JP6617230B2 - Phycoerythrobilin-containing oligopeptide, its production method and its use - Google Patents
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Description
本発明は、フィコエリスロビリン含有オリゴペプチド（オリゴペプチドが結合しているフィコエリスロビリン）に関し、更に詳細には、紅藻、藍藻等の藻類を、タンパク質分解酵素で加水分解後、熱水抽出することで得られるフィコエリスロビリン含有オリゴペプチド、その製造法およびその、赤色色素、蛍光色素、タンパク質糖化抑制剤等としての利用に関する。 The present invention relates to a phycoerythrobilin-containing oligopeptide (phycoerythrobilin to which an oligopeptide is bound), and more specifically, algae such as red algae and cyanobacteria are hydrolyzed with a protease and then extracted with hot water. The present invention relates to a phycoerythrobilin-containing oligopeptide, a production method thereof, and use thereof as a red dye, a fluorescent dye, a protein saccharification inhibitor, and the like.
紅藻類、藍藻類などの藻類中には、紅色色素の１種であるフィコエリスリンが含まれていることが知られている。 Algae such as red algae and cyanobacteria are known to contain phycoerythrin, which is a kind of red pigment.
例えば、単細胞紅藻チノリモ（Porphyridium Cruentum）のＢ−フィコエリスリンは分子量１９ｋＤａ程度のα，β２種のサブユニット、分子量３０ｋＤａ程度のγサブユニットからなるタンパク質とフィコエリスロビリン色素が共有結合したものであり、具体的には、開環テトラピロールであるフィコエリスロビリンと上記タンパク質のシステイン残基が共有結合したものである。 For example, B-phycoerythrin of the single-cell red alga Porphyridium Cruentum is a protein in which α and β2 subunits having a molecular weight of about 19 kDa and a protein consisting of a γ subunit having a molecular weight of about 30 kDa and a phycoerythrobilin dye are covalently bound. Specifically, phycoerythrovirin, which is a ring-opened tetrapyrrole, and a cysteine residue of the above protein are covalently bonded.
フィコエリスリンは光合成色素として重要な役割を果たしている（非特許文献１）。フィコエリスリンの極大吸収波長は５４０〜５７０ｎｍ付近で、極大蛍光波長は５７５〜５７８ｎｍ付近である。このフィコエリスリン色素は天然由来の食品用着色料として食品工業等において利用されている。 Phycoerythrin plays an important role as a photosynthetic pigment (Non-patent Document 1). The maximum absorption wavelength of phycoerythrin is around 540 to 570 nm, and the maximum fluorescence wavelength is around 575 to 578 nm. This phycoerythrin pigment is used in the food industry and the like as a naturally occurring food colorant.
また、フィコエリスリンは臨床診断や細胞化学研究において、抗体など様々なタンパク質を標識する蛍光色素としても広く利用されている。フィコエリスリンの励起波長は広範にわたり、様々な励起源を使用できるという特徴がある。 In addition, phycoerythrin is widely used as a fluorescent dye for labeling various proteins such as antibodies in clinical diagnosis and cytochemical research. Phycoerythrin has a wide range of excitation wavelengths and is characterized by the ability to use various excitation sources.
このような色素としての用途の他に、紅藻類スサビノリ（Porphyra yezoensis）に含まれるフィコエリスリンは抗酸化性を有すること、フィコエリスリンとフィコエリスリンの色素成分であるフィコエリスロビリンに、アレルギー性炎症反応に対する阻害効果のあることが報告されている（非特許文献２ ）。 In addition to its use as a pigment, phycoerythrin contained in the red alga Porphyra yezoensis has antioxidant properties, phycoerythrin and phycoerythrin, which is a pigment component of phycoerythrin. Have been reported to have an inhibitory effect on the inflammatory reaction (Non-patent Document 2).
ところで、このフィコエリスリンの抽出法としては、藻類の細胞を塩類溶液など薬剤処理や超音波処理等の機械的手段により破砕することにより水中に抽出し、硫安塩析、カラムクロマトグラフィー、有機溶媒等を用いる方法が従来から行われている。例えば、特許文献１には、夾雑色素を含有する藻類由来のフィコエリスリン色素液（Ａ）と前記夾雑色素を凝集させるアルカリ土類金属のリン酸塩（Ｂ）とを混合し、前記フィコエリスリン色素液（Ａ）中の夾雑色素を凝集させて凝集物としたのち、前記凝集物を除去するフィコエリスリン色素液の精製方法が記載されている。そして、原料のフィスコエリスリン色素液は、加熱処理したものを利用することが記載されている。また、特許文献２には、赤色色素含有藻から得られた色素抽出液を加熱処理し、赤色色素を分離する天然赤色色素の製造法が記載されている。 By the way, this extraction method of phycoerythrin is extracted into water by crushing algal cells by mechanical means such as salt solution and chemical treatment or ultrasonic treatment, ammonium sulfate salting out, column chromatography, organic solvent A method using the above has been conventionally performed. For example, in Patent Document 1, an algae-derived phycoerythrin pigment solution (A) containing a contaminant pigment and an alkaline earth metal phosphate (B) that aggregates the contaminant pigment are mixed, and the phycoerythris A method for purifying a phycoerythrin dye solution is described in which the contaminating dye in the phosphorus dye solution (A) is aggregated to form an aggregate, and then the aggregate is removed. In addition, it is described that the fiscoerythrin dye solution as a raw material uses a heat-treated one. Patent Document 2 describes a method for producing a natural red pigment, in which a pigment extract obtained from a red pigment-containing algae is heat-treated to separate the red pigment.
