JP6622613B2 - Antioxidant - Google Patents
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Description
本発明は、ヒアルロン酸を含有する抗酸化剤に関する。特に安価に製造することができ、高い抗酸化活性が得られる抗酸化剤に関する。 The present invention relates to an antioxidant containing hyaluronic acid. In particular, the present invention relates to an antioxidant that can be produced at a low cost and can provide high antioxidant activity.
ヒアルロン酸は、保湿効果や保水効果を高める働きがあることが知られており、従来からさまざまな化粧品や医薬品に配合されている。例えば、乾燥肌や荒れ肌に直接適用することにより保湿性を高めて肌のコンディションを調えたり、乾燥期に皮膚表面から水分が失われたりすることを防ぐために予防的に皮膚表面に適用することが通常行われている。また、ヒアルロン酸は、保湿効果から派生する機能や保湿効果以外の有用な特性の発現も期待され、その新たな利用法に関する研究も幾つか見受けられる。 Hyaluronic acid is known to have a moisturizing effect and a water retaining effect and has been conventionally incorporated into various cosmetics and pharmaceuticals. For example, it can be applied directly to dry or rough skin to prevent moisture from being lost from the skin surface during the dry season to improve moisture retention and condition the skin. Usually done. In addition, hyaluronic acid is expected to exhibit functions derived from the moisturizing effect and useful properties other than the moisturizing effect, and there are some studies on its new usage.
例えば、特許文献１には、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を創傷治療剤に用いることが提案されている。この創傷治療剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているために安全性が高く、例えば経口投与や創傷部位への直接投与により創傷を迅速に治療することができる。
For example,
上記のように、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物は、創傷治療剤として高い有用性を有する。しかし、この分解生成物は、創傷治療効果が確認されているだけで他の作用効果は殆ど知られておらず、応用範囲が限られていた。 As described above, a degradation product obtained by decomposing a composition containing hyaluronic acid and protein with a protease has high utility as a wound healing agent. However, this degradation product has been confirmed to have a wound healing effect, and has little known other effects, and its application range has been limited.
一方、近年、生体内で発生した活性酸素が与える生命体への悪影響が大きな問題になっている。活性酸素とは、普通の酸素分子よりも活性が高い酸素分子、およびその関連物質のことをいい、スーパーオキサイド（・Ｏ2 -）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、過酸化水素（Ｈ2０2）、一重項酸素（1Ｏ2）といった狭義の活性酸素の他、ヒドロペルオキシルラジカル、アルコキシルラジカル、アルキルペルオキシルラジカル等のラジカル種、ペルオキシナイトライド、脂質ヒドロペルオキシド等のノンラジカル種も含まれる。狭義の活性酸素は、生命体が酸素（3Ｏ2）を消費する過程で発生するものであり、こうした活性酸素が過剰に発生すると、ＤＮＡ、脂質、酵素、タンパク質といった重要な生体成分が活性酸素により酸化され、他の活性酸素や酸化変性物等が生成される、いわゆる酸化障害が引き起こされる。こうした活性酸素による酸化障害は、老化現象を亢進することが知られており、糖尿病、高血圧、動脈硬化などの生活習慣病をはじめとする様々な疾患の発症に深く関わっていることが明らかになっている。
これらの活性酸素による生命体の酸化障害を抑制する方法としては、抗酸化物質を生命体に投与して活性酸素を消去する方法が従来から知られている。抗酸化物質には、フラボノイド、カテキン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）等の水溶性抗酸化物質、ビタミンＥやβカロテン等の脂溶性抗酸化物質があるが、脂溶性抗酸化物質は体内に蓄積するため、投与量や投与方法の選定が難しいという問題がある。一方、水溶性抗酸化物質は、こうした体内蓄積の問題が生じないため、医薬品の他に、サプリメントとして多用されているが、生命体の酸化障害を十分に抑制する程の高い抗酸化活性は認められていない。
On the other hand, in recent years, adverse effects on living organisms caused by active oxygen generated in vivo have become a major problem. Active oxygen refers to oxygen molecules having higher activity than ordinary oxygen molecules and related substances, such as superoxide (· O 2 − ), hydroxyl radical (HO ·), hydrogen peroxide (H 2 0 2). ), Radical oxygen species such as hydroperoxyl radicals, alkoxyl radicals and alkylperoxyl radicals, and non-radical species such as peroxynitride and lipid hydroperoxide, in addition to active oxygen in the narrow sense such as singlet oxygen ( 1 O 2 ) . In the narrow sense, active oxygen is generated in the process of the life organism consuming oxygen ( 3 O 2 ), and when such active oxygen is generated excessively, important biological components such as DNA, lipids, enzymes, and proteins are activated oxygen. Oxidized by oxygen, and other active oxygen, oxidatively modified products, etc. are generated, so-called oxidative damage is caused. Such oxidative damage due to active oxygen is known to enhance the aging phenomenon, and it has become clear that it is deeply involved in the development of various diseases including lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, and arteriosclerosis. ing.
As a method for suppressing the oxidative damage of living organisms due to these active oxygens, there has been conventionally known a method of eliminating active oxygen by administering an antioxidant to a living organism. Antioxidants include water-soluble antioxidants such as flavonoids, catechins, and vitamin C (ascorbic acid), and fat-soluble antioxidants such as vitamin E and β-carotene, but fat-soluble antioxidants accumulate in the body. Therefore, there is a problem that it is difficult to select the dosage and administration method. On the other hand, since water-soluble antioxidants do not cause such accumulation problems in the body, they are frequently used as supplements in addition to pharmaceuticals, but they have a high antioxidant activity that sufficiently suppresses oxidative damage to living organisms. It is not done.
そこで本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる抗酸化剤およびその製造方法を提供することを課題として検討を進めた。 In order to solve the problems of the prior art, the present inventors have developed an antioxidant and a method for producing the same that have high antioxidant activity and can effectively suppress oxidative damage of biological components. We proceeded with the study as an issue to provide.
上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、上記の創傷治療作用があることが知られている組成物、すなわちヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物がラジカルを捕捉する作用も有し、抗酸化剤として極めて有用であることを初めて見出した。さらに、この分解生成物が、ラジカルによる赤血球溶血反応（酸化障害）を効果的に抑制する作用を有することの知見も得た。本発明は、これらの知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors obtained a composition known to have the above-mentioned wound healing action, that is, a composition containing hyaluronic acid and a protein as a protease. It was found for the first time that the decomposition product decomposed in
［１］ ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
［２］ 前記組成物が鶏冠であることを特徴とする［１］に記載の抗酸化剤。
［３］ 前記分解生成物が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸を含有することを特徴とする［１］または［２］に記載の抗酸化剤。
［４］ 前記分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量が、抗酸化剤の全量に対して１０質量％以上であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［５］ 分子量が１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることを特徴とする［３］または［４］に記載の抗酸化剤。
［６］ Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が、抗酸化剤の全量に対して０．０１質量％以下であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［７］ 総遊離アミノ酸量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であり、且つ、総蛋白質量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［８］ 前記遊離アミノ酸が、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチンおよびチロシンから選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする［７］に記載の抗酸化剤。
［９］ 前記分解生成物の凍結乾燥物を粉砕して得た粉砕物を含むことを特徴とする［１］〜［８］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１０］ 前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行うことで得た水飽和１−ブタノール画分を含有することを特徴とする［１］〜［９］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１１］ ラジカルを捕捉する作用を有することを特徴とする［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１２］ 生体成分の酸化障害を抑制する作用を有することを特徴とする［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
[1] An antioxidant comprising a degradation product obtained by decomposing a composition containing hyaluronic acid and protein with a protease.
[2] The antioxidant according to [1], wherein the composition is a chicken crown.
[3] The antioxidant according to [1] or [2], wherein the decomposition product contains a low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 380 to 5,000.
[4] The content of the low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 380 to 5000 is 10% by mass or more based on the total amount of the antioxidant, [1] to [3] Antioxidants as described in 1.
[5] The ratio of low molecular hyaluronic acid having a molecular weight of 1520 to 5000 is 60% by mass or more of the total amount of low molecular hyaluronic acid having a molecular weight of 380 to 5000, as described in [3] or [4] Antioxidants.
[6] The antioxidant according to any one of [1] to [5], wherein the content of N-acetylglucosamine is 0.01% by mass or less based on the total amount of the antioxidant. Agent.
[7] The total amount of free amino acids is 2% by mass or more in terms of the mass ratio to the total amount of the antioxidant, and the total protein mass is 2% by mass or more in terms of the mass ratio to the total amount of the antioxidant. The antioxidant according to any one of [1] to [6].
