JP6623162B2 - Factors involved in fatigue and their use - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトの疲労度を評価する方法およびその利用法、疲労度を評価するためのキット、ならびに抗疲労物質または抗疲労法の抗疲労力測定方法、および疲労モデル動物に関する。   The present invention relates to a method for evaluating the degree of human fatigue and its use, a kit for evaluating the degree of fatigue, a method for measuring anti-fatigue power of an anti-fatigue substance or anti-fatigue method, and a fatigue model animal.

疲労は、日常生活において非常に身近な問題であり、ストレスの多い現代人の中では、さまざまな疲労に悩む人が多い。疲労には、「生理的疲労」と呼ばれる、健常者において心身に運動や労働などの負荷が生じた際に発現する疲労と、「病的疲労」と呼ばれる、何らかの原疾患に付随する疲労がある。最近では、「病的疲労」の中でも特に、慢性疲労症候群(CFS)やうつ病などの中枢神経系の疾患による疲労は、脳に異常な疲労感が生じるもので、「pathological fatigue」として、生理的疲労や末梢臓器や末梢組織の疾患による病的疲労と区別される。生理的疲労とpathological fatigue以外の病的疲労は、合わせて「nonpathological fatigue」と呼ばれ、末梢の臓器や組織に対する疲労負荷が何らかの方法で脳に伝わり、脳が疲労を感じることで発生する。これに対し、pathological fatigueは、末梢には原因はなく、脳に何らかの異常が生じていることで疲労感を感じるものである(非特許文献1)。すなわち、nonpathological fatigueは末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労、pathological fatigueは脳の疾患による疲労と言える。なお、pathological fatigueとnonpathological fatigueには今のところ適切な邦訳がないため、本明細書では英語での名称をそのまま使用する。 本明細書におけるnonpathological fatigueは、生理的疲労のすべてと、末梢臓器や末梢組織の疾患が疲労の原因となる病的疲労を含んだ疲労を表す。また、特に断っていない場合は、本明細書における疲労はnonpathological fatigueを示す。   Fatigue is a very familiar problem in daily life, and among modern people with much stress, many people suffer from various types of fatigue. There are two types of fatigue: “physiological fatigue”, fatigue that occurs when the body and body are subjected to physical and physical stress, and fatigue associated with some primary disease, called “pathological fatigue”. . Recently, fatigue caused by diseases of the central nervous system, such as chronic fatigue syndrome (CFS) and depression, can cause abnormal fatigue in the brain, especially as “pathological fatigue”. It is distinguished from morbid fatigue due to mechanical fatigue and diseases of peripheral organs and tissues. Pathological fatigue other than physiological fatigue and pathological fatigue is collectively referred to as “nonpathological fatigue” and occurs when fatigue load on peripheral organs and tissues is transmitted to the brain in some way, and the brain feels fatigue. On the other hand, pathological fatigue has no cause in the periphery, and feels fatigue due to some abnormality in the brain (Non-patent Document 1). That is, nonpathological fatigue can be said to be fatigue caused by peripheral organs and tissues, and pathological fatigue can be said to be fatigue caused by brain diseases. Since there is no appropriate Japanese translation for pathological fatigue and nonpathological fatigue, the names in English are used as they are in this specification. Nonpathological fatigue in the present specification represents fatigue including all physiological fatigue and pathological fatigue caused by diseases of peripheral organs and tissues. Further, unless otherwise specified, fatigue in the present specification indicates nonpathological fatigue.

疲労が大きな社会問題であるにも関わらず、疲労に関する科学的・医学的研究は、断片的に行われていたに過ぎず、疲労をいかに定量的・客観的に表すかという決定的手段または定量尺度については、確立されていない。本発明者らの先行特許である唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法(特許文献1、2)では、客観的な疲労(特にnonpathological fatigueの)測定が可能であるが、測定対象が中長期的な疲労の測定に限られ、疲労負荷試験などの急性の疲労の測定には不向きであった。また、疲労のメカニズムを解明していない点や、ヒトにのみ適用可能であり動物モデルによる疲労の研究や試験への応用ができないといった問題点もあった。疲労のメカニズムの理解や、負荷試験や動物実験は、抗疲労物質のスクリーニングや、疲労の予防法や回復法の開発に不可欠な要因であるため、これらの疑問に答え、疲労を客観的に測定する方法は強く求められていた。   Despite fatigue being a major social problem, scientific and medical research related to fatigue was only fragmented, and was a decisive means or quantification of how to express fatigue quantitatively and objectively. No scale has been established. According to the inventors' prior patent, the fatigue measurement method (patent documents 1 and 2) using human herpesvirus in saliva can measure objective fatigue (especially nonpathological fatigue), but the measurement target is medium- to long-term. However, it was limited to measurement of fatigue and was not suitable for measurement of acute fatigue such as fatigue load test. In addition, there are problems that the mechanism of fatigue has not been elucidated and that it can be applied only to humans and cannot be applied to research and testing of fatigue using animal models. Understanding fatigue mechanisms, stress tests and animal experiments are essential factors for screening anti-fatigue substances and developing methods for preventing and recovering from fatigue, so answer these questions and measure fatigue objectively. There was a strong demand for ways to do this.

疲労のメカニズムに関しては、少し前まで「疲労」の代表的な例として、筋肉疲労が主に研究されており、その指標として、筋肉中の乳酸産生量の増加が注目されていた。一般に「疲労物質」イコール乳酸であるという説が広まったのはこのことによる。しかし、本来乳酸は重要なエネルギー源であり、乳酸が筋肉活動を阻害するという説は、現在では否定的に捉えられている。その他、筋肉疲労にともなって、pHが低下する現象が知られている。しかし、これらは筋肉への負荷(運動負荷)という一定のストレスを与えたときには確かにみられる現象であるが、筋肉という局所にとどまる現象であると考えられる。「疲労」は、生体に現れるもっと幅広い大きな生理現象と考えられ、これら以外のメカニズムの解明が必要であると考えられる様になった(非特許文献2)。   With regard to the mechanism of fatigue, muscle fatigue has been mainly studied as a representative example of “fatigue” a while ago, and an increase in the amount of lactic acid produced in the muscle has attracted attention as an index. This is why the theory of “fatigue substance” equal lactic acid has spread. However, lactic acid is an important energy source by nature, and the theory that lactic acid inhibits muscle activity is now viewed negatively. In addition, there is a known phenomenon that pH decreases with muscle fatigue. However, these are certain phenomena that can be seen when a certain amount of stress (exercise load) is applied to the muscles, but are thought to be phenomena that remain locally as muscles. “Fatigue” is considered to be a broader and larger physiological phenomenon appearing in the living body, and it is considered that it is necessary to elucidate mechanisms other than these (Non-Patent Document 2).

次に、疲労のメカニズムとして熱心に研究されたのが、慢性疲労症候群(CFS)であった。CFS研究からは、疲労のメカニズムとして、酸化ストレス、炎症性サイトカイン、自律神経機能障害、免疫異常などが上げられ、これらが疲労、特に慢性的な疲労のバイオマーカーとして有力視されてきた。しかし、その一方で、CFSの疲労はpathological fatigueであるため、脳の疾患が関係しない条件における疲労を代表するものではないことが指摘されている。さらに、CFS自体に関しても、何らかの感染による神経疾患であるとする説や、うつ病の一種と考えるのが適切であるとする説が有力となりつつあり、CFSのバイオマーカーとして得られた指標がそのまま疲労の指標として使用可能であるかどうかは、疑問視される様になった。   Next, chronic fatigue syndrome (CFS) was studied intensively as a mechanism of fatigue. From the CFS studies, fatigue mechanisms include oxidative stress, inflammatory cytokines, autonomic dysfunction, and immune abnormalities, which have been regarded as promising biomarkers of fatigue, particularly chronic fatigue. On the other hand, however, it has been pointed out that CFS fatigue is pathological fatigue and is not representative of fatigue in conditions not related to brain diseases. Furthermore, regarding CFS itself, theories that it is a neurological disease caused by some kind of infection and that it is appropriate to consider it as a type of depression are becoming more prominent, and the indicators obtained as biomarkers for CFS remain unchanged. Whether it can be used as an indicator of fatigue has been questioned.

疲労の動物実験においても、CFSに類似の慢性疲労状態を再現することに重点が置かれ、非生理的な強い過労における疲労のメカニズムが検討されている。また、疲労メカニズムの研究においては、感染モデルと呼ばれるウイルス感染を模したモデルが用いられることもある。しかし何れの動物モデルも、CFSと類似の慢性化した病的な疲労状態を再現したものとなっている。この様な状況により、生理的な条件による疲労のメカニズムは、ほとんど解明されていない(非特許文献3、4)。   In animal experiments of fatigue, emphasis is placed on reproducing a chronic fatigue state similar to CFS, and the mechanism of fatigue in non-physiological overwork is being investigated. In the study of the fatigue mechanism, a model imitating a viral infection called an infection model may be used. However, both animal models reproduce the chronic pathological fatigue state similar to CFS. Under such circumstances, the mechanism of fatigue due to physiological conditions has hardly been elucidated (Non-Patent Documents 3 and 4).

疲労のメカニズムを研究する際に説明すべき、疲労、特に生理的疲労の重要な特徴として、休息によって容易に回復するという性質(可逆性または易回復性と呼ばれる)が挙げられる。この性質は、疲労という生理現象を定義する際の重要な要素であり、疲労のメカニズムの解明にも必要な要素であると考えられる。   An important characteristic of fatigue, particularly physiological fatigue, that should be explained when studying the mechanism of fatigue is the property of being easily recovered by rest (called reversibility or easy recovery). This property is an important factor in defining the physiological phenomenon of fatigue, and is considered to be a factor necessary for elucidating the mechanism of fatigue.

疲労の発生機構は何らかのストレス応答と関係すると考えられるが、ストレス応答の種類やシグナル伝達経路は非常に多く、疲労に特異的なメカニズムやシグナル伝達経路を絞り込むことは非常に難しい。さらに、DNAマイクロアレイを用いた研究によって、疲労刺激に反応して1,000種類を超える遺伝子の発現が変化することが知られており、このことからも疲労のメカニズムやシグナル伝達経路の同定が極めて困難であることが予想された。
また、DNAマイクロアレイによる疲労の分子バイオマーカー検索は、疲労による発現量の変化によってスクリーニングを行うことが多い。シグナル伝達においては、変化の大きいものが必ずしも特異的な変化を反映するとは限らないため、この様な検索方法で、正しく疲労特異的な分子バイオマーカーが検索可能であるかには疑問があった。
このため、疲労の分子バイオマーカーには、疲労負荷によって増加するという条件の他に、実験動物への導入によって疲労を誘導できること、当該分子の機能阻害によって疲労が減弱できること、可能な限りシグナル伝達経路の上流にあること、疲労の原因となる物質との関係が示されること、などの条件が要求される(非特許文献5)。
Although the mechanism of fatigue is thought to be related to some kind of stress response, there are many types of stress responses and signal transmission pathways, and it is very difficult to narrow down the mechanisms and signal transmission pathways specific to fatigue. Furthermore, studies using DNA microarrays are known to change the expression of more than 1,000 genes in response to fatigue stimuli, which makes it extremely difficult to identify fatigue mechanisms and signal transduction pathways. It was expected to be.
In addition, molecular biomarker searches for fatigue using DNA microarrays are often screened based on changes in expression due to fatigue. In signal transduction, a large change does not necessarily reflect a specific change, so there was a question as to whether a fatigue-specific molecular biomarker can be searched correctly using such a search method. .
For this reason, in addition to the condition that it increases due to fatigue load, fatigue biomolecules can be induced by introduction into experimental animals, fatigue can be attenuated by inhibiting the function of the molecule, and signal transduction pathways as much as possible The condition of being upstream, and showing the relationship with the substance causing fatigue (Non-Patent Document 5) is required.

上述のように、筋肉疲労やCFSに関する疲労のメカニズムや測定法は提案されているが、日常生活における生理的疲労は、先に述べたように、多くの現代人が感じているものであるにも関わらず、そのメカニズムや客観的な評価方法について、ほとんど報告がなされていない。さらに、生理的疲労と病的疲労の判別や、pathological fatigueと nonpathological fatigueの判別が可能なバイオマーカーも明らかでなく、これらを評価したり判別したりする方法も確立されていない。日常生活における疲労は、たとえ生理的疲労であっても、そのまま放置すると精神疾患などの健康障害や過労死に直結するおそれもある。過労・疲労による精神疾患の問題や過労死の問題は医学的、経済的、社会的にも非常に重要であると認識されているにもかかわらず、肝心な疲労の科学的メカニズムについてほとんど解明されていない。このため、近年、社会問題化しているこれらの問題を防止するためにも疲労のメカニズムに基づく客観的な疲労度の評価方法が必要とされている。   As mentioned above, mechanisms and methods for fatigue related to muscle fatigue and CFS have been proposed, but as mentioned earlier, physiological fatigue in everyday life is something that many modern people feel. Nevertheless, there are few reports on the mechanism and objective evaluation method. Furthermore, biomarkers capable of discriminating between physiological fatigue and pathological fatigue, and pathological fatigue and nonpathological fatigue are not clear, and methods for evaluating and discriminating these have not been established. Even if the fatigue in daily life is physiological fatigue, if it is left as it is, there is a risk that it may directly lead to health problems such as mental illness and death from overwork. Although the problem of mental illness due to overwork and fatigue and the problem of death from overwork are recognized to be very important medically, economically and socially, the scientific mechanism of vital fatigue has been largely elucidated. Not. For this reason, in order to prevent these problems that have become social problems in recent years, an objective fatigue evaluation method based on the fatigue mechanism is required.

さらに、市場に氾濫する栄養ドリンクなどの医薬品または健康食品等の多くは、抗疲労効果を売り物としたものであるため、その機能性に対する科学的な裏づけが消費者のみならず市場・社会全体において広く求められている。また、疲労や疲労の影響や障害を予防あるいは抑制する、または回復させる効果を総称して抗疲労効果と呼ぶが、抗疲労効果には、疲労を予防または防止する効果(疲労予防効果)と、生じた疲労や疲労の影響を回復または抑制する効果(疲労回復効果)が含まれる。抗疲労物質や抗疲労法を効率良く利用するには、これらが疲労予防効果と疲労回復効果のどちらを有するかなどの作用機序を評価し、適切に使用することが必要である。   In addition, many of the medicines such as energy drinks that flood the market or health foods are for sale with anti-fatigue effects, so the scientific support for their functionality is not limited to consumers but also to the market and society as a whole. Widely sought after. In addition, the effect of preventing or suppressing or recovering from fatigue or fatigue effects and disorders is collectively referred to as the anti-fatigue effect, but the anti-fatigue effect includes the effect of preventing or preventing fatigue (fatigue prevention effect), and It includes the effect of recovering or suppressing the generated fatigue and the effect of fatigue (fatigue recovery effect). In order to efficiently use anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, it is necessary to evaluate the action mechanism, such as whether these have a fatigue prevention effect or a fatigue recovery effect, and use them appropriately.

この様な状況を背景に、本発明者らは客観的疲労測定法の開発や、疲労のメカニズムに関する研究を行った(非特許文献6〜12)。この研究で得た発明者しか知り得ない未発表のノウハウを利用して、本特許明細書にある発明を得た。   Against this background, the present inventors conducted research on the development of objective fatigue measurement methods and fatigue mechanisms (Non-Patent Documents 6 to 12). Using the unpublished know-how that only the inventor obtained by this research knows, the invention described in this patent specification was obtained.

以上のように、疲労による障害の可能性を評価し、これに対し適切な防止策を講じるためには、疲労を定量的に測定するに留まらず、疲労が生理的疲労であるのか病的疲労であるのか、pathological fatigueであるのかnonpathological fatigueであるのかなど、疲労の種類を客観的に評価し、これらに適切に対処することが可能な抗疲労物質や抗疲労法を利用することが必要である。このため、簡便かつ客観的に疲労の質および量を評価することができる方法およびその利用法の開発が強く求められている。   As described above, in order to evaluate the possibility of failure due to fatigue and take appropriate preventive measures, it is not only quantitative measurement of fatigue, but whether fatigue is physiological fatigue or pathological fatigue. It is necessary to objectively evaluate the type of fatigue, such as whether it is pathological fatigue or nonpathological fatigue, and use anti-fatigue substances and anti-fatigue methods that can appropriately deal with these types of fatigue. is there. For this reason, there is a strong demand for the development of a method that can easily and objectively evaluate the quality and amount of fatigue and its utilization method.

「疲労度評価方法およびその利用」特許第4218842号公報(2009年2月4日発行)"Fatigue degree evaluation method and its utilization" Patent No. 4218842 (issued February 4, 2009) 「疲労度評価方法およびその利用」特許第4812708号公報(2011年11月9日発行)"Fatigue degree evaluation method and its use" Patent No. 4812708 (issued on November 9, 2011)

What is fatigue? Pathological and nonpathological fatigue. Jason LA, Evans M, Brown M, Porter N. PM&R. 2010;2(5):327-31.What is fatigue? Pathological and nonpathological fatigue. Jason LA, Evans M, Brown M, Porter N. PM & R. 2010; 2 (5): 327-31. 「疲労のメカニズム」渡辺恭良(医学のあゆみ 2009; 228 (6): 598-604)"Mechanism of fatigue" Akira Watanabe (Ayumi of Medicine 2009; 228 (6): 598-604) 「過労モデル動物を用いた研究からわかってきた疲労のメカニズム」田中雅彰(医学のあゆみ 2009; 228 (6): 610-4)"Mechanism of fatigue as revealed from research using overworked animal models" Masaaki Tanaka (Ayumi of Medicine 2009; 228 (6): 610-4) 「免疫学的疲労モデルにおける疲労の分子神経メカニズム」片渕俊彦(医学のあゆみ 2009; 228 (6): 615-9)"Molecular neural mechanism of fatigue in an immunological fatigue model" Toshihiko Katanabe (Ayumi Medicine 2009; 228 (6): 615-9) 「末梢血遺伝子発現プロファイルからみたイミダゾールジペプチドの抗疲労効果の検証」中村誠二, 杉野友啓, 梶本修身, 松原謙一, 的場亮、第33回日本分子生物学会(2010年、神戸)、http://www.dna-chip.co.jp/research/pdf/r4_MBSJ2010.pdf"Verification of anti-fatigue effects of imidazole dipeptides from the perspective of peripheral blood gene expression profile" Seiji Nakamura, Tomohiro Sugino, Osamu Enomoto, Kenichi Matsubara, Ryo Matoba, 33rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (2010, Kobe), http: //www.dna-chip.co.jp/research/pdf/r4_MBSJ2010.pdf 厚生労働科学研究費補助金(障害者対策総合研究事業)分担研究報告書(平成21-23年度)、自律神経機能異常を伴い慢性的な疲労を訴える患者に対する客観的な疲労診断法の確立と慢性疲労診断指針の作成、「慢性疲労患者における唾液の生物学的評価」、近藤一博Welfare Labor Sciences Research Grants (Disability Countermeasure Research Research Project) Research Report (FY2009-23), Establishing an Objective Fatigue Diagnosis Method for Patients Complaining of Chronic Fatigue with Autonomic Nervous System Abnormalities Preparation of diagnostic guidelines for chronic fatigue, “Biological evaluation of saliva in patients with chronic fatigue”, Kazuhiro Kondo 厚生労働科学研究費補助金(障害者対策総合研究事業)分担研究報告書(平成25年度)、慢性疲労症候群の病因病態の解明と画期的診断・治療法の開発、「唾液中HHV-6、HHV-7による慢性疲労症候群と労働による疲労の鑑別」、近藤一博Health Labor Sciences Grant-in-Aid for Scientific Research on Disability (Comprehensive Research Project for Persons with Disabilities) Research Report (2013), Elucidation of the Pathogenesis of Chronic Fatigue Syndrome and Development of Breakthrough Diagnosis and Treatment, “HHV-6 in Saliva , Differentiation of Chronic Fatigue Syndrome from HHV-7 and Labor Fatigue ", Kazuhiro Kondo 「Identification of Novel HHV-6 Latent Protein associated with Mood Disorders and Molecular Mechanism of Fatigue due to Overwork」、Kazuhiro Kondo et al.、国際疲労学会(International Conference on Fatigue Science 2008)抄録 S2-03"Identification of Novel HHV-6 Latent Protein associated with Mood Disorders and Molecular Mechanism of Fatigue due to Overwork", Kazuhiro Kondo et al., International Conference on Fatigue Science 2008 Abstract S2-03 「Identification of a novel molecular mechanism and a major cause of fatigue」、Kazuhiro Kondo、第36回国際生理学会世界大会(The 36th Congress of the International Union of Physiological Sciences 2009)抄録 RS LB-52-1"Identification of a novel molecular mechanism and a major cause of fatigue", Kazuhiro Kondo, The 36th Congress of the International Union of Physiological Sciences 2009 Abstract RS LB-52-1 「新しい疲労のみかた」、近藤一博、小林伸行、岡直美、第68回日本体力医学会(2013年)抄録 特別講演2“New fatigue” Kazuhiro Kondo, Nobuyuki Kobayashi, Naomi Oka, 68th Annual Meeting of the Japanese Society of Physical Fitness (2013) Special Lecture 2 「疲労のバイオマーカー: 客観的な疲労の測定法」、近藤一博、Medical Technology誌 2013年 41(6) 583-584ページ"Fatigue biomarkers: Objective fatigue measurement method", Kazuhiro Kondo, Medical Technology Journal 2013 41 (6) 583-584 「心身相関の源流にある「疲労」を科学する」、近藤一博、心身医学 2014年 54巻9号828-833ページ“Science of“ fatigue ”at the source of psychosomatic correlation”, Kazuhiro Kondo, Psychosomatic Medicine 2014, Vol. 54, No. 9, pp. 828-833

疲労の測定法は、一見客観的に見えても、実際には脳における疲労感の認識機構が介在していることが多く、生理的疲労を含むnonpathological fatigueにおける末梢臓器や末梢組織の疲労を直接測定することは困難であった。   Although the measurement method of fatigue seems to be objective at first glance, in many cases it actually involves a recognition mechanism of fatigue in the brain, and directly measures fatigue of peripheral organs and tissues in nonpathological fatigue including physiological fatigue. It was difficult to measure.

nonpathological fatigueの原因は主として末梢組織にあり、pathological fatigueの原因は脳にあるため、その予防法や治療法に大きな違いがあると考えられる。このため、客観的疲労測定法は、これらの疲労を簡便に判別できるべきである。   The cause of nonpathological fatigue is mainly in the peripheral tissues, and the cause of pathological fatigue is in the brain. For this reason, an objective fatigue measurement method should be able to easily distinguish these fatigues.

また、唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法は、疲労を客観的に測定できる数少ない方法の一つであるが、測定には1週間以上の疲労の蓄積を待つ必要があった。抗疲労物質や抗疲労法の効率的なスクリーニングには、短時間の疲労負荷における疲労測定が可能であることが要求される。   In addition, the fatigue measurement method using human herpesvirus in saliva is one of the few methods that can objectively measure fatigue, but it was necessary to wait for accumulation of fatigue for more than one week for measurement. For efficient screening of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, it is required to be able to measure fatigue under a short-term fatigue load.

さらに、唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法は、ヒトにおいてのみ測定が可能であった。抗疲労物質や抗疲労法の効率的なスクリーニングには、実験動物においても使用可能な客観的疲労測定法が必要である。   Furthermore, the fatigue measurement method using human herpesvirus in saliva can be measured only in humans. For efficient screening of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, an objective fatigue measurement method that can be used in laboratory animals is required.

抗疲労物質や抗疲労法を開発するためには、疲労の動物モデルが必要であり、様々な負荷を与えることで動物を疲労させることが行われている。しかし、実験動物はヒトと異なり、自分の状態を訴えることができないため、与えた負荷によって疲労以外の現象が生じているかどうかは判別できない。そこで、疲労物質や疲労シグナル伝達、または抗疲労効果に関係する物質やシグナル伝達を動物に導入することで、純粋に疲労に関係する現象のみを生じさせる疲労モデル動物が必要である。   In order to develop an anti-fatigue substance and an anti-fatigue method, an animal model of fatigue is required, and the animal is fatigued by applying various loads. However, unlike humans, laboratory animals cannot complain of their own condition, so it is impossible to determine whether a phenomenon other than fatigue has occurred due to the applied load. Therefore, there is a need for a fatigue model animal that causes only a phenomenon related to fatigue purely by introducing a substance or signal transmission related to a fatigue substance, fatigue signal transmission, or anti-fatigue effect into the animal.

本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、疲労という現象(nonpathological fatigueまたは生理的疲労)の本態の重要な部分が以下の現象、すなわち、(1)臓器を構成する細胞のタンパク質合成機構をになう真核生物翻訳開始因子2α(eukaryotic initiation factor-2 alpha subunit: eIF-2α)のリン酸化、(2)eIF-2αのリン酸化によって生じる臓器細胞や血液細胞におけるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子(eIF-2αリン酸化シグナルを伝達する因子)の増加、特にactivating transcription factor (ATF)4、ATF3、C/EBP-homologous protein (CHOP)の増加、(3)ATF3およびCHOPを介したTNF-αなどの炎症性サイトカインの増加とこれらの炎症性サイトカインの増加によって生じる脳での疲労感の認識、によって構成されることを独自に見出し、これらを評価する実験系を利用して日常生活における疲労度を測定することができる本発明を完成させるに至った。   As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that the essential part of the phenomenon of fatigue (nonpathological fatigue or physiological fatigue) is the following phenomenon: (1) Proteins of cells constituting the organ Phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha subunit (eIF-2α) that forms the synthesis mechanism, (2) eIF-2α in organ cells and blood cells caused by phosphorylation of eIF-2α Increase in phosphorylation signaling factor (factor that transmits eIF-2α phosphorylation signal), especially increase in activating transcription factor (ATF) 4, ATF3, C / EBP-homologous protein (CHOP), (3) ATF3 and CHOP By using an experimental system that uniquely identifies and evaluates the increase in inflammatory cytokines such as TNF-α and the recognition of fatigue in the brain caused by the increase in these inflammatory cytokines. Daily life Measuring the degree of fatigue in and completed the present invention that it is.

eIF-2αのリン酸化は、タンパク合成が抑制される現象であり、ATF3は通常、炎症性サイトカインの産生を抑制する機能が有名である。このため、炎症性サイトカインの産生増加を特徴とする疲労現象と、eIF-2αリン酸化やATF3産生が関係するシグナル伝達経路とを結びつけて考えることは難しかった。   Phosphorylation of eIF-2α is a phenomenon in which protein synthesis is suppressed, and ATF3 is usually famous for its function of suppressing the production of inflammatory cytokines. For this reason, it was difficult to consider the fatigue phenomenon characterized by increased production of inflammatory cytokines and the signal transduction pathways involved in eIF-2α phosphorylation and ATF3 production.