上記特許文献１や２での加熱処理は、色素抽出液中に含まれるフィコシアニンやクロロフィル等の赤色色素以外の色素を変性させ、不純物として沈澱させるというものであり、その加熱温度は好ましくは４０〜７０℃、特に好ましくは５０〜６０℃であり、加熱時間は、２〜３０分とされている。一般に加熱温度が高いほど、または加熱時間が長いほど赤色色素の純度が高くなり色調が向上するが、収量が減るという問題が知られている。そして、上記温度範囲以外、例えば加熱温度が４０℃以下では、色素液の色調は赤紫色を呈し、所望する鮮明な赤色色素が得にくくなる。また、７０℃以上では赤色色素も沈降性となり、色素回収率が低下すると引用文献２の段落［０００９］に記載されている。 The heat treatment in Patent Documents 1 and 2 is to denature pigments other than red pigments such as phycocyanin and chlorophyll contained in the pigment extract and precipitate as impurities, and the heating temperature is preferably 40 to 40. It is 70 degreeC, Most preferably, it is 50-60 degreeC, and the heating time is 2 to 30 minutes. In general, the higher the heating temperature or the longer the heating time, the higher the purity of the red pigment and the better the color tone, but the problem is that the yield decreases. In addition, when the heating temperature is other than the above temperature range, for example, at 40 ° C. or less, the color tone of the dye solution exhibits a reddish purple color, making it difficult to obtain a desired clear red dye. In addition, it is described in paragraph [0009] of the cited document 2 that the red pigment becomes sedimentation at 70 ° C. or more and the pigment recovery rate decreases.
ところで、特許文献３には、クビレオゴノリを含むオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンが記載されている。この発明のオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンは、フィコエリスロビリンとタンパク質が共有結合したものであり、以下のような物性を有する。 By the way, Patent Document 3 describes phycoerythrin derived from seaweeds of the genus Ogonori, including the scorpion gonorrhoeae. The phycoerythrin derived from the seaweed of the genus Ogonori of this invention is a phycoerythrobilin and a protein covalently bound to each other and has the following physical properties.
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有す
る。
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発
する。
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が
９５,０００±５,０００である。
(1) It has absorption maximum wavelengths at 496 ± 5 nm, 539 ± 5 nm and 566 ± 5 nm.
(2) Fluorescence of 573 ± 5 nm is emitted at excitation wavelengths of 496 ± 5 nm and 539 ± 5 nm.
(3) The molecular weight measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis is 95,000 ± 5,000.
そしてその製造法は、オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程と、得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程を含むものであり、また、フィコエリスリンを精製するために、得られた上清に硫酸アンモニウムを添加し、沈殿物を回収後、この沈殿物を少量の蒸留水で再溶解し、蒸留水で透析、沈殿物中の硫酸アンモニウムを除く工程を使用できることも記載されている。更に、この透析後の再溶解液は、フィコエリスリンを豊富に含有するもので、そのまま各種用途に使用できるが、更に、クロマトグラフィー等の公知の手段により精製してもよいことも記載されている。 The production method includes a step of crushing seaweeds of the genus Ogonori, mixing with water, stirring the mixture, centrifuging the obtained mixture, and obtaining a supernatant thereof, and In order to purify phycoerythrin, ammonium sulfate was added to the obtained supernatant, the precipitate was recovered, this precipitate was redissolved with a small amount of distilled water, dialyzed with distilled water, ammonium sulfate in the precipitate It is also described that a process other than can be used. Furthermore, this redissolved solution after dialysis contains abundant phycoerythrin and can be used as it is for various applications, but it is further described that it may be purified by known means such as chromatography. Yes.
一方、フィコエリスリンを低分子化した例としては、フィコビリン結合部位のタンパク質アミノ酸配列を知る目的で、単細胞紅藻チノリモであるポルフィリディウム・クルエンタム（以下、「Ｐ.クルエンタム」と略称する）からクロマトグラフィー等でＢ−フィコエリスリンを精製し、トリプシン分解して得たフィコエリスロビリントリペプチドを解析した例がある（非特許文献３）。同様に、Ｐ.クルエンタムのフィコエリスリンをクロマトグラフィー等で精製したのち、トリプシン分解してフィコエリスロビリン結合ペプチド（アミノ酸数６〜４０残基）を精製、フィコビリン結合部位のアミノ酸配列を解析した例がある（非特許文献４）。 On the other hand, as an example of reducing the molecular weight of phycoerythrin, for the purpose of knowing the protein amino acid sequence of the phycobilin binding site, it is from Porphyridium cruentum (hereinafter abbreviated as “P. cruentum”) which is a single-cell red alga chinorimo. There is an example in which phycoerythrobilin tripeptide obtained by purifying B-phycoerythrin by chromatography or the like and digesting it with trypsin was analyzed (Non-patent Document 3). Similarly, P. cruentham's phycoerythrin was purified by chromatography, etc., then trypsinized to purify phycoerythrobilin-binding peptide (6 to 40 amino acids), and the amino acid sequence of the phycobilin binding site was analyzed (Non-Patent Document 4).