[8] The antioxidant according to [7], wherein the free amino acid contains at least one selected from isoleucine, β-aminoisobutyric acid, alanine, taurine, phenylalanine, aspartic acid, cystine and tyrosine. Agent.
[9] The antioxidant according to any one of [1] to [8], comprising a pulverized product obtained by pulverizing a freeze-dried product of the decomposition product.
[10] Any one of [1] to [9], wherein the decomposition product contains a water-saturated 1-butanol fraction obtained by performing a liquid separation operation with water and water-saturated 1-butanol. The antioxidant of 1 item | term.
[11] The antioxidant according to any one of [1] to [10], which has an action of scavenging radicals.
[12] The antioxidant according to any one of [1] to [11], which has an action of suppressing oxidative damage of a biological component.
［１３］ ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法。
［１４］ 前記組成物が鶏冠であり、前記酵素処理工程の前に、前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程を有することを特徴とする［１３］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１５］ 前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を、凍結乾燥した後、粉砕して粉砕物を得る工程を有することを特徴とする［１３］または［１４］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１６］ 前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を精製する精製工程を有することを特徴とする［１３］〜［１５］のいずれか１項に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１７］ 前記精製工程が、前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行って水飽和１−ブタノール画分を得る分液工程を含むことを特徴とする［１６］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１８］ ［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする内服剤。
［１９］ ［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする外用剤。
［２０］ 化粧品であることを特徴とする［１９］に記載の外用剤。
[13] A method for producing an antioxidant, comprising an enzyme treatment step of decomposing a composition containing hyaluronic acid and a protein with a protease.
[14] The antioxidant according to [13], wherein the composition is a chicken crown, and has a step of fragmenting the chicken crown into 0.5 cm square or more per side before the enzyme treatment step. Manufacturing method.
[15] The method according to [13] or [14], wherein after the enzyme treatment step, the degradation product obtained in the enzyme treatment step is freeze-dried and then pulverized to obtain a pulverized product. The manufacturing method of the antioxidant of description.
[16] The antioxidant according to any one of [13] to [15], further comprising a purification step for purifying the degradation product obtained in the enzyme treatment step after the enzyme treatment step. Manufacturing method.
[17] The method according to [16], wherein the purification step includes a liquid separation step of performing a liquid separation operation with water and water-saturated 1-butanol on the decomposition product to obtain a water-saturated 1-butanol fraction. The manufacturing method of the antioxidant of description.
[18] An internal medicine comprising the antioxidant according to any one of [1] to [12].
[19] An external preparation comprising the antioxidant according to any one of [1] to [12].
[20] The external preparation described in [19], which is a cosmetic.
本発明の抗酸化剤は、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる。また、本発明の抗酸化剤の製造方法によれば、上記の有用な作用効果を奏する抗酸化剤を低コストで製造することができる。 The antioxidant of the present invention has high antioxidant activity and can effectively suppress oxidative damage of biological components. Moreover, according to the manufacturing method of the antioxidant of this invention, the antioxidant which shows said useful effect can be manufactured at low cost.
以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The description of the constituent elements described below may be made based on representative embodiments and specific examples, but the present invention is not limited to such embodiments. In the present specification, a numerical range expressed using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a lower limit value and an upper limit value.
［抗酸化剤］
本発明の抗酸化剤は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を含有する点に特徴がある。
[Antioxidant]
The antioxidant of the present invention is characterized in that it contains a decomposition product obtained by decomposing a composition containing hyaluronic acid and protein with a protease.
上記組成物に含まれるヒアルロン酸は、化粧品や医薬品の成分として通常用いられているヒアルロン酸であれば特に制限なく使用することができる。ヒアルロン酸は、元来ウシの眼の硝子体から単離されたものであるが、これに限らず、動物の関節液やニワトリの鶏冠などから単離されたものであっても使用することができる。また、自然界から単離されたものでなく、合成や微生物発酵法により得られたものでもよい。 The hyaluronic acid contained in the composition can be used without particular limitation as long as it is a hyaluronic acid usually used as a cosmetic or pharmaceutical ingredient. Hyaluronic acid was originally isolated from the vitreous of bovine eyes, but is not limited to this, and it can be used even if it is isolated from animal joint fluids or chicken caps. it can. Moreover, it may not be isolated from nature but may be obtained by synthesis or microbial fermentation.
ヒアルロン酸は、アミノ酸とウロン酸からなる複雑な多糖類であるが、その構造の詳細は特に限定されない。例えば、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなるニ糖を繰り返し単位とする多糖を挙げることができる。組成物に含まれるヒアルロン酸の分子量は特に限定されないが、例えば鶏冠に含まれるヒアルロン酸は、分子量が６００万〜１０００万であり、鶏冠から抽出したヒアルロン酸は、抽出過程で分解されるため、平均分子量が数十万〜数百万である。本発明で使用するヒアルロン酸は抗酸化活性を過度に失わない限り、誘導化や熱変性を受けたものであっても構わない。いわゆるヒアルロン酸誘導体として知られている化合物は、本発明で有効に使用することができる。 Hyaluronic acid is a complex polysaccharide composed of an amino acid and uronic acid, but details of its structure are not particularly limited. For example, the polysaccharide which uses the disaccharide which consists of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine as a repeating unit can be mentioned. Although the molecular weight of hyaluronic acid contained in the composition is not particularly limited, for example, hyaluronic acid contained in the chicken crown has a molecular weight of 6 million to 10 million, and hyaluronic acid extracted from the chicken crown is decomposed in the extraction process, The average molecular weight is several hundred thousand to several million. The hyaluronic acid used in the present invention may be subjected to derivatization or heat denaturation as long as the antioxidant activity is not lost excessively. Compounds known as so-called hyaluronic acid derivatives can be used effectively in the present invention.
上記組成物に含まれる蛋白質はその種類を問わないが、鶏冠に含まれる蛋白質が極めて好ましい。鶏冠の種類は特に制限されないが、ニワトリの鶏冠を用いるのが好ましい。ニワトリの鶏冠はヒアルロン酸を含有するため、本発明の抗酸化剤の製造に用いる組成物を提供するに際して、鶏冠にヒアルロン酸を別途添加しなくてもよいというメリットがある。このため、鶏冠を用いれば本発明の抗酸化剤の製造工程が簡略化でき、製造コストも下げることができる。 Although the protein contained in the said composition does not ask | require the kind, the protein contained in a chicken crown is very preferable. The kind of chicken crown is not particularly limited, but it is preferable to use a chicken chicken crown. Since chicken hen's crown contains hyaluronic acid, there is an advantage that it is not necessary to add hyaluronic acid separately to the chicken's crown when providing the composition used for producing the antioxidant of the present invention. For this reason, if a chicken crown is used, the manufacturing process of the antioxidant of this invention can be simplified, and manufacturing cost can also be reduced.
本発明で用いる組成物は、蛋白質とヒアルロン酸のみを含んでいてもよいし、その他の成分や溶媒、分散媒を含んでいてもよい。溶媒および分散媒としては、蛋白質やヒアルロン酸を溶解できるものであればよく、水や水性緩衝液を好適に用いることができる。また、組成物は、蛋白質とヒアルロン酸を含む天然物そのものであってもよい。組成物となる天然物としては、動物の関節液や鶏冠を挙げることができ、ヒアルロン酸を豊富に含むことからニワトリの鶏冠であることが好ましい。 The composition used in the present invention may contain only protein and hyaluronic acid, or may contain other components, a solvent, and a dispersion medium. Any solvent and dispersion medium may be used as long as they can dissolve protein and hyaluronic acid, and water or an aqueous buffer can be suitably used. Further, the composition may be a natural product itself containing protein and hyaluronic acid. Examples of natural products to be used in the composition include animal joint fluids and chicken crowns, which are preferably chicken chicken crowns because they contain abundant hyaluronic acid.
本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものである。プロテアーゼの種類は特に制限されない。通常の蛋白質分解に用いられるプロテアーゼであればいずれも使用することができる。すなわち、エンドペプチダーゼであっても、エキソぺプチダーゼであっても使用することが可能であり、また活性部位はセリン、システイン、金属、アスパラギン酸等のいずれであってもよい。また、複数のプロテアーゼを混合して使用してもよい。好ましいプロテアーゼとして、例えばプロナーゼを使用することができる。 The degradation product used in the present invention is a product obtained by degrading the above composition with a protease. The type of protease is not particularly limited. Any protease can be used as long as it is a protease used for normal proteolysis. That is, an endopeptidase or an exopeptidase can be used, and the active site may be any of serine, cysteine, metal, aspartic acid and the like. A plurality of proteases may be mixed and used. As a preferred protease, for example, pronase can be used.