さらに本発明者らは、疲労の際には、eIF-2αのリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制する因子(eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子)、特にgrowth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)などの産生が亢進することを見出した。
これらのeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴って誘導されることから、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子の増加は、現時点よりも少し過去に疲労の増加が生じていたことを示す。また、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子は、疲労の本態であるeIF-2αのリン酸化またはeIF-2αリン酸化によって誘導される疲労のシグナル伝達を抑制することで、疲労を回復または抑制する作用を持つ。このため、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子が強く誘導されることは、疲労回復力が強いことを意味する。したがって、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子の量を指標として被験対象生物の抗疲労力(疲労回復力)を評価することもでき、そのような方法も本発明に含まれる。かかる抗疲労力評価方法は、好適には、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも有意に多ければ、被験対象生物の抗疲労力が高いと評価することを特徴とする。換言すれば、本発明の抗疲労力評価方法は、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合が所定の基準値より高い場合に、被験対象生物の抗疲労力が高いと評価することを特徴とする。上記基準値は、具体的なeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の組合せごとに予め設定された基準値であってもよく、例えば、抗疲労物質候補を摂取する前または抗疲労法候補を実施する前の、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合を基準値とすることができる。一方、抗疲労物質候補を摂取した後または抗疲労法候補を実施した後の、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合が抗疲労物質候補の摂取前または抗疲労法候補前の値よりも高い値を示す被験対象生物は、抗疲労物質候補または抗疲労法候補によって抗疲労力が高くなったと評価することができる。
なお、本明細書において、「疲労の回復」とは「疲労負荷によって生じる疲労のシグナル伝達およびその効果を、疲労負荷が無くなってから減少させる働き」を意味し、「疲労負荷によって生じる疲労のシグナル伝達およびその効果を、疲労負荷がある時点で減少させる働き」については「疲労の抑制」と表現する。また、「疲労の発生を防止したり、疲労を回復させる力や疲労を抑制する力を高めることで、疲労の影響を軽減すること」を「疲労の予防」と称し、疲労の回復、抑制、および予防の総称として「抗疲労」と表現する。なお、疲労を回復させる力と疲労を抑制する力を合わせて疲労回復力と表現する場合がある。本発明のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労負荷時に作用すれば疲労を抑制し、疲労負荷終了後に作用すれば疲労を回復する。また、この因子の作用を上昇させることは疲労の予防につながる。
Furthermore, the present inventors, in the case of fatigue, have a factor that suppresses phosphorylation of eIF-2α and signal transduction associated therewith (eIF-2α phosphorylation signal inhibitor), particularly growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ), etc. We found that production was enhanced.
Since these eIF-2α phosphorylation signal suppressors are induced by eIF-2α phosphorylation due to fatigue, the increase in eIF-2α phosphorylation signal suppressors was slightly increased in the past. An increase has occurred. In addition, eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor restores or suppresses fatigue by suppressing fatigue signal transduction induced by phosphorylation of eIF-2α or eIF-2α phosphorylation, which is the true state of fatigue Has an effect. For this reason, the strong induction of the phosphorylation signal inhibitory factor of eIF-2α means that the fatigue recovery ability is strong. Therefore, the anti-fatigue power (fatigue recovery power) of the test subject organism can be evaluated using the amount of the phosphorylation signal inhibitory factor of eIF-2α as an index, and such a method is also included in the present invention. Such an anti-fatigue strength evaluation method is preferably such that if the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor is significantly greater than the amount predicted from the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, It is characterized by evaluating that the anti-fatigue power is high. In other words, the anti-fatigue power evaluation method of the present invention provides a test subject organism when the ratio of the amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor to the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor is higher than a predetermined reference value. It is characterized by evaluating that the anti-fatigue power of is high. The reference value may be a reference value set in advance for each specific combination of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor and eIF-2α phosphorylation signal suppressor, for example, ingesting anti-fatigue substance candidates The ratio of the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor to the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor before the execution of the anti-fatigue method candidate can be used as a reference value. On the other hand, the ratio of the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor to the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor after ingesting the anti-fatigue substance candidate or after implementing the anti-fatigue method candidate is the anti-fatigue substance candidate It is possible to evaluate that a test subject organism showing a value higher than the value before ingesting or before anti-fatigue method candidate has increased anti-fatigue power by the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate.
In the present specification, “recovery of fatigue” means “the signal transmission of fatigue caused by fatigue load and the effect of reducing the effect after the fatigue load is lost”, and “the signal of fatigue caused by fatigue load”. “The function of reducing the transmission and its effect at a time when there is a fatigue load” is expressed as “inhibition of fatigue”. In addition, "to reduce the influence of fatigue by increasing the ability to prevent fatigue, recover fatigue and suppress fatigue" is called "prevention of fatigue", recovery and suppression of fatigue, It is expressed as “anti-fatigue” as a general term for prevention. In addition, the force for recovering fatigue and the force for suppressing fatigue may be combined and expressed as fatigue recovery force. The eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor of the present invention suppresses fatigue if acting upon fatigue loading, and recovers fatigue if acting after the end of fatigue loading. Also, increasing the action of this factor leads to fatigue prevention.

eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子のうち、GADD34およびCRePは、eIF-2αのリン酸化を解除する(リン酸化されたeIF-2αの脱リン酸化を促進する)機構により抗疲労効果を発揮し、Nck1およびNck2は、PKR等によるeIF-2αのリン酸化を抑制する機構により抗疲労効果を発揮する。これらの因子の抗疲労効果は、本発明者らが本発明における疲労のメカニズムと疲労シグナル伝達経路を明らかにするまで知られていなかった。
また、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子のうち、ZFP36、GILZも同様に、疲労の回復・抑制に関与する。これらのうちZFP36は、別名Tristetraprolinとも呼ばれ、ARE(AU-rich element)に結合するタンパク質であり、ARE-RNAの不安定化を促進する。ZFP36は、この機能によってTNFαのmRNAを不安定化させその産生を低下させる細胞内蛋白である。また、GILZは、別名TSC22D3とも呼ばれ、グルココルチコイドより誘導されるロイシンジッパー含有タンパクである。GILZは転写因子AP-1とNF-kappaBのDNA結合を阻害することで、これらの転写因子が関与するシグナル伝達を妨害し、マクロファージや樹状細胞の抗炎症シグナルを抑制することが知られている。両者は免疫現象に影響を与えることで抗疲労効果を発揮する(免疫機構を抑制して抗疲労効果を発揮する)が、この様な疲労との関係は本発明者らが本発明における疲労シグナル伝達経路を発見するまで明らかではなかった。
Among the eIF-2α phosphorylation signal suppressors, GADD34 and CReP exert anti-fatigue effects by a mechanism that releases phosphorylation of eIF-2α (promotes dephosphorylation of phosphorylated eIF-2α), Nck1 and Nck2 exert an anti-fatigue effect by a mechanism that suppresses phosphorylation of eIF-2α by PKR and the like. The anti-fatigue effect of these factors was not known until the present inventors clarified the fatigue mechanism and the fatigue signal transduction pathway in the present invention.
Among the eIF-2α phosphorylation signal inhibitors, ZFP36 and GILZ are also involved in recovery / suppression of fatigue. Among these, ZFP36, also called Tristetraprolin, is a protein that binds to ARE (AU-rich element) and promotes destabilization of ARE-RNA. ZFP36 is an intracellular protein that destabilizes TNFα mRNA and reduces its production by this function. GILZ, also called TSC22D3, is a leucine zipper-containing protein derived from glucocorticoid. GILZ is known to inhibit the DNA binding of transcription factors AP-1 and NF-kappaB, thereby blocking the signal transduction involved in these transcription factors and suppressing the anti-inflammatory signal of macrophages and dendritic cells. Yes. Both exert an anti-fatigue effect by affecting the immune phenomenon (suppressing the immune mechanism and exhibiting an anti-fatigue effect). The relationship between such fatigue and the present inventors is the fatigue signal in the present invention. It was not clear until the discovery of the transmission pathway.

本発明者らが検討した結果、動物にATF3を導入することによって疲労を発生させることができた。また、逆に干渉RNAを用いて動物のATF3産生を抑制することによって、疲労を減弱させることができた。このことは、ATF3が疲労の発生を司る因子であることを示している。また、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の導入によって筋肉の運動や、臓器の負担などの影響なしに、純粋に疲労が生体機能、特に脳機能に与える影響を検討可能な動物モデルが確立できたことを示している。さらに、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子を抑制することで、疲労を減弱できることも示している。このように、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子は、「疲労の発生に関係する因子」として作用し得る。   As a result of studies by the present inventors, fatigue could be generated by introducing ATF3 into animals. On the other hand, by suppressing the ATF3 production in animals using interfering RNA, fatigue could be reduced. This indicates that ATF3 is a factor responsible for fatigue. In addition, the introduction of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor typified by ATF3 is an animal that can examine the effects of fatigue purely on biological functions, especially brain functions, without the effects of muscle movement or organ burden. This shows that the model has been established. Furthermore, it is shown that fatigue can be attenuated by suppressing eIF-2α phosphorylation signaling factor typified by ATF3. Thus, the eIF-2α phosphorylation signaling factor represented by ATF3 can act as a “factor related to the occurrence of fatigue”.

また本発明者らは、疲労の発生に関係する因子であるeIF-2αのリン酸化シグナルを、薬剤によって阻害することによって抗疲労効果が得られることを見いだした。
eIF2のαのリン酸化は、integrated stress response(ISR)と呼ばれるストレス応答に関係する因子でもある。ストレス応答に関係するシグナル伝達経路や因子は、熱ショックタンパク、視床下部-下垂体-副腎-軸(HPA axis)、カテコラミン、酸化ストレス、エピジェネティックな応答、細胞膜の変化、脂質の変化、等々、非常に多くの種類が知られている。このため、疲労とストレスが関係することは知られているものの、何れのストレス応答が疲労との関係を持つかは、本発明者らが発見するまで知られていなかった。また、確実な証拠が得られていたわけではないが、多くの研究グループは、疲労と関係するストレス応答として、酸化ストレスやHPA axisを有力視していた。これらの理由から、ISRと疲労との関係は注目されなかった。また、ISRに関しては、免疫疾患、精神疾患、認知証、ガンなどの重要な疾患との関係が注目され、疲労、特に本発明の対象である生理的な疲労との関係を考察する上での阻害要因となっていた。
Further, the present inventors have found that an anti-fatigue effect can be obtained by inhibiting the phosphorylation signal of eIF-2α, which is a factor related to the occurrence of fatigue, with a drug.
The phosphorylation of α of eIF2 is also a factor related to stress response called integrated stress response (ISR). Signal transduction pathways and factors related to stress responses include heat shock proteins, hypothalamus-pituitary-adrenal-axis (HPA axis), catecholamines, oxidative stress, epigenetic responses, cell membrane changes, lipid changes, etc. A great many types are known. For this reason, although it is known that fatigue and stress are related, it has not been known until the present inventors which stress response has a relationship with fatigue. In addition, although there is no solid evidence, many research groups looked at oxidative stress and HPA axis as prominent stress responses related to fatigue. For these reasons, the relationship between ISR and fatigue was not noted. In addition, regarding ISR, attention has been paid to the relationship with important diseases such as immune diseases, mental illnesses, identification cards, cancer, etc., and in considering the relationship with fatigue, particularly physiological fatigue that is the object of the present invention. It was an impediment.

また、本発明者らは、eIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤であるsalubrinalによって疲労の増強や疲労回復の遅延が生じることを見いだした。このことは、eIF-2αのリン酸化やeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が疲労の発生に関係することや、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が疲労の回復や抑制に関与することを改めて証明する証拠であると考えられる。さらに、eIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤が疲労の増強や疲労回復の遅延を生じさせるという事実は、逆にeIF-2αの脱リン酸化を促進する物質が抗疲労効果を持つことを示す。さらに、eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果をもって、抗疲労法や抗疲労物質の候補の効果判定が可能になることも示している。   In addition, the present inventors have found that salubrinal, an agent that inhibits dephosphorylation of eIF-2α, causes fatigue enhancement and fatigue recovery delay. This proves again that eIF-2α phosphorylation and eIF-2α phosphorylation signaling factor are involved in fatigue, and that eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is involved in recovery and suppression of fatigue. It is thought that it is evidence to do. Furthermore, the fact that drugs that inhibit dephosphorylation of eIF-2α cause increased fatigue and delay fatigue recovery suggests that substances that promote dephosphorylation of eIF-2α have an anti-fatigue effect. Show. Furthermore, it is shown that the effect of anti-fatigue method and anti-fatigue substance candidate can be determined with the effect of promoting dephosphorylation of eIF-2α.

また本発明者らは、通常の疲労におけるeIF-2αのリン酸化を誘導する因子(eIF-2αリン酸化誘導因子)が、主として、干渉RNAを構成するsmall interfering RNA(siRNA)やmicroRNA(miRNA)といった細胞機能調節に関わるRNA分子であり、これらがprotein kinase RNA-activated (PKR)を介してeIF-2αリン酸化を生じさせることを見出した。また、siRNAやmiRNAに関わる遺伝子(干渉RNA関連因子)、特にDiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8)、Droshaといった因子も疲労によって増加することを見出した。
また、eIF-2αのリン酸化の原因として、小胞体ストレスも疲労の際のeIF-2αリン酸化誘導因子となり得ることを見出し、小胞体ストレスに関連する因子、特にglucose-regulated protein 78kDa (GRP78)やX-box binding protein 1 (XBP-1)といった因子も疲労によって増加することを見出した。本明細書では、干渉RNAに関連したeIF-2αリン酸化誘導因子と、eIF-2αリン酸化を誘導する小胞体ストレスなどの他のストレスに関係する因子とを、まとめてeIF-2αリン酸化誘導関連因子と呼ぶ。eIF-2αリン酸化誘導関連因子は、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子を活性化することで疲労の発生に関係し、干渉RNA関連因子は、eIF-2αリン酸化誘導関連因子を間接的に測定するための指標となる。すなわち、eIF-2αリン酸化誘導関連因子および干渉RNA関連因子は、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子と同様に「疲労の発生に関係する因子」として作用し得る。
In addition, the present inventors mainly used small interfering RNA (siRNA) and microRNA (miRNA), which are factors that induce phosphorylation of eIF-2α in normal fatigue (eIF-2α phosphorylation-inducing factor), which mainly constitute interfering RNA. It was found that these RNA molecules are involved in the regulation of cell functions, and that they cause eIF-2α phosphorylation via protein kinase RNA-activated (PKR). We also found that genes related to siRNA and miRNA (interfering RNA-related factors), especially DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8) and Drosha, increase with fatigue.
In addition, we found that endoplasmic reticulum stress can also be an eIF-2α phosphorylation-inducing factor during fatigue as a cause of phosphorylation of eIF-2α, and factors related to endoplasmic reticulum stress, especially glucose-regulated protein 78kDa (GRP78) We also found that factors such as X-box binding protein 1 (XBP-1) increase with fatigue. In the present specification, eIF-2α phosphorylation-inducing factors related to interfering RNA and other stress-related factors such as endoplasmic reticulum stress that induces eIF-2α phosphorylation are collectively referred to as eIF-2α phosphorylation induction. Called a related factor. eIF-2α phosphorylation-related factor is related to fatigue by activating eIF-2α phosphorylation signaling factor, and interfering RNA-related factor indirectly measures eIF-2α phosphorylation-related factor It becomes an index to do. That is, eIF-2α phosphorylation induction-related factors and interfering RNA-related factors can act as “factors related to the occurrence of fatigue” in the same manner as eIF-2α phosphorylation signaling factors represented by ATF3.

疲労の際に観察される干渉RNAの増加やprotein kinase RNA-activated (PKR)の活性化は、インフルエンザなどの遺伝子にRNAを持つウイルスの感染時や、Poly(I:C)投与による疑似感染モデルなどに生じる二重鎖RNAに対する反応にも共通している。しかし、ウイルス感染の症状は発熱、数日間続く倦怠感、食欲低下が主要なものであり、生理的疲労の性質である、発熱がない、休息によって速やかに疲労感が改善する、食欲はむしろ上昇するなどといった特徴とは非常に異なったものとなっている。またCFSの原因はウイルス感染によると考えられているため、感染モデルによる疲労は、CFSの疲労に近いと考えられている。CFSの疲労と生理的疲労とは異なる機序によって生じると考えられるため、上記の情報は、細胞内に存在するRNAと生理的疲労とを結びつける障害となりうるものであった。
実際には、干渉RNAの増加が疲労の原因となっているものの、これに続いて、eIF-2αのリン酸化によるタンパク合成阻害および過剰なサイトカイン産生を阻害する因子であるATF3の増加、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の増加といった、発明者が今回初めて疲労との関係を明らかにした現象によって、発熱を伴わない、易回復性であるなどの生理的疲労の特徴が説明される。しかし、これは発明者の今回の発明があって初めて説明が可能な現象であり、既知の情報からはRNAと生理的疲労とを結びつけることは困難である。
Interfering RNA increase and protein kinase RNA-activated (PKR) activation observed during fatigue are caused by infection with viruses with RNA in genes such as influenza, or pseudo infection model by Poly (I: C) administration It is also common for reactions to double-stranded RNA generated in However, the main symptoms of viral infection are fever, malaise that lasts for several days, and a decrease in appetite, which is the nature of physiological fatigue. No fever, resting quickly improves fatigue, and appetite rather increases It is very different from the features such as. In addition, since the cause of CFS is thought to be due to virus infection, fatigue due to the infection model is thought to be close to fatigue of CFS. Since CFS fatigue and physiological fatigue are thought to be caused by different mechanisms, the above information could be an obstacle to link RNA present in cells with physiological fatigue.
In fact, the increase in interfering RNA causes fatigue, but this is followed by an increase in ATF3, a factor that inhibits protein synthesis and excessive cytokine production due to phosphorylation of eIF-2α, eIF- The phenomenon that the inventor has clarified the relationship with fatigue for the first time, such as an increase in 2α phosphorylation signal inhibitory factor, explains the characteristics of physiological fatigue, such as no fever and easy recovery. However, this is a phenomenon that can only be explained by the present invention of the inventor, and it is difficult to link RNA and physiological fatigue from known information.

すなわち、本発明にかかる疲労度評価方法は、上記の課題を解決するために、臓器中または血液の細胞中における、リン酸化されたeIF-2αおよびeIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル分子(eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子)、eIF-2αのリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制する因子(eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子)、eIF-2αのリン酸化を誘導する因子および当該誘導に関連する因子(eIF-2αリン酸化誘導関連因子)、ならびに干渉RNAの調節に関わる分子(干渉RNA関連因子)からなる群より選択される少なくとも1種の上記の因子の量を指標として疲労度を評価することを特徴とする。また、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労のバイオマーカーとして利用可能であると同時に、これらの因子の誘導能の多寡が疲労回復力の強弱と関係する。上記の方法では簡便かつ客観的にヒトおよび実験動物の疲労度および疲労回復力を評価でき、疲労回復又は抑制効果を持つ医薬品をはじめ、栄養ドリンクや健康食品といった栄養補助食品などの抗疲労物質や抗疲労法の効果効能を定量的に求めることも可能である。さらに、短時間の疲労負荷などで引き起こされる即時的な疲労を簡便、客観的かつ高感度に定量することも可能である。   That is, in order to solve the above-described problem, the fatigue evaluation method according to the present invention is a signal molecule induced by phosphorylation of phosphorylated eIF-2α and eIF-2α in an organ or a blood cell. (EIF-2α phosphorylation signaling factor), a factor that suppresses phosphorylation of eIF-2α and signal transduction associated therewith (eIF-2α phosphorylation signal suppressor), a factor that induces phosphorylation of eIF-2α and the like Fatigue with the amount of at least one of the above factors selected from the group consisting of factors related to induction (factors related to induction of eIF-2α phosphorylation) and molecules involved in regulation of interfering RNA (interfering RNA-related factors) It is characterized by evaluating the degree. In addition, eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factors can be used as biomarkers of fatigue, and at the same time, the inducibility of these factors is related to the strength of fatigue recovery. In the above method, the fatigue level and fatigue recovery ability of humans and laboratory animals can be evaluated simply and objectively, and anti-fatigue substances such as nutritional supplements such as nutritional drinks and health foods, as well as pharmaceuticals with fatigue recovery or suppression effects, It is also possible to quantitatively determine the effectiveness of the anti-fatigue method. Furthermore, it is possible to quantify the instantaneous fatigue caused by a short-time fatigue load, etc. simply, objectively and with high sensitivity.

本発明で同定した疲労のシグナル伝達経路に基づく疲労測定法は、生理的疲労を含むnonpathological fatigue、すなわち末梢に原因のある疲労を測定する方法であるため、対象者において問題となっている疲労現象の原因が、末梢にあるか脳や精神的なものにあるかを事前に判別しておくことによって、疲労測定の効率や精度が高くなると考えられる。
本発明者らは、以前に発明者が発明した唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)を利用した疲労測定法「疲労度評価方法およびその利用」(登録番号 特許第4812708号)による測定で、疲労していないと判定されたヒトでは、疲労感として認識される自覚症状の強さ、すなわち疲労感のVisual Analog Scale(VAS) が、うつ症状の強さと強く相関することを見出した。一方、この検査によって、疲労していると判別されたヒトでは、疲労感とうつ症状との間に相関関係はなかった。このことにより、疲労のVASと唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)の組合せによる、うつ状態の簡易診断法という新たな診断法が見出された。
The fatigue measurement method based on the signal transduction pathway of fatigue identified in the present invention is a nonpathological fatigue including physiological fatigue, that is, a method of measuring fatigue caused by the periphery. It is considered that the efficiency and accuracy of fatigue measurement can be improved by discriminating in advance whether the cause of this is in the periphery or in the brain or mental.
The inventors of the present invention have previously measured the fatigue measurement method using the human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva, which was previously invented by the inventor `` Fatigue degree evaluation method and use thereof '' (Registered No. 4812708). In humans who were determined not to be fatigued, the intensity of subjective symptoms recognized as fatigue, that is, the Visual Analog Scale (VAS) of fatigue, was found to correlate strongly with the intensity of depressive symptoms. On the other hand, there was no correlation between fatigue and depressive symptoms in humans who were determined to be tired by this test. As a result, a new diagnostic method called a simple diagnostic method for depression was found by combining VAS for fatigue and human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva.

本発明にかかる疲労評価キットは、上記の課題を解決するために、上述の疲労度評価方法を実施するためのものであることを特徴としている。   The fatigue evaluation kit according to the present invention is characterized in that it is for carrying out the above-described fatigue evaluation method in order to solve the above problems.

本発明にかかる抗疲労物質および疲労回復法の効果の測定方法は、上記の課題を解決するために、上述の疲労度評価方法および疲労度評価キットのいずれかを用いて、動物およびヒトにおいて抗疲労物質および疲労回復法の抗疲労力を測定することを特徴としている。   In order to solve the above-described problems, the anti-fatigue substance and the method for measuring the effect of the fatigue recovery method according to the present invention can be used in animals and humans by using any of the above-described fatigue evaluation methods and fatigue evaluation kits. It is characterized by measuring anti-fatigue power of fatigue materials and fatigue recovery methods.