また、フィコエリスリンから、ペプチド結合のないフィコエリスロビリン色素の生成については、Ｐ.クルエンタムのフィコエリスリンに、メタノールとＨｇＣｌ２を用いてフィコビリンとシステイン残基の間の共有結合を解離させるメタノリシスによりフィコエリスロビリンの精製が報告されている（非特許文献４）。更に、ノリの焙焼によるフィコエリスロビリンの生成が報告されている（非特許文献５）。 As for the formation of a phycoerythrobilin dye having no peptide bond from phycoerythrin, methanolysis in which P. cruentham's phycoerythrin dissociates a covalent bond between phycobilin and a cysteine residue using methanol and HgCl 2. Reported the purification of phycoerythrobilin (Non-patent Document 4). Furthermore, it has been reported that phycoerythrobilin is produced by roasting laver (Non-patent Document 5).
このようにフィコエリスリンの製造法は多数報告されているが、いずれも製造工程が煩雑である上、大量生産には向いていないものであった。また、前記したようにフィコエリスリンは、開環テトラピロールであるフィコエリスロビリンとサブユニットタンパクが共有結合したものであるため、サブユニットタンパク由来部分の影響を受ける場合もあった。 As described above, a large number of methods for producing phycoerythrin have been reported, but all of them involve complicated production processes and are not suitable for mass production. In addition, as described above, phycoerythrin is a ring-opened tetrapyrrole, phycoerythrovirin, and a subunit protein that are covalently bound to each other, and thus may be affected by a subunit protein-derived portion.
本発明は、フィコエリスリンを含有する藻類から赤色色素や、蛍光色素として使用できる成分を工業的に取得することが可能な技術、特に、色素等として有利に使用できる、フィコエリスリンを低分子化した、フィコエリスロビリンオリゴペプチドを大量生産しうる技術の提供を課題とするものである。 The present invention relates to a technology capable of industrially obtaining components that can be used as red pigments and fluorescent pigments from algae containing phycoerythrin, in particular, phycoerythrin that can be advantageously used as a pigment, etc. It is an object of the present invention to provide a technology capable of mass-producing a phycoerythrobilin oligopeptide.
本発明者らは、フィコエリスリンを含有する藻類中から、工業的に有利に赤色色素や、蛍光色素（色素成分）を取得できる技術について研究を行っていたところ、まず、原料である藻類をタンパク質分解酵素で加水分解し、次いでこの加水分解物を熱水抽出することにより、容易に色素成分を可溶化できることを見出した。 The inventors of the present invention have been researching technology that can industrially advantageously obtain red pigments and fluorescent pigments (pigment components) from algae containing phycoerythrin. It was found that the pigment component can be easily solubilized by hydrolyzing with a proteolytic enzyme and then extracting the hydrolyzate with hot water.
またこの工程で得られたフィコエリスロビリンオリゴペプチドは、新規であり、赤色色素、蛍光色素としての作用のほか、従来の色素成分では報告されていなかったタンパク質糖化抑制作用を有することも見出した。 The phycoerythrobilin oligopeptide obtained in this step is also novel and has been found to have a protein glycation-inhibiting action that has not been reported with conventional dye components in addition to the action as a red dye and a fluorescent dye.
本発明は、これらの知見に基づくものであり、次の内容を含むものである。 The present invention is based on these findings and includes the following contents.
（１）フィコエリスリンを含有する藻類をタンパク質分解酵素で加水分解後、熱水抽出
することにより得られるフィコエリスロビリンオリゴペプチド。
（２）分子量が７００以上１０,０００以下である（１）のフィコエリスロビリンオリ
ゴペプチド。
（３）水に対し可溶性である（１）または（２）のフィコエリスロビリンオリゴペプチ
ド。
（４）次の式（Ｉ）
ル基を示し、Ｌ１とＬ２の合計のアミノ酸基の数は、２０以内である）
で表される（１）ないし（３）の何れかのフィコエリスロビリンオリゴペプチド。
（５）Ｌ１が、Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−であり、Ｌ２がヒドロキシル基である（４）
のフィコエリスロビリンオリゴペプチド。
（６）フィコエリスリンを含有する藻類が、紅藻、藍藻、灰色藻およびクリプト藻より
なる群から選ばれたものである（１）ないし（５）の何れかのフィコエリスロビリ
ンオリゴペプチド。
（７）タンパク質分解酵素が、ペプシン、ブロメライン、パパイン、フィシン、サーモ
ライシン、プロテアーゼＫ、糸状菌由来プロテアーゼ、酵母由来プロテアーゼ、放
線菌由来プロテアーゼ、担子菌由来プロテアーゼおよび細菌由来プロテアーゼより
なる群から選ばれたものである（１）ないし（６）の何れかのフィコエリスロビリ
ンオリゴペプチド。
（８）フィコエリスリンを含有する藻類をタンパク質分解酵素で加水分解後、熱水抽出
することを特徴とするフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製造法。
（９）フィコエリスリンを含有する藻類が、紅藻、藍藻、灰色藻およびクリプト藻から
なる群から選ばれたものである（８）のフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製
造法。
（１０）タンパク質分解酵素が、ペプシン、ブロメライン、パパイン、フィシン、サー
モライシン、プロテアーゼＫ、糸状菌由来プロテアーゼ、酵母由来プロテアーゼ、
放線菌由来プロテアーゼ、担子菌由来プロテアーゼおよび細菌由来プロテアーゼよ
りなる群から選ばれたものである（８）または（９）のフィコエリスロビリンオリ
ゴペプチドの製造法。
（１１）熱水抽出を、８０ないし１３５℃の温度、０．１ないし０．２２ＭＰａの圧力
で行う（８）ないし（１０）の何れかのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製
造法。
（１２）熱水抽出を１ないし６０分間行う（８）ないし（１１）のフィコエリスロビリ
ンオリゴペプチドの製造法。
（１３）（１）ないし（７）の何れか記載のフィコエリスロビリンオリゴペプチドを含
有するタンパク質糖化抑制剤。
（１４）（１）ないし（７）の何れか記載のフィコエリスロビリンオリゴペプチドを含
有する赤色色素。
（１４）（１）ないし（７）の何れか記載のフィコエリスロビリンオリゴペプチドを含
有する蛍光色素。
(1) A phycoerythrobilin oligopeptide obtained by hydrolyzing algae containing phycoerythrin with a proteolytic enzyme followed by hot water extraction.