また、本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものであるため、少なくとも、プロテアーゼにより分解された蛋白質の分解物と、ヒアルロン酸を含有し、未分解の蛋白質（プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていた蛋白質）や組成物由来の他の成分を含有していてもよい。
分解生成物に含まれる蛋白質の分解物としては、未分解の蛋白質よりも低分子量の蛋白質、ペプチド、遊離アミノ酸を挙げることができ、これらが混在していてもよい。
また、分解生成物は、遊離アミノ酸を含有することが好ましい。分解生成物が含有する遊離アミノ酸は、蛋白質の分解物としての遊離アミノ酸であってもよいし、プロテアーゼ添加前の組成物に遊離アミノ酸として元々含まれていたものであってもよい。遊離アミノ酸の種類は、組成物の成分によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠である分解生成物では、比較的含有率が多いアミノ酸としてイソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等を挙げることができ、この他にも、多種類のアミノ酸を含む。
In addition, since the degradation product used in the present invention is a product obtained by degrading the above composition with a protease, it contains at least a degradation product of a protein degraded by a protease and hyaluronic acid, and an undegraded protein (protease). The protein originally contained in the composition before addition) and other components derived from the composition may be contained.
Examples of the degradation product of the protein contained in the degradation product include proteins, peptides, and free amino acids having a molecular weight lower than that of the undegraded protein, and these may be mixed.
The decomposition product preferably contains a free amino acid. The free amino acid contained in the degradation product may be a free amino acid as a protein degradation product, or may be one originally contained as a free amino acid in the composition before addition of protease. The type of free amino acid varies depending on the components of the composition. For example, in a decomposition product whose composition is a chicken crown, amino acids having a relatively high content are isoleucine, β-aminoisobutyric acid, alanine, taurine, phenylalanine, aspartic acid. , Cystine, tyrosine and the like, and in addition, various amino acids are included.
抗酸化剤における総蛋白質量は、抗酸化剤の全量に対する質量比で０．５〜１０質量％であることが好ましく、１〜７質量％であることがより好ましく、２〜５質量％であることがさらに好ましい。また、抗酸化剤における総遊離アミノ酸量は、抗酸化剤の全量に対する質量比で０．５〜１２質量％であることが好ましく、１〜８質量％であることがより好ましく、２〜６質量％であることがさらに好ましい。抗酸化剤における総蛋白質量および遊離アミノ酸量が上記の範囲であることにより、抗酸化剤が効果的に作用すると考えられ、ラジカルによる物質の酸化を顕著に抑制することができる。
本明細書中において「総蛋白質量」とは、Lowry法により求めた総蛋白質含量のことをいい、「総遊離アミノ酸量」とは、Ninhydrin法により求めた遊離アミノ酸の総量のことをいう。
The total protein mass in the antioxidant is preferably 0.5 to 10% by mass, more preferably 1 to 7% by mass, and 2 to 5% by mass with respect to the total amount of the antioxidant. More preferably. The total amount of free amino acids in the antioxidant is preferably 0.5 to 12% by mass, more preferably 1 to 8% by mass, and more preferably 2 to 6% by mass with respect to the total amount of the antioxidant. % Is more preferable. When the total protein mass and free amino acid content in the antioxidant are within the above ranges, the antioxidant is considered to act effectively, and the oxidation of the substance by radicals can be remarkably suppressed.
In the present specification, “total protein mass” refers to the total protein content determined by the Lowry method, and “total free amino acid amount” refers to the total amount of free amino acids determined by the Ninhydrin method.
上記の分解生成物に含まれるヒアルロン酸は、プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていたヒアルロン酸がそのまま残存したもの（以下、「未分解のヒアルロン酸」という）であってもよいし、ヒアルロン酸の分解物（以下、「低分子ヒアルロン酸」という）であってもよいし、未分解のヒアルロン酸と低分子ヒアルロン酸とが混在したものであってもよいが、低分子ヒアルロン酸を含有することが好ましい。低分子ヒアルロン酸は生命体の深部に浸透し易く、生命体に対する作用を効果的に得ることができる。分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であってもよいし、上記の組成物とは別の系でヒアルロン酸を加水分解し、得られた低分子ヒアルロン酸を分解生成物に添加したものであってもよいが、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であることが好ましい。組成物中での低分子ヒアルロン酸の生成は、塩酸やヒアルロニダーゼ等の、ヒアルロン酸を加水分解する物質を組成物に添加することにより行うことができる。また、組成物が天然物である場合には、天然物に元々含まれる物質による自己消化を利用して低分子ヒアルロン酸を生成してもよい。ただし、ヒアルロン酸の生体に対する作用を有効に得る点から、ヒアルロン酸は構成単位を保持していること、すなわち、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンまで分解が進行していないことが好ましい。具体的には、抗酸化剤におけるＮ−アセチルグルコサミンの含有量は、抗酸化剤の全量に対して０．０１質量％以下であることが好ましく、０質量％であることが最も好ましい。
本明細書中において「Ｎ−アセチルグルコサミン量」とはMorgan-Elson法により求めたＮ−アセチルグルコサミン含量のことをいう。
The hyaluronic acid contained in the degradation product may be one in which the hyaluronic acid originally contained in the composition before addition of the protease remains as it is (hereinafter referred to as “undegraded hyaluronic acid”), It may be a degradation product of hyaluronic acid (hereinafter referred to as “low molecular hyaluronic acid”) or a mixture of undegraded hyaluronic acid and low molecular hyaluronic acid. It is preferable to contain. Low-molecular-weight hyaluronic acid easily penetrates into the deep part of a living organism, and can effectively obtain an action on the living organism. The low molecular weight hyaluronic acid contained in the decomposition product may be a low molecular weight hyaluronic acid obtained by hydrolyzing hyaluronic acid in the composition, or the hyaluronic acid is hydrolyzed in a system different from the above composition. The low molecular weight hyaluronic acid obtained by decomposition may be added to the decomposition product, but is preferably a low molecular weight hyaluronic acid obtained by hydrolyzing hyaluronic acid in the composition. The production of low-molecular hyaluronic acid in the composition can be performed by adding a substance that hydrolyzes hyaluronic acid, such as hydrochloric acid or hyaluronidase, to the composition. Moreover, when the composition is a natural product, low molecular hyaluronic acid may be generated by utilizing autolysis by a substance originally contained in the natural product. However, from the viewpoint of effectively obtaining the action of hyaluronic acid on a living body, it is preferable that hyaluronic acid retains a structural unit, that is, the decomposition does not proceed to glucuronic acid and N-acetylglucosamine. Specifically, the content of N-acetylglucosamine in the antioxidant is preferably 0.01% by mass or less, and most preferably 0% by mass with respect to the total amount of the antioxidant.
In this specification, “N-acetylglucosamine amount” refers to the N-acetylglucosamine content determined by the Morgan-Elson method.
分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、分子量が３８０〜５０００であることが好ましい。分子量３８０〜５０００は、ヒアルロン酸の繰り返し単位数で約１〜１４に相当する。抗酸化剤における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量は、抗酸化剤の全量に対して５質量％以上であることが好ましく、７質量％以上であることがより好ましく、１０質量％以上であることがさらに好ましい。また、低分子ヒアルロン酸のうちでは、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸が主成分であることが好ましく、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、７５質量％以上であることがさらに好ましい。これにより、抗酸化剤が効果的に作用すると考えられ、ラジカルによる物質の酸化を顕著に抑制することができる。
低分子ヒアルロン酸の分子量と質量比率は、ポリエチレングリコールを分子量マーカーに用いる高速液体クロマトグラフィにより分析することができる。
The low molecular weight hyaluronic acid contained in the decomposition product preferably has a molecular weight of 380 to 5,000. The molecular weight of 380 to 5000 corresponds to about 1 to 14 as the number of repeating units of hyaluronic acid. The content of the low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 380 to 5000 in the antioxidant is preferably 5% by mass or more, more preferably 7% by mass or more, based on the total amount of the antioxidant. % Or more is more preferable. Of the low molecular weight hyaluronic acids, low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 1520 to 5000 is preferably the main component, and the proportion of low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 1520 to 5000 is the total amount of low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 380 to 5000. It is preferably 60% by mass or more, more preferably 70% by mass or more, and further preferably 75% by mass or more. Thereby, it is thought that an antioxidant acts effectively and can oxidize the substance by a radical notably.
The molecular weight and mass ratio of the low molecular weight hyaluronic acid can be analyzed by high performance liquid chromatography using polyethylene glycol as a molecular weight marker.