すなわち、上記の課題を解決するために、より具体的には下記の発明が提供される。
〔1〕細胞中の真核生物翻訳開始因子2α(eIF-2α)リン酸化関連因子の量を指標として、被験対象生物の疲労度を評価することを特徴とする、疲労度評価方法。
〔2〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量が多ければ、疲労度が高いと評価することを特徴とする、〔1〕に記載の疲労度評価方法。
〔3〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量を、eIF-2αリン酸化関連因子のmRNA発現量またはタンパク産生量として測定する、〔2〕に記載の疲労度評価方法。
〔4〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量が多ければ、被験対象生物にnonpathological fatigueが生じていると評価することを特徴とする、〔1〕ないし〔3〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔5〕上記eIF-2αリン酸化関連因子が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子、eIF-2αリン酸化誘導関連因子および干渉RNA関連因子からなる群より選択される、〔1〕ないし〔4〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔6〕上記eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、activating transcription factor (ATF)3、ATF4、およびC/EBP-homologous protein (CHOP) からなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔5〕に記載の疲労度評価方法。
〔7〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔5〕に記載の疲労度評価方法。
〔8〕上記eIF-2αリン酸化誘導関連因子が、干渉RNAを構成するSmall interfering RNA(siRNA)およびmicroRNA(miRNA)を含む細胞機能調節に関わるRNA分子、protein kinase RNA-activated (PKR)、ならびにglucose-regulated protein 78kDa (GRP78)およびX-box binding protein 1 (XBP-1)を含むeIF-2αのリン酸化を誘導する小胞体ストレスに関係する因子からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、上記干渉RNA関連因子が、DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8)、およびDroshaからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔5〕に記載の疲労度評価方法。
〔9〕上記細胞が、血液、肝臓、心臓、筋肉、脳、皮膚および膵臓から選ばれる少なくとも一種類であることを特徴とする、〔1〕ないし〔8〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔10〕上記〔1〕ないし〔9〕のいずれかに記載の疲労度評価方法を実施するための手段を含む、疲労度評価キット。
〔11〕採取した細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として被験対象生物の疲労度を評価するために前記キットを使用できることが表示されている、〔10〕に記載のキット。
〔12〕細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として、被験対象生物の疲労がnonpathological fatigueであるかpathological fatigueであるかを評価することを特徴とする、疲労の質を評価する方法。
〔13〕上記eIF-2αリン酸化関連因子が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子またはeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子である、〔12〕に記載の疲労の質を評価する方法。
〔14〕(i) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物の細胞から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定する、摂取前eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
(ii) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定する、摂取後eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
(iii) (i)の摂取前eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程、及び(ii)の摂取後eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後におけるeIF-2αリン酸化関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化を算出する、eIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程と、
(iv) (iii)のeIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後における細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔15〕(i) 抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をしなかった被験対象生物から採取されたそれぞれの細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定するeIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
(ii) (i)のeIF-2αリン酸化関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無によるeIF-2αリン酸化関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化を算出する、eIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程と、
(iii) (ii)のeIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔16〕上記〔1〕ないし〔9〕のいずれかに記載の疲労度評価方法および〔10〕または〔11〕のいずれかに記載の疲労度評価キットのいずれかを用いて、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果を測定することを特徴とする、〔14〕または〔15〕のいずれかに記載の抗疲労効果評価方法。
〔17〕抗疲労物質または抗疲労法をスクリーニングするための、〔14〕ないし〔16〕のいずれかに記載の抗疲労効果評価方法。
〔18〕細胞中の〔7〕に記載のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を指標として、被験対象生物の抗疲労力を評価することを特徴とする抗疲労力評価方法。
〔19〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、〔6〕に記載のeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも多ければ、抗疲労力が高いと評価することを特徴とする、〔18〕に記載の抗疲労力評価方法。
〔20〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量と上記eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子のmRNA発現量またはタンパク産生量として測定する、〔19〕に記載の抗疲労力評価方法。
〔21〕(i) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取前測定工程と、
(ii) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取後測定工程と、
(iii) (i)の摂取前測定工程、及び(ii)の摂取後測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後におけるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の変化を算出する、算出工程と、
(iv) (iii)の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔22〕(i) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、しなかった被験対象生物の細胞から採取されたそれぞれの細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、測定工程と、
(ii) (i)の測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無によるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化を算出する、算出工程と、
(iii) (ii)の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔23〕〔6〕または〔8〕のいずれかに記載の遺伝子のうちの少なくとも一種またはその遺伝子産物を導入して疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔24〕eIF-2αリン酸化によって疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔25〕ATF3遺伝子またはその遺伝子産物を導入して疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔26〕〔7〕に記載の遺伝子のうちの少なくとも一種またはその遺伝子産物を導入して抗疲労能を付与することを特徴とする、抗疲労モデル動物。
〔27〕eIF-2αリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制することによって抗疲労能を付与することを特徴とする、抗疲労モデル動物。
〔28〕〔7〕に記載の遺伝子のうちの少なくとも一種の遺伝子産物の機能を阻害して抗疲労効果を抑制することを特徴とする、疲労モデル動物。
〔29〕細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として、被験者の疲労がnonpathological fatigueであるかpathological fatigueであるかを判定することを特徴とする、疲労の質を評価する方法。
〔30〕上記被験者の自覚的疲労感が強いにも関わらず、上記被験者から採取した細胞中の〔6〕ないし〔8〕のいずれかに記載のeIF-2αリン酸化関連因子の量が通常に比して多くなければ、上記被験者の疲労がpathological fatigueであると判定することを特徴とする、〔29〕に記載の疲労の質を評価する方法。
〔31〕唾液中のヒトヘルペスウイルスの量を指標として、被験者の精神状態および/または自覚的疲労感の原因を評価することを特徴とする、被験者の精神状態および/または自覚的疲労感の原因を評価する方法。
〔32〕上記被験者の自覚的疲労感に比して、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量が少なければ、上記被験者の自覚的疲労感がうつ症状によると評価することを特徴とする、〔31〕に記載の方法。
〔33〕上記被験者が健常な被験者であり、上記被験者が、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量による疲労測定によって疲労していないと判定されれば、上記被験者の疲労感はうつ症状によるものと判定されることを特徴とする、〔31〕ないし〔32〕に記載の方法。
〔34〕上記被験者が健常な被験者であり、上記被験者が、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量による疲労測定によって疲労していないと判定されるにも関わらず、自覚的疲労感が強い場合に、上記被験者がうつ状態にあると判定されることを特徴とする、〔31〕ないし〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔35〕上記ヒトヘルペスウイルス量を、ヒトヘルペスウイルスDNA量またはヒトヘルペスウイルスタンパク量として測定する、〔31〕ないし〔34〕のいずれかに記載の方法。
〔36〕上記ヒトヘルペスウイルスが、ヒトヘルペスウイルス6とヒトヘルペスウイルス7から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔31〕ないし〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔37〕eIF-2αリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制することによって抗疲労効果を発揮する、抗疲労物質または抗疲労法。
〔38〕eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを指標として抗疲労効果の強さを評価することを特徴とする、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔39〕eIF-2αの脱リン酸化を促進することによって抗疲労効果を発揮する、抗疲労物質または抗疲労法。
〔40〕eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果の強さを指標として抗疲労効果の強さを評価することを特徴とする、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔41〕以下からなる群より選択される物質を有効成分として含有する、抗疲労剤(疲労回復剤、疲労抑制剤、または疲労予防剤):
(i)〔6〕または〔8〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質;
(ii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種;および
(iii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔42〕以下からなる群より選択される物質を有効成分として含有する、抗疲労剤(疲労回復剤、疲労抑制剤、または疲労予防剤):
(a)eIF-2αのリン酸化を阻害する物質(eIF-2αリン酸化阻害剤);
(b)eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質(eIF-2α脱リン酸化促進剤);および
(c)eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質(eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤)。
〔43〕上記疲労が、生理的疲労を含むnonpathological fatigueである、〔41〕または〔42〕に記載の抗疲労剤。
〔44〕上記疲労が、末梢臓器または末梢組織に原因がある疲労である、〔41〕または〔42〕に記載の抗疲労剤。
〔45〕上記疲労が、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労である、〔41〕または〔42〕に記載の抗疲労剤。
〔46〕以下からなる群より選択される工程を含む、疲労を軽減する(疲労を回復させるかまたは抑制する)方法:
(i)〔6〕または〔8〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程;および
(ii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程。
〔47〕以下からなる群より選択される効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程を含む、疲労を軽減する(疲労を回復させるかまたは抑制する)方法:
(a)eIF-2αのリン酸化を阻害する;
(b)eIF-2αの脱リン酸化を促進する;および
(c)eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する。
〔48〕上記疲労が、生理的疲労を含むnonpathological fatigueである、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔49〕上記疲労が、末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労である、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔50〕上記疲労が、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労である、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔51〕抗疲労剤(疲労回復剤または疲労抑制剤)の製造における、以下からなる群より選択される抗疲労物質の使用:
(i)〔6〕または〔8〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質;
(ii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種;および
(iii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔52〕抗疲労剤(疲労回復剤または疲労抑制剤)の製造における、以下からなる群より選択される抗疲労物質の使用:
(a)eIF-2αのリン酸化を阻害する物質(eIF-2αリン酸化阻害剤);
(b)eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質(eIF-2α脱リン酸化促進剤);および
(c)eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質(eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤)。
〔53〕疲労の軽減(疲労の回復または抑制)において用いるための、以下からなる群より選択される抗疲労物質:
(i)〔6〕または〔8〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質;
(ii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種;および
(iii)〔7〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔54〕疲労の軽減(疲労の回復または抑制)において用いるための、以下からなる群より選択される抗疲労物質:
(a)eIF-2αのリン酸化を阻害する物質(eIF-2αリン酸化阻害剤);
(b)eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質(eIF-2α脱リン酸化促進剤);および
(c)eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質(eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤)。
〔55〕以下の工程のいずれかを含む、抗疲労物質(例えば抗疲労剤)または抗疲労法を実施するための抗疲労器具の製造方法:
(1)当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化を阻害する効果の強さを評価する工程;
(2)当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果の強さを評価する工程;
(3)当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを評価する工程;あるいは
(4)〔14〕ないし〔16〕または〔21〕または〔22〕のいずれかに記載の方法によって、当該抗疲労物質または当該抗疲労法の抗疲労効果を評価する工程。
Specifically, in order to solve the above problems, the following inventions are provided more specifically.
[1] A method for evaluating the degree of fatigue, comprising evaluating the degree of fatigue of a test organism using the amount of a eukaryotic translation initiation factor 2α (eIF-2α) phosphorylation-related factor in a cell as an index.
[2] The method for evaluating fatigue level according to [1], wherein if the amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor is large, the fatigue level is evaluated to be high.
[3] The fatigue evaluation method according to [2], wherein the amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor is measured as the mRNA expression level or protein production amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor.
[4] The fatigue according to any one of [1] to [3], characterized in that if the amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor is large, it is evaluated that nonpathological fatigue has occurred in the test subject organism. Degree evaluation method.
[5] The eIF-2α phosphorylation-related factor is selected from the group consisting of an eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, an eIF-2α phosphorylation signal inhibitor, an eIF-2α phosphorylation induction-related factor, and an interfering RNA-related factor. The fatigue evaluation method according to any one of [1] to [4].
[6] The eIF-2α phosphorylation signaling factor is at least one selected from the group consisting of phosphorylated eIF-2α, activating transcription factor (ATF) 3, ATF4, and C / EBP-homologous protein (CHOP) The fatigue evaluation method according to [5], characterized in that:
[7] The above eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ).
[8] The eIF-2α phosphorylation induction-related factor is an RNA molecule involved in cell function regulation, including small interfering RNA (siRNA) and microRNA (miRNA) constituting interfering RNA, protein kinase RNA-activated (PKR), and It is at least one selected from the group consisting of factors related to endoplasmic reticulum stress that induces phosphorylation of eIF-2α including glucose-regulated protein 78kDa (GRP78) and X-box binding protein 1 (XBP-1), The interfering RNA-related factor is at least one selected from the group consisting of DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8) and Drosha, [5].
[9] The fatigue evaluation according to any one of [1] to [8], wherein the cell is at least one selected from blood, liver, heart, muscle, brain, skin and pancreas. Method.
[10] A fatigue evaluation kit including means for carrying out the fatigue evaluation method according to any one of [1] to [9].
[11] The kit according to [10], wherein the kit can be used to evaluate the degree of fatigue of the test organism using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the collected cells as an index.
[12] Assessing the quality of fatigue characterized by evaluating whether the test subject's fatigue is nonpathological fatigue or pathological fatigue using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cell as an index Method.
[13] The method for evaluating the quality of fatigue according to [12], wherein the eIF-2α phosphorylation-related factor is an eIF-2α phosphorylation signal transduction factor or an eIF-2α phosphorylation signal inhibitor.
[14] (i) The amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells collected from the cells of the subject organism before the subject organism ingests the anti-fatigue substance candidate or performs the anti-fatigue method candidate. Measuring a pre-intake eIF-2α phosphorylation-related factor amount measuring step,
(Ii) Post-ingestion eIF that measures the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells collected from the subject organism after the subject organism has ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate -2α phosphorylation-related factor amount measurement step,
(Iii) Ingestion of the anti-fatigue substance candidate obtained by the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor before ingestion in (i) and the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor after ingestion of (ii) Based on the measurement results of changes in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor before and after the implementation of the anti-fatigue method candidate, ingestion of the anti-fatigue substance candidate or eIF-2α phosphorylation-related in cells before and after the implementation of the anti-fatigue method candidate EIF-2α phosphorylation-related factor amount change calculating step for calculating a change in factor amount;
(Iv) The amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the step of calculating the change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in (iii) An anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate anti-fatigue effect evaluation method, comprising: an anti-fatigue power measurement step of measuring an anti-fatigue power in a living body of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate based on the change of
[15] (i) Collected from test subject organisms that have ingested anti-fatigue substance candidates or anti-fatigue method candidates and from test subject organisms that have not ingested anti-fatigue substance candidates or anti-fatigue method candidates EIF-2α phosphorylation-related factor amount measuring step for measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in each cell;
(Ii) The change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor caused by the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in (i) A step of calculating a change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cell based on the measurement result, calculating a change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cell depending on whether the anti-fatigue substance candidate is ingested or whether the anti-fatigue method candidate is implemented. When,
(Iii) eIF-2α phosphorylation-related factor in cells depending on whether the anti-fatigue substance candidate is ingested or the anti-fatigue method candidate is obtained by the step of calculating the change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in (ii) An anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate anti-fatigue effect evaluation method, comprising: an anti-fatigue force measurement step of measuring an anti-fatigue force in a living body of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate based on a change in amount.
[16] Anti-fatigue substance candidates using the fatigue evaluation method according to any one of [1] to [9] and the fatigue evaluation kit according to any one of [10] or [11] Alternatively, the anti-fatigue effect evaluation method according to any one of [14] and [15], wherein the anti-fatigue effect of an anti-fatigue method candidate is measured.
[17] The anti-fatigue effect evaluation method according to any one of [14] to [16], for screening an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method.
[18] A method for evaluating anti-fatigue power, comprising evaluating the anti-fatigue power of a test organism using the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor described in [7] in a cell as an index.
[19] If the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor is greater than the amount predicted from the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor described in [6], the anti-fatigue power is evaluated to be high. The anti-fatigue power evaluation method according to [18], wherein
[20] The amount of the eIF-2α phosphorylation signal suppressor and the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor are expressed as the mRNA expression level of the eIF-2α phosphorylation signal suppressor and the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, or The anti-fatigue power evaluation method according to [19], which is measured as protein production.
[21] (i) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor and eIF in cells collected from the subject organism before the subject organism ingests the anti-fatigue substance candidate or performs the anti-fatigue method candidate A pre-intake measurement step to measure the amount of -2α phosphorylation signaling factor;
(Ii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor and eIF-2α phosphorylation in cells collected from the test organism after the test organism has ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate A post-ingestion measuring step to measure the amount of signaling factor; and
(Iii) Inhibition of eIF-2α phosphorylation signal before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the pre-intake measurement step of (i) and the post-intake measurement step of (ii) Based on the measurement results of the amount of the factor and the change in the amount of the eIF-2α phosphorylation signaling factor, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate Calculating the amount and change in eIF-2α phosphorylation signaling factor; and
(Iv) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor and eIF-2α phosphorylation signal in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the calculation step of (iii) An anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate anti-fatigue, including an anti-fatigue force measurement step that measures the anti-fatigue power in the living body of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate based on a change in the amount of the transfer factor Effectiveness evaluation method.
[22] (i) eIF-2α in each cell collected from cells of the test subject organism in which the test subject organism has taken the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate and not A measurement step of measuring the amount of phosphorylation signal inhibitor and the amount of eIF-2α phosphorylation signaling factor;
(Ii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor and eIF-2α phosphorylation signal transduction by ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the measurement step of (i) Based on the measurement result of the change in the amount of the factor, the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor in the cell and the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor depending on the ingestion of the anti-fatigue substance candidate or the presence or absence of the anti-fatigue method candidate. A calculation step for calculating a change in quantity;
(Iii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor and eIF-2α phosphorylation in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate obtained by the calculation step of (ii) or the implementation of the anti-fatigue method candidate An anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method including an anti-fatigue power measurement step of measuring intake of the anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue power in the living body of the anti-fatigue method candidate based on a change in the amount of a signal transduction factor Candidate anti-fatigue effect evaluation method.
[23] A fatigue model animal, wherein fatigue is caused by introducing at least one of the genes according to [6] or [8] or a gene product thereof.
[24] A fatigue model animal characterized by causing fatigue by eIF-2α phosphorylation.
[25] A fatigue model animal, characterized by introducing an ATF3 gene or a gene product thereof to cause fatigue.
[26] An anti-fatigue model animal characterized by imparting anti-fatigue ability by introducing at least one of the genes according to [7] or a gene product thereof.
[27] An anti-fatigue model animal characterized by imparting anti-fatigue ability by suppressing eIF-2α phosphorylation and signal transmission associated therewith.
[28] A fatigue model animal, wherein the anti-fatigue effect is suppressed by inhibiting the function of at least one gene product of the genes according to [7].
[29] A method for evaluating the quality of fatigue, comprising determining whether a subject's fatigue is nonpathological fatigue or pathological fatigue using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells as an index.
[30] The amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor according to any one of [6] to [8] in the cells collected from the subject, although the subject's subjective fatigue is strong [29] The method for evaluating the quality of fatigue according to [29], wherein if it is not so much, it is determined that the subject's fatigue is pathological fatigue.
[31] Cause of subject's mental state and / or subjective fatigue, characterized by evaluating subject's mental state and / or cause of subjective fatigue, using amount of human herpesvirus in saliva as an index How to evaluate.
[32] If the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject is small compared to the subject's subjective fatigue, the subject's subjective fatigue is evaluated as being due to depressive symptoms, 31].
[33] If it is determined that the subject is a healthy subject and the subject is not fatigued by fatigue measurement based on the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject, the subject's fatigue is due to depressive symptoms The method according to [31] to [32], wherein the method is determined.
[34] The subject is a healthy subject and the subject has a strong feeling of subjective fatigue even though it is determined that the subject is not fatigued by fatigue measurement based on the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject The method according to any one of [31] to [33], wherein the subject is determined to be in a depressed state.
[35] The method according to any one of [31] to [34], wherein the amount of human herpesvirus is measured as the amount of human herpesvirus DNA or the amount of human herpesvirus protein.
[36] The method according to any one of [31] to [35], wherein the human herpesvirus is at least one selected from human herpesvirus 6 and human herpesvirus 7.
[37] An anti-fatigue substance or an anti-fatigue method that exerts an anti-fatigue effect by suppressing the effect of a signal transduction pathway related to eIF-2α phosphorylation.
[38] An anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method characterized by evaluating the strength of an anti-fatigue effect using as an index the strength of an effect of suppressing the effect of a signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α Candidate anti-fatigue effect evaluation method.
[39] An anti-fatigue substance or an anti-fatigue method that exhibits an anti-fatigue effect by promoting dephosphorylation of eIF-2α.
[40] Method for evaluating anti-fatigue effect of anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate, comprising evaluating strength of anti-fatigue effect using strength of effect of promoting dephosphorylation of eIF-2α as an index .
[41] An anti-fatigue agent (fatigue recovery agent, fatigue inhibitor, or fatigue preventive agent) containing a substance selected from the group consisting of the following as an active ingredient:
(I) a substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) a substance that enhances expression or function of at least one of the factors according to [7]; and (iii) at least one of the factors according to [7].
[42] An anti-fatigue agent (fatigue recovery agent, fatigue inhibitor, or fatigue preventive agent) containing a substance selected from the group consisting of the following as an active ingredient:
(A) a substance that inhibits phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) a substance that promotes dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoter); and (c) a substance that suppresses the activity of a signal transduction pathway induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF -2α phosphorylation signal inhibitor).
[43] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is nonpathological fatigue including physiological fatigue.
[44] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is caused by peripheral organs or tissues.
[45] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.
[46] A method of reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue), comprising a step selected from the group consisting of:
(I) Ingesting an anti-fatigue substance that exhibits an effect of inhibiting the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8], or a step of performing an anti-fatigue method that exhibits the effect And (ii) ingesting an anti-fatigue substance exhibiting an effect of enhancing the expression or function of at least one of the factors described in [7], or performing an anti-fatigue method exhibiting the effect.
[47] Reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue), including a step of ingesting an anti-fatigue substance that exhibits an effect selected from the group consisting of: how to:
(A) inhibits phosphorylation of eIF-2α;
(B) promotes the dephosphorylation of eIF-2α; and (c) suppresses the activity of signal transduction pathways induced by the phosphorylation of eIF-2α.
[48] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is nonpathological fatigue including physiological fatigue.
[49] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is caused by peripheral organs or peripheral tissues.
[50] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.
[51] Use of an anti-fatigue substance selected from the group consisting of the following in the manufacture of an anti-fatigue agent (fatigue recovery agent or fatigue inhibitor):
(I) a substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) a substance that enhances expression or function of at least one of the factors according to [7]; and (iii) at least one of the factors according to [7].
[52] Use of an anti-fatigue substance selected from the group consisting of the following in the manufacture of an anti-fatigue agent (fatigue recovery agent or fatigue inhibitor):
(A) a substance that inhibits phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) a substance that promotes dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoter); and (c) a substance that suppresses the activity of a signal transduction pathway induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF -2α phosphorylation signal inhibitor).
[53] An anti-fatigue substance selected from the group consisting of the following for use in reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue):
(I) a substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) a substance that enhances expression or function of at least one of the factors according to [7]; and (iii) at least one of the factors according to [7].
[54] An anti-fatigue substance selected from the group consisting of the following for use in reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue):
(A) a substance that inhibits phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) a substance that promotes dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoter); and (c) a substance that suppresses the activity of a signal transduction pathway induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF -2α phosphorylation signal inhibitor).
[55] A method of manufacturing an anti-fatigue device for performing an anti-fatigue substance (for example, an anti-fatigue agent) or an anti-fatigue method, including any of the following steps:
(1) a step of evaluating the strength of the effect of inhibiting phosphorylation of eIF-2α by the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method;
(2) a step of evaluating the strength of the effect of promoting dephosphorylation of eIF-2α by the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method;
(3) a step of evaluating the strength of the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method for suppressing the effect of a signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α; or (4) [14] to [16 ] The process of evaluating the anti-fatigue effect of the said anti-fatigue substance or the said anti-fatigue method by the method in any one of [21] or [22].

本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キット、その利用方法、及び抗疲労物質と抗疲労法の抗疲労力(抗疲労効果)測定方法は、被験者の臓器、血液または唾液を採取することにより、被験者のnonpathological fatigueが定量的に評価できるという効果を奏する。また、nonpathological fatigueとpathological fatigueの判別を行うことも可能となる。さらに、本発明にかかる方法及びキットは、いずれも簡便であるだけでなく、長時間にわたる拘束も必要としないため、被験者にとっては苦痛やわずらわしさを感じさせることがない。また、方法等も実施者にとっても簡便であり、被験者及び実施者の両者にとって非常に取り扱いやすいものであるという効果を奏する。それゆえ、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法や、抗疲労能を謳った食品等のin vivo評価およびin vitro評価に利用することができ、非常に有用な技術である。   The method for assessing fatigue level according to the present invention, a kit for assessing fatigue level, a method for using the same, and a method for measuring the anti-fatigue substance (anti-fatigue effect) of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods are to collect a subject's organ, blood or saliva. As a result, the nonpathological fatigue of the subject can be quantitatively evaluated. It is also possible to distinguish between nonpathological fatigue and pathological fatigue. Furthermore, the method and kit according to the present invention are not only simple, but also do not require long-term restraint, so that the subject does not feel pain or annoyance. In addition, the method and the like are simple for the practitioner and are very easy to handle for both the subject and the practitioner. Therefore, it can be used for screening methods of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, and in vivo evaluation and in vitro evaluation of foods with anti-fatigue ability, and is a very useful technique.

本発明の中で、eIF-2αリン酸化関連の分子バイオマーカーを利用した方法は、ヒトと同様に動物さらには、培養細胞にも使用が可能である。また本発明は、生理的疲労を専門的に解析可能な動物モデルも提供する。これにより、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニングがヒトでの試験において行うよりもはるかに効率良く行え、より良い製品の開発に貢献することが可能となる。   In the present invention, a method using a molecular biomarker related to eIF-2α phosphorylation can be used for animals and cultured cells as well as humans. The present invention also provides an animal model capable of professionally analyzing physiological fatigue. As a result, screening of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods can be performed much more efficiently than in human tests, and it is possible to contribute to the development of better products.

本発明にかかる疲労度評価キットによれば、例えば、被験者から採取された血液中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定し、その量を算出することで、疲労抑制又は回復効果がある医薬品、食品および抗疲労法の効果効能を評価できる。さらに、変化したeIF-2αリン酸化関連因子の種類と量を総合的に測定することで、当該物質や方法が疲労発生のどの段階で作用するのか、疲労抑制効果をもつのか、疲労回復効果をもつのかなどの詳細な検討が可能となる。すなわち、疲労抑制又は回復効果がある医薬品又は食品の生体における効果効能を簡便かつ定量的に求めることができる。   According to the kit for assessing fatigue level according to the present invention, for example, by measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in blood collected from a subject and calculating the amount, there is a fatigue suppression or recovery effect. Evaluate the effectiveness of medicines, foods and anti-fatigue methods. In addition, by comprehensively measuring the types and amounts of eIF-2α phosphorylation-related factors that have changed, it is possible to determine at which stage the substance or method acts, whether it has fatigue suppression effect, fatigue recovery effect Detailed examination such as whether it has is possible. That is, it is possible to easily and quantitatively determine the efficacy and efficacy in the living body of a pharmaceutical or food that has a fatigue suppression or recovery effect.

本発明の方法によれば、ヒトの疲労症状に対して、抗疲労物質や抗疲労法が疲労の発生機構のどの段階に作用して、どの程度改善効果を有するのか、すなわち、抗疲労物質や抗疲労法の有する抗疲労力について、簡便かつ確実、さらに定量的に、測定することができる。このことにより、異なったメカニズムで抗疲労効果を発揮する抗疲労物質や抗疲労法を複合的に使用することによって、より強力で確実な抗疲労効果を科学的に得ることが可能となる。   According to the method of the present invention, the anti-fatigue substance or anti-fatigue method acts on human fatigue symptoms at which stage of the fatigue generation mechanism and how much improvement effect is obtained, that is, anti-fatigue substance or The anti-fatigue power possessed by the anti-fatigue method can be measured simply, reliably and quantitatively. This makes it possible to scientifically obtain a stronger and more reliable anti-fatigue effect by using a combination of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods that exhibit anti-fatigue effects with different mechanisms.

本発明は、日常生活における疲労度を簡便かつ定量的に測定・評価するための方法、キット及びその利用法を提供するものである。このため、本発明によれば、日常生活において、疲労度を客観的に知ることができ、疲労が知らず知らずのうちに蓄積して引き起こされる種々の疾患の発生を回避できる。さらに、疲労の蓄積による最大の死因の一つである自殺の引き金になる、うつ症状を簡便に判定することも可能となるので、疲労を意識せずに働き続けることにより発生する過労死や自殺の発生率を低下させることもできる。   The present invention provides a method, a kit, and a method for using the method for simply and quantitatively measuring and evaluating the degree of fatigue in daily life. For this reason, according to the present invention, it is possible to objectively know the degree of fatigue in daily life, and it is possible to avoid the occurrence of various diseases that are accumulated and caused without knowing fatigue. Furthermore, it is possible to easily determine the depressive symptoms that trigger suicide, which is one of the biggest causes of death due to the accumulation of fatigue, so overwork death and suicide caused by continuing to work without being aware of fatigue. It is also possible to reduce the occurrence rate.