(2) The phycoerythrobilin oligopeptide of (1) having a molecular weight of 700 or more and 10,000 or less.
(3) The phycoerythrovirin oligopeptide of (1) or (2) that is soluble in water.
(4) The following formula (I)
The phycoerythrobilin oligopeptide of any one of (1) to (3) represented by:
(5) L 1 is Val-Asn-Lys-, and L 2 is a hydroxyl group (4)
Phycoerythrobilin oligopeptide.
(6) The phycoerythroline oligopeptide according to any one of (1) to (5), wherein the algae containing phycoerythrin is selected from the group consisting of red algae, cyanobacteria, gray algae and crypto algae.
(7) The proteolytic enzyme is selected from the group consisting of pepsin, bromelain, papain, ficin, thermolysin, protease K, filamentous fungus-derived protease, yeast-derived protease, actinomycetes-derived protease, basidiomycete-derived protease, and bacteria-derived protease. The phycoerythrobilin oligopeptide according to any one of (1) to (6).
(8) A method for producing a phycoerythrobilin oligopeptide, comprising hydrolyzing algae containing phycoerythrin with a proteolytic enzyme and then extracting with hot water.
(9) The method for producing a phycoerythrobilin oligopeptide according to (8), wherein the algae containing phycoerythrin is selected from the group consisting of red algae, cyanobacteria, gray algae and crypto algae.
(10) The proteolytic enzyme is pepsin, bromelain, papain, ficin, thermolysin, protease K, filamentous fungus-derived protease, yeast-derived protease,
(8) or (9) a method for producing a phycoerythrobilin oligopeptide selected from the group consisting of actinomycete-derived protease, basidiomycete-derived protease and bacteria-derived protease.
(11) The method for producing a phycoerythrovirin oligopeptide according to any one of (8) to (10), wherein hot water extraction is performed at a temperature of 80 to 135 ° C. and a pressure of 0.1 to 0.22 MPa.
(12) The method for producing a phycoerythrobilin oligopeptide according to (8) to (11), wherein hot water extraction is performed for 1 to 60 minutes.
(13) A protein glycation inhibitor comprising the phycoerythrobilin oligopeptide according to any one of (1) to (7).
(14) A red pigment comprising the phycoerythrobilin oligopeptide according to any one of (1) to (7).
(14) A fluorescent dye comprising the phycoerythrobilin oligopeptide according to any one of (1) to (7).
本発明により、フィコエリスリンを含有する藻類から赤色色素、蛍光色素を容易に大量生産できる。本発明により得られた赤色色素、蛍光色素（分子量７００以上１０,０００以下のフィコエリスロビリンオリゴペプチド）は、鮮やかな赤色を呈し、紫外線で励起することにより蛍光を発する。また、フィコエリスロビリンオリゴペプチドはタンパク質糖化抑制作用を有する。従って、本発明の色素は、食品分野では赤色色素、蛍光色素として、医療・研究分野ではタンパク質の蛍光標識用試薬として、また、蛍光を利用したオブジェの材料などとして利用することができ、さらには、タンパク質糖化抑制作用を有する健康食品として利用することができる。 According to the present invention, red pigments and fluorescent pigments can be easily mass-produced from algae containing phycoerythrin. A red dye and a fluorescent dye (phycoerythrobilin oligopeptide having a molecular weight of 700 or more and 10,000 or less) obtained by the present invention exhibit a bright red color and emit fluorescence when excited with ultraviolet rays. In addition, phycoerythrobilin oligopeptide has a protein glycation-inhibiting action. Therefore, the dye of the present invention can be used as a red dye or a fluorescent dye in the food field, as a fluorescent labeling reagent for proteins in the medical / research field, or as an object material using fluorescence, etc. It can be used as a health food having a protein saccharification-inhibiting action.