分解生成物の性状は、用いる組成物の成分や組成比、プロテアーゼの種類によっても異なるが、通常は液状、さらには粘質性を帯びた液状である。分解生成物は、そのまま本発明の抗酸化剤としてもよいし、適宜精製して他の成分と組み合わせる等して本発明の抗酸化剤としてもよい。分解生成物を精製することにより、より抗酸化活性が高い抗酸化剤とすることができる。液状の抗酸化剤は、塗布や点眼のための外用剤、飲料タイプの内服剤等として用いることができる。また、分解生成物を凍結乾燥等により乾燥した後、粉砕した場合は、粉末状の抗酸化剤を提供することが可能である。粉末状の抗酸化剤は、そのまま、もしくは他の成分を含有させて内服剤に用いてもよいし、錠剤やカプセル剤に加工してもよいし、所望の溶媒または分散媒を添加して液状とし、塗布や点眼のための外用剤や飲料タイプの内服剤等として用いてもよい。 The properties of the degradation product vary depending on the composition and composition ratio of the composition to be used and the type of protease, but are usually liquid or sticky. The decomposition product may be used as it is as the antioxidant of the present invention, or may be purified as appropriate and combined with other components to form the antioxidant of the present invention. By purifying the decomposition product, an antioxidant having higher antioxidant activity can be obtained. The liquid antioxidant can be used as an external preparation for application and eye drops, a beverage-type internal use and the like. In addition, when the decomposition product is dried by freeze-drying or the like and then pulverized, it is possible to provide a powdered antioxidant. The powdered antioxidant may be used as an internal preparation as it is, or may contain other components, or may be processed into tablets or capsules, or may be liquidized by adding a desired solvent or dispersion medium. In addition, it may be used as an external preparation for application or eye drops, a drink-type internal use, or the like.
本発明の抗酸化剤には、上記分解生成物以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、抗酸化剤に賦形剤を含有させた場合には、分解生成物と賦形剤の配合率を制御して総蛋白質量や総遊離アミノ酸量、低分子ヒアルロン酸量等の成分量を調整することができる。また、保存し易い抗酸化剤の態様として、凍結乾燥させた分解生成物を粉砕して得た粉末を賦形剤で希釈した混合粉末を挙げることができる。賦形剤としては、特に限定されないが、デキストリンが好適である。賦形剤による希釈倍率は、質量比で２〜１０倍であることが好ましく、２〜７倍であることがより好ましく、３〜５倍であることがさらに好ましい。 The antioxidant of the present invention can contain various components other than the above decomposition products. For example, when an excipient is included in an antioxidant, the amount of ingredients such as total protein mass, total free amino acid content, and low molecular hyaluronic acid content can be controlled by controlling the blending ratio of degradation products and excipients. Can be adjusted. Moreover, as an aspect of the antioxidant that is easy to store, a mixed powder obtained by diluting a powder obtained by pulverizing a freeze-dried decomposition product with an excipient can be mentioned. Although it does not specifically limit as an excipient | filler, A dextrin is suitable. The dilution ratio with the excipient is preferably 2 to 10 times, more preferably 2 to 7 times, and further preferably 3 to 5 times in terms of mass ratio.
本発明の抗酸化剤は、ラジカルを捕捉する作用を有し、高い抗酸化活性を発揮する。
ここで、本明細書中において「抗酸化活性」とは、酸化を防ぐ性質のことをいい、生体成分（ＤＮＡ、脂質、酵素、タンパク質等）の酸化障害を抑制する機能の他、食品等の酸化による劣化を防ぐ機能等も含む。本発明の抗酸化剤は、これら機能の両方を奏するが、有用性が特に高いことから、生体成分の酸化障害を抑制する機能を利用することが好ましい。
本発明の抗酸化剤に捕捉させるラジカルは特に限定されず、活性酸素としてのラジカルであってもよいし、活性酸素以外のラジカルであってもよい。ラジカルの具体例として、スーパーオキサイド（・Ｏ2 -）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、ヒドロペルオキシルラジカル（ＨＯＯ・）、アルコキシルラジカル（ＲＯ・）、アルキルペルオキシルラジカル（ＲＯＯ・）等を挙げることができる。
このように、本発明の抗酸化剤は高い抗酸化活性を有するため、経口で摂取され、その成分が腸管から吸収された場合には、生体内で発生した活性酸素を捕捉し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制しうる。その結果、老化の進行が抑えられるとともに、生活習慣病やがん等の酸化ストレスが起因する各種疾患の発症を抑制することができる。
ここで、本発明の抗酸化剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているため安全性が高く、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
また、本発明の抗酸化剤は、皮膚に適用することも可能である。皮膚から内部に吸収された成分は、表皮や真皮、皮下組織で発生した活性酸素を捕捉して、皮膚の老化や炎症、色素沈着等の障害を効果的に抑制することができる。また、皮膚から生体内に吸収されず、皮膚表面に残った成分は、皮膚の表面や表面付近で発生した活性酸素を捕捉して、活性酸素による皮膚の老化や炎症、色素沈着等の障害を効果的に抑制することができる。本発明の抗酸化剤は、プロテアーゼによる分解を経ているため、その条件の変更により、皮膚からの吸収性を制御することができ、これにより、特定の部位（例えば皮膚表面、皮膚の表面付近または皮膚の深部等）に優先的に作用させることも可能である。
The antioxidant of the present invention has an action of scavenging radicals and exhibits high antioxidant activity.
As used herein, the term “antioxidant activity” refers to the property of preventing oxidation. In addition to the function of suppressing oxidative damage of biological components (DNA, lipids, enzymes, proteins, etc.), Also includes a function to prevent deterioration due to oxidation. The antioxidant of the present invention exhibits both of these functions, but since its usefulness is particularly high, it is preferable to utilize the function of suppressing oxidative damage of biological components.
The radical to be trapped by the antioxidant of the present invention is not particularly limited, and may be a radical as active oxygen or a radical other than active oxygen. Specific examples of the radical, superoxide (· O 2 -), hydroxyl radical (HO ·), Hydroperoxyl (HOO ·), alkoxyl radical (RO ·), alkyl peroxyl radicals (ROO ·), etc. be given Can do.
Thus, since the antioxidant of the present invention has high antioxidant activity, when it is taken orally and the component is absorbed from the intestinal tract, it captures active oxygen generated in the living body, It can effectively suppress oxidative damage. As a result, the progress of aging can be suppressed and the onset of various diseases caused by oxidative stress such as lifestyle-related diseases and cancer can be suppressed.
Here, since the antioxidant of the present invention uses hyaluronic acid and protein, which are biological components, and an enzyme with a mild reaction, there is an advantage that it is highly safe and easy to use as an oral preparation taken orally.
Moreover, the antioxidant of this invention can also be applied to skin. The components absorbed inside from the skin can capture active oxygen generated in the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, and can effectively inhibit disorders such as skin aging, inflammation, and pigmentation. In addition, components that are not absorbed into the living body from the skin and remain on the skin surface capture active oxygen generated on or near the surface of the skin, causing damage such as skin aging, inflammation, and pigmentation due to active oxygen. It can be effectively suppressed. Since the antioxidant of the present invention has undergone degradation by protease, it is possible to control the absorbability from the skin by changing the conditions thereof, whereby a specific site (for example, the skin surface, the vicinity of the surface of the skin or the like) It is also possible to preferentially act on the deep part of the skin).
本発明の抗酸化剤の使用量は、対象とする障害によっても異なるが、例えば本発明の抗酸化剤を内服薬として経口投与する場合、その投与量は８０〜２０００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましく、１日に２〜３回に分けて投与することが適当である。
また、本発明の抗酸化剤を化粧品または外用薬として、皮膚に塗布する場合、その塗布量は０．５ｇ〜５．０ｇ／１０ｃｍ2であることが好ましく、使用回数は１〜４回／日程度が適当である。
The use amount of the antioxidant of the present invention varies depending on the target disorder. For example, when the antioxidant of the present invention is orally administered as an internal medicine, the dose is 80 to 2000 mg / adult standard body weight / day. It is preferable to administer in 2 to 3 divided doses per day.
In addition, when the antioxidant of the present invention is applied to the skin as a cosmetic or an external medicine, the application amount is preferably 0.5 g to 5.0 g / 10 cm 2 , and the number of uses is 1 to 4 times / day. The degree is appropriate.
［抗酸化剤の製造方法］
次に、本発明の抗酸化剤の製造方法について説明する。
本発明の抗酸化剤の製造方法は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を含むことを特徴とする。
本発明の抗酸化剤の製造方法は、さらに必要に応じて、この他の工程を有していてもよい。例えば、組成物が鶏冠である場合には、酵素処理工程の前に、鶏冠を小片化する小片化工程を有していてもよい。また、酵素処理工程の後に、分解生成物を濾過する濾過工程、濾過した分解生成物を乾燥した後、粉砕する製粉工程、濾過した分解生成物を精製する精製工程を有していてよい。以下において、本発明の抗酸化剤の製造方法を詳細に説明する。
[Production method of antioxidant]
Next, the manufacturing method of the antioxidant of this invention is demonstrated.