さらに、本発明によれば、市場に数多く供給される、疲労回復、滋養強壮・栄養補給を謳う医薬品や食品さらには疲労回復効果を謳った健康器具や電化製品などがどの程度生体において抗疲労力を発揮するのか、といった情報を消費者及び社会に提供することができる。これらの情報は、消費者にとって、疲労の予防や、滋養強壮に有効な抗疲労食品や医薬品、健康器具などを選択する際の一つの目安として利用することができるものであり、これらの点において、本発明は非常に有用かつ社会的インパクトの強い発明である。   Furthermore, according to the present invention, the amount of anti-fatigue power in the living body, such as pharmaceuticals and foods that provide fatigue recovery, nourishing tonics and nutritional supplements, and health appliances and electrical appliances that are effective for fatigue recovery, which are supplied to the market Can provide information to consumers and society. This information can be used as a guideline for consumers to select anti-fatigue foods, medicines, and health equipment that are effective in preventing fatigue and nourishing. The present invention is very useful and has a strong social impact.

実施例1における疲労によるeIF-2α、PKRのリン酸化とATF4タンパク産生の亢進を示すウェスタンブロッティングの写真および各バンドを定量化したグラフである。2 is a photograph of Western blotting showing phosphorylation of eIF-2α and PKR and enhancement of ATF4 protein production due to fatigue in Example 1, and a graph quantifying each band. 実施例2における精神疲労による各種臓器でのATF3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in ATF3 in various organs by the mental fatigue in Example 2. FIG. 実施例3における肉体疲労による各種臓器でのATF3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in ATF3 in various organs by the physical fatigue in Example 3. FIG. 実施例4におけるヒトの末梢血液を用いたATF3による肉体疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the physical fatigue by ATF3 using the human peripheral blood in Example 4. FIG. 実施例5における肉体疲労と精神疲労による肝臓でのCHOPの増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in CHOP in the liver by the physical fatigue and mental fatigue in Example 5. 実施例6におけるヒトの末梢血液を用いたCHOPによる肉体疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the physical fatigue by CHOP using the human peripheral blood in Example 6. FIG. 実施例7におけるATF3導入による疲労の誘導を示す図である。It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of the fatigue by ATF3 introduction | transduction in Example 7. FIG. 実施例8におけるATF3の発現抑制による疲労の軽減効果を示す図である。It is a figure which shows the reduction effect of the fatigue | exhaustion by the expression suppression of ATF3 in Example 8. 実施例9におけるATF3導入によるATF3と炎症性サイトカインの遺伝子発現を示す図である。It is a figure which shows the gene expression of ATF3 and inflammatory cytokine by ATF3 introduction | transduction in Example 9. 図9−1の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIGS. 実施例10における疲労による干渉RNAの誘導を示す図である。FIG. 10 shows interference RNA induction by fatigue in Example 10. 図10−1の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIG. 実施例11における疲労による干渉RNA関連分子の誘導を示す図である。FIG. 10 shows the induction of interfering RNA-related molecules by fatigue in Example 11. 実施例12におけるヒトの血液中の干渉RNA関連分子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the interference RNA related molecule | numerator in the human blood in Example 12. FIG. 実施例13におけるヒトの血液中の小胞体ストレス関連分子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the endoplasmic reticulum stress related molecule | numerator in the human blood in Example 13. FIG. 実施例14におけるPoly(I:C)の腹腔投与によるATF3の遺伝子発現がほとんどないことを示す図である。It is a figure which shows that there is almost no gene expression of ATF3 by intraperitoneal administration of Poly (I: C) in Example 14. 実施例15における精神疲労と肉体疲労による各種臓器でのeIF-2αリン酸化抑制因子の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in the eIF-2 (alpha) phosphorylation inhibitory factor in various organs by the mental fatigue and physical fatigue in Example 15. 図15−1の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIG. 実施例16におけるヒトの血液中のeIF-2αリン酸化抑制因子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the eIF-2 (alpha) phosphorylation inhibitory factor in the human blood in Example 16. 実施例17におけるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子を用いた疲労回復法と抗疲労成分の効果判定を示す図である。It is a figure which shows the fatigue recovery method using the eIF-2 (alpha) phosphorylation signal transduction factor and the eIF-2 (alpha) phosphorylation signal inhibitory factor in Example 17, and the effect determination of an anti-fatigue component. 実施例18における慢性疲労症候群患者の疲労関連因子による疲労測定を示す図である。It is a figure which shows the fatigue measurement by the fatigue related factor of the chronic fatigue syndrome patient in Example 18. FIG. 実施例19におけるうつ病性障害患者の疲労測定結果を示す図である。It is a figure which shows the fatigue measurement result of the depression disorder patient in Example 19. FIG. 実施例20における疲労のVASと唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)の組合せによる、うつ状態の簡易診断法を示す図である。It is a figure which shows the simple diagnosis method of the depression state by the combination of fatigue VAS and the human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva in Example 20. 実施例21における精神疲労による各臓器でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in ZFP36 in each organ by mental fatigue in Example 21. FIG. 実施例22における精神疲労による各臓器でのTSC22D3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in TSC22D3 in each organ by mental fatigue in Example 22. FIG. 実施例23における肉体疲労による各臓器でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in ZFP36 in each organ by the physical fatigue in Example 23. 実施例24における肉体疲労による各臓器でのTSC22D3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in TSC22D3 in each organ by the physical fatigue in Example 24. 実施例25における精神疲労によるヒトの末梢血でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in ZFP36 in the human peripheral blood by mental fatigue in Example 25. 実施例26におけるeIF-2αリン酸化シグナル阻害剤ISRIBによるマウスの強制水泳移動距離の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in the forced swimming movement distance of the mouse | mouth by the eIF-2 (alpha) phosphorylation signal inhibitor ISRIB in Example 26. 実施例27におけるeIF-2αの脱リン酸化阻害剤salubrinalによるマウスの強制水泳移動距離の減少を示す図である。It is a figure which shows the reduction | decrease of the forced swimming movement distance of the mouse | mouth by eIF-2 (alpha) dephosphorylation inhibitor salubrinal in Example 27.

以下、本発明にかかる疲労度評価方法、キット、及び利用法について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。   Hereinafter, although the fatigue evaluation method, kit, and utilization method concerning this invention are demonstrated, this invention is not limited to this.

本明細書における「疲労」とは、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられたときにみられる一時的な身体的・精神的機能および体力の質的あるいは量的な低下現象で、生理的疲労と病的疲労に分類される。本明細書における「生理的疲労」とは、健康な人が、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられたときにみられる一時的な身体的および精神的作業能力の質的あるいは量的な低下現象を意味する。「病的疲労」とは、慢性疲労症候群、精神疾患、中枢神経系疾患、心臓病、肝炎、貧血、各種感染症、悪性腫瘍などの疾患にともなう疲労を意味する。   In this specification, “fatigue” is a temporary physical / mental function and physical qualitative or quantitative decrease in physical strength that occurs when a physical or mental load is continuously applied. It is classified into physical fatigue and morbid fatigue. As used herein, “physiological fatigue” refers to the qualitative or quantitative nature of temporary physical and mental work abilities seen when a healthy person is given physical or mental loads continuously. It means a serious decline phenomenon. “Pathologic fatigue” means fatigue associated with diseases such as chronic fatigue syndrome, mental illness, central nervous system disease, heart disease, hepatitis, anemia, various infectious diseases, and malignant tumors.

「病的疲労」の中でも特に、慢性疲労症候群(CFS)やうつ病などの中枢神経系の疾患による疲労は、特に疲労の負荷がないにも関わらず脳が異常な疲労感を感じるもので、「pathological fatigue」として生理的疲労や他の病的疲労と区別される。生理的疲労やpathological fatigue以外の病的疲労は「nonpathological fatigue」と呼ばれ、末梢の臓器や組織における疲労が何らかの方法で脳に伝わり、脳が疲労を感じることで生じる。これに対し、pathological fatigueは、末梢には原因はなく、脳に異常が生じていることで疲労感を感じるものである。すなわち、nonpathological fatigueは末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労、pathological fatigueは脳の疾患による疲労と言える。本明細書におけるnonpathological fatigueは、生理的疲労のすべてと、末梢臓器や末梢組織が疲労の原因となる病的疲労を含んだ疲労を表す。   Among `` pathological fatigue '', fatigue due to diseases of the central nervous system such as chronic fatigue syndrome (CFS) and depression is something that the brain feels abnormally tired even though there is no fatigue load, “Pathological fatigue” is distinguished from physiological fatigue and other pathological fatigue. Pathological fatigue other than physiological fatigue and pathological fatigue is called "nonpathological fatigue" and occurs when fatigue in peripheral organs and tissues is transmitted to the brain in some way and the brain feels fatigue. Pathological fatigue, on the other hand, has no cause in the periphery, and feels fatigue due to abnormalities in the brain. That is, nonpathological fatigue can be said to be fatigue caused by peripheral organs and tissues, and pathological fatigue can be said to be fatigue caused by brain diseases. Nonpathological fatigue in this specification represents fatigue including all physiological fatigue and pathological fatigue in which peripheral organs and tissues cause fatigue.

「生理的疲労」はさらに、「急性疲労」と「持続的疲労」に分類される。本明細書における「急性疲労」とは、適切な休息によって回復する一過性の疲労を意味する。また、「持続的疲労」とは、日々の回復が不完全なために疲労が蓄積した、長期間にわたる疲労を意味する。本明細書における中長期的疲労とは、上記持続的疲労に至る前の急性疲労を意味する。   “Physiological fatigue” is further classified into “acute fatigue” and “continuous fatigue”. As used herein, “acute fatigue” means transient fatigue that is recovered by appropriate rest. “Sustained fatigue” means fatigue over a long period in which fatigue has accumulated due to incomplete daily recovery. The term “medium- to long-term fatigue” in this specification means acute fatigue before reaching the above-mentioned persistent fatigue.

「急性疲労」、及び「持続的疲労」はそれぞれ、「精神疲労」と「肉体疲労」に分類される。本明細書における「精神疲労」とは、複雑な計算や記憶、または思考などの心理活動ばかりでなく、我慢や緊張または時間に追われて作業をすることの焦操感など、感情や意思の活動が過度に要求された場合に生じる、睡眠不足、眼精疲労、心的ストレスを含む疲労を意味する。また、本明細書における「肉体疲労」とは、肉体的作業の遂行や運動によって起こる疲労を意味する。さらに、本明細書における「疲労負荷」とは、上記疲労を与えることを意味する。   “Acute fatigue” and “persistent fatigue” are classified into “mental fatigue” and “physical fatigue”, respectively. “Mental fatigue” in this specification means not only complicated calculations, memories, or psychological activities such as thinking, but also emotional and intentional feelings such as the feeling of working with patience, tension, or time. It means fatigue, including lack of sleep, eye strain, and mental stress, caused by excessive demand for activity. In addition, “physical fatigue” in this specification means fatigue caused by performing physical work or exercise. Furthermore, “fatigue load” in this specification means giving the fatigue.

本明細書における「疲労度」とは、上記に挙げた各種の「疲労」の結果生じた、過度の肉体的、精神的な活動または、疾患の影響により生じた「疲労感」を伴う身体・精神機能および体力の減弱状態の度合いをいう。   In this specification, “fatigue level” refers to a body / body with excessive physical and mental activities or “fatigue” caused by the effects of the disease resulting from the various “fatigue” listed above. Degree of mental function and physical strength.

本明細書における「疲労感」とは、上記に挙げた各種の「疲労」の結果生じた、脳が疲労を感じる感覚で、「疲れ」や「倦怠感」などの独特の不快感と休養を求める欲求を伴う感覚である。   In this specification, “fatigue” is a feeling that the brain feels fatigue resulting from the various types of “fatigue” mentioned above, and has a unique discomfort and rest such as “fatigue” and “fatigue”. It is a sense accompanied by the desire to seek.

本発明は、上記に挙げた各種の「疲労」の全てを対象とするものであるが、なかでも、nonpathological fatigueであることが好ましい。nonpathological fatigueの中でも急性疲労または中長期疲労であることが好ましい。なお、nonpathological fatigueには、ガン患者の疲労など、病気による疲労も含まれ、このような疲労の測定も本発明の重要な使用法の一つである。また、本発明の対象は、うつ症状や精神疾患にともなう、病的疲労のうちのpathological fatigueが好ましい。   The present invention is intended for all of the various types of “fatigue” mentioned above, and among them, nonpathological fatigue is preferable. Among nonpathological fatigue, acute fatigue or medium to long-term fatigue is preferable. Note that nonpathological fatigue includes fatigue due to illness, such as fatigue of cancer patients, and measurement of such fatigue is one of the important uses of the present invention. In addition, the subject of the present invention is preferably pathological fatigue of pathological fatigue associated with depressive symptoms and mental illness.

本発明を実施するために最適な疲労に関連する因子(疲労関連因子)の条件としては、ヒトおよび動物のnonpathological fatigueに関連する因子であること、および測定することが簡単に行えることが挙げられる。   Conditions for optimal fatigue-related factors (fatigue-related factors) for carrying out the present invention include factors related to human and animal nonpathological fatigue, and ease of measurement. .

上記条件を満たす疲労関連因子としては、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子(リン酸化されたeIF-2α、ATF3、ATF4、CHOP)、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子(GADD34、Nck1、Nck2、CReP、ZFP36、GILZ)、eIF-2αリン酸化誘導関連因子(siRNA、miRNAなどの干渉RNA、PKR、 GRP78、XBP-1)、および干渉RNA関連因子(Dgcr8、Drosha)などのeIF-2αリン酸化関連因子、ならびに、ヒトヘルペスウイルス(HHV-6、HHV-7)が好適であると考えられる。なお、本明細書において、これらの因子について用いる「遺伝子」なる用語は、当該因子であるタンパク質もしくは干渉RNA分子またはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれをも含む概念を意味し、当該タンパク質もしくは干渉RNA分子と、当該ポリヌクレオチドとの両方について言及する場合には、当該因子について「遺伝子または遺伝子産物」と表現する場合がある。   Fatigue-related factors that satisfy the above conditions include eIF-2α phosphorylation signaling factor (phosphorylated eIF-2α, ATF3, ATF4, CHOP), eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor (GADD34, Nck1, Nck2, CReP , ZFP36, GILZ), eIF-2α phosphorylation-related factors (interfering RNAs such as siRNA and miRNA, PKR, GRP78, XBP-1), and interfering RNA-related factors (Dgcr8, Drosha) Factors and human herpesviruses (HHV-6, HHV-7) are considered suitable. In this specification, the term “gene” used for these factors means a concept including both the protein or interfering RNA molecule that is the factor or a polynucleotide encoding them, and the protein or interfering RNA. When referring to both a molecule and the polynucleotide, the factor may be expressed as a “gene or gene product”.

また、これらの因子は疲労負荷によって細胞中でのmRNA量またはタンパク量(当該因子がsiRNAやmiRNAなどの干渉RNA分子である場合、当該RNAの量)が増加するので、ヒトでは血液細胞中のmRNA量またはタンパク量(あるいは干渉RNAの量)を、動物モデルでは、血液や各種臓器中のmRNA量またはタンパク量(あるいは干渉RNAの量)を測定すれば、疲労に伴う変化を簡単に測定することができる。ヒトヘルペスウイルスに関しては、唾液中にウイルスDNAが放出されることが知られているので、唾液中のウイルスDNAを測定すれば、簡便に測定することができる。   In addition, these factors increase the amount of mRNA or protein in cells due to fatigue load (if the factor is an interfering RNA molecule such as siRNA or miRNA), the amount of RNA in humans increases in blood cells. By measuring the amount of mRNA or protein (or the amount of interfering RNA), and in animal models, the amount of mRNA or protein (or the amount of interfering RNA) in blood or various organs, changes associated with fatigue can be measured easily. be able to. Regarding human herpesviruses, it is known that viral DNA is released into saliva. Therefore, it can be easily measured by measuring viral DNA in saliva.

さらに、eIF2αおよび一部のeIF-2αリン酸化関連因子には、リン酸化によって疲労の発生を誘導し、脱リン酸化によって抗疲労効果と関係する因子がある。ヒトでは血液やバイオプシー、病理標本、法医学標本における各種臓器中でのリン酸化の度合いを、動物モデルでは血液や各種臓器中でのリン酸化の度合いを測定すれば、疲労に伴う変化を簡単に測定することができる。   Furthermore, eIF2α and some eIF-2α phosphorylation-related factors include factors that induce the occurrence of fatigue by phosphorylation and are related to the anti-fatigue effect by dephosphorylation. By measuring the degree of phosphorylation in various organs in blood, biopsy, pathological specimens, and forensic specimens in humans, and measuring the degree of phosphorylation in blood and various organs in animal models, changes due to fatigue can be easily measured. can do.

以下に、本発明の概要を簡単に説明する。ここで述べる方法の概要は、後述するキット及び利用方法にも共通する部分が多分に存在する。   The outline of the present invention will be briefly described below. In the outline of the method described here, there are many parts common to the kit and the usage method described later.

(1)疲労度評価方法
本発明者らは、ヒトにおいては被験者から採取された血液について、動物においては採取された血液または各種臓器や組織について細胞中に存在する上記疲労関連因子の量を測定することにより、ヒトおよび動物の疲労度を簡便かつ定量的に測定することができることを見出した。なおヘルペスウイルスに関しては、ヒトのみが適応となり、唾液を測定に用いる。この方法は、大掛かりな装置が必要ないだけでなく、ヒトにおける血液の採取時間が短いことから、被験者にとって時間的拘束が少なく、また、方法の実施者にとっても非常に簡便な方法である。
(1) Fatigue degree evaluation method The present inventors measured the amount of the fatigue-related factor present in cells of blood collected from a subject in humans, blood collected in animals or various organs and tissues in animals. By doing so, it was found that the degree of fatigue of humans and animals can be measured easily and quantitatively. Regarding herpes virus, only humans are indicated, and saliva is used for measurement. This method not only requires a large-scale apparatus, but also has a short time for blood collection in humans, so there are few time constraints for the subject, and it is a very simple method for the person who performs the method.

本発明の対象となる疲労関連因子としては、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子(リン酸化されたeIF-2α、ATF3、ATF4、CHOP)、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子(GADD34、Nck1、Nck2、CReP、ZFP36、GILZ)、eIF-2αリン酸化誘導関連因子(siRNA、miRNAなどの干渉RNA、PKR、GRP78、XBP-1)、干渉RNA関連因子(Dgcr8、Drosha)、ヒトヘルペスウイルス(HHV-6、HHV-7)が好適である。   The fatigue-related factors that are the subject of the present invention include eIF-2α phosphorylation signaling factor (phosphorylated eIF-2α, ATF3, ATF4, CHOP), eIF-2α phosphorylation signal inhibitor (GADD34, Nck1, Nck2 , CReP, ZFP36, GILZ), eIF-2α phosphorylation-related factors (siRNA, miRNA and other interfering RNAs, PKR, GRP78, XBP-1), interfering RNA-related factors (Dgcr8, Drosha), human herpesvirus (HHV- 6, HHV-7) is preferred.

本発明の対象となる細胞は血液および各種臓器や組織から選ばれる少なくとも一種以上であればよいが、ヒトでは血液が、実験動物では各種臓器が好適である。   The cells to be the subject of the present invention may be at least one selected from blood and various organs and tissues, but blood is suitable for humans and various organs for laboratory animals.

血液の採取方法は、mRNAによる測定の利便性を考慮して、Paxgene RNA採血管による採血が好適である。動物モデルでは、RNA保護剤を用いる方法が望ましい。   The blood collection method is preferably blood collection using a Paxgene RNA blood collection tube in consideration of the convenience of measurement using mRNA. In animal models, a method using an RNA protecting agent is desirable.

細胞中の上記疲労関連因子の量の測定は従来公知の方法であればよく、具体的な手法、条件などは、当業者であれば適宜設定可能である。mRNA、siRNA、miRNAなどのRNA分子の量を測定する方法やタンパク質の量を測定する方法などがある。   The measurement of the amount of the fatigue-related factor in the cells may be a conventionally known method, and specific methods and conditions can be appropriately set by those skilled in the art. There are a method for measuring the amount of RNA molecules such as mRNA, siRNA, miRNA, and a method for measuring the amount of protein.

上記疲労関連因子のmRNAの量を測定する方法としては、例えば、血液細胞からRNAを精製し、それぞれの疲労関連因子に特異的なリアルタイムPCR(Real-time PCR)用のプライマーとプローブを用いて、mRNA量をReal-time PCR法により測定する方法等が挙げられる。siRNAやmiRNAなどのRNA分子の量についても同様に、当該RNA分子に特異的なリアルタイムPCR(Real-time PCR)用のプライマーとプローブを用いて発現量を測定することができる。ウイルスDNAに関しては、唾液中のDNAを精製し、ウイルス特異的なReal-time PCR法により測定する方法(参考資料:特許第4218842号、特許第4812708号)等が挙げられる。本発明においては、リアルタイムPCR法 (Real-time PCR) が好適である。   As a method for measuring the amount of mRNA of the fatigue-related factor, for example, RNA is purified from blood cells, and a primer and a probe for real-time PCR specific to each fatigue-related factor are used. And a method for measuring the amount of mRNA by Real-time PCR. Similarly, the amount of RNA molecules such as siRNA and miRNA can be measured using primers and probes for real-time PCR specific to the RNA molecule. Examples of viral DNA include a method in which DNA in saliva is purified and measured by a virus-specific Real-time PCR method (reference materials: Patent No. 4218842, Patent No. 4812708). In the present invention, the real-time PCR method is preferred.

上記疲労関連因子タンパクの量を測定する方法としては、例えば、ウイルスタンパクに対する抗体を用いた免疫測定法(イムノアッセイ法)がある。代表的な免疫測定法として、例えばサンドイッチELISA法などが挙げられる(参考文献:J. Clin. Microbiol. 1983 May;17(5):942-4.「Typing of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosorbent assay: comparison between indirect and double-antibody sandwich techniques.」Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.)。   Examples of a method for measuring the amount of the fatigue-related factor protein include an immunoassay method (immunoassay method) using an antibody against a viral protein. As a typical immunoassay method, for example, a sandwich ELISA method is cited (reference: J. Clin. Microbiol. 1983 May; 17 (5): 942-4. “Typing of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosorbent”. assay: comparison between indirect and double-antibody sandwich techniques. "Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.).

また、本発明に係る疲労度測定方法においては、被験対象生物から採取された細胞中の疲労関連因子の量がより多いかまたは少なければ当該生物の疲労度がより高いと評価することができるが、細胞中の上記疲労関連因子の量がより多ければ被験者および被験動物の疲労度がより高いと評価することが好適である。これは、後述する実施例に示すように、被験者および被験動物の疲労度が高まれば、それに応じて上記疲労関連因子の細胞中の発現量が上昇することから導かれる。細胞中の上記疲労関連因子の量は、所定の基準値(対照値)と比較して評価することが好適である。すなわち、好適には、本発明に係る疲労度測定方法は、被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量が所定の基準値より有意に多ければ、当該被験対象生物の疲労度が高いと評価することを特徴とする。本発明の一態様において、上記基準値は、疲労負荷を受ける前、十分な休息をとった後(好ましくは休息の直後)、抗疲労物質を摂取した後、または抗疲労法を実施した後の被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量である。あるいは、上記基準値は、当該被験対象生物と同一の生物種であって、疲労負荷を与えられていない、休息をとった、抗疲労物質を摂取した、または抗疲労法を実施した生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量であってもよく、当該基準値は予め測定された値であってもよい。
ヒトヘルペスウイルスの場合は、後述する実施例に示すように、自覚的疲労感との比較が重要である。
Further, in the fatigue level measurement method according to the present invention, if the amount of fatigue-related factors in the cells collected from the test target organism is larger or smaller, it can be evaluated that the level of fatigue of the organism is higher. It is preferable to evaluate that the fatigue level of the subject and the test animal is higher when the amount of the fatigue-related factor in the cell is larger. This is derived from the fact that the expression level of the fatigue-related factor in the cells increases in accordance with the increase in the fatigue level of the subject and the test animal, as shown in the examples described later. The amount of the fatigue-related factor in the cells is preferably evaluated by comparison with a predetermined reference value (control value). That is, preferably, in the method for measuring fatigue level according to the present invention, if the amount of the fatigue-related factor in the cells collected from the test target organism is significantly greater than a predetermined reference value, the fatigue level of the test target organism is determined. It is characterized by being evaluated as high. In one embodiment of the present invention, the reference value may be determined after receiving a fatigue load, after taking sufficient rest (preferably immediately after rest), after taking an anti-fatigue substance, or after performing an anti-fatigue method. It is the amount of the fatigue-related factor in cells collected from the test subject organism. Alternatively, the reference value is collected from an organism that is the same species as the subject organism and is not fatigued, rested, ingested an anti-fatigue substance, or has undergone an anti-fatigue method. The amount of the fatigue-related factor in the cells thus obtained may be used, and the reference value may be a value measured in advance.
In the case of human herpesvirus, as shown in the examples described later, it is important to compare with subjective fatigue.

さらに、本発明にかかる疲労度評価方法の一部あるいは全部をコンピュータ等の従来公知の演算装置(情報処理装置)を利用して行うことも可能であることは、当業者には明らかである。例えば、本発明にかかる疲労度評価方法は、血液細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する測定工程と、血液細胞中の疲労関連因子の量の測定結果に応じて被験者の疲労度を評価する評価工程とを含むと換言できるが、この中でも、特に評価工程に演算装置を利用することができる。   Furthermore, it will be apparent to those skilled in the art that part or all of the fatigue evaluation method according to the present invention can be performed using a conventionally known arithmetic device (information processing device) such as a computer. For example, the fatigue level evaluation method according to the present invention includes a measurement step for measuring the amount of the fatigue-related factor in blood cells, and evaluates the fatigue level of the subject according to the measurement result of the amount of the fatigue-related factor in blood cells. In other words, an arithmetic unit can be used particularly for the evaluation process.