以下、本発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるものでなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜実施し得る。 Hereinafter, the present invention will be described in detail, but the scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following exemplifications, the present invention can be appropriately implemented without departing from the spirit of the present invention.
本発明のフィコエリスロビリンオリゴペプチドは、フィコエリスリンを含有する藻類をタンパク質分解酵素で加水分解後、熱水抽出することにより得ることができる。 The phycoerythrobilin oligopeptide of the present invention can be obtained by hydrolyzing algae containing phycoerythrin with a proteolytic enzyme and then extracting with hot water.
このものは、例えば次の一般式（Ｉ）
で表されるものである。
This is, for example, the following general formula (I)
It is represented by
このものは、分子量が７００以上１０,０００以下で、水に対して可溶性であり、赤色色素、蛍光色素としての作用を有するものである。なお、水に対して可溶性であることは、目視において浮遊物、沈殿物が認められないことを意味する。例えば、後述の実施例５において、得られた色素成分を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液とした際に浮遊物、沈殿物が認められず、また、これを１５，０００ｒｐｍで、１５分間の遠心処理した後も沈降物を認められないことにより判断できる。 This has a molecular weight of 700 or more and 10,000 or less, is soluble in water, and functions as a red dye or a fluorescent dye. In addition, being soluble in water means that floating matter and sediment are not visually observed. For example, in Example 5, which will be described later, when the obtained pigment component is an aqueous solution having a concentration of 50 mg / ml, no suspended matter or precipitate is observed, and this is centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes. It can be judged by the fact that no sediment is observed after the treatment.
このフィコエリスロビリンオリゴペプチドを製造するための原料である藻類は、フィコエリスリンを含有する藻類である。このような藻類の例としては、紅藻や藍藻等が挙げられる。より具体的には、オゴノリ（Gracilaria tikvahiae）、クビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）、イソノハナ (Halymenia floresia)、チノリモ（Porphyridium Cruentum）、スサビノリ（Porphyra yezoensis）、アサクサノリ（Porphyra tenera）、テングサ（Gelidiaceae）、フノリ（Gloiopeltis）、マフノリ（Gloiopeltis tenax (Turner) Decaisne）等の紅藻、藍藻を挙げることができる。 Algae that are raw materials for producing this phycoerythrobilin oligopeptide are algae containing phycoerythrin. Examples of such algae include red algae and cyanobacteria. More specifically, Gracilaria (Gracilaria tikvahiae), constricted Gracilaria (Gracilaria blodgettii), Isonohana (Halymenia floresia), Chinorimo (Porphyridium cruentum), Porphyra yezoensis (Porphyra yezoensi s), Asakusanori (Porphyra tenera), Gelidium (Gelidiaceae), funori Examples include red algae and cyanobacteria such as ( Gloiopeltis ) and mafnori ( Gloiopeltis tenax (Turner) Decaisne).
上記のうち、クビレオゴノリは南西諸島に分布し、モーイ豆腐の原料（寒天の材料），刺身のツマや海藻サラダとして用いられている藻類である（沖縄水海研セ事報９６，５０−５３（２００８））。また、イソノハナは石垣島で冬季に見られる藻類である（沖縄深層水研報１０号、１９−２０頁）。更に、紅藻、藍藻のほかにフィコエリスリンを含有するものであれば、灰色藻、クリプト藻を用いてもよい。更にまた、上記藻類に代え、精製したフィコエリスリンあるいはフィコエリスリンを含む粗製物を材料として用いてもよい。 Of the above, Kubireogonori is an algae that is distributed in the Nansei Islands, and is used as a raw material for Moi tofu (agar material), sashimi, and seaweed salad (Okinawa Sukaikai Research Report 96, 50-53). (2008)). Isonohana is an algae found in Ishigaki Island in winter (Okinawa Deep Water Research Bulletin No. 10, pages 19-20). In addition to red algae and cyanobacteria, gray algae and crypto algae may be used as long as they contain phycoerythrin. Furthermore, instead of the algae, purified phycoerythrin or a crude product containing phycoerythrin may be used as a material.
一方、本発明に用いるタンパク質分解酵素は、特に限定されることなく種々のものを利用することができる。その具体例としては、ペプシン、ブロメライン、パパイン、フィシン、サーモライシン、プロテアーゼＫ、その他糸状菌由来プロテアーゼ、酵母由来プロテアーゼ、放線菌由来プロテアーゼ、担子菌由来プロテアーゼ、細菌由来プロテアーゼ等が含まれる。 On the other hand, the proteolytic enzyme used in the present invention is not particularly limited, and various types can be used. Specific examples thereof include pepsin, bromelain, papain, ficin, thermolysin, protease K, other filamentous fungus-derived proteases, yeast-derived proteases, actinomycetes-derived proteases, basidiomycetous-derived proteases, bacterially-derived proteases, and the like.
本発明のフィコエリスロビリンオリゴペプチドを得るには、例えば次のようにすればよい。すなわち、まず、フィコエリスリンを含有する藻類（以下、「原料藻類」と略称することがある）を適当な反応容器中で水に懸濁させ、懸濁液とする。 In order to obtain the phycoerythrobilin oligopeptide of the present invention, for example, the following may be performed. That is, first, algae containing phycoerythrin (hereinafter sometimes abbreviated as “raw algae”) are suspended in water in a suitable reaction vessel to obtain a suspension.