The manufacturing method of the antioxidant of this invention is characterized by including the enzyme treatment process which decomposes | disassembles the composition containing a hyaluronic acid and protein with a protease.
The manufacturing method of the antioxidant of this invention may have this other process further as needed. For example, when the composition is a chicken crown, it may have a fragmentation step of fragmenting the chicken crown before the enzyme treatment step. Further, after the enzyme treatment step, a filtration step for filtering the decomposition product, a milling step for pulverizing the filtered decomposition product, and a purification step for purifying the filtered decomposition product may be provided. Below, the manufacturing method of the antioxidant of this invention is demonstrated in detail.
まず、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物を準備する。組成物としてニワトリの鶏冠を利用する場合には、性別、年令を問わず使用し得る。ただし、採取後なるべく時間を置かずにプロテアーゼ分解に供することが好ましい。また、時間を置いてプロテアーゼ分解するときには、冷凍保存した後に解凍して使用することが好ましい。 First, a composition containing hyaluronic acid and protein is prepared. When using a chicken fowl as a composition, it can be used regardless of gender or age. However, it is preferable to subject to protease degradation with as little time as possible after collection. When protease is decomposed over time, it is preferable to use after thawing after freezing.
鶏冠をプロテアーゼ分解するときには、まず鶏冠を小片化する小片化工程を行ってから、該鶏冠の小片をプロテアーゼ含有溶液に接触させることが好ましい。鶏冠は、好ましくは０．５ｃｍ角以上、より好ましくは０．７ｃｍ角以上、さらに好ましくは０．９ｃｍ角以上の小片にする。過度に細片化してしまったり、ミンチ状にしてしまったりすると、水分が過度に流れ出てしまうため好ましくない。 When proteolytic decomposition of the chicken crown, it is preferable to first perform a fragmentation step for fragmenting the chicken crown, and then contact the small piece of the chicken crown with the protease-containing solution. The chicken crown is preferably a small piece of 0.5 cm square or more, more preferably 0.7 cm square or more, and still more preferably 0.9 cm square or more. If it is excessively fragmented or minced, moisture will flow out excessively, which is not preferable.
次に、組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を行う。本発明の製造方法で用いるプロテアーゼの説明については、上記の［抗酸化剤］の欄のプロテアーゼの説明を参照することができる。酵素処理は、組成物やプロテアーゼの種類によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠等の固形物や粉末である場合には、プロテアーゼを溶解した水溶液等の溶液（酵素液）を組成物に添加した後、一定時間放置することで行うことが好ましい。ここで、酵素液のｐＨは５．０〜１０．０であることが好ましく、処理温度は４０〜６０℃であることが好ましく、処理時間は０．５〜３．０時間であることが好ましい。また、酵素処理は、酵素液を添加した組成物を振とうしながら行うことが好ましい。 Next, an enzyme treatment step for decomposing the composition with a protease is performed. Regarding the description of the protease used in the production method of the present invention, the description of the protease in the column of [Antioxidant] can be referred to. The enzyme treatment varies depending on the type of composition and protease. For example, when the composition is a solid or powder such as a chicken crown, a solution (enzyme solution) such as an aqueous solution in which protease is dissolved is added to the composition. After that, it is preferable to leave it for a certain period of time. Here, the pH of the enzyme solution is preferably 5.0 to 10.0, the treatment temperature is preferably 40 to 60 ° C., and the treatment time is preferably 0.5 to 3.0 hours. . Moreover, it is preferable to perform enzyme treatment, shaking the composition which added the enzyme liquid.
以上のようにして得られた分解生成物は、ろ過などの方法により鶏冠等の固形分を除去して、液状の分解生成物として用いることができる。また、凍結乾燥等により乾燥してさらに粉砕する製粉工程を行うことにより、粉末状の分解生成物として用いることもできる。これらの分解生成物は、そのまま本発明の抗酸化剤としてもよいし、適宜精製し、賦形剤等の他の成分と組み合わせる等して本発明の抗酸化剤としてもよい。 The decomposition product obtained as described above can be used as a liquid decomposition product by removing solids such as chicken crown by a method such as filtration. Moreover, it can also be used as a powdery decomposition product by performing a milling step of drying by freeze-drying or the like and further grinding. These degradation products may be used as the antioxidant of the present invention as they are, or may be purified as appropriate and combined with other components such as excipients to form the antioxidant of the present invention.
本発明の抗酸化剤は、このように、極めて簡単な工程で製造することができる。このため、本発明の抗酸化剤の製造方法を用いることにより、有用性が高い抗酸化剤を低いコストで提供することができる。
また、濾過した分解生成物や粉末状の分解生成物を精製することにより、抗酸化活性がより高い抗酸化剤とすることができる。分解生成物の精製方法の詳細については、後掲の実施例の＜プロテアーゼ分解物の精製＞の欄を参照することができる。分解生成物を精製するに当たっては、分解生成物に、水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行うことが好ましい。この分液操作により得られる水飽和１−ブタノール画分は、抗酸化活性が高い成分を含んでおり、さらにカラムクロマトグラフィ等の他の精製操作を行うことにより、抗酸化活性が極めて高い抗酸化剤を得ることができる。
Thus, the antioxidant of the present invention can be produced by a very simple process. For this reason, by using the method for producing an antioxidant of the present invention, a highly useful antioxidant can be provided at a low cost.
Moreover, it can be set as the antioxidant with higher antioxidant activity by refine | purifying the degradation product filtered and the powdery degradation product. For details of the method for purifying the degradation product, reference can be made to the <Purification of protease degradation product> column in the Examples below. In purifying the decomposition product, the decomposition product is preferably subjected to a liquid separation operation with water and water-saturated 1-butanol. The water-saturated 1-butanol fraction obtained by this liquid separation operation contains a component having a high antioxidant activity, and an antioxidant having a very high antioxidant activity by performing other purification operations such as column chromatography. Can be obtained.
［抗酸化剤の用途］
上記のように、本発明の抗酸化剤は、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる。このため、本発明の抗酸化剤は、ヒト等の動物に投与する内服剤や外用剤として効果的に用いることができる。本発明の抗酸化剤が外用剤である場合、外用医薬であってもよいし、化粧品であってもよい。化粧品である場合、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンスなどの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダー、おしろい、アイシャドーなどのメイクアップ化粧料等の態様で好適に用いることができる。
本発明の抗酸化剤は、その用途に応じて、上記分解生成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
また、抗酸化剤である化粧品には、化粧品に通常用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することもできる。
[Use of antioxidants]
As described above, the antioxidant of the present invention has high antioxidant activity and can effectively suppress oxidative damage of biological components. Therefore, the antioxidant of the present invention can be effectively used as an internal preparation or an external preparation to be administered to animals such as humans. When the antioxidant of the present invention is an external preparation, it may be an external medicine or a cosmetic. When it is a cosmetic, for example, it is preferably used in the form of basic cosmetics such as emulsions, creams, lotions, essences, lipsticks, foundations, liquid foundations, makeup pressed powders, makeup cosmetics such as funny and eye shadows, etc. Can do.
The antioxidant of the present invention can contain various components in addition to the degradation products and excipients depending on the application. For example, vitamins, vegetable powders, minerals, yeast extracts, colorants, thickeners and the like can be included as necessary. The kind of these components is not particularly limited, and the content can be appropriately adjusted within a range in which the intended function can be sufficiently exhibited.
In addition, for cosmetics that are antioxidants, the ingredients commonly used in cosmetics, such as oily ingredients, surfactants, moisturizers, thickeners, preservatives / bactericides, powder ingredients, ultraviolet absorbers, dyes, fragrances Etc. can be appropriately blended as necessary.
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、割合、操作等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The materials, ratios, operations, and the like shown in the following examples can be changed as appropriate without departing from the spirit of the present invention. Therefore, the scope of the present invention should not be construed as being limited by the specific examples shown below.
本実施例で製造した抗酸化剤の成分分析は下記の方法により行った。
（１）水分含有量の測定
水分含有量は、抗酸化剤の１ｇを１０５℃で３時問加熱乾燥し、精密天秤で恒量を求め定量した。
The component analysis of the antioxidant produced in this example was performed by the following method.
(1) Measurement of water content The water content was determined by quantifying 1 g of an antioxidant by heating and drying at 105 ° C. for 3 hours and obtaining a constant weight with a precision balance.