(2)疲労度評価キット
次に、本発明にかかる疲労度評価キットについて説明する。本発明にかかる疲労度評価キットは、ヒトまたは動物における疲労度を評価するキットである。すなわち、上記(1)欄で説明した本発明にかかる疲労度評価方法を実施するためのキットであればよい。詳細には、被験生物の細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する手段を含むキットであればよい。本発明における細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する手段としては、従来公知の測定方法を実施するために必要な手段であればよい。従来公知の測定方法を実施するために必要な手段とは、具体的には、例えば、上記(1)欄で説明した細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する方法を実施するために必要な試薬、器具、装置、触媒その他のものをいい、好ましくは本発明の対象となる疲労関連因子の量を特異的に測定するためのプローブ、プライマー、または抗体等が挙げられる。本発明にかかる疲労度評価キットは、被験生物の細胞を採取するための手段を含んでいてもよい。また、その包装材に付されたラベル又は添付された文書に、細胞中の上記疲労関連因子のうち少なくとも一種の量を指標として被験者の疲労度を評価するために使用できることが表示されていてもよい。
(2) Fatigue degree evaluation kit Next, the fatigue degree evaluation kit according to the present invention will be described. The fatigue evaluation kit according to the present invention is a kit for evaluating fatigue in humans or animals. That is, the kit may be any kit for carrying out the fatigue evaluation method according to the present invention described in the above section (1). Specifically, it may be a kit including means for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells of the test organism. The means for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells in the present invention may be any means necessary for carrying out a conventionally known measurement method. The means necessary for carrying out the conventionally known measurement method is specifically, for example, necessary for carrying out the method for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells described in the above section (1). Such as a probe, a primer, or an antibody for specifically measuring the amount of a fatigue-related factor that is a subject of the present invention. The fatigue evaluation kit according to the present invention may include means for collecting cells of a test organism. In addition, even if the label attached to the packaging material or the attached document indicates that it can be used to evaluate the fatigue level of the subject using at least one of the fatigue-related factors in the cells as an indicator. Good.

さらに本発明にかかる疲労度評価キットを用いる疲労度評価には、コンピュータなどの従来公知の演算装置を使用してもよい。   Further, a conventionally known arithmetic device such as a computer may be used for the fatigue evaluation using the fatigue evaluation kit according to the present invention.

(3)疲労度評価方法及び疲労度評価キットの利用法
以上のように、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットを用いて、被験生物が抗疲労物質を摂取する前後または抗疲労法を実施する前後において、被験生物の細胞中の上記疲労関連因子の量を測定することで、当該抗疲労物質または抗疲労法候補の被験生物生体内における抗疲労力(抗疲労効果)を定量的に測定・評価することができる。さらに、かかる方法、キットはいずれも簡便であるだけでなく、大掛かりな装置や長時間における拘束が必要ないため、被験者及び実施者の両者にとって非常に取り扱いやすいものであるという利点がある。
(3) Fatigue level evaluation method and usage method of fatigue level evaluation kit As described above, before and after ingesting anti-fatigue substances by test organisms using the fatigue level evaluation method and fatigue level evaluation kit according to the present invention or anti-fatigue Measure the amount of the above fatigue-related factors in the cells of the test organism before and after performing the method to quantify the anti-fatigue power (anti-fatigue effect) of the anti-fatigue substance or anti-fatigue method candidate in the test organism Can be measured and evaluated automatically. Furthermore, both of these methods and kits are not only simple, but also have the advantage that they are very easy to handle for both the subject and the practitioner because they do not require a large-scale device or long-term restraint.

このため、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを用いて、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力(抗疲労効果)を測定する方法も本発明に含まれる。かかる抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力測定方法は、例えば、
(i) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する摂取前上記疲労関連因子量測定工程と、
(ii) 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する摂取後上記疲労関連因子量測定工程と、
(iii) (i)の摂取前上記疲労関連因子量測定工程、及び(ii)の摂取後上記疲労関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における上記疲労関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中の上記疲労関連因子量の変化を算出する上記疲労関連因子量変化算出工程と、
(iv) (iii)の上記疲労関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中の上記疲労関連因子量変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程と
を含む方法と換言することもできる。
Therefore, a method for measuring the anti-fatigue substance (anti-fatigue effect) of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate using either the fatigue evaluation method or the fatigue evaluation kit according to the present invention is also included in the present invention. It is. The anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate anti-fatigue power measurement method is, for example,
(I) The fatigue-related factor before ingestion that measures the amount of the fatigue-related factor in cells collected from the subject organism before the test subject ingests the anti-fatigue substance candidate or conducts the anti-fatigue method candidate. A quantity measuring step;
(Ii) The amount of the fatigue-related factor after ingestion that measures the amount of the fatigue-related factor in cells collected from the test subject after the test organism has ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate Measuring process;
(Iii) Ingestion of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate obtained by the step of measuring the amount of fatigue-related factors before ingestion of (i) and the step of measuring the amount of fatigue-related factors after ingestion of (ii) Based on the measurement result of the change in the amount of the fatigue-related factor before and after, the change in the amount of the fatigue-related factor that calculates the change in the amount of the fatigue-related factor in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate A calculation process;
(Iv) Based on the change in the fatigue-related factor amount in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the calculation step of the fatigue-related factor amount change in (iii) In other words, the method includes an anti-fatigue strength measurement step of measuring an anti-fatigue strength in a living body of a substance candidate or an anti-fatigue method candidate.

本発明の抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力を測定する方法においては、さらに、かかる抗疲労物質候補の投与または抗疲労法候補の実施をした被験生物と、当該抗疲労物質候補を投与しなかった、または抗疲労法候補を実施しなかった被験生物において、上記抗疲労力測定方法を実施する方法とすることもできる。   In the method for measuring anti-fatigue power of an anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate of the present invention, a test organism that has administered such an anti-fatigue substance candidate or implemented an anti-fatigue method candidate, and the anti-fatigue substance candidate It is also possible to adopt a method for carrying out the above anti-fatigue power measurement method in a test organism that has not been administered or that has not been subjected to anti-fatigue method candidates.

被験生物における抗疲労物質候補の摂取方法、または抗疲労法候補の実施方法は、当業者であれば適宜設定可能である。本明細書における「摂取」とは、被験生物における当該物質の飲食品としての摂取のみならず、当該物質の経口投与、及び非経口投与のいずれをも意味する。   A person skilled in the art can appropriately set the method of ingesting the anti-fatigue substance candidate in the test organism or the implementation method of the anti-fatigue method candidate. “Ingestion” in the present specification means not only intake of the substance as a food or drink in a test organism, but also oral administration and parenteral administration of the substance.

本明細書における「抗疲労」とは、疲労の回復、抑制、または予防効果を意味する。抗疲労のメカニズムは、結果として疲労を軽減するものであればよく、疲労を予防するものでもよいし、疲労の回復または抑制を促進するものでもよい。抗疲労効果は、抗疲労物質の摂取の他、抗疲労法の実施によってももたらされる。「抗疲労物質」とは、疲労を回復、抑制または予防する効果を有する何らかの方法で体内に摂取可能な分子であり、薬剤、栄養成分、香り成分、気体分子、液体分子、及び生体機能補完物質を含む。「生体機能補完物質」とは、生体のバランスを整える物質を意味し、免疫機能を高める機能を有する物質等を含む。「抗疲労法」とは、疲労を回復、抑制または予防する効果を有する、体操などの運動法、マッサージ、鍼灸などを含む施術、アロマテラピーや催眠術を含む民間療法、寝具などを含む家具、健康器具、照明、エアーコンディショナー、パソコンなどの電化製品を含む抗疲労器具の使用を含む。   “Anti-fatigue” in the present specification means an effect of recovery, suppression or prevention of fatigue. The anti-fatigue mechanism may be any mechanism that reduces fatigue as a result, may be one that prevents fatigue, or may promote recovery or suppression of fatigue. The anti-fatigue effect is brought about not only by the intake of anti-fatigue substances but also by the implementation of an anti-fatigue method. “Anti-fatigue substance” is a molecule that can be taken into the body by any method that has the effect of recovering, suppressing, or preventing fatigue, and is a drug, nutritional component, scent component, gas molecule, liquid molecule, and biological function complementing substance. including. “Biological function-complementing substance” means a substance that adjusts the balance of the living body, and includes substances having a function of enhancing immune function. "Anti-fatigue method" means exercise methods such as gymnastics, massage, treatment including acupuncture, folk remedies including aromatherapy and hypnosis, furniture including bedding, etc., which have the effect of restoring, suppressing or preventing fatigue, Includes the use of anti-fatigue devices including appliances such as health appliances, lighting, air conditioners and personal computers.

また、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットは、例えば、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法に利用することができる。すなわち、本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法は、上記疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを利用して、抗疲労物質や抗疲労法をスクリーニングする方法であればよく、その具体的な方法、条件などは限定されるものではない。   The fatigue evaluation method and the fatigue evaluation kit according to the present invention can be used, for example, as a screening method for anti-fatigue substances and anti-fatigue methods. That is, the screening method for anti-fatigue substances and anti-fatigue methods according to the present invention is a method for screening anti-fatigue substances and anti-fatigue methods using any one of the above fatigue evaluation methods and fatigue evaluation kits. Well, the specific method, conditions, etc. are not limited.

上記スクリーニング方法によれば、例えば、抗疲労食品として利用可能と思われる食品を被験生物に経口摂取させて、実際にin vivoで優れた抗疲労能を示す食品を簡便かつ客観的に選択することができる。したがって、上記スクリーニング方法により得られた抗疲労物質や抗疲労食品は、生体における効果が証明されたものであり、市場において高い評価を獲得することができる。抗疲労法も同様にin vivoでの選択が可能で、市場において高い評価を獲得することができる。   According to the above screening method, for example, a test organism can be orally ingested with a food that seems to be usable as an anti-fatigue food, and a food that actually shows excellent anti-fatigue ability in vivo can be selected simply and objectively. Can do. Therefore, the anti-fatigue substances and anti-fatigue foods obtained by the screening method have been proven to be effective in the living body and can be highly evaluated in the market. The anti-fatigue method can be selected in vivo as well, and can be highly evaluated in the market.

本発明にかかる新規抗疲労物質や新規抗疲労法は、上記スクリーニング方法により取得されたものであればよく、上記のスクリーニング方法により取得された抗疲労物質や抗疲労法も本発明に含まれる。そのような抗疲労物質や抗疲労法は、好ましくは、(i)eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子、eIF-2αリン酸化誘導関連因子または干渉RNA関連因子(すなわち、疲労の発生に関係する因子)のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害し;かつ/あるいは(ii)eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子(すなわち、疲労の回復または抑制に関係する因子)のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強することによって抗疲労効果を発揮することができる。   The new anti-fatigue substance and the new anti-fatigue method according to the present invention may be those obtained by the above screening method, and the anti-fatigue substance and the anti-fatigue method obtained by the above screening method are also included in the present invention. Such anti-fatigue substance or anti-fatigue method is preferably (i) an eIF-2α phosphorylation signaling factor, an eIF-2α phosphorylation induction related factor or an interfering RNA related factor (ie, factors related to the occurrence of fatigue) And / or (ii) the expression or function of at least one of eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor (ie, a factor related to recovery or suppression of fatigue). The anti-fatigue effect can be exhibited by strengthening.

抗疲労効果は、好ましくは、eIF-2αリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制することによって発揮され、例えば、eIF-2αのリン酸化を阻害する、eIF-2αの脱リン酸化を促進する、またはeIF-2αリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制することによって発揮される。したがって、本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法の抗疲労効果の強さは、当該抗疲労物質や抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを指標として評価することができる。そのような効果を発揮する抗疲労物質は抗疲労剤として有用であり得、例えば、eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質(eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤)であるISRIB、eIF-2αのリン酸化を阻害する物質(eIF-2αリン酸化阻害剤)であるGSK2606414等を挙げることができるが、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する物質を有効成分として含有する限りにおいて特に限定されない。   The anti-fatigue effect is preferably exerted by suppressing the effects of signal transduction pathways involving eIF-2α phosphorylation, for example, promoting eIF-2α dephosphorylation, inhibiting eIF-2α phosphorylation Or exerted by inhibiting the activity of signal transduction pathways induced by eIF-2α phosphorylation. Accordingly, the strength of the anti-fatigue effect of the anti-fatigue substance or anti-fatigue method according to the present invention is the effect of suppressing the effect of the signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α by the anti-fatigue substance or anti-fatigue method. Can be evaluated as an index. Anti-fatigue substances that exhibit such effects can be useful as anti-fatigue agents, for example, substances that suppress the activity of signal transduction pathways induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation signal inhibitors ) ISRIB, a substance that inhibits phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor) GSK2606414, etc., but the effects of signal transduction pathways related to phosphorylation of eIF-2α There is no particular limitation as long as the substance to be suppressed is contained as an active ingredient.

また、本発明は、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する(例えば、eIF-2αのリン酸化を阻害する、eIF-2αの脱リン酸化を促進する、またはeIF-2αリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する)効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程を含む、疲労を軽減する(疲労を回復させるかまたは抑制する)方法にも関する。本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法、および本発明にかかる疲労を軽減する(疲労を回復させるかまたは抑制する)方法が対象とする疲労は、好ましくは、生理的疲労を含むnonpathological fatigue、すなわち末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労であり、例えば、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労が挙げられる。   The present invention also suppresses the effects of signal transduction pathways related to phosphorylation of eIF-2α (eg, inhibits phosphorylation of eIF-2α, promotes dephosphorylation of eIF-2α, or eIF- 2) Reducing fatigue, including ingesting anti-fatigue substances that exhibit an effect that suppresses the activity of signal transduction pathways induced by 2α phosphorylation, or implementing an anti-fatigue method that exhibits that effect. It also relates to methods of recovery or suppression). The fatigue targeted by the anti-fatigue substance and anti-fatigue method according to the present invention and the method of reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue) according to the present invention is preferably nonpathological fatigue including physiological fatigue, That is, fatigue caused by peripheral organs and tissues, such as mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.

また、疲労が社会問題化されるにつれて、抗疲労機能を謳った抗疲労物質、抗疲労食品、抗疲労法が種類、数量とともに増加してきており、これらの食品や方法の抗疲労力を適切に評価する方法の開発も強く求められているが、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットおよびその利用法によれば、この要求にも応えることができる。   In addition, as fatigue becomes a social problem, anti-fatigue substances, anti-fatigue foods, and anti-fatigue methods with anti-fatigue functions have been increasing with types and quantities, and the anti-fatigue power of these foods and methods has been increased appropriately. Development of a method for evaluation is also strongly demanded. However, according to the fatigue evaluation method, fatigue evaluation kit, and usage thereof according to the present invention, this requirement can be met.

さらに、本発明で示される疲労度評価方法は、nonpathological fatigueとpathological fatigueとを判別する方法(疲労の質を評価する方法)、すなわち、疲労現象の原因が末梢にあるか脳や精神的なものにあるかを判別する方法として利用することができる。また、当該方法をVASなどの自覚的疲労度の測定と組合せることによって、健常者におけるうつ状態を検出することが可能であり、労働者のメンタルヘルスやメンタルケアにおける簡便で客観的な評価方法となる。   Further, the fatigue evaluation method shown in the present invention is a method of discriminating between nonpathological fatigue and pathological fatigue (method of evaluating the quality of fatigue), that is, the cause of the fatigue phenomenon in the periphery, brain or mental It can be used as a method for discriminating whether or not there is. In addition, by combining this method with the measurement of subjective fatigue such as VAS, it is possible to detect depression in healthy individuals, and a simple and objective evaluation method for mental health and mental care of workers. It becomes.

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   Embodiments of the present invention will be described in more detail below with reference to the accompanying drawings. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications are possible. Embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also included in the technical scope of the present invention. .

本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。   All prior art documents cited herein are hereby incorporated by reference.

マウスに疲労負荷を与えることによって、肝臓細胞のeIF-2αのリン酸化とその関連因子の変化を検討した。   We studied the phosphorylation of eIF-2α in liver cells and the related factors by applying fatigue load to mice.

(1)方法
水を1cm張ったケージにマウス(C57BL/6NCrSlc)を24時間置いた。負荷直後のマウス及び対照群として負荷を与えていないマウスから肝臓を摘出し、凍結した。Cell Lysateの中で肝臓を超音波破砕し、そのライセートをUltra-15 遠心式フィルターユニット Ultracel-100 (MILLIPORE)にて遠心、flow throughをUltra-15 遠心式フィルターユニット Ultracel-30 (MILLIPORE)にて遠心し、ライセートを濃縮した。ライセートをSDS-PAGEで分離し、PKR (phospho T451) antibody (ab4818) (abcam) (希釈倍率:1/1000), Anti-PKR antibody [YE350] (ab32052) (abcam) (希釈倍率:1/1000), Phospho-eIF-2α(Ser51) (119A11) antibody (Cell Signaling) (希釈倍率:1/1000), Anti-EIF2S1 (Bio Matrix Research Inc) (希釈倍率:1/100), Anti-ATF4 antibody (ProteinTech Group, Inc) (希釈倍率:1/100), Anti-ACTB (Bio Matrix Research Inc) (希釈倍率:1/200)を1次抗体として、VECTASTAIN ABC キット (VECTOR)を利用して、X線フィルムで検出した。X線フィルム画像における各バンドのdensityをImageJ 1.38(National Institutes of Health)にて定量化した。
(1) Method A mouse (C57BL / 6NCrSlc) was placed in a cage with 1 cm of water for 24 hours. Livers were extracted from mice immediately after loading and mice not subjected to loading as a control group and frozen. Ultrasonic crush the liver in Cell Lysate, centrifuge the lysate with Ultra-15 centrifugal filter unit Ultracel-100 (MILLIPORE), flow through with Ultra-15 centrifugal filter unit Ultracel-30 (MILLIPORE) Centrifuge and concentrate the lysate. Lysates were separated by SDS-PAGE, and PKR (phospho T451) antibody (ab4818) (abcam) (dilution ratio: 1/1000), Anti-PKR antibody [YE350] (ab32052) (abcam) (dilution ratio: 1/1000) ), Phospho-eIF-2α (Ser51) (119A11) antibody (Cell Signaling) (dilution ratio: 1/1000), Anti-EIF2S1 (Bio Matrix Research Inc) (dilution ratio: 1/100), Anti-ATF4 antibody ( ProteinTech Group, Inc) (dilution ratio: 1/100), Anti-ACTB (Bio Matrix Research Inc) (dilution ratio: 1/200) as the primary antibody and X-ray using the VECTASTAIN ABC kit (VECTOR) Detected with film. The density of each band in the X-ray film image was quantified with ImageJ 1.38 (National Institutes of Health).

(2)結果
24時間の疲労負荷によって、肝臓細胞のeIF-2αのリン酸化(図1中、P-eIF2)とeIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル因子であるATF4の産生が亢進することが判った。eIF-2αのリン酸化の亢進の原因には、小胞体ストレス、紫外線刺激、酸化ストレスなどの要因が挙げられるが、Protein kinase RNA-activated (PKR)のリン酸化(図1中、P-PKR)が同時に観察されたことから、何らかのRNAがeIF-2αのリン酸化に関与していることが示された(図1)。
疲労は生体の危険を知らせるアラームであると考えられているが、その内容は、生体の働き過ぎや休息不足を知らせ、生体に「休め」と指令するシグナルである。eIF-2αのリン酸化は、細胞のタンパク合成を強制的に停止させる「休め」のシグナルであり、疲労シグナルが細胞レベルでも発揮されるというこの発見は、疲労の概念と良く一致しており、疲労の根元をなすものと考えられる。
(2) Results
It was found that the 24-hour fatigue load increased the production of ATF4, a signal factor induced by phosphorylation of eIF-2α in the liver cells (P-eIF2 in Fig. 1) and eIF-2α phosphorylation. . Causes of enhanced phosphorylation of eIF-2α include factors such as endoplasmic reticulum stress, ultraviolet light stimulation, and oxidative stress. Protein kinase RNA-activated (PKR) phosphorylation (P-PKR in Fig. 1) Was observed at the same time, indicating that some RNA is involved in phosphorylation of eIF-2α (FIG. 1).
Fatigue is thought to be an alarm that informs the danger of a living body, but its content is a signal that informs the living body of too much work or lack of rest and commands the living body to "rest". Phosphorylation of eIF-2α is a “rest” signal that forcibly stops cellular protein synthesis, and this finding that fatigue signals are also exerted at the cellular level is in good agreement with the concept of fatigue, It is thought to form the basis of fatigue.

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のATF3の増加を測定した。   Using the mouse insomnia model, the increase in ATF3 in the organ due to mental fatigue due to insomnia was measured.

(1)方法
水を1cm張ったケージにマウス(C57BL/6NCrSlc)を置き、負荷直後のマウス(4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 36h負荷)及び対照群として負荷を与えていないマウス(0h)から経時的に臓器を摘出(n=2〜14)し、凍結した。凍結した臓器をホモジナイズし、BioRobot EZ1 workstationとEZ1 RNA Universal Tissue Kit (QIAGEN, Inc.)を用いてRNAを精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いてcDNA を合成した。ATF3、GAPDHのmRNAをApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems)を利用して測定した。測定はduplicateで下記の条件で行った。
リアルタイムPCR条件:FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl、TaqManプローブ (10 μM) 0.625 μl、cDNA 2 μl、PCR-grade water 9.425 μlの計25 μl。初期ステップ 95℃ 10 分、次に95℃ 10秒、60℃ 31 秒を45 サイクル。
プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ATF3 probe, 5'-FAM- CGCCTCAGACTTGGTGACTGACATCTCCA-TAMRA-3'(配列番号:1)
ATF3 forward primer, 5'- AGTCAGTTACCGTCAACAACAGA- 3'(配列番号:2)
ATF3 reverse primer, 5'- CCGCCTCCTTTTCCTCTCATC- 3'(配列番号:3)
GAPDH probe, 5'-FAM- TGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCA-TAMRA-3'(配列番号:4)
GAPDH forward primer, 5'- TGAAGGTCGGTGTGAACGG- 3'(配列番号:5)
GAPDH reverse primer, 5'- CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG- 3'(配列番号:6)
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Place the mouse (C57BL / 6NCrSlc) in a cage with 1 cm of water, and immediately after loading (4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 36h loading) and as a control group no mouse (0h) ), The organs were removed over time (n = 2-14) and frozen. Frozen organs were homogenized, RNA was purified using BioRobot EZ1 workstation and EZ1 RNA Universal Tissue Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). ATF3 and GAPDH mRNA were measured using Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). The measurement was performed in duplicate under the following conditions.
Real-time PCR conditions: FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl, TaqMan probe (10 μM) 0.625 μl, cDNA 2 μl PCR-grade water 9.425 μl, total 25 μl. Initial step 95 ° C 10 minutes, then 95 ° C 10 seconds, 60 ° C 31 seconds 45 cycles.
The probe and primer sequences are as follows.
ATF3 probe, 5'-FAM- CGCCTCAGACTTGGTGACTGACATCTCCA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 1)
ATF3 forward primer, 5'- AGTCAGTTACCGTCAACAACAGA-3 '(SEQ ID NO: 2)
ATF3 reverse primer, 5'- CCGCCTCCTTTTCCTCTCATC-3 '(SEQ ID NO: 3)
GAPDH probe, 5'-FAM- TGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 4)
GAPDH forward primer, 5'- TGAAGGTCGGTGTGAACGG-3 '(SEQ ID NO: 5)
GAPDH reverse primer, 5'- CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
Data analysis was performed using Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems). The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
ATF3は、8時間程度の不眠においても増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の測定に利用可能であることがわかった。また、ATF3の増加は、脳、筋肉、心臓、肝臓と多岐にわたり、これらの臓器における疲労の度合いを個別に評価できることがわかった (図2)。
(2) Results
ATF3 increased in insomnia of about 8 hours, and was found to be useful for measuring the mental labor fatigue experienced daily. In addition, the increase in ATF3 was diverse in the brain, muscle, heart, and liver, and it was found that the degree of fatigue in these organs could be individually evaluated (Fig. 2).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後と休息後の各種臓器でのATF3の増加を測定した。   Using a forced swimming model of mice, the increase in ATF3 was measured in various organs immediately after physical fatigue and after rest.

(1)方法
足が着かない程の充分な深さの水を張ったプール(直径22cm)でマウス(C57BL/6NCrSlc)を強制的に泳がせ、負荷直後のマウス(30分, 1時間, 2時間負荷)及び対照群として負荷を与えていないマウス(0時間)から経時的に臓器を摘出(n=2〜12)し、凍結した。さらに、強制水泳(FS)を2時間行った後、通常のケージで2時間休息を与えた後に臓器を摘出し、凍結した(図3中、FS 2h + 休息2h)。実施例2で示した実験と同様の方法で、ATF3、GAPDHのmRNAをTaqMan PCR法にて定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Forcibly swim a mouse (C57BL / 6NCrSlc) in a pool (22cm in diameter) with water deep enough to prevent your feet from reaching, and immediately after loading (30 minutes, 1 hour, 2 hours) Load) and as a control group, organs were removed over time (n = 2-12) from mice not subjected to load (0 hour) and frozen. Furthermore, after performing forced swimming (FS) for 2 hours, after giving a rest for 2 hours in a normal cage, the organ was removed and frozen (in FIG. 3, FS 2h + rest 2h). ATF3 and GAPDH mRNA were quantified by the TaqMan PCR method in the same manner as the experiment shown in Example 2. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
水泳1時間および2時間において、脳、筋肉、心臓、肝臓といった様々な臓器で、ATF3の増加が観察された。また、2時間程度の休息によって、ATF3は急速に減少した。このことは、ATF3の測定によって各種臓器における肉体疲労と回復が定量的に測定可能であることを示している。また、この疲労モデルにおける水泳は、重りなどの負荷をかけていない状態で行っているため、日常の運動負荷のレベルを逸脱しない疲労負荷であると考えられる(図3)。
(2) Results In 1 hour and 2 hours of swimming, an increase in ATF3 was observed in various organs such as brain, muscle, heart and liver. In addition, with a rest of about 2 hours, ATF3 decreased rapidly. This indicates that physical fatigue and recovery in various organs can be quantitatively measured by measuring ATF3. In addition, since swimming in this fatigue model is performed without applying a load such as a weight, it is considered that the fatigue load does not deviate from the level of daily exercise load (FIG. 3).