原料藻類は、水で洗浄後、細かく細断して用いてもよいが、水洗後に乾燥、粉砕機で粉砕して用いるのが望ましい。また、反応容器としては、フラスコ、鍋等の容器を利用することができる。 The raw algae may be used after being washed with water and then finely chopped, but it is desirable to use after drying with water and pulverizing with a pulverizer. Moreover, containers, such as a flask and a pan, can be utilized as a reaction container.
更に、懸濁に利用する水としては、例えば、最終生産物が食品の用途である場合は、精製水が好適であるが、次の工程で用いるタンパク分解酵素の種類によっては、これに適合した緩衝液や、精製水中に塩類等の安定化剤を含むものであってもよい。 Furthermore, as the water used for the suspension, for example, purified water is suitable when the final product is used for food, but this is suitable depending on the type of proteolytic enzyme used in the next step. It may contain a stabilizer such as salts in a buffer solution or purified water.
この懸濁液中の原料藻類の重量（乾燥重量）は、特に制約はなく適宜変更しうるが、例えば、精製水１００ｍｌあたり２ｇ程度の濃度とすることが好ましい。 The weight (dry weight) of the raw material algae in the suspension is not particularly limited and can be appropriately changed. For example, the concentration is preferably about 2 g per 100 ml of purified water.
また、上記懸濁液は、例えば、ポリトロンなどでホモジェナイズすることが望ましいが、マグネットスターラー等で攪拌してもよい。 The suspension is preferably homogenized with, for example, polytron, but may be stirred with a magnetic stirrer or the like.
次に、このようにして調製した懸濁液に、上記したタンパク質分解酵素を加え、加水分解を行う。 Next, the above-mentioned proteolytic enzyme is added to the suspension thus prepared to perform hydrolysis.
この加水分解に用いるタンパク質分解酵素の濃度は、例えば、サーモライシンを用いる場合は、原料藻類の乾燥重量の０.１〜４質量％（以下、「％」で示す）程度（溶液中濃度として０.００２％〜０.０８％程度）、好ましくは０.５〜２％程度（溶液中濃度０.０１％〜０.０４％程度）であり、より好適には０.５％程度（溶液中濃度０.０１％程度である。 The concentration of the proteolytic enzyme used for the hydrolysis is, for example, about 0.1 to 4% by mass (hereinafter referred to as “%”) of the dry weight of the raw algae when using thermolysin (the concentration in the solution is about 0.1). 002% to 0.08%), preferably about 0.5 to 2% (concentration in solution of about 0.01% to 0.04%), more preferably about 0.5% (concentration in solution) It is about 0.01%.
また、加水分解反応を行う温度は、それぞれの酵素の至適温度付近とすれば良く、例えば、サーモライシンを用いる場合は、３０℃から６０℃程度の範囲であり、６０℃で行うと反応時間が短くてすむ。更に、加水分解反応を行う時間はとくに限定はないが、例えばサーモライシンを用いる場合は１時間から６時間程度であり、３時間の反応時間で十分である。 The temperature for the hydrolysis reaction may be around the optimum temperature for each enzyme. For example, when thermolysin is used, the temperature is in the range of about 30 to 60 ° C. It is short. Furthermore, the time for performing the hydrolysis reaction is not particularly limited. For example, when thermolysin is used, the reaction time is about 1 to 6 hours, and a reaction time of 3 hours is sufficient.
上記加水分解反応物は、次に熱水抽出に付される。この熱水抽出は、前の酵素反応の停止工程も兼ねて行うこともできる。具体的には、沸騰水中に反応容器を入れ、１ないし６０分間、好ましくは１ないし２０分間、さらに好ましくは５ないし１５分間煮沸することで行なえば良い。 The hydrolysis reaction product is then subjected to hot water extraction. This hot water extraction can also be performed in conjunction with the previous enzymatic reaction termination step. Specifically, the reaction may be performed by placing a reaction vessel in boiling water and boiling for 1 to 60 minutes, preferably 1 to 20 minutes, more preferably 5 to 15 minutes.
以上のようにして得られる熱水抽出液は、次に、この容器を氷水中に入れることで、冷却される。得られた熱水抽出液は、冷却後遠心分離を行なうことで、上清として回収される。また、この方法に代え、濾紙等による濾過を行い、不溶物を除去しても良い。 The hot water extract obtained as described above is then cooled by placing the container in ice water. The obtained hot water extract is recovered as a supernatant by centrifuging after cooling. Moreover, it replaces with this method and may filter with a filter paper etc. and may remove an insoluble matter.
このような工程により製造されたフィコエリスロビリンオリゴペプチドを含有する色素液は、このまま利用してもよいが、凍結乾燥、遠心エバポレーター等で乾燥、粉末として利用してもよい。あるいは、さらに限外濾過、クロマトグラフィー等による精製を行い、高純度標品として利用してもよい。 The dye solution containing the phycoerythrobilin oligopeptide produced by such a process may be used as it is, but may also be used as a powder after being dried by freeze drying, a centrifugal evaporator or the like. Or you may refine | purify by ultrafiltration, chromatography, etc., and may utilize as a high purity sample.