（２）全窒素の定食
全窒素はＡＯＡＣ法に基づくセミミクロケルダール法によって定量した。
(2) Total nitrogen set meal Total nitrogen was quantified by the semi-micro Kjeldahl method based on the AOAC method.
（３）遊離アミノ酸の定量およびアミノ酸組成の分析
総遊離アミノ酸量はNinhydrin法によって定量した。定量には標準アミノ酸としてロイシンの検量線を作成し使用した。また、遊離アミノ酸の組成は、生体分析用カラムを装着したアミノ酸自動分析機（日立社製、L-8500型）を用いて分析した。この分析には、抗酸化剤の５０ｍｇを蒸留水に溶解し、ロータリーエバポレーダー（６０℃）で減圧乾固させた後、０．０２Ｎ塩酸５ｍＬで溶出し、ろ紙でろ過したのち、滅菌フィルターでろ過したろ液５０μＬを分析試料として使用した。
(3) Quantification of free amino acids and analysis of amino acid composition The total amount of free amino acids was quantified by the Ninhydrin method. For quantification, a calibration curve of leucine was prepared and used as a standard amino acid. The composition of free amino acids was analyzed using an amino acid automatic analyzer (manufactured by Hitachi, L-8500 type) equipped with a biological analysis column. For this analysis, 50 mg of the antioxidant was dissolved in distilled water, dried under reduced pressure with a rotary evaporator (60 ° C.), eluted with 5 mL of 0.02N hydrochloric acid, filtered with filter paper, and then filtered with a sterile filter. 50 μL of the filtered filtrate was used as an analysis sample.
（４）タンパク質の定量
総タンバク質量はLawry法によって決定した。標準検量線の作成には牛血清アルブミンを使用した。
(4) Protein quantification The total protein mass was determined by the Lawry method. Bovine serum albumin was used to create a standard calibration curve.
（５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの定量
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有量はMorgan-Elson法で定量した。
(5) Quantification of N-acetyl-D-glucosamine The N-acetyl-D-glucosamine content was quantified by the Morgan-Elson method.
（６）グルコサミノグリカンの定量
２−ニトロフェニルヒドラジンカップリング法による比色定量法で分析した。標準検量の作成には鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＲＣ）およびstreptococcus zooepidemicus由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＳＺ）を用いた。
(6) Quantification of glucosaminoglycan The glucosaminoglycan was analyzed by a colorimetric method based on a 2-nitrophenylhydrazine coupling method. For preparation of the standard calibration, sodium crown-derived hyaluronate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, HARC) and sodium hyaluronate derived from streptococcus zooepidemicus (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, HASZ) were used.
（７）低分子ヒアルロン酸の分子量測定
示差屈折計（Shimazu社製、RID-10A型）を装着した高速液体クロマトグラフィー（Shimazu社製）によってヒアルロン酸の分子量を推定した。カラムとしてTSKgel G-2,500PWXL（7.8mmID×30cm）を用い、水を移動相として流速１ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。分子量マーカーには分子量４００、１０００、２０００、６０００の４種のポリエチレングリコール（Aldrich社製）を用いた。また、各低分子ヒアルロン酸の構成重量比は、抗酸化剤とデキストリンのみのサンプルを高速液体クラマトグラフィにより分析し、抗酸化剤で現れたピークのピーク面積からデキストリンのピーク面積を差し引くことにより求めた。
(7) Molecular weight measurement of low molecular hyaluronic acid The molecular weight of hyaluronic acid was estimated by high performance liquid chromatography (manufactured by Shimazu) equipped with a differential refractometer (manufactured by Shimazu, RID-10A type). TSKgel G-2,500PW XL (7.8 mm ID × 30 cm) was used as a column, and water was used as a mobile phase for analysis at a flow rate of 1 ml / min. As the molecular weight marker, four types of polyethylene glycol (manufactured by Aldrich) having molecular weights of 400, 1000, 2000, and 6000 were used. The component weight ratio of each low molecular weight hyaluronic acid is obtained by analyzing a sample containing only an antioxidant and dextrin by high performance liquid chromatography, and subtracting the peak area of the dextrin from the peak area of the peak that appears in the antioxidant. It was.
［製造例］
採取したてのニワトリの鶏冠１ｋｇを約１ｃｍ角に切断して小片化し、１００℃で蒸きょうを行うことにより加熱殺菌した。この小片状の鶏冠にプロテアーゼを中心とした食物由来の酵素類を添加して４５℃で１．５時間反応させた後、攪拌して均質化した。その後、濾過して粗大な固形成分を除去し、液状の分解生成物（以下、「プロテアーゼ分解物」という）を得た。このプロテアーゼ分解物は、ｐＨ６．５、Ｂｒｉｘ値６．２０、固形分濃度５．９１質量％であった。このプロテアーゼ分解物を凍結乾燥して粉砕し、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末（抗酸化剤１）を得た。また、このプロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末に３倍等量（質量比）のデキストリンを添加することにより、デキストリン添加凍結乾燥粉末（抗酸化剤１’）を製造した。
[Production example]
1 kg of a freshly collected chicken's chicken crown was cut into about 1 cm square pieces, and sterilized by heating at 100 ° C. for steaming. Enzymes derived from foods, mainly proteases, were added to this small piece of chicken crown, reacted at 45 ° C. for 1.5 hours, and then stirred to homogenize. Thereafter, filtration was performed to remove coarse solid components, and a liquid degradation product (hereinafter referred to as “protease degradation product”) was obtained. This protease degradation product had a pH of 6.5, a Brix value of 6.20, and a solid content concentration of 5.91% by mass. The protease degradation product was freeze-dried and pulverized to obtain a freeze-dried powder (antioxidant 1) of the protease degradation product. In addition, dextrin-added freeze-dried powder (
［抗酸化剤の成分分析］
製造した抗酸化剤１’について、上記の方法により成分分析を行った。測定された一般成分の含有率を表１に示し、遊離アミノ酸の組成を表２に示し、低分子ヒアルロン酸の分子量の分析結果を表３に示す。なお、表１〜３中の「％」は「質量％」を表す。
[Antioxidant component analysis]
About the manufactured antioxidant 1 ', the component analysis was performed by said method. Table 1 shows the measured contents of the general components, Table 2 shows the composition of free amino acids, and Table 3 shows the results of analysis of the molecular weight of low-molecular hyaluronic acid. In Tables 1 to 3, “%” represents “mass%”.