ヒトの末梢血検体を使用して、ATF3による疲労測定を行った。   Using human peripheral blood specimens, fatigue measurements were performed using ATF3.

(1)方法
健常者(n=2)にサイクルエルゴメーター (Aerobike 75XL2 ME; Combi Wellness Co.)を用いて、無酸素性作業閾値 (Anaerobics Threshold;AT)80%の強度で自転車漕ぎを4 時間行った。負荷前後に血液をPAXgene Blood RNA 採血管 (日本BD)に採取した。血液RNAをPAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.)を用いて精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いて、cDNA を合成した。血液中ATF3とβ-アクチンのmRNAをApplied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems)を用いて、TaqMan Arrayで以下条件のduplicateで定量した。プローブ、プライマーセット:ATF3 (Hs00231069_m1), ACTB (Hs01060665_g1); 1 portあたり、TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl、cDNA 10 μl、PCR-grade water 40 μl。PCR条件: 初期ステップ:50℃ 2分、次に95℃ 10 分、95℃ 15 秒、60℃ 1 分を40サイクル。データの解析はExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Using a cycle ergometer (Aerobike 75XL2 ME; Combi Wellness Co.) for a healthy person (n = 2), cycling anaerobic for 4 hours at anaerobic threshold (AT) of 80% went. Before and after loading, blood was collected in a PAXgene Blood RNA blood collection tube (Japan BD). Blood RNA was purified using PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). ATF3 and β-actin mRNA in blood was quantified using a Applied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems) with a TaqMan Array under the following conditions. Probe and primer set: ATF3 (Hs00231069_m1), ACTB (Hs01060665_g1); per port, TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl, cDNA 10 μl, PCR-grade water 40 μl. PCR conditions: Initial step: 50 ° C 2 minutes, then 95 ° C 10 minutes, 95 ° C 15 seconds, 60 ° C 1 minute 40 cycles. Data analysis was performed using ExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems). The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のATF3が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、ATF3による疲労測定が可能であることが示された(図4)。
(2) Results It was confirmed that ATF3 in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. As a result, it was shown that the fatigue measurement by ATF3 is possible in the test using human peripheral blood (FIG. 4).

マウスの不眠モデルを用いた不眠による精神的疲労と強制水泳モデルを用いた肉体疲労を、肝臓中のCHOPの発現増加によって測定した。   Mental fatigue due to insomnia using the mouse insomnia model and physical fatigue using the forced swimming model were measured by increasing the expression of CHOP in the liver.

(1)方法
実施例2及び3で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス肝臓(n=2〜4)でのCHOP及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCTGTCAGCCAAGCTAGGGACGC-TAMRA-3'(配列番号:7)
CHOP forward primer, 5'-CCTATATCTCATCCCCAGGAAACG- 3'(配列番号:8)
CHOP reverse primer, 5'-TGTGCGTGTGACCTCTGTTG- 3'(配列番号:9)
図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method CHOP and GAPDH mRNA in the mouse liver (n = 2 to 4) subjected to fatigue load was quantified by the same method as the experiments shown in Examples 2 and 3. The probe and primer sequences are as follows.
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCTGTCAGCCAAGCTAGGGACGC-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 7)
CHOP forward primer, 5'-CCTATATCTCATCCCCAGGAAACG-3 '(SEQ ID NO: 8)
CHOP reverse primer, 5'-TGTGCGTGTGACCTCTGTTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
水泳2時間(図5左側グラフにおけるFS 2h)ならびに不眠8時間および24時間(図5右側グラフにおける8hおよび24h)において、肝臓におけるCHOP発現量の増加が観察された。このことは、CHOP発現量の測定によって臓器における肉体疲労と精神疲労が定量的に測定可能であることを示している (図5)。
(2) Results An increase in the expression level of CHOP in the liver was observed at 2 hours of swimming (FS 2h in the left graph of FIG. 5) and 8 hours and 24 hours of insomnia (8h and 24h in the right graph of FIG. 5). This indicates that physical fatigue and mental fatigue in organs can be quantitatively measured by measuring the amount of CHOP expression (FIG. 5).

ヒトの末梢血検体を使用して、CHOPによる疲労測定を行った。   Using human peripheral blood specimens, fatigue measurement by CHOP was performed.

(1)方法
実施例4で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中CHOP(プローブ、プライマーセット:Hs00358796_g1)及びACTBのmRNAを測定した。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method CHOP (probe, primer set: Hs00358796_g1) and ACTB mRNA in blood before and after bicycle rowing (n = 2) and ACTB were measured by the same method as the experiment shown in Example 4. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のCHOP発現量が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、CHOPによる疲労測定が可能であることが示された(図6)。
(2) Results It was confirmed that the amount of CHOP expression in human peripheral blood specimens increased due to exercise fatigue load. Thereby, it was shown that fatigue measurement by CHOP is possible in a test using human peripheral blood (FIG. 6).

ATF3によって疲労が誘導されることを確認した。   It was confirmed that fatigue was induced by ATF3.

(1)方法
i) ATF3発現プラスミドベクターの構築
Codon Usageをマウスに最適化したマウスATF3(Mm ATF3)の合成遺伝子(Mm ATF3-opt(配列番号:64))を作製し、GFPコード領域を除去したpEGFP-N1発現ベクター(pEGFP(-)-N1)に組み込み、得られたプラスミドをMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1とした。
(1) Method
i) Construction of ATF3 expression plasmid vector
A synthetic gene (Mm ATF3-opt (SEQ ID NO: 64)) of mouse ATF3 (Mm ATF3) optimized for Codon Usage for mice was prepared, and the pEGFP-N1 expression vector (pEGFP (-)-) with the GFP coding region removed. The resulting plasmid was called Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1.

ii) Hydrodynamic delivery systemによるATF3の生体内一過性発現
マウスの生体内でATF3を一過性発現させるために、TransIT(r) Hydrodynamic Delivery System(TaKaRa)を使用した。方法は標準プロトコールに従った。ATF3発現プラスミドはMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1を使用した。
ii) Transient expression of ATF3 in vivo by Hydrodynamic delivery system TransIT (r) Hydrodynamic Delivery System (TaKaRa) was used to transiently express ATF3 in vivo in mice. The method followed a standard protocol. MTF ATF3-opt / pEGFP (−)-N1 was used as an ATF3 expression plasmid.

iii) ATF3生体内一過性発現マウスの行動試験
ATF3発現プラスミドMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1のマウス生体内投与から0, 4, 8, 16時間後に10分間のオープンフィールド試験を行い、移動距離をTopScan(CleverSys社)で測定した。統計学的有意(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)はWelch's t testを用いて算出した。
iii) Behavioral testing of ATF3 in vivo transiently expressed mice
An open field test for 10 minutes was performed 0, 4, 8, and 16 hours after the in vivo administration of the ATF3 expression plasmid Mm ATF3-opt / pEGFP (−)-N1 to the mouse, and the moving distance was measured by TopScan (CleverSys). Statistical significance (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001) was calculated using Welch's t test.

(2)結果
ATF3発現マウスはプラスミド導入後4, 8時間で自発行動が有意に低下し、導入後16時間で自発運動量の回復が観察された。従って、ATF3の発現によってマウスには疲労が生じ、脳が疲労感を感じ、このために自発運動が低下したことが示された。また、ATF3によって誘導された疲労は短時間で回復し、生理的疲労の特徴を有していることが示された(図7)。
(2) Results
In ATF3-expressing mice, spontaneous movement decreased significantly 4 to 8 hours after plasmid introduction, and recovery of locomotor activity was observed 16 hours after introduction. Therefore, it was shown that the expression of ATF3 caused fatigue in the mice, and the brain felt fatigue, which decreased the locomotor activity. Moreover, it was shown that the fatigue induced by ATF3 recovered in a short time and had the characteristics of physiological fatigue (FIG. 7).

ATF3特異的な干渉RNAによるATF3の発現抑制によって疲労が軽減されるかどうかを検討した。   We investigated whether suppression of ATF3 expression by ATF3-specific interfering RNA can reduce fatigue.

(1)方法
マウス(C57BL/6NCrSlc)を回転滑車付きケージ (日本クレア)にて飼育した。滑車の回転数は1回転を3カウントとして、コンピューターシステム(日本クレア)により記録した。午前中にATF3に対するStealth RNAi siRNA (MSS273298) (Life Technologies) 40 μgとTKプロモーターで発現するLuciferase発現ベクター(pLuc-TK) 1μgをTransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution (Mirus Bio LCC.)を利用して、ハイドロダイナミック法で導入した(n=6)。対照として、発現抑制効果を認めないStealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (12935-400) 40 μg (Life Technologies)とpLuc-TK 1μgを導入した(n=2)。導入後、水を1cm張ったケージにマウスを8時間置いた後に、回転ケージに戻し、自発運動量を測定した。負荷当日の夜間運動量を前日との比率で算出した。自発運動測定後、マウスから肝臓を摘出、超音波破砕し、Luciferase Reporter Assay System (Promega)により、Luciferase活性を測定した。Luciferase活性を認めないマウスはハイドロダイナミック法による遺伝子導入に失敗したものとして解析から除いた。図の値は平均±標準誤差で示した(図8)。
(1) Method Mice (C57BL / 6NCrSlc) were bred in a cage with a rotating pulley (Clea Japan). The number of rotations of the pulley was recorded by a computer system (CLEA Japan) with 3 rotations per rotation. In the morning, Stealth RNAi siRNA against ATF3 (MSS273298) (Life Technologies) 40 μg and Luciferase expression vector (pLuc-TK) 1 μg expressed with TK promoter using TransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution (Mirus Bio LCC.) Introduced by hydrodynamic method (n = 6). As controls, Stealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (12935-400) 40 μg (Life Technologies) and pLuc-TK 1 μg were introduced (n = 2). After the introduction, the mice were placed in a cage with 1 cm of water for 8 hours and then returned to the rotating cage to measure the spontaneous momentum. The amount of night exercise on the day of loading was calculated as a percentage of the previous day. After measuring locomotor activity, the liver was removed from the mouse, sonicated, and Luciferase activity was measured by the Luciferase Reporter Assay System (Promega). Mice that did not show Luciferase activity were excluded from the analysis because they failed to introduce the gene by hydrodynamic method. The values in the figure are shown as mean ± standard error (FIG. 8).

(2)結果
マウスの自発運動量を測定した結果、ATF3に対する特異的な干渉RNA(siRNA)を導入したものにおいて自発運動量が多いことがわかった。この結果は、ATF3の産生を阻害すると疲労が抑制されることを示しており、疲労の本態においてATF3が重要な働きをしていることを示している(図8)。
(2) Results As a result of measuring the spontaneous momentum of the mouse, it was found that the amount of spontaneous momentum was large in those into which interfering RNA (siRNA) specific for ATF3 was introduced. This result indicates that inhibition of ATF3 production suppresses fatigue, indicating that ATF3 plays an important role in the true state of fatigue (FIG. 8).

ATF3導入による疲労関連因子の変化を観察した。   We observed changes in fatigue-related factors with the introduction of ATF3.

(1)方法
実施例7と同様のMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1のHydrodynamic Delivery Systemによる生体内形質転換後0, 4, 8, 16時間のマウス各4匹の肝臓を採取し、ATF3および炎症関連因子の遺伝子発現量を比較した。図9は、A) 内在性ATF3の遺伝子発現、B) 炎症性サイトカインIL-1βの遺伝子発現、C)炎症性サイトカインIL-6の遺伝子発現、D)炎症性サイトカインTNF-αの遺伝子発現をそれぞれ示している。棒グラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。統計学的有意(*p<0.05)はWelch's t testを用いて算出した。
プライマー、プローブの配列は、以下の通り。
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3'(配列番号:10)
Primer-F : 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3'(配列番号:11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'(配列番号:12)
IL-1β:
Probe; 5'-TGCTCTCATCAGGACAGCCCAGGTCA-3'(配列番号:13)
Primer-F: 5'-CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3'(配列番号:14)
Primer-R: 5'-CTGCTGCGAGATTTGAAGCTG-3'(配列番号:15)
IL-6:
Probe: 5'-ACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACT-3'(配列番号:16)
Primer-F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAGA-3'(配列番号:17)
Primer-R: 5'-GTTGTTCATACAATCAGAATTGCCATT-3'(配列番号:18)
TNF-α:
Probe: 5'-ATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACG-3'(配列番号:19)
Primer-F: 5'-CCAGACCCTCACACTCAGATCAT-3'(配列番号:20)
Primer-R: 5'-CCTCCACTTGGTGGTTTGCTAC-3'(配列番号:21)
(1) Method The livers of 4 mice each of 0, 4, 8, and 16 hours after in vivo transformation by the hydrodynamic delivery system of Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1 as in Example 7 were collected, The gene expression levels of ATF3 and inflammation-related factors were compared. FIG. 9 shows A) gene expression of endogenous ATF3, B) gene expression of inflammatory cytokine IL-1β, C) gene expression of inflammatory cytokine IL-6, and D) gene expression of inflammatory cytokine TNF-α. Show. The bar graph shows the average value, and the error bar shows the standard error. Statistical significance (* p <0.05) was calculated using Welch's t test.
Primer and probe sequences are as follows.
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3 '(SEQ ID NO: 10)
Primer-F: 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3 '(SEQ ID NO: 12)
IL-1β:
Probe; 5'-TGCTCTCATCAGGACAGCCCAGGTCA-3 '(SEQ ID NO: 13)
Primer-F: 5'-CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3 '(SEQ ID NO: 14)
Primer-R: 5'-CTGCTGCGAGATTTGAAGCTG-3 '(SEQ ID NO: 15)
IL-6:
Probe: 5'-ACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACT-3 '(SEQ ID NO: 16)
Primer-F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAGA-3 '(SEQ ID NO: 17)
Primer-R: 5'-GTTGTTCATACAATCAGAATTGCCATT-3 '(SEQ ID NO: 18)
TNF-α:
Probe: 5'-ATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACG-3 '(SEQ ID NO: 19)
Primer-F: 5'-CCAGACCCTCACACTCAGATCAT-3 '(SEQ ID NO: 20)
Primer-R: 5'-CCTCCACTTGGTGGTTTGCTAC-3 '(SEQ ID NO: 21)

(2)結果
ATF3-optとマウスの内在性ATF3は、タンパクのアミノ酸配列は同じであるが、DNAの塩基配列が異なるため、Real-time PCR法によって、ATF3がATF3を誘導する能力があるかどうかを検討することが可能である。この検討の結果、図8Aに示される様に、ATF3がATF3の発現を誘導することと、その効果が比較的短時間であることが判った。このことは、ATF3がポジティブ・フィードバックによって一時的に大きなATF3発現誘導効果を発揮するものの、その効果は速やかに解消され、疲労が短時間で回復するという生理的疲労としての性質を有していることを示している。
(2) Results
Since ATF3-opt and mouse endogenous ATF3 have the same protein amino acid sequence, but have different DNA base sequences, we investigate whether ATF3 has the ability to induce ATF3 by Real-time PCR. It is possible. As a result of this examination, as shown in FIG. 8A, it was found that ATF3 induces the expression of ATF3 and that the effect is relatively short. This indicates that although ATF3 temporarily exerts a large ATF3 expression-inducing effect by positive feedback, the effect is quickly eliminated and the fatigue recovers in a short time. It is shown that.

また、疲労を脳に伝え、疲労感を発生させると考えられている炎症性サイトカインに関しては、ATF3が関与する生理的疲労では、TNF-αが主として働いていることが判った。また、CFSの疲労感において主要な働きをすると考えられているIL-1βやIL-6は、むしろ低下していることが判った。ATF3は、IL-1βやIL-6に関しては抑制的に働くことが知られており、CFSにおける慢性的に持続する疲労の原因となるIL-1βやIL-6を抑制することで、生理的疲労の特徴である易回復性や可逆性をもたらしていると考えられる(図9)。   In addition, regarding inflammatory cytokines that are thought to transmit fatigue to the brain and generate a feeling of fatigue, it was found that TNF-α mainly works in physiological fatigue involving ATF3. It was also found that IL-1β and IL-6, which are thought to play a major role in CFS fatigue, are rather lowered. ATF3 is known to act in a suppressive manner with respect to IL-1β and IL-6, and by suppressing IL-1β and IL-6, which cause chronic persistent fatigue in CFS, It is thought that it provides easy recovery and reversibility, which are characteristics of fatigue (FIG. 9).

全身的な生理的疲労の原因となる疲労物質はこれまでに同定されていなかった。疲労物質は、生体の働き過ぎや休息不足を生体に知らせるアラームであるので、疲労のアラームのトリガーは、生命活動によって生体内に蓄積される老廃物または代謝物であると考えられる。また、実施例1から、この現象にRNAが関係している可能性が考えられたので、生体調節に重要な働きを持つ干渉RNAを疲労物質の候補として検討した。干渉RNAにはsiRNAやmiRNAがあるが、多くの分子種があり、通常はmRNAに特異的に結合して効果を発揮する。今回発明者が着目したのは、この様な本来の干渉RNAの機能とは無関係な、干渉RNAの細胞内の総量である。疲労によって干渉RNAの総量が増加し、PKRを介してeIF-2αのリン酸化を生じさせる可能性を検討した。   Fatigue substances that cause generalized physiological fatigue have not been identified so far. Since the fatigue substance is an alarm that informs the living body that the living body is overworked or lacked in rest, the trigger for the fatigue alarm is considered to be a waste product or a metabolite accumulated in the living body due to life activity. In addition, since there was a possibility that RNA was related to this phenomenon from Example 1, interfering RNA having an important function in biological regulation was examined as a fatigue substance candidate. Interfering RNA includes siRNA and miRNA, but there are many molecular species, which usually exert their effects by binding specifically to mRNA. The inventor has focused on the total amount of interfering RNA in the cell that is unrelated to the function of the original interfering RNA. We investigated the possibility that fatigue increases the total amount of interfering RNA and causes phosphorylation of eIF-2α via PKR.

(1)方法
実施例2及び3で示した実験と同様の方法で疲労負荷をかけたマウス心臓及び肝臓(n=1)から、micro RNA (miRNA)を含むRNAをmiRNeasy 分離 Kit (Qiagen)を用いて精製した。RT2 miRNA First Strand Kit (SABioscoences)を用いて、それぞれの臓器RNA 100 ngに含まれるmiRNAから逆転写を行い、標準プロトコールに従い、cDNAを計10 μl合成した。そのcDNAにRNase-free water 90 μlを加えた希釈cDNA 100 μl、2X RT2 SYBR Green PCR Master Mix 5.0 ml、およびwater 4.9 mlからなる計10mlの反応液を調製した。反応液を25 μlずつRT2 miRNA PCR Array(SABioscoences)に分注し、以下の条件で網羅的にmiRNAを定量化した。
PCR条件:初期ステップ:95℃ 10分、次に95℃ 15秒、60℃ 31 秒、72℃ 30秒を40サイクル。
PCR Array Data Analysis Web Portal (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)にて、データを解析した。
(1) Method From a mouse heart and liver (n = 1) subjected to fatigue loading in the same manner as in the experiments shown in Examples 2 and 3, RNA containing micro RNA (miRNA) was miRNAeasy isolation Kit (Qiagen) And purified. Using RT2 miRNA First Strand Kit (SABioscoences), reverse transcription was performed from miRNA contained in 100 ng of each organ RNA, and a total of 10 μl of cDNA was synthesized according to the standard protocol. A total of 10 ml of a reaction solution was prepared consisting of 100 μl of diluted cDNA obtained by adding 90 μl of RNase-free water to the cDNA, 5.0 ml of 2X RT2 SYBR Green PCR Master Mix, and 4.9 ml of water. 25 μl of the reaction solution was dispensed into RT2 miRNA PCR Array (SABioscoences), and miRNA was quantified comprehensively under the following conditions.
PCR conditions: Initial step: 95 ° C 10 minutes, then 95 ° C 15 seconds, 60 ° C 31 seconds, 72 ° C 30 seconds 40 cycles.
Data was analyzed on the PCR Array Data Analysis Web Portal (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php).

(2)結果
図10では、各種の干渉RNAの解析結果の代表例を示しているが、肝臓(図10−1)においても心臓(図10−2)においても、疲労負荷における各種干渉RNAの増加が示された。同時に計算された干渉RNAの総量も同様に増加していた。また、干渉RNAの増加は、運動疲労(図10におけるFS 2h)においても精神的疲労(図10における8hおよび24h)においても観察された。このことより、生理的疲労の最初のトリガーとなる疲労原因物質は干渉RNAであることが示された(図10)。
(2) Results FIG. 10 shows a representative example of the analysis results of various interfering RNAs. In both the liver (FIG. 10-1) and the heart (FIG. 10-2), various interfering RNAs under fatigue load are shown. An increase was shown. The total amount of interfering RNA calculated simultaneously increased as well. In addition, an increase in interfering RNA was observed both in exercise fatigue (FS 2h in FIG. 10) and mental fatigue (8h and 24h in FIG. 10). This indicates that the fatigue-causing substance that is the first trigger of physiological fatigue is interfering RNA (FIG. 10).

干渉RNAは測定に手間と費用がかかるため、干渉RNAの増加を正確に反映し、簡便に測定が可能な分子バイオマーカーの検索を行った。候補としたのは、干渉RNAの産生に関わる酵素であるDgcr8とDroshaである。   Because interfering RNA is laborious and expensive to measure, we searched for molecular biomarkers that accurately reflect the increase in interfering RNA and can be measured easily. Candidates are Dgcr8 and Drosha, enzymes involved in the production of interfering RNA.

(1)方法
実施例2及び3で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス肝臓(n=2)のDgcr8、Drosha及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
Dgcr8 probe, 5'-FAM- TGCGAAGAATAAAGCTGCCCGAGCCA-TAMRA-3'(配列番号:22)
Dgcr8 forward primer, 5'- CGGATCTGGAACTGCAAGCA- 3'(配列番号:23)
Dgcr8 reverse primer, 5'- GTTCTTCACTGTCTTTAGGCTTCTC- 3'(配列番号:24)
Drosha probe, 5'-FAM- AGTTCCTCTGCTACCTTGGCTTGCGT-TAMRA-3'(配列番号:25)
Drosha forward primer, 5'- ACAGAGTACTTGTTCATTCATTTCCC - 3'(配列番号:26)
Drosha reverse primer, 5'- TGTCGTTGGTGATGGCATACTC- 3'(配列番号:27)
図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Dgcr8, Drosha and GAPDH mRNA in mouse liver (n = 2) subjected to fatigue loading was quantified in the same manner as the experiments shown in Examples 2 and 3. The probe and primer sequences are as follows.
Dgcr8 probe, 5'-FAM- TGCGAAGAATAAAGCTGCCCGAGCCA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 22)
Dgcr8 forward primer, 5'-CGGATCTGGAACTGCAAGCA-3 '(SEQ ID NO: 23)
Dgcr8 reverse primer, 5'-GTTCTTCACTGTCTTTAGGCTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 24)
Drosha probe, 5'-FAM- AGTTCCTCTGCTACCTTGGCTTGCGT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 25)
Drosha forward primer, 5'- ACAGAGTACTTGTTCATTCATTTCCC-3 '(SEQ ID NO: 26)
Drosha reverse primer, 5'- TGTCGTTGGTGATGGCATACTC-3 '(SEQ ID NO: 27)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
干渉RNAの産生に関わる酵素であるDGCR8とDroshaの発現量が、運動疲労(図11中、FS 2h)と精神的疲労(図11中、8h、12h、24h)によって増加することが判った。この結果、これらも生理的疲労の測定に使用可能なバイオマーカーとなることが示された(図11)。
(2) Results The expression levels of DGCR8 and Drosha, enzymes involved in the production of interfering RNA, increase due to exercise fatigue (FS 2h in FIG. 11) and mental fatigue (8h, 12h, 24h in FIG. 11). I understood. As a result, it was shown that these were also biomarkers that could be used for the measurement of physiological fatigue (FIG. 11).

ヒトの末梢血検体を使用して、Dgcr8とDroshaによる疲労測定を行った。   Fatigue measurements were performed with Dgcr8 and Drosha using human peripheral blood samples.

(1)方法
実施例4で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中Dgcr8 (プローブ、プライマーセット:Hs00256062_m1)、Drosha (プローブ、プライマーセット:Hs00203008_m1)及びACTBのmRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Dgcr8 (probe, primer set: Hs00256062_m1), Drosha (probe, primer set: Hs00203008_m1) and ACTB before and after bicycle rowing (n = 2) in the same manner as the experiment shown in Example 4 MRNA was quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のDgcr8とDroshaが増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、Dgcr8またはDroshaによる疲労測定が可能であることが示された(図12)。
(2) Results It was confirmed that Dgcr8 and Drosha in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. Thereby, it was shown that the fatigue measurement by Dgcr8 or Drosha is possible in the test using human peripheral blood (FIG. 12).

ヒトの末梢血検体を使用して、GRP78とXBP-1による疲労測定を行った。   Using human peripheral blood specimens, fatigue measurements with GRP78 and XBP-1 were performed.

(1)方法
実施例4で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中GRP78 (probe、プライマーセット:Hs00607129_gH)、XBP1 (probe、プライマーセット:Hs00231936_m1)及びACTB mRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method GRP78 (probe, primer set: Hs00607129_gH), XBP1 (probe, primer set: Hs00231936_m1) and ACTB before and after bicycle rowing (n = 2) in the same manner as the experiment shown in Example 4 mRNA was quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のGRP78とXBP-1の発現量が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、GRP78やXBP-1を利用した疲労測定が可能であることが示された(図13)。
(2) Results It was confirmed that the expression levels of GRP78 and XBP-1 in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. As a result, it was shown that fatigue tests using GRP78 and XBP-1 were possible in tests using human peripheral blood (FIG. 13).