かくして得られた本発明のフィコエリスロビリンオリゴペプチドは、例えば、赤色色素、蛍光色素等として、清涼飲料、乳酸飲料、調味料、スープ、チーズ、ハム、アイスクリーム、菓子類などの様々な食品中に添加して用いることができる。また、本発明に係るフィコエリスロビリンオリゴペプチドは、抗体や種々の生体タンパク質の蛍光標識を目的とした、医療、研究分野で用いることができる。 The phycoerythrobilin oligopeptide of the present invention thus obtained is used in various foods such as soft drinks, lactic acid drinks, seasonings, soups, cheeses, hams, ice creams and confectionery, for example, as red dyes and fluorescent dyes. It can be added to and used. The phycoerythrobilin oligopeptide according to the present invention can be used in the medical and research fields for the purpose of fluorescent labeling of antibodies and various biological proteins.
なお、フィコエリスロビリンオリゴペプチドおよびこれを含有する画分は、上記した色素としての作用の他、タンパク質糖化抑制作用を有することが本発明者により見出された。 In addition, it was found by the present inventor that the phycoerythrobilin oligopeptide and the fraction containing it have a protein glycation-inhibiting action in addition to the action as the dye described above.
タンパク質の糖化とは、タンパク質とグルコースが結合し、アマドリ化合物を経て糖化最終生成物（advanced glycosylation end products ；ＡＧＥｓ）を生成する現象で、ＡＧＥｓとして多数の物質が知られている。例えば、カルボキシメチルリジンは、糖尿病時に生成し、カルボキシメチルリジン化したコラーゲンはヒト皮膚線維芽細胞のアポトーシスを誘導するとされている。ペントシジンはリジン残基とアルギニン残基が五炭糖により架橋された構造で蛍光性があり、糖尿病や慢性腎不全患者の血中ペントシジン濃度は高値になるとされている。またこのものは皮膚コラーゲン中にも存在して加齢と共に増加、骨粗鬆症を反映するマーカーとされている。 Protein saccharification is a phenomenon in which protein and glucose are combined to produce advanced glycation end products (AGEs) via an Amadori compound, and many substances are known as AGEs. For example, carboxymethyllysine is produced during diabetes, and carboxymethyllysed collagen is said to induce apoptosis of human dermal fibroblasts. Pentosidine is fluorescent with a structure in which a lysine residue and an arginine residue are cross-linked by a pentose sugar, and the blood pentosidine concentration in patients with diabetes or chronic renal failure is said to be high. Moreover, this thing exists also in skin collagen, increases with aging, and is considered as a marker reflecting osteoporosis.
このタンパク質糖化を抑制する薬剤としては、アミノグアニジンなど多数の化合物が知られているが、経口的に摂取するにはその安全性に疑問があるものが多かった。 Many drugs, such as aminoguanidine, are known as drugs that inhibit this protein glycation, but many of them have doubts about their safety when taken orally.
これに対し、本発明のフィコエリスロビリンオリゴペプチドおよびこれを含有する画分は、食品成分由来のものであるから、安全性が高く、アンチエイジングなどの目的で、さまざまな食品に添加し、機能性食品として用いることができる。 On the other hand, the phycoerythrobilin oligopeptide of the present invention and the fraction containing the same are derived from food ingredients, and thus are highly safe and added to various foods for the purpose of anti-aging, etc. It can be used as a sex food.
なお、海藻由来のタンパク質糖化抑制成分としては、特許文献４に、もずく成分の記載がある（特許文献４）。しかし、もずくは褐藻であり、赤色色素フィコエリスロビリンを含有しないことから、本発明の成分とは異なると判断される。 In addition, as a protein saccharification suppression component derived from seaweed, patent document 4 has a description of a mozuku component (patent document 4). However, since mozuku is a brown algae and does not contain the red pigment phycoerythrovirin, it is judged to be different from the components of the present invention.
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not restrict | limited at all by these Examples.
実 施 例 １.
クビレオゴノリからのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製造（１）：
クビレオゴノリ（（Gracilaria blodgettii）；沖縄県産を乾燥し、これを破砕してクビレオゴノリ粉末を得た。この粉末０.４ｇを容量５０ｍｌの遠心チューブに入れ、蒸留水２０ｍｌを加えて攪拌した。更にこれにサーモライシン（株式会社ペプチド研究所製）２ｍｇを添加し、６０℃で３時間保温することで、タンパク質を加水分解した。
Examples 1.
Production of Phycoerythrobilin Oligopeptide from Kubileogonori (1):
( Gracilaria blodgettii ); produced in Okinawa Prefecture, dried and crushed to obtain a Kubireogonori powder, 0.4 g of this powder was placed in a 50 ml centrifuge tube, and 20 ml of distilled water was added and stirred. Furthermore, 2 mg of thermolysin (manufactured by Peptide Institute, Inc.) was added thereto, and the protein was hydrolyzed by incubating at 60 ° C. for 3 hours.