表２に示すように、抗酸化剤１’に含まれる遊離アミノ酸の中では、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸の含有量が多く、ついで、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等が多く含まれていた。
また、表３に示すように、抗酸化剤１’に含まれる低分子ヒアルロン酸は、推定分子量５０００、１５２０、１１４０、７６０および３８０の５種類からなることがわかった。また、ヒアルロン酸の繰り返し単位１つの分子量を約４００とすると、各低分子ヒアルロン酸の繰り返し単位数は、分子量の大きい順に、１３〜１４、４、３、２および１であり、質量比率は、３３％、４７％、１０％、６％および４％であった。よって、低分子ヒアルロン酸の主要成分は、分子量１５２０程度の４分子成分と分子量５０００程度の１３〜１４分子成分の２成分であることがわかった。なお、抗酸化剤１’における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有率は、抗酸化剤１’の全量に対して１３．４質量％であった。
As shown in Table 2, among the free amino acids contained in the
Further, as shown in Table 3, it was found that the low molecular weight hyaluronic acid contained in the
［抗酸化活性評価］
（ａ）ラジカル捕捉試験
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、ＡＢＴＳラジカルカチオン（非天然のモデルラジカル）に対するラジカル捕捉活性を、Biol. Pharm. Bull., 29, 766-771(2006)に記載された分光光度法を用いて評価した。具体的には、ＡＢＴＳラジカルカチオンを含む反応溶液３ｍＬに、終濃度が３００μｇ／ｍＬとなるように抗酸化剤１を加え、５分、１５分、３０分、６０分および１２０分を経過した時点でＡＢＴＳラジカルカチオンの残存率を調べた。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸またはアルブチンを各２０μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。それらの結果を図１に示す。
[Evaluation of antioxidant activity]
(A) Radical scavenging test For the manufactured antioxidant 1 (lyophilized powder of protease degradation product), radical scavenging activity against ABTS radical cation (non-natural model radical) was measured using Biol. Pharm. Bull., 29, 766- Evaluation was carried out using the spectrophotometric method described in 771 (2006). Specifically, the
図１を見ると、抗酸化剤１を添加した系は、コントロールやアスコルビン酸を添加した系に比べてＡＢＴＳラジカルカチオンの残存率が大きく低減しており、抗酸化剤１が優れたラジカル捕捉活性を示すことを確認することができた。また、アスコルビン酸やアルブチンを添加した系では、一旦、ラジカル残存率が低くなると、それ以上時間が経過してもラジカル残存率が変化しないのに対して、抗酸化剤１を添加した系では、一旦、ラジカル残存率が大きく低減した後に、時間の経過に伴ってラジカル残存率が徐々に低くなる。このことから、抗酸化剤１のラジカル捕捉活性は持続的であり、抗酸化剤として有利な特長が認められた。
As can be seen from FIG. 1, in the system added with the
（ｂ）ＯＲＡＣ法
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）から発生するアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルに対する抗酸化活性を、Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 1558-1563(2008)に記載されたＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity）法を用い、反応溶液を生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）に調整して評価した。試験に用いた抗酸化剤１の量は３０μｇ／ｍＬである。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸各３μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。それらの結果を図２に示す。
ＯＲＡＣ法は、蛍光プローブであるフルオレセインがラジカルにより酸化、分解されて蛍光強度が減少する現象を利用するものであり、蛍光強度の減少を遅延させる（グラフを右にシフトさせる）もの程、抗酸化活性が高いと評価することができる。また、この評価で使用しているアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルは、生体成分の過酸化反応に関与する脂質アルコキシラジカル、脂質ペルオキシラジカルを模したラジカル種である。したがって、ここで評価される抗酸化活性は生体での抗酸化活性に近似したものとして見ることができる。
以上の点から図２を見ると、抗酸化剤１を添加した系のグラフは、コントロールやアスコルビン酸を添加した系のグラフに比べて大きく右側にシフトしており、蛍光強度の減少がより遅延していることを示している。このことから、抗酸化剤１は、生体成分の過酸化反応において、アスコルビン酸を遥かに上回る高い抗酸化活性を発揮しうることが示唆された。
(B) ORAC method About the manufactured antioxidant 1 (freeze-dried powder of protease degradation product), resistance against alkoxy radicals and peroxy radicals generated from 2,2′-azobis (2-aminopropane) dihydrochloride (AAPH) Oxidation activity was evaluated by adjusting the reaction solution to physiological pH (pH 7.4) using the ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) method described in Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 1558-1563 (2008). did. The amount of
The ORAC method uses a phenomenon in which the fluorescence intensity of fluorescein, which is a fluorescent probe, is oxidized and decomposed by radicals and decreases in fluorescence intensity. It can be evaluated that the activity is high. Further, the alkoxy radical and peroxy radical used in this evaluation are radical species that imitate the lipid alkoxy radical and lipid peroxy radical involved in the peroxidation reaction of biological components. Therefore, the antioxidant activity evaluated here can be seen as an approximation of the antioxidant activity in a living body.
In view of the above, FIG. 2 shows that the graph of the system to which the
（Ｃ）酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）から発生するアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルに対する抗酸化活性を、Food Chem., 134, 606-610(2012)に記載された酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験を用いて評価した。試験に用いた抗酸化剤１の量は３００μｇ／ｍＬである。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸を各５０μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。同じ条件で３回試験を行い、その平均値と標準偏差を求めた結果を図３に示す。
酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験は、アルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルにより赤血球膜の脂質やタンパク質が酸化されて生じる溶血反応（酸化障害）により、赤血球の残存率が減少する現象を利用するものであり、溶血反応を遅延させる（グラフを右側にシフトさせる）もの程、抗酸化活性が高いと評価することができる。
図３を見ると、抗酸化剤１を添加した系のグラフは、コントロールやアスコルビン酸を添加した系のグラフに比べて右側にシフトしており、赤血球の溶血反応がより遅延していることを示している。このことから、抗酸化剤１は、生体成分の酸化障害を効果的に抑制する作用を有し、その作用はアスコルビン酸を大きく上回ることを確認することができた。
(C) Oxidative stress-induced erythrocyte hemolysis inhibition test For the produced antioxidant 1 (lyophilized powder of protease degradation product), alkoxy generated from 2,2′-azobis (2-aminopropane) dihydrochloride (AAPH) Antioxidant activity against radicals and peroxy radicals was evaluated using the oxidative stress-induced erythrocyte hemolysis inhibition test described in Food Chem., 134, 606-610 (2012). The amount of
Oxidative stress-induced erythrocyte hemolysis inhibition test utilizes the phenomenon that the residual rate of erythrocytes decreases due to hemolysis (oxidation damage) caused by oxidation of lipids and proteins in erythrocyte membranes by alkoxy radicals and peroxy radicals. It can be evaluated that the more the hemolytic reaction is delayed (the graph is shifted to the right side), the higher the antioxidant activity.
As shown in FIG. 3, the graph of the system to which the
＜プロテアーゼ分解物の精製＞
上記の製造例で調製したプロテアーゼ分解物の凍結乾燥物粉末を以下のようにして精製した。
まず、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥物粉末３２．０ｇに超純水を加えてろ過し、そのろ液に、全量が１．５Ｌになるように超純水を加えて希釈した。このろ液の希釈液について、１．５Ｌの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）による分液操作を２回行い、さらに、得られた水画分に７５０ｍｌの水飽和１−ブタノールによる分液操作を２回行った。分液操作で得られた水飽和１−ブタノール画分、酢酸エチル画分、水画分について、上記のＡＢＴＳラジカルカチオンを用いたラジカル捕捉試験を行った。その結果を図４に示す。図４に示すように、水飽和１−ブタノール画分と水画分に高い抗酸化活性が認められ、特に水飽和１−ブタノール画分に強い抗酸化活性が認められた。また、各分液操作で得られた水飽和１−ブタノール画分（固形分：４０３．３ｍｇ）、水画分（固形分：３７．３ｇ）について、以下のようにしてカラムクロマトグラフィによる精製を行った。その精製スキームを図５に示す。なお、図５に示すカラムのうち、カラム１、５以外のカラムに注入したサンプルは、その直前のカラムから溶出したフラクションのうち、ＡＢＴＳラジカルカチオンを用いたラジカル捕捉試験で比較的高い活性が認められたフラクションまたはそれらのフラクションの混合液である。
<Purification of protease degradation product>
The freeze-dried powder of protease degradation product prepared in the above production example was purified as follows.
First, ultrapure water was added to 32.0 g of freeze-dried powder of protease degradation product and filtered, and the filtrate was diluted by adding ultrapure water so that the total amount became 1.5 L. About the diluted solution of this filtrate, the liquid separation operation by 1.5 L ethyl acetate (EtOAc) was performed twice, and also the liquid separation operation by 750 ml of water saturated 1-butanol was performed twice by the obtained water fraction. It was. The water-saturated 1-butanol fraction, ethyl acetate fraction, and water fraction obtained by the liquid separation operation were subjected to a radical scavenging test using the ABTS radical cation. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 4, high antioxidant activity was observed in the water-saturated 1-butanol fraction and the water fraction, and particularly strong antioxidant activity was observed in the water-saturated 1-butanol fraction. In addition, the water saturated 1-butanol fraction (solid content: 403.3 mg) and the water fraction (solid content: 37.3 g) obtained by each liquid separation operation were purified by column chromatography as follows. It was. The purification scheme is shown in FIG. Of the columns shown in FIG. 5, samples injected into columns other than
［水飽和１−ブタノール画分の精製］
まず、水飽和１−ブタノール画分を下記条件のカラム１に注入し、７０％メタノール１Ｌを流して溶出を行った。
（カラム１の条件）
カラム１ ：TOYOPEARL HW-40C（直径４．０ｃｍｘ３９．０ｃｍ、４８９．８ｃｍ3）
サンプル ：水飽和１ブタノール画分（固形分：３９３．３ｍｇ）
フラクションサイズ :フラクション１；１００ｍＬ、フラクション２〜１９；５０ｍＬ
溶出液 : ７０％メタノール（１Ｌ）
[Purification of water-saturated 1-butanol fraction]
First, the water-saturated 1-butanol fraction was injected into the
(Conditions for column 1)
Column 1: TOYOPEARL HW-40C (diameter 4.0 cm × 39.0 cm, 489.8 cm 3 )
Sample: Water-saturated 1-butanol fraction (solid content: 393.3 mg)
Fraction size:
Eluent: 70% methanol (1 L)
カラム１から溶出したフラクション４を下記条件のカラム２に注入し、５０％メタノール４００ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム２の条件）
カラム２ ：TOYOPEARL HW-40F（直径２．５ｃｍ×長さ３５．０ｃｍ、１７１．７ｃｍ3）
サンプル ：カラム１のフラクション４（１２７．０ｍｇ）
流速 ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：１０ｍＬ
溶出液 ：５０％メタノール（４００ｍＬ）
Fraction 4 eluted from
(Conditions for column 2)
Column 2: TOYOPEARL HW-40F (diameter 2.5 cm × length 35.0 cm, 171.7 cm 3 )
Sample: fraction 4 of column 1 (127.0 mg)
Flow rate: 1.2 mL / min
Fraction size: 10mL
Eluent: 50% methanol (400 mL)
カラム２から溶出したフラクション１３〜１４の混合液を下記条件のカラム３に注入し、４０％メタノール４００ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム３の条件）
カラム３ ：TOYOPEARL HW-40F（直径２．５ｃｍ×長さ３４．５ｃｍ、１７０．０ｃｍ3）
サンプル ：カラム２のフラクション１３〜１４の混合液（固形分：４７．８ｍｇ）
流速 ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：１０ｍｌ
溶出液 ：４０％メタノール（４００ｍＬ）
The mixed solution of fractions 13 to 14 eluted from the column 2 was injected into the column 3 under the following conditions, and elution was performed by flowing 400 mL of 40% methanol.
