fluorescence intensities,
If the particle ratio exceeds a preset threshold, calculate the intensity center of the fluorescence intensity range of the maximum fluorescence intensity group,
When the particle ratio is equal to or less than the threshold value, the intensity center of the fluorescence intensity range is calculated by regarding the fluorescence intensity group having the second highest intensity as the maximum fluorescence intensity group,
An information processing system , wherein an intensity center of a fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group is calculated based on the fluorescence intensity ratio of the sample with reference to the recognized intensity center .
該情報処理工程では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理方法。 Obtaining a plurality of fluorescence intensities based on fluorescence signals from a sample composed of a plurality of particles labeled with fluorescent dyes having different fluorescence intensities, and intensities for each of the plurality of fluorescence intensities detected based on a fluorescence intensity ratio of the sample. recognizes the range, have row information processing step of calculating information about the sensitivity of the fluorescence detection section,
In the information processing step, calculate the particle ratio for the entire sample of the maximum fluorescence intensity population having the maximum intensity among the plurality of fluorescence intensities,
If the particle ratio exceeds a preset threshold, calculate the intensity center of the fluorescence intensity range of the maximum fluorescence intensity group,
When the particle ratio is equal to or less than the threshold value, the intensity center of the fluorescence intensity range is calculated by regarding the fluorescence intensity group having the second highest intensity as the maximum fluorescence intensity group,
An information processing method , comprising: calculating an intensity center of a fluorescence intensity group other than the maximum fluorescence intensity group based on a fluorescence intensity ratio of the sample with the recognized intensity center as a reference .
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