ATF3発現によって、生理的疲労と、感染やCFSによる疲労のモデルとされるPoly(I:C)腹腔投与モデルとの区別が可能かどうかを検討した。   We examined whether ATF3 expression can distinguish physiological fatigue from Poly (I: C) peritoneal administration model, which is a model of fatigue due to infection and CFS.

(1)方法
Poly(I:C)のマウス腹腔投与から6時間後のマウス各3匹の肝臓を採取し、ATF3の遺伝子発現量を比較した。また、2時間の強制水泳を行ったマウス4匹のATF3遺伝子発現をFS 2hrとして示した。
(1) Method
The livers of 3 mice each 6 hours after the intraperitoneal administration of Poly (I: C) were collected, and the gene expression levels of ATF3 were compared. In addition, ATF3 gene expression of 4 mice subjected to 2 hours of forced swimming is shown as FS 2hr.

Poly(I:C)の腹腔投与:
マウスにPoly(I:C)を腹腔投与するために、Poly(I:C)ナトリウム塩(Sigma-Aldrich)をエンドトキシンフリー生理食塩水(大塚製薬)で希釈し、0, 1, 2 mg/ml Poly(I:C)水溶液を調製した。6週齢のC57BL/6NCrSlcマウスの腹腔に、0, 5, 10 mg/kgとなるようにPoly(I:C)水溶液を投与した(約100μl)。腹腔投与後のマウスは飼育ケージに戻した。
Intraperitoneal administration of Poly (I: C):
Poly (I: C) sodium salt (Sigma-Aldrich) was diluted with endotoxin-free physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) for intraperitoneal administration of Poly (I: C) to mice, 0, 1, 2 mg / ml An aqueous solution of Poly (I: C) was prepared. Poly (I: C) aqueous solution was administered to the abdominal cavity of 6-week-old C57BL / 6NCrSlc mice at 0, 5, 10 mg / kg (about 100 μl). The mice after intraperitoneal administration were returned to the breeding cage.

Poly(I:C)腹腔投与マウスの遺伝子発現解析:
Poly(I:C)腹腔投与後の時間経過に伴うATF3遺伝子発現量を確認した結果、6時間後に発現量が最大となることが判明した(データ示さず)。そこで、Poly(I:C)のマウス腹腔投与から6時間後にマウスの肝臓を採取した。肝臓のRNAを精製し、ATF3のmRNA量をreal-time RT-PCRで定量した。リファレンス遺伝子としてβ-アクチン遺伝子を用いた。また、比較のため、2時間の強制水泳(FS)を実施したマウスのATF3発現量も測定した。real-time RT-PCRで使用したプライマープローブの配列は、以下の通り。
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3'(配列番号:10)
Primer-F : 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3'(配列番号:11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'(配列番号:12)
棒グラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。統計学的有意(**p<0.01)はWelch's t testを用いて算出した。統計学的有意(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)はWelch's t testを用いて算出した。
Gene expression analysis of Poly (I: C) peritoneally administered mice:
As a result of confirming the ATF3 gene expression level over time after Poly (I: C) intraperitoneal administration, it was found that the expression level reached the maximum after 6 hours (data not shown). Therefore, the mouse liver was collected 6 hours after the intraperitoneal administration of Poly (I: C) to the mouse. Liver RNA was purified, and the amount of ATF3 mRNA was quantified by real-time RT-PCR. The β-actin gene was used as a reference gene. For comparison, the ATF3 expression level of mice subjected to 2-hour forced swimming (FS) was also measured. Primer probe sequences used in real-time RT-PCR are as follows.
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3 '(SEQ ID NO: 10)
Primer-F: 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3 '(SEQ ID NO: 12)
The bar graph shows the average value, and the error bar shows the standard error. Statistical significance (** p <0.01) was calculated using Welch's t test. Statistical significance (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001) was calculated using Welch's t test.

(2)結果
2時間のFSによりATF3は強く誘導されるが、Poly(I:C)腹腔投与6時間後のATF3発現量はこれに比べて著しく低かった。別の試験によって、Poly(I:C)腹腔投与後に誘導されるATF3は、6時間後が最高値であることは確認してある。また、他の実施例により精神的疲労においてもATF3は2時間のFSと同程度に上昇することが判っている。このため、CFSやウイルス感染のモデルであると考えられているPoly(I:C)腹腔投与モデルで観察される疲労は生理的疲労とは異なることが示された(図14)。
(2) Results Although ATF3 was strongly induced by 2 hours of FS, the expression level of ATF3 6 hours after Poly (I: C) intraperitoneal administration was remarkably low. Another study confirms that ATF3 induced after Poly (I: C) intraperitoneal administration is highest after 6 hours. In addition, according to another embodiment, it has been found that ATF3 increases as much as FS of 2 hours in mental fatigue. For this reason, it was shown that the fatigue observed in the Poly (I: C) peritoneal administration model considered to be a model of CFS and virus infection is different from physiological fatigue (FIG. 14).

精神疲労や肉体疲労が、各種臓器でのeIF-2αリン酸化抑制因子の増加によって評価できるかどうかを検討した。   We examined whether mental fatigue and physical fatigue can be evaluated by increasing eIF-2α phosphorylation inhibitory factor in various organs.

(1)方法
実施例2及び3で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス心臓及び肝臓 (n=2〜4)のGADD34、Nck1、Nck2、CReP及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ADD34 probe, 5'-FAM- TCTCAGCGAAGTGTACCTTCCGAGCT-TAMRA-3'(配列番号:28)
GADD34 forward primer, 5'- GGCGGCTCAGATTGTTCAAAG- 3'(配列番号:29)
GADD34 reverse primer, 5'- CAGCAAGGAAATGGACTGTGAC- 3'(配列番号:30)
Nck1 probe, 5'-FAM- CACCAGGCACCAGGCAGAAATGGCAT-TAMRA-3'(配列番号:31)
Nck1 forward primer, 5'- GCTGGCAATCCTTGGTATTATGG- 3'(配列番号:32)
Nck1 reverse primer, 5'- CCCTTGTGCTTTTAGTGATACTGAG- 3'(配列番号:33)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCCTCGCCCAGTGACTTCTCCGTGT-TAMRA-3'(配列番号:34)
Nck2 forward primer, 5'- CGACTTCCTCATTAGGGACAGC- 3'(配列番号:35)
Nck2 reverse primer, 5'- CACCTTGAAGTGCTTGTTTCTCC- 3'(配列番号:36)
CReP probe, 5'-FAM- AGGCTCTTGCTGGAGAAAGATACACCCA-TAMRA-3'(配列番号:37)
CReP forward primer, 5'- AAGAAGATAATTGTCCAGGCTGTG- 3'(配列番号:38)
CReP reverse primer, 5'- CTCATCACCACTTATATAATACTCAGTAAC- 3'(配列番号:39)
図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method GADD34, Nck1, Nck2, CReP, and GAPDH mRNA in mouse heart and liver (n = 2 to 4) subjected to fatigue load were quantified in the same manner as the experiments shown in Examples 2 and 3. . The probe and primer sequences are as follows.
ADD34 probe, 5'-FAM- TCTCAGCGAAGTGTACCTTCCGAGCT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 28)
GADD34 forward primer, 5'-GGCGGCTCAGATTGTTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 29)
GADD34 reverse primer, 5'-CAGCAAGGAAATGGACTGTGAC-3 '(SEQ ID NO: 30)
Nck1 probe, 5'-FAM- CACCAGGCACCAGGCAGAAATGGCAT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 31)
Nck1 forward primer, 5'-GCTGGCAATCCTTGGTATTATGG-3 '(SEQ ID NO: 32)
Nck1 reverse primer, 5'-CCCTTGTGCTTTTAGTGATACTGAG-3 '(SEQ ID NO: 33)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCCTCGCCCAGTGACTTCTCCGTGT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 34)
Nck2 forward primer, 5'-CGACTTCCTCATTAGGGACAGC-3 '(SEQ ID NO: 35)
Nck2 reverse primer, 5'-CACCTTGAAGTGCTTGTTTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 36)
CReP probe, 5'-FAM- AGGCTCTTGCTGGAGAAAGATACACCCA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 37)
CReP forward primer, 5'- AAGAAGATAATTGTCCAGGCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 38)
CReP reverse primer, 5'- CTCATCACCACTTATATAATACTCAGTAAC-3 '(SEQ ID NO: 39)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
精神疲労(図15中、FS 2h)および運動疲労(図15中、8h、12h、24h)の負荷によって、マウスの心臓及び肝臓でのeIF-2αリン酸化抑制因子(GADD34、Nck1、Nck2、CReP)の発現量が増加することが判った。このことより、eIF-2αリン酸化抑制因子によって精神疲労および肉体疲労の評価ができることが示された(図15)。
(2) Results eIF-2α phosphorylation inhibitory factor (GADD34, Nck1 in the heart and liver of mice) due to the stress of mental fatigue (FS 2h in FIG. 15) and exercise fatigue (8h, 12h, 24h in FIG. 15). , Nck2, and CReP) were found to increase. From this, it was shown that mental fatigue and physical fatigue can be evaluated by the eIF-2α phosphorylation inhibitory factor (FIG. 15).

被験者の疲労が血液細胞中のeIF-2αリン酸化抑制因子の増加によって評価できるかどうかを検討した。   We examined whether the fatigue of subjects can be evaluated by the increase of eIF-2α phosphorylation inhibitor in blood cells.

(1)方法
実施例4で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中GADD34 (プローブ、プライマーセット:Hs00169585_m1)、Nck1 (プローブ、プライマーセット:Hs01592377_m1)、Nck2 (プローブ、プライマーセット:Hs02561903_s1)、CReP (プローブ、プライマーセット:Hs00262481_m1)、及びACTBのmRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method In the same manner as the experiment shown in Example 4, blood GADD34 (probe, primer set: Hs00169585_m1), Nck1 (probe, primer set: Hs01592377_m1), Nck2 before and after bicycle rowing (n = 2) (Probe, primer set: Hs02561903_s1), CReP (probe, primer set: Hs00262481_m1), and ACTB mRNA were quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
運動疲労の負荷によって、ヒトの血液細胞中のeIF-2αリン酸化抑制因子(GADD34、CReP、Nck1)が増加することが判った。このことより、eIF-2αリン酸化抑制因子によって精神疲労および肉体疲労の評価ができることが示された(図16)。
(2) Results It was found that eIF-2α phosphorylation inhibitory factors (GADD34, CReP, Nck1) in human blood cells increase due to exercise fatigue. This showed that eIF-2α phosphorylation inhibitory factor can evaluate mental fatigue and physical fatigue (FIG. 16).

eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の代表としてATF3を、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の代表としてGADD34を用いて、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子またはeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子、あるいは両者の組合せによる、抗疲労物質や抗疲労法の効果判定が可能であるかどうかを検討した。
早い山登りにおいては疲労が生じるのに対し、ハイキングは疲労回復の方法として良く知られている抗疲労法である。また、イミダペプチドは、鳥のムネ肉から抽出された高濃度のイミダゾールジペプチドを含む製剤で、様々な検討から抗疲労効果があることが確認されている抗疲労物質である。この様な抗疲労物質および抗疲労法の効果がeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3と、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34によってどの様に判定されるかを検討した。
eIF-2α phosphorylation signaling factor or eIF-2α phosphorylation signal suppressor, or both using ATF3 as a representative of eIF-2α phosphorylation signaling factor and GADD34 as a representative of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor We examined whether it was possible to determine the effects of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods by combining the above.
Hiking is an anti-fatigue method that is well known as a method of recovering from fatigue, while fatigue occurs during early mountain climbing. Imidapeptide is a preparation containing a high concentration of imidazole dipeptide extracted from chicken breast meat, and is an anti-fatigue substance that has been confirmed to have an anti-fatigue effect from various studies. We examined how the effects of such anti-fatigue substances and anti-fatigue methods were judged by the eIF-2α phosphorylation signaling factor ATF3 and the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34.

(1)方法
山をオーバーペース気味に登った群(早い山登り群)(n=5)及び休憩を入れながらゆっくり歩いて登った群(ハイキング群)(n=8)において、山登り前後で採血し、実施例4で示した実験と同様の方法で、山登り前後の血液中RNAを精製し、cDNAを合成した。
また、健常者(n=6)にイミダペプチド240 (日本予防医薬) 1本/日を1週間摂取させた群では、摂取2週間前と摂取後で採血し、血液中RNAを精製し、cDNAを合成した。
ATF3、GADD34及びGAPDHのmRNA量をApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems)を利用して測定した。測定はduplicateで下記の条件で行った。
リアルタイムPCR条件:FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl、TaqManプローブ (10 μM) 0.625 μl、cDNA 2 μl、PCR-grade water 9.425 μlの計25 μl。初期ステップ 95℃ 10 分、次に95℃ 10秒、60℃ 31 秒を45 サイクル。
プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ATF3 probe, 5'-FAM-CCCTCGGGGTGTCCATCACAAAAGCC-TAMRA-3'(配列番号:40)
ATF3 forward primer, 5'-CGCTGGAATCAGTCACTGTCAG- 3' (配列番号:41)
ATF3 reverse primer, 5'-CCTTCTTCTTGTTTCGGCACTTTG- 3' (配列番号:42)
GADD34 probe, 5'-FAM- GCCTTTAGGGGAGTCTCAGGGTCCG-TAMRA-3' (配列番号:43)
GADD34 forward primer, 5'-GCCCAGAAACCCCTACTCATG- 3' (配列番号:44)
GADD34 reverse primer, 5'-AGGAAATGGACAGTGACCTTCTC- 3' (配列番号:45)
GAPDH probe, 5'-FAM-CGCCCAATACGACCAAATCCGTTGACTCC-TAMRA-3' (配列番号:46)
GAPDH forward primer, 5'- CACCATGGGGAAGGTGAAGG- 3' (配列番号:47)
GAPDH reverse primer, 5'-CAATATCCACTTTACCAGAGTTAAAAGC- 3' (配列番号:48)
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。
(1) Method Blood was collected before and after mountain climbing in the group that climbed the mountain in an overpace (fast climbing group) (n = 5) and the group that climbed slowly with a break (hiking group) (n = 8). In the same manner as in the experiment shown in Example 4, RNA in blood before and after climbing was purified to synthesize cDNA.
In addition, in a group in which healthy subjects (n = 6) were imidated with Imida Peptide 240 (Japanese preventive medicine) 1 day / day for 1 week, blood was collected 2 weeks before and after ingestion, RNA in blood was purified, and cDNA was obtained. Synthesized.
The amount of mRNA of ATF3, GADD34 and GAPDH was measured using Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). The measurement was performed in duplicate under the following conditions.
Real-time PCR conditions: FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl, TaqMan probe (10 μM) 0.625 μl, cDNA 2 μl PCR-grade water 9.425 μl, total 25 μl. Initial step 95 ° C 10 minutes, then 95 ° C 10 seconds, 60 ° C 31 seconds 45 cycles.
The probe and primer sequences are as follows.
ATF3 probe, 5'-FAM-CCCTCGGGGTGTCCATCACAAAAGCC-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 40)
ATF3 forward primer, 5'-CGCTGGAATCAGTCACTGTCAG-3 '(SEQ ID NO: 41)
ATF3 reverse primer, 5'-CCTTCTTCTTGTTTCGGCACTTTG-3 '(SEQ ID NO: 42)
GADD34 probe, 5'-FAM- GCCTTTAGGGGAGTCTCAGGGTCCG-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 43)
GADD34 forward primer, 5'-GCCCAGAAACCCCTACTCATG-3 '(SEQ ID NO: 44)
GADD34 reverse primer, 5'-AGGAAATGGACAGTGACCTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 45)
GAPDH probe, 5'-FAM-CGCCCAATACGACCAAATCCGTTGACTCC-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 46)
GAPDH forward primer, 5'- CACCATGGGGAAGGTGAAGG-3 '(SEQ ID NO: 47)
GAPDH reverse primer, 5'-CAATATCCACTTTACCAGAGTTAAAAGC-3 '(SEQ ID NO: 48)
Data analysis was performed using Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems). The values in the figure are shown as mean ± standard error.

(2)結果
eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3単独での判定では、ハイキングとイミダペプチドによって、ATF3の比率が開始当初よりも低下していることが判った。このことから、使用前後でATF3の低下がみられれば、該当する抗疲労物質候補や抗疲労法候補に抗疲労効果があると判定できることが判った。eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34単独でも、イミダペプチドの抗疲労効果と対応して、GADD34の強い誘導がみられた。
eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34の総合的判断では、早い山登りでは、GADD34の強い誘導がみられるものの、ATF3の効果を打ち消すに至っていないが、ハイキングでは、GADD34の効果がATF3の効果を上回ることで、ATF3を低下させ、抗疲労効果を発揮することが示された。また、イミダペプチドにおいては、イミダペプチドがGADD34を強く誘導し、かつATF3を強く抑制することで、強い抗疲労効果を発揮することが示された(図17)。
(2) Results
In the determination with the eIF-2α phosphorylation signaling factor ATF3 alone, it was found that the ratio of ATF3 was decreased from the beginning due to hiking and imidapepide. From this, it was found that if ATF3 decreases before and after use, it can be determined that the corresponding anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate has an anti-fatigue effect. Even with the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34 alone, strong induction of GADD34 was observed corresponding to the anti-fatigue effect of imidapeptide.
According to the comprehensive judgment of eIF-2α phosphorylation signaling factor ATF3 and eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34, early hill climbing shows strong induction of GADD34, but the effect of ATF3 has not been counteracted. It has been shown that the effect of GADD34 exceeds that of ATF3, thereby reducing ATF3 and exerting anti-fatigue effects. Moreover, in the imidapeptide, it was shown that the imidapeptide exerts strong anti-fatigue effect by strongly inducing GADD34 and strongly suppressing ATF3 (FIG. 17).

疲労関連因子によるpathological fatigueの評価をCFS患者を例にあげて示す。   The evaluation of pathological fatigue by fatigue-related factors is shown by taking CFS patients as an example.

(1)方法
CFS患者(n=79)及び健常者(n=69)より採血し、実施例17で示した実験と同様の方法で、ATF3,CHOP、GADD34、Nck1、Nck2、CReP及びGAPDHのmRNAを定量した。CHOP、Nck1、Nck2、CRePのプローブ、プライマー配列は以下の通り。
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCCTCAGTCAGCCAAGCCAGAGA-TAMRA-3'(配列番号:49)
CHOP forward primer, 5'-CCTATGTTTCACCTCCTGGAAATG- 3'(配列番号:50)
CHOP reverse primer, 5'-GTGACCTCTGCTGGTTCTGG- 3'(配列番号:51)
Nck1 probe, 5'-FAM- CATCAGCAGGAGATGCAGAATCTGGCACAC-TAMRA-3'(配列番号:52)
Nck1 forward primer, 5'- GCTCGGAAAGCATCTATTGTGAAA- 3'(配列番号:53)
Nck1 reverse primer, 5'- ATGTTGAGGTCATAGAGACGTTCC- 3'(配列番号:54)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCTCCCCGTGCTCGCTGGTGAAGAT-TAMRA-3'(配列番号:55)
Nck2 forward primer, 5'- GAGCGGAAGAACAGCCTGAAG- 3'(配列番号:56)
Nck2 reverse primer, 5'- GGCCCTGACGAGGTAGAGC- 3'(配列番号:57)
CReP probe, 5'-FAM- TGTGTCTTCCTCCAGAAAGAACGTCACGCT-TAMRA-3'(配列番号:58)
CReP forward primer, 5'- GAAAGTGAATGTCCAGACTCGGTA- 3'(配列番号:59)
CReP reverse primer, 5'- ACTCAGTAACTTCTTCAAGGAAGGT- 3'(配列番号:60)
図の値は中央値で示した。2群間の比較はMann-WhitneyのU検定で行った。
(1) Method
Blood was collected from CFS patients (n = 79) and healthy subjects (n = 69), and ATF3, CHOP, GADD34, Nck1, Nck2, CReP, and GAPDH mRNA were quantified in the same manner as the experiment shown in Example 17. . CHOP, Nck1, Nck2, and CReP probes and primer sequences are as follows.
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCCTCAGTCAGCCAAGCCAGAGA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 49)
CHOP forward primer, 5'-CCTATGTTTCACCTCCTGGAAATG-3 '(SEQ ID NO: 50)
CHOP reverse primer, 5'-GTGACCTCTGCTGGTTCTGG-3 '(SEQ ID NO: 51)
Nck1 probe, 5'-FAM- CATCAGCAGGAGATGCAGAATCTGGCACAC-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 52)
Nck1 forward primer, 5'-GCTCGGAAAGCATCTATTGTGAAA-3 '(SEQ ID NO: 53)
Nck1 reverse primer, 5'- ATGTTGAGGTCATAGAGACGTTCC-3 '(SEQ ID NO: 54)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCTCCCCGTGCTCGCTGGTGAAGAT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 55)
Nck2 forward primer, 5'-GAGCGGAAGAACAGCCTGAAG-3 '(SEQ ID NO: 56)
Nck2 reverse primer, 5'- GGCCCTGACGAGGTAGAGC-3 '(SEQ ID NO: 57)
CReP probe, 5'-FAM-TGTGTCTTCCTCCAGAAAGAACGTCACGCT-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 58)
CReP forward primer, 5'-GAAAGTGAATGTCCAGACTCGGTA-3 '(SEQ ID NO: 59)
CReP reverse primer, 5'- ACTCAGTAACTTCTTCAAGGAAGGT-3 '(SEQ ID NO: 60)
The values in the figure are shown as median values. Comparison between the two groups was performed by Mann-Whitney U test.

(2)結果
CFS患者は何れも強い自覚的疲労感を訴えているにも関わらず、生理的疲労の場合とは異なり、血液細胞中の疲労関連因子の増加は観察されなかった。eIF-2αリン酸化抑制因子であるGADD34とNck1に関しては、生理的疲労と逆に有為な減少が観察された。このことは、疲労関連因子の測定が、生理的疲労とpathological fatigueの区別に有用であることを示している(図18)。
(2) Results
Although all patients with CFS complained of strong subjective fatigue, no increase in fatigue-related factors in blood cells was observed, unlike physiological fatigue. Contrary to physiological fatigue, a significant decrease was observed for GADD34 and Nck1, which are eIF-2α phosphorylation inhibitors. This indicates that measurement of fatigue-related factors is useful for distinguishing between physiological fatigue and pathological fatigue (FIG. 18).

疲労関連因子によるpathological fatigueの評価を、うつ病患者を例にあげて示す。   The evaluation of pathological fatigue by fatigue-related factors is shown by taking depression patients as an example.

(1)方法
うつ病性障害患者(Dep)(n=19)及び健常者(n=18)より採血し、実施例4で示した実験と同様の方法で、血液中ATF3、GADD34及びGAPDH (プローブ、プライマーセット:Hs99999905_m1) のmRNAを定量した。図の値は中央値で示した。2群間の比較はMann-WhitneyのU検定で行った。
(1) Method Blood was collected from patients with depressive disorder (Dep) (n = 19) and healthy subjects (n = 18), and ATF3, GADD34 and GAPDH (BET) in blood were collected in the same manner as the experiment shown in Example 4. Probe and primer set: Hs99999905_m1) mRNA was quantified. The values in the figure are shown as median values. Comparison between the two groups was performed by Mann-Whitney U test.

(2)結果
うつ病患者も、自覚的疲労感を訴える場合が非常に多いにも関わらず、生理的疲労の場合とは異なり、血液細胞中の疲労関連因子の増加は観察されなかった。eIF-2αリン酸化抑制因子であるGADD34に関しては、生理的疲労と逆に有為な減少が観察された。このことは、うつ病においても、疲労関連因子の測定が、生理的疲労とpathological fatigueの区別に有用であることを示している(図19)。
(2) Results Despite the fact that depression patients often complain of subjective fatigue, no increase in fatigue-related factors in blood cells was observed unlike physiological fatigue. A significant decrease was observed for GADD34, an eIF-2α phosphorylation inhibitor, as opposed to physiological fatigue. This indicates that measurement of fatigue-related factors is also useful for distinguishing between physiological fatigue and pathological fatigue even in depression (FIG. 19).

生活、とくに労働にともなう疲労では、疲労とうつ病の関係や、疲労によるうつ症状による作業効率の低下が問題となっている。本発明者らは客観的な疲労の評価方法として唾液中ヒトヘルペスウイルスによる客観的疲労判定法をすでに発明している。この方法によって、健常労働者の精神状態に関する情報を得ることが可能であるかどうかを検討した。   In fatigue associated with life, particularly labor, there are problems of the relationship between fatigue and depression, and a decrease in work efficiency due to depressive symptoms due to fatigue. The present inventors have already invented an objective fatigue evaluation method using human herpesvirus in saliva as an objective fatigue evaluation method. We examined whether it was possible to obtain information about the mental state of healthy workers by this method.