(Conditions for column 3)
Column 3: TOYOPEARL HW-40F (diameter 2.5 cm × length 34.5 cm, 170.0 cm 3 )
Sample: Mixed solution of fractions 13 to 14 in column 2 (solid content: 47.8 mg)
Flow rate: 1.0 mL / min
Fraction size: 10ml
Eluent: 40% methanol (400 mL)
カラム３から溶出したフラクション１３を下記条件のカラム４に注入し、５０％メタノール８０ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム４の条件）
カラム４ ：Sephadex LH-20（直径１．０ｃｍ×長さ２６．０ｃｍ、２０．４１ｃｍ3）
サンプル ：カラム３のフラクション１３（固形分：１４．２ｍｇ）
流速 ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：２．０ｍＬ
溶出液 ：５０％メタノール（８０ｍＬ）
カラム４から溶出したフラクション７〜１１の混合液を抗酸化剤２とした。
Fraction 13 eluted from column 3 was injected into column 4 under the following conditions, and elution was performed by flowing 80 mL of 50% methanol.
(Conditions for column 4)
Column 4: Sephadex LH-20 (diameter 1.0 cm × length 26.0 cm, 20.41 cm 3 )
Sample: Fraction 13 of column 3 (solid content: 14.2 mg)
Flow rate: 0.5 mL / min
Fraction size: 2.0mL
Eluent: 50% methanol (80 mL)
The mixture of fractions 7 to 11 eluted from the column 4 was used as the antioxidant 2.
［水画分の精製］
水画分を下記条件のカラム５に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１００、５／９５、１０／９０、２０／８０、４０／６０の順に変化させて５．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム５の条件）
カラム５ ：DIAION HP20（直径１２．０ｃｍ×長さ４０．５ｃｍ、４５７８ｃｍ3）
サンプル ：水画分（固形分：３７．３ｇ）
フラクションサイズ：２．５Ｌ
溶出液 ：水、メタノールと水の混合液
[Purification of water fraction]
The water fraction was injected into the column 5 under the following conditions, and methanol and water were changed in the order of 0/100, 5/95, 10/90, 20/80, and 40/60 in the mixing ratio (methanol / water). Elution was performed by flowing 5.0 L each through the column.
(Conditions for column 5)
Column 5: DIAION HP20 (diameter 12.0 cm × length 40.5 cm, 4578 cm 3 )
Sample: Water fraction (solid content: 37.3 g)
Fraction size: 2.5L
Eluent: Water, methanol and water mixture
カラム５から溶出したフラクション７〜１２の混合液を下記条件のカラム６に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１０、１／９、２／８、４／６、６／４、８／２の順に変化させて４．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム６の条件）
カラム６ ：DIAION HP20（直径１２．０ｃｍ×長さ４０．５ｃｍ、４５７８ｃｍ3）
サンプル ：カラム５のフラクション７〜１２の混合液（固形分：１２．５８ｇ）
フラクションサイズ：２．０Ｌ
溶出液 ：水、メタノールと水の混合液
The mixed solution of fractions 7 to 12 eluted from the column 5 is injected into the column 6 under the following conditions, and methanol and water are mixed at a mixing ratio (methanol / water) of 0/10, 1/9, 2/8, 4/6. , 6/4, 8/2, and 4.0 L was applied to the column for elution.
(Conditions for column 6)
Column 6: DIAION HP20 (diameter 12.0 cm × length 40.5 cm, 4578 cm 3 )
Sample: Mixed liquid of fractions 7 to 12 in column 5 (solid content: 12.58 g)
Fraction size: 2.0L
Eluent: Water, methanol and water mixture
カラム６から溶出したフラクション８〜９の混合液を下記条件のカラム７に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１０、１／９、２／８、３／７、４／６、５／５、６／４の順に変化させて２．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム７の条件）
カラム７ ：DlAION HP20（直径７．０ｃｍ×長さ３６．５ｃｍ、１４０４ｃｍ3）
サンプル ：カラム６のフラクション８〜９の混合液（固形分：６．５７ｇ）
フラクションサイズ：５００ｍＬ
溶出液 ：水、水とメタノールの混合液
The mixed solution of fractions 8 to 9 eluted from the column 6 is injected into the column 7 under the following conditions. Methanol and water are mixed at a mixing ratio (methanol / water) of 0/10, 1/9, 2/8, 3/7. The elution was carried out by changing the flow rate in the order of 4/6, 5/5, and 6/4, and passing through the column in 2.0 L increments.
(Conditions for column 7)
Column 7: DlAION HP20 (diameter 7.0 cm × length 36.5 cm, 1404 cm 3 )
Sample: Mixed liquid of fractions 8 to 9 in column 6 (solid content: 6.57 g)
Fraction size: 500mL
Eluent: Water, a mixture of water and methanol
カラム７から溶出したフラクション２１〜２６の混合液を下記条件のカラム８に注入し、５０％メタノール１．０Ｌを流して溶出を行った。
（カラム８の条件）
カラム８ ：TOYOPEAL HW-40C（直径４．０ｃｍ×長さ４３ｃｍ、５４０．０ｃｍ3）
サンプル ：カラム７のフラクション２１〜２６の混合液（固形分：２．０ｇ）
フラクションサイズ：３０ｍＬ
溶出液 ：５０％メタノール（１．０Ｌ）
カラム８から溶出したフラクション１３〜１４の混合液を抗酸化剤３とした。
The mixed solution of fractions 21 to 26 eluted from the column 7 was injected into the column 8 under the following conditions, and elution was performed by flowing 1.0 L of 50% methanol.
(Conditions for column 8)
Column 8: TOYOPEAL HW-40C (diameter 4.0 cm × length 43 cm, 540.0 cm 3 )
Sample: Mixed liquid of fractions 21 to 26 in column 7 (solid content: 2.0 g)
Fraction size: 30mL
Eluent: 50% methanol (1.0 L)
A mixed solution of fractions 13 to 14 eluted from the column 8 was used as the antioxidant 3.
以上の工程で精製した抗酸化剤２、３について、上記のラジカル捕捉試験、ＯＲＡＣ法による試験、酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験を行ったところ、抗酸化剤２、３は、抗酸化剤１よりも高い抗酸化活性を示すことを確認することができた。また、分液操作により得た各画分の中では、水飽和１−ブタノール画分が高い抗酸化活性を有しており、さらに水飽和１−ブタノール画分を精製して得た抗酸化剤２が極めて高い抗酸化活性を示した。 The antioxidants 2 and 3 purified in the above steps were subjected to the above radical scavenging test, the ORAC method test, and the oxidative stress-induced erythrocyte hemolysis inhibition test. It was confirmed that it showed higher antioxidant activity. In each fraction obtained by the liquid separation operation, the water-saturated 1-butanol fraction has a high antioxidant activity, and the antioxidant obtained by further purifying the water-saturated 1-butanol fraction 2 showed very high antioxidant activity.
本発明によれば、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制する抗酸化剤を低コストで提供することができる。このため、本発明の抗酸化剤を用いれば、活性酸素が起因する老化現象の亢進、生活習慣病をはじめとする各種疾患の発症を抑制することが可能になり、さらに、こうした抗酸化活性が高く、しかも安価な内服剤や外用剤を提供することができる。このため、本発明は産業上の利用可能性が高い。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the antioxidant which has high antioxidant activity and suppresses the oxidative damage of a biological component effectively can be provided at low cost. For this reason, by using the antioxidant of the present invention, it becomes possible to suppress the onset of various diseases including the aging phenomenon caused by active oxygen, lifestyle-related diseases, and such antioxidant activity. It is possible to provide high-priced and inexpensive internal preparations and external preparations. For this reason, this invention has high industrial applicability.
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