(1)方法
健常労働者(n=41)から唾液を唾液採取用チューブSalivette (Sarstedt AG & Co.)に採取した。採取後、4℃ で1,700 g、5〜15分間遠心し、flow-throughを解析まで-80℃で保存した。解凍し、唾液400 μlから、BioRobot EZ1 workstation及びEZ1 virus mini kit v2.0 (QIAGEN, Inc.)を用いて、ウイルスDNAを精製した。DNAはelution buffer 90 μlに溶出した。唾液中HHV-7 DNAはApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems) を使用して、TaqMan PCR法にてduplicateで定量した。PCR条件は以下の通り:Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc.) 25 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.45 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.45 μl、TaqManプローブ (10 μM) 1.25 μl、Rox reference dye 1 μl、ウイルスDNA 5 μl、PCR-grade water 16.85 μlの計50 μl。初期ステップ 95℃ 30秒、次に95℃ 5秒、60℃ 31 秒を50 サイクル。
HHV-7を定量するプローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
HHV-7 probe, 5′-FAM-CCTCGCAGATTGCTTGTTGGCCATG-TAMRA-3′(配列番号:61)
HHV-7 forward primer, 5′-CGGAAGTCACTGGAGTAATGAC-3′(配列番号:62)
HHV-7 reverse primer, 5′-CCAATCCTTCCGAAACCGAT-3′(配列番号:63)
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。
疲労度の低い群と高い群は、唾液中HHV-7 DNA量を、100,000コピー/mlまたは40,000コピー/mlで境界線を引くことで分けた。うつ症状をBeck Depression Inventory (BDI)、自覚的疲労度をvisual analogue scale (VAS)で評価した。
(1) Method Saliva was collected from healthy workers (n = 41) into a saliva collection tube Salivette (Sarstedt AG & Co.). After collection, it was centrifuged at 1,700 g for 5 to 15 minutes at 4 ° C., and the flow-through was stored at −80 ° C. until analysis. The virus DNA was purified from 400 μl of saliva using BioRobot EZ1 workstation and EZ1 virus mini kit v2.0 (QIAGEN, Inc.). DNA was eluted in 90 μl of elution buffer. HHV-7 DNA in saliva was quantified by duplicate using TaqMan PCR method using Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). PCR conditions are as follows: Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc.) 25 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.45 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.45 μl, TaqMan probe (10 μM) 50 μl total of 1.25 μl, Rox reference dye 1 μl, viral DNA 5 μl, PCR-grade water 16.85 μl. Initial step 95 ° C 30 seconds, then 95 ° C 5 seconds, 60 ° C 31 seconds 50 cycles.
The probe and primer sequences for quantifying HHV-7 are as follows.
HHV-7 probe, 5′-FAM-CCTCGCAGATTGCTTGTTGGCCATG-TAMRA-3 ′ (SEQ ID NO: 61)
HHV-7 forward primer, 5′-CGGAAGTCACTGGAGTAATGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 62)
HHV-7 reverse primer, 5′-CCAATCCTTCCGAAACCGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 63)
Data analysis was performed using Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems).
The low fatigue group and the high fatigue group were separated by drawing a boundary line of the amount of HHV-7 DNA in saliva at 100,000 copies / ml or 40,000 copies / ml. Depressive symptoms were evaluated by Beck Depression Inventory (BDI), and subjective fatigue was evaluated by visual analogue scale (VAS).

(2)結果
疲労度の低い群(図20左)と高い群(図20右)における、自覚的疲労度(VAS)と、うつ状態を表すスコア(BDI)との相関を検討した(図20は、100,000コピー/mlを境界とした例を示す)。
その結果、驚くべきことに、唾液中のHHV-7による疲労測定法において、疲労度が低いと判定された群では、被験者のうつ症状が病的な状態に至らない状態においても、被験者の自覚的疲労度とうつ症状にかなり強い相関があることが判った。相関係数は、境界線が40,000コピー/ml の場合は、相関係数0.73、p<0.01、境界線が100,000コピー/ml の場合は相関係数 0.69、p<0.001であった。疲労が高い場合は、何れの場合も、自覚的疲労度とうつ症状には相関関係がなかった(図20)。
健康な労働者の精神状態が客観的に観察されたことは、疲労評価法の研究を含む従来の研究からは予測し得なかった成果であり、尚且つ、唾液検査と自覚症状だけの検査項目で、非常に簡便で専門家の診断を必要としない、うつ症状やうつ病のスクリーニング法になりうるものと考えられた(図20)。
(2) Results Correlation between subjective fatigue level (VAS) and score (BDI) indicating depression in the low fatigue level group (FIG. 20 left) and high group (FIG. 20 right) was examined (FIG. 20). Shows an example with 100,000 copies / ml as the boundary).
As a result, surprisingly, in the group where the degree of fatigue was determined to be low in the method for measuring fatigue with HHV-7 in saliva, the subject's awareness even when the subject's depressive symptoms did not lead to a morbid state. It was found that there was a fairly strong correlation between mental fatigue and depressive symptoms. The correlation coefficients were 0.73 and p <0.01 when the boundary line was 40,000 copies / ml, and 0.69 and p <0.001 when the boundary line was 100,000 copies / ml. When fatigue was high, there was no correlation between subjective fatigue level and depressive symptoms (FIG. 20).
The objective observation of the mental state of healthy workers was an outcome that could not have been predicted from previous studies, including studies on fatigue assessment methods. Therefore, it was considered to be a screening method for depression and depression which is very simple and does not require specialist diagnosis (FIG. 20).

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のZFP36の増加を測定した。   Using a mouse insomnia model, the increase in ZFP36 in organs due to mental fatigue due to insomnia was measured.

(1) 方法
実施例2で示した実験装置と同様の装置で、疲労負荷をかけたマウス(C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、筋肉(n=4)および脳(n=6)のZFP36及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、肝臓は2時間または24時間、心臓、筋肉は、4時間または24時間、脳は4時間または8時間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ZFP36 probe, 5'-FAM- TGAGCCATGACCTGTCATCCGACCACG -TAMRA-3'(配列番号:65)
ZFP36 forward primer, 5'- TCTGCCATCTACGAGAGCCTC -3'(配列番号:66)
ZFP36 reverse primer, 5'- GAGTCCGAGTTTATGTTCCAAAGTC -3'(配列番号:67)
ACTB probe, 5'-FAM- CACACCCGCCACCAGTTCGCCATG -TAMRA-3'(配列番号:68)
ACTB forward primer, 5'- CGCGAGCACAGCTTCTTTG -3'(配列番号:69)
ACTB reverse primer, 5'- CGACCAGCGCAGCGATATC -3'(配列番号:70)
(1) Method In the same apparatus as the experimental apparatus shown in Example 2, ZFP36 of the liver, heart, muscle (n = 4) and brain (n = 6) of mice (C57BL / 6NCrSlc) subjected to fatigue load and β-actin (ACTB) mRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The fatigue loading time was 2 or 24 hours for the liver, 4 or 24 hours for the heart and muscle, and 4 or 8 hours for the brain. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. The probe and primer sequences are as follows.
ZFP36 probe, 5'-FAM- TGAGCCATGACCTGTCATCCGACCACG -TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 65)
ZFP36 forward primer, 5'- TCTGCCATCTACGAGAGCCTC -3 '(SEQ ID NO: 66)
ZFP36 reverse primer, 5'-GAGTCCGAGTTTATGTTCCAAAGTC -3 '(SEQ ID NO: 67)
ACTB probe, 5'-FAM- CACACCCGCCACCAGTTCGCCATG -TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 68)
ACTB forward primer, 5'- CGCGAGCACAGCTTCTTTG -3 '(SEQ ID NO: 69)
ACTB reverse primer, 5'-CGACCAGCGCAGCGATATC -3 '(SEQ ID NO: 70)

(2) 結果
ZFP36は、2時間〜24時間程度の不眠においても有意に増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の際に、ZFP36が増加していることが判った。このことから、精神的疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をZFP36が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、ZFP36は、精神的疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、ZFP36の増加は、肝臓、心臓、筋肉、脳と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、コントロール群(睡眠)と精神疲労負荷群(不眠)間においてp<0.05であった (図21A:肝臓、心臓、筋肉、図21B:脳)。
(2) Results
ZFP36 increased significantly even in insomnia of 2 to 24 hours, and it was found that ZFP36 increased during the mental labor fatigue experienced on a daily basis. From this, it was found that ZFP36 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction associated with phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in mental fatigue. It was also found that ZFP36 can be used to measure fatigue as a biomarker of mental fatigue. In addition, it was found that the increase in ZFP36 was diverse in the liver, heart, muscle, and brain, and the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs could be individually evaluated. Statistical significance was determined by t-test, and in any organ, p <0.05 between the control group (sleep) and mental fatigue load group (insomnia) (FIG. 21A: liver, heart, muscle, FIG. 21B: brain).

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のTSC22D3(GILZ)の増加を測定した。   Using a mouse insomnia model, the increase in TSC22D3 (GILZ) in the organ due to mental fatigue due to insomnia was measured.

(1) 方法
実施例21で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウスの疲労負荷をかけたマウス(C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、筋肉(n=4)のTSC22D3及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。TSC22D3のプローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
TSC22D3 probe, 5'-FAM- TTCTTCACGAGGTCCATGGCCTGCTCA -TAMRA-3'(配列番号:71)
TSC22D3 forward primer, 5'- GTGGTGGCCCTAGACAACAAG -3'(配列番号:72)
TSC22D3 reverse primer, 5'- CCTCTCTCACAGCGTACATCAG -3'(配列番号:73)
(1) Method In the same manner as in the experiment shown in Example 21, the TSC22D3 and β of the liver, heart, and muscle (n = 4) of the mouse (C57BL / 6NCrSlc) subjected to fatigue load were subjected to the fatigue load. -Actin (ACTB) mRNA was quantified using TaqMan PCR. TSC22D3 probe and primer sequences are as follows.
TSC22D3 probe, 5'-FAM-TTCTTCACGAGGTCCATGGCCTGCTCA-TAMRA-3 '(SEQ ID NO: 71)
TSC22D3 forward primer, 5'- GTGGTGGCCCTAGACAACAAG -3 '(SEQ ID NO: 72)
TSC22D3 reverse primer, 5'- CCTCTCTCACAGCGTACATCAG -3 '(SEQ ID NO: 73)

(2) 結果
TSC22D3は、4時間および24時間の不眠においても有意に増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の際に、TSC22D3が増加していることが判った。このことから、精神的疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をTSC22D3が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、TSC22D3は、精神的疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、TSC22D3の増加は、肝臓、心臓、筋肉、と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、コントロール群(睡眠)と精神疲労負荷群(不眠)間においてp<0.05であった (図22)。
(2) Results
TSC22D3 was also significantly increased at 4 and 24 hours of insomnia, and it was found that TSC22D3 was increased during the mental labor fatigue experienced daily. From this, it was found that TSC22D3 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction associated with phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in mental fatigue. We also found that TSC22D3 can be used to measure fatigue as a biomarker of mental fatigue. In addition, the increase in TSC22D3 was diverse in the liver, heart, and muscle, and it was found that the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be individually evaluated. Statistical significance was determined by t-test, and p <0.05 between the control group (sleep) and the mental fatigue load group (insomnia) in any organ (FIG. 22).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後のZFP36の増加を測定した。   The increase in ZFP36 immediately after physical fatigue was measured using a forced swimming model of mice.

(1) 方法
実施例3で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス (C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、脳、末梢血(n=6)のZFP36及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、肝臓、心臓、脳は1時間、末梢血は30分間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は実施例21の通り。
(1) Method In the same manner as the experiment shown in Example 3, ZFP36 and β-actin (ACTB) of liver, heart, brain, peripheral blood (n = 6) of mice subjected to fatigue load (C57BL / 6NCrSlc) ) MRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The fatigue loading time was 1 hour for the liver, heart, and brain, and 30 minutes for peripheral blood. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. Probe and primer sequences are as in Example 21.

(2) 結果
ZFP36は、30分間〜1時間程度の運動負荷においても有意に増加し、日常的に経験する肉体労働の疲労の際に、ZFP36が増加していることが判った。このことから、肉体疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をZFP36が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、ZFP36は、肉体疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、ZFP36の増加は、肝臓、心臓、脳、末梢血と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、運動前群と運動後群間においてp<0.05であった (図23A:肝臓、心臓、図23B:末梢血、脳)。
(2) Results
It was found that ZFP36 increased significantly even during exercise load of about 30 minutes to 1 hour, and that ZFP36 increased during the physical labor fatigue experienced on a daily basis. From this, it was found that, in physical fatigue, ZFP36 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction associated with phosphorylation of eIF-2α due to fatigue. It was also found that ZFP36 can be used to measure fatigue as a biomarker of physical fatigue. In addition, the increase in ZFP36 was diverse in the liver, heart, brain, and peripheral blood, and it was found that the fatigue suppression effect and the degree of fatigue in these organs can be individually evaluated. Statistical significance was determined by t-test, and p <0.05 between the pre-exercise group and the post-exercise group in any organ (FIG. 23A: liver, heart, FIG. 23B: peripheral blood, brain).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後のTSC22D3の増加を測定した。   Using a forced swimming model of mice, the increase in TSC22D3 immediately after physical fatigue was measured.

(1) 方法
実施例23で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス (C57BL/6NCrSlc)の心臓、脳、末梢血(n=6)のTSC22D3及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、心臓、脳は1時間、末梢血は30分間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は実施例22の通り。
(1) Method In the same manner as in the experiment shown in Example 23, TSC22D3 and β-actin (ACTB) of heart, brain and peripheral blood (n = 6) of mice subjected to fatigue load (C57BL / 6NCrSlc) mRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The fatigue loading time was 1 hour for the heart and brain, and 30 minutes for peripheral blood. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. Probe and primer sequences are as in Example 22.

(2) 結果
TSC22D3は、30分間〜1時間程度の運動負荷においても有意に増加し、日常的に経験する肉体労働の疲労の際に、TSC22D3が増加していることが判った。このことから、肉体疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をTSC22D3が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、TSC22D3は、肉体疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、TSC22D3の増加は、心臓、脳、末梢血と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、運動前群と運動後群間においてp<0.05であった (図24)。
(2) Results
It was found that TSC22D3 increased significantly even during exercise loads of about 30 minutes to 1 hour, and that TSC22D3 increased during physical labor fatigue experienced on a daily basis. From this, it was found that TSC22D3 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction accompanying phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in physical fatigue. It was also found that TSC22D3 can be used to measure fatigue as a biomarker of physical fatigue. In addition, the increase in TSC22D3 was diverse in the heart, brain, and peripheral blood, and it was found that the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be individually evaluated. Statistical significance was determined by t-test, and p <0.05 between the pre-exercise group and the post-exercise group in any organ (FIG. 24).

ヒトの末梢血検体を使用して、ZFP36の測定を行った。   ZFP36 was measured using a human peripheral blood sample.

(1) 方法
睡眠不足による精神的疲労が顕著であると考えられる、睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者(図25: A, B, n=56; C, n=13)及び健常者(図25: A, B, n=21; C, n=18)を対象とした。血液をPAXgene Blood RNA 採血管 (日本BD)に採取した。血液RNAをPAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.)を用いて精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いて、cDNA を合成した。血液中ATF3、Nck1、ZFP36とβ-アクチン(ACTB)のmRNAをApplied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems)を用いて、TaqMan Arrayで以下条件のduplicateで定量した。プローブ、プライマーセット:ATF3 (Hs00231069_m1), Nck1 (Hs01592377_m1), ZFP36 (Hs00185658_m1), ACTB (Hs01060665_g1); 1 portあたり、TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl、cDNA 10 μl、PCR-grade water 40 μl。PCR条件: 初期ステップ:50℃ 2分、次に95℃ 10 分、95℃ 15 秒、60℃ 1 分を40サイクル。データの解析はExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems)を用いた。図25の値は平均±標準誤差で示した。* P < 0.05, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, Welch's t test.
(1) MethodPatients diagnosed with sleep apnea syndrome (SAS), which is considered to have significant mental fatigue due to lack of sleep (Figure 25: A, B, n = 56; C, n = 13) and Healthy subjects (FIG. 25: A, B, n = 21; C, n = 18) were used as subjects. Blood was collected in a PAXgene Blood RNA blood collection tube (Japan BD). Blood RNA was purified using PAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). ATF3, Nck1, ZFP36 and β-actin (ACTB) mRNA in blood were quantified with a TaqMan Array using Applied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems) under the following conditions. Probe and primer set: ATF3 (Hs00231069_m1), Nck1 (Hs01592377_m1), ZFP36 (Hs00185658_m1), ACTB (Hs01060665_g1); TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl per port, cDNA 10 μl, PCR-grade water 40 μl. PCR conditions: Initial step: 50 ° C 2 minutes, then 95 ° C 10 minutes, 95 ° C 15 seconds, 60 ° C 1 minute 40 cycles. Data analysis was performed using ExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems). The values in FIG. 25 are shown as mean ± standard error. * P <0.05, *** P <0.001, **** P <0.0001, Welch's t test.

(2) 結果
SASでは、ヒトの末梢血検体中のATF3、Nck1及びZFP36が健常者(対照)と比べて増加していることが確認された。これにより、睡眠不足や精神的疲労を生じているヒトの末梢血液を利用した検査において、ATF3、Nck1及びZFP36による疲労測定が可能であることが示された(図25)。
(2) Results
SAS confirmed that ATF3, Nck1, and ZFP36 in human peripheral blood samples were increased compared to healthy subjects (controls). As a result, it was shown that it is possible to measure fatigue with ATF3, Nck1, and ZFP36 in a test using peripheral blood of a human who suffers from sleep deprivation or mental fatigue (FIG. 25).

ISRIBによるeIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の阻害による抗疲労効果の測定
低分子化合物Integrated Stress Response inhibitor (ISRIB)はISRの経路を阻害することで、記憶の増強などの効果を発揮することが知られていた。本発明者らは、本発明者らによる発見の裏付けと、抗疲労薬の開発を目的とし、ISRIBなどのISR阻害機能をもつ物質が抗疲労効果を持つかどうかを検討した。
Measurement of anti-fatigue effect by inhibition of signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α by ISRIB Integrated stress response inhibitor (ISRIB) exerts effects such as memory enhancement by inhibiting ISR pathway It was known to do. The present inventors examined whether a substance having an ISR inhibitory function such as ISRIB has an anti-fatigue effect for the purpose of supporting the discovery by the present inventors and developing an anti-fatigue drug.

(1) 方法
ISRIBを2.5mg/kg腹腔注射したマウス(n=4)と、溶媒のみ注射した対照マウス(n=4)において、実施例3と同様のマウスの強制水泳実験装置を用いて、強制水泳50分後から10分間のマウスの移動距離(強制水泳開始後50分〜60分の移動距離)をTopScan(CleverSys社)で測定した。
(1) Method
In the mouse (n = 4) intraperitoneally injected with ISRIB 2.5 mg / kg and the control mouse (n = 4) injected with the solvent alone, using the same mouse forced swimming experimental apparatus as in Example 3, forced swimming 50 minutes The distance of movement of the mouse for 10 minutes later (movement distance of 50 to 60 minutes after the start of forced swimming) was measured with TopScan (CleverSys).

(2) 結果
ISRIBを腹腔注射したマウスと、溶媒のみ注射した対照マウスの、強制水泳50分後から10分間の移動距離は、ISRIB群の方が有意に長かった。この結果より、ISRIBによって強制水泳の疲労が減少し、50分後においても、より長距離の水泳が可能となったことが判る。統計学的有意はマン=ホイットニーのU検定で行い、コントロール群とISRIB群間においてp<0.05であった (図26)。
(2) Results
The movement distance of the mice injected intraperitoneally with ISRIB and the control mice injected with solvent alone for 10 minutes after 50 minutes of forced swimming was significantly longer in the ISRIB group. From this result, it can be seen that the fatigue of forced swimming was reduced by ISRIB, and that swimming at a longer distance became possible even after 50 minutes. Statistical significance was determined by the Mann-Whitney U test with p <0.05 between the control and ISRIB groups (FIG. 26).

このことは、eIF-2αのリン酸化が疲労の増加をもたらすことを示すとともに、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路を抑制する物質が抗疲労薬等の抗疲労物質として有用であることや、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路を抑制する効果をもって、抗疲労薬等の抗疲労物質、抗疲労器具の実施等の抗疲労法の候補の抗疲労効果判定が可能であることを示すと考えられる。   This indicates that phosphorylation of eIF-2α leads to increased fatigue, and substances that suppress signal transduction pathways related to phosphorylation of eIF-2α are useful as anti-fatigue substances such as anti-fatigue drugs. And anti-fatigue effects of anti-fatigue substances such as anti-fatigue drugs and anti-fatigue devices can be determined with the effect of suppressing signal transduction pathways related to phosphorylation of eIF-2α. It is thought to show that there is.

SalubrinalによるeIF-2αの脱リン酸化の阻害による疲労回復機構の抑制
前述のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子であるGADD34およびCrePが関係する疲労回復機構であるeIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤salubrinalによる、疲労増強効果を見いだした。
Suppression of fatigue recovery mechanism by inhibition of eIF-2α dephosphorylation by Salubrinal Inhibits dephosphorylation of eIF-2α, a fatigue recovery mechanism involving GADD34 and CreP, which are the aforementioned eIF-2α phosphorylation signal suppressors We found the fatigue enhancement effect of the drug salubrinal.

(1) 方法
DMSO 3mlに20mg/ml のsalubrinal stock solutionを37.5μlを入れたもの100μlを腹腔注射したマウス(salubrinal)と、溶媒であるDMSOのみを100μl腹腔注射したマウス(対照)の、強制水泳開始10分後から10分間の移動距離(強制水泳開始後10分〜20分の移動距離)を、実施例26と同様の実験系を用いて測定した。
(1) Method
10 minutes after the start of forced swimming in mice (salubrinal) injected with 100 μl of 37.5 μl of 20 mg / ml salubrinal stock solution in 3 ml of DMSO and mice injected with 100 μl of DMSO as a solvent (control) alone (control) The 10-minute movement distance (movement distance from 10 minutes to 20 minutes after the start of forced swimming) was measured using the same experimental system as in Example 26.

(2) 結果
Salubrinalを腹腔注射したマウスと、溶媒のみ注射した対照マウスの、強制水泳10分後から10分間の移動距離は、salubrinal群の方が有意に短かった。この結果より、salubrinalによって強制水泳の疲労抑制・回復が抑制され、強制水泳における移動距離が減少したものと考えられる。統計学的有意はt検定で行い、コントロール群とsalubrinal群間においてp<0.05であった (図27)。
この結果は、eIF-2αの脱リン酸化が抗疲労効果、とくに疲労抑制・回復効果をもつことを示すとともに、eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質が抗疲労薬等の抗疲労物質として有用であることや、eIF-2αの脱リン酸化の効果をもって、抗疲労薬等の抗疲労物質、抗疲労器具の実施等の抗疲労法の候補の抗疲労効果判定が可能であることを示すものと考えられる。
(2) Results
The distance traveled for 10 minutes after 10 minutes of forced swimming between the mice injected intraperitoneally with Salubrinal and the control mice injected with solvent alone was significantly shorter in the salubrinal group. From this result, it is considered that the fatigue suppression and recovery of forced swimming was suppressed by salubrinal, and the travel distance in forced swimming decreased. Statistical significance was determined by t-test, and p <0.05 between the control group and salubrinal group (FIG. 27).
This result shows that dephosphorylation of eIF-2α has anti-fatigue effects, especially fatigue suppression / recovery effects, and substances that promote dephosphorylation of eIF-2α are anti-fatigue substances such as anti-fatigue agents. The usefulness and eIF-2α dephosphorylation effects indicate that anti-fatigue substances such as anti-fatigue drugs and anti-fatigue methods such as anti-fatigue devices can be evaluated for anti-fatigue effects. It is considered a thing.

本発明にかかる疲労度評価方法は、ストレスや疲労メカニズムの解明に利用することができ、ストレス解消方法の開発、疲労の程度評価、疲労にともなうメンタル面の評価をすることができる。また、本発明を利用することにより、市場に出回る抗疲労を謳う健康食品、特定保健用食品、栄養ドリンクおよび生体機能補完物質や、電化製品、家具、民間療法などの効果の定量化(評価)が可能になる。よって本発明は、医療業、製薬業、健康食品産業、健康機器産業等の広範な分野に利用が可能である。   The fatigue evaluation method according to the present invention can be used for elucidation of stress and fatigue mechanism, and can develop a stress relieving method, evaluate the degree of fatigue, and evaluate the mental surface associated with fatigue. In addition, by using the present invention, quantification (evaluation) of the effects of health foods, anti-fatigue health foods, foods for specified health use, nutrition drinks and biological function supplements, electrical appliances, furniture, folk remedies, etc. Is possible. Therefore, the present invention can be used in a wide range of fields such as the medical industry, the pharmaceutical industry, the health food industry, and the health equipment industry.

Claims (3)

細胞中の真核生物翻訳開始因子2α(eIF-2α)リン酸化シグナル抑制因子の量を指標として、被験対象生物の抗疲労力を評価することを特徴とする抗疲労力評価方法であって、当該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも多ければ、抗疲労力が高いと評価することを特徴とする、抗疲労力評価方法:
ここで、当該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、activating transcription factor (ATF)3、ATF4、およびC/EBP-homologous protein (CHOP) からなる群から選ばれる少なくとも一種である。
An anti-fatigue power evaluation method characterized by evaluating the anti-fatigue power of a test target organism using the amount of a eukaryotic translation initiation factor 2α (eIF-2α) phosphorylation signal inhibitor in a cell as an index, The anti-fatigue power is characterized by evaluating that the anti-fatigue power is high if the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is larger than the amount predicted from the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor. Evaluation method:
Here, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ), and the eIF-2α phosphorylation signaling factor is phosphorylated eIF- It is at least one selected from the group consisting of 2α, activating transcription factor (ATF) 3, ATF 4, and C / EBP-homologous protein (CHOP).
上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量と上記eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子のmRNA発現量またはタンパク産生量として測定する、請求項1に記載の抗疲労力評価方法。   The amount of eIF-2α phosphorylation signal suppressor and the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor are expressed as the amount of mRNA expression or protein production of eIF-2α phosphorylation signal suppressor and eIF-2α phosphorylation signal transduction factor. The anti-fatigue strength evaluation method according to claim 1, measured as follows. 自覚的疲労感を有する被験者について、唾液中のヒトヘルペスウイルスの量を指標として被験者自覚的疲労感の原因を評価する方法であって、
(1)被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス7のDNA量を測定する工程;
(2)前記DNA量が、被験者の疲労度が低いと判定する境界線以下である場合に、被験者の自覚的疲労感うつ症状によると評価する工程であって、ここで、該境界線は、唾液中のヒトヘルペスウイルス7のDNA量が100,000コピー/ml以下である、工程;
を含む方法。
About a subject having subjective fatigue, using the amount of human herpesvirus in saliva as an index , a method for evaluating the cause of the subject 's subjective fatigue,
(1) a step of measuring the DNA level of human herpesvirus 7 in the saliva of the subject;
(2) When the amount of DNA is equal to or lower than a boundary line for determining that the subject's fatigue level is low, the subject's subjective fatigue is evaluated as a depressive symptom , wherein the boundary line is The amount of DNA of human herpesvirus 7 in saliva is 100,000 copies / ml or less;
Including methods.
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