反応後、この遠心チューブを沸騰水中に１０分間保持することで、熱水抽出を行った。１０分経過後直ちに氷冷し、１０,０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した。また、サーモライシンを添加しない以外は、上と同様の処理を行ない、比較上清を得た。 After the reaction, hot water extraction was performed by holding the centrifuge tube in boiling water for 10 minutes. Immediately after 10 minutes, the mixture was ice-cooled, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. In addition, a comparative supernatant was obtained by performing the same treatment as above except that thermolysin was not added.
得られたサーモライシンで処理後熱水抽出を行った上清を目視で観察したところ、このものは可溶化されており、赤色を呈していたが、比較上清では、赤色はほとんど観察できなかった。また、これらの５４０ｎｍの吸光度は、サーモライシン処理後熱水抽出した上清で０.６２、比較上清では０.０３６で、吸光度に２０倍近い差のあることが確認できた。 When the supernatant obtained by hot water extraction after treatment with the obtained thermolysin was visually observed, it was solubilized and exhibited a red color, but in the comparative supernatant, almost no red color could be observed. . The absorbance at 540 nm was 0.62 for the supernatant extracted with hot water after thermolysin treatment and 0.036 for the comparative supernatant, confirming that there was a 20-fold difference in absorbance.
また、サーモライシンで加水分解後、熱水抽出液した上清を３６５ｎｍの紫外線で励起したところ、蛍光を発することが確認できた。 Moreover, it was confirmed that when the supernatant obtained by hot water extraction after hydrolysis with thermolysin was excited with 365 nm ultraviolet light, fluorescence was emitted.
実 施 例 ２.
クビレオゴノリからのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製造（２）：
容量５０ｍｌの遠心チューブに、実施例１のクビレオゴノリ粉末０.５ｇを入れ、蒸留水２５ｍｌを加えて攪拌した。これにプロテアーゼＫ（プロメガ株式会社製）４ｍｇを添加し、４５℃で４時間保温することで、タンパク質を加水分解した。
Example 2.
Production of Phycoerythrobilin Oligopeptide from Kubileogonori (2):
In a centrifuge tube having a capacity of 50 ml, 0.5 g of the Kubileogonori powder of Example 1 was added, and 25 ml of distilled water was added and stirred. To this was added 4 mg of protease K (manufactured by Promega Corporation), and the protein was hydrolyzed by incubating at 45 ° C. for 4 hours.
反応後、この遠心チューブを沸騰水中に１０分間保持することで、熱水抽出を行った。１０分経過後直ちに氷冷し、１０,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した。 After the reaction, hot water extraction was performed by holding the centrifuge tube in boiling water for 10 minutes. Immediately after 10 minutes, the mixture was ice-cooled, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
この結果、プロテアーゼＫ処理後熱水抽出液した上清を目視で観察したところ、このものは可溶化されており、赤色を呈していた。また、この上清の５４０ｎｍの吸光度は０.７７５であった。更に、プロテアーゼＫ処理後熱水抽出液した上清を３６５ｎｍの紫外線で励起したところ蛍光を発することが確認できた。 As a result, when the supernatant of the hot water extract after the protease K treatment was visually observed, it was solubilized and had a red color. The absorbance of this supernatant at 540 nm was 0.775. Furthermore, it was confirmed that when the supernatant obtained by the protease K-treated hot water extract was excited with 365 nm ultraviolet light, fluorescence was emitted.
実 施 例 ３.
イソノハナからのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの製造（１）：
イソノハナ（Halymenia floresia；沖縄県産を乾燥し、これを破砕してイソノハナ粉末を得た。この粉末０.６ｇを容量５０ｍｌの遠心チューブに入れ、蒸留水３０ｍｌを加えて攪拌した。更にこれにサーモライシン３ｍｇを添加し、６０℃で３時間保温することで、タンパク質を加水分解した。
Example 3.
Production of Phycoerythrobilin Oligopeptide from Isonohana (1):
Isonohana ( Halymenia floresia ; produced in Okinawa Prefecture was dried and crushed to obtain isonohana powder. 0.6 g of this powder was placed in a 50 ml centrifuge tube, and 30 ml of distilled water was added and stirred. The protein was hydrolyzed by adding 3 mg and incubating at 60 ° C. for 3 hours.
反応終了後、この遠心チューブを沸騰水中に１０分間保持することで、熱水抽出を行った。１０分間経過後、直ちに氷冷し、１０,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した。また、サーモライシンを添加しない以外は、上記と同様の処理を行ない、比較上清を得た。 After completion of the reaction, hot water extraction was performed by holding the centrifuge tube in boiling water for 10 minutes. After 10 minutes, the mixture was immediately ice-cooled, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. In addition, a comparative supernatant was obtained by performing the same treatment as above except that thermolysin was not added.
得られたサーモライシン処理後熱水抽出を行った上清を目視で観察したところ、このものは可溶化されており、比較上清に比べ濃い赤色を呈していた。これに対し、比較上清は僅かに赤色を呈しているが、低温にすると僅かに残存する多糖類の塊が浮遊し、この赤色部分はこの多糖類に吸着したものであり、実際は水に溶けていないものであった。 When the obtained supernatant obtained after the thermolysin treatment was subjected to hot water extraction was visually observed, it was solubilized and exhibited a deep red color compared to the comparative supernatant. In contrast, the comparative supernatant is slightly red, but when the temperature is lowered, the remaining polysaccharide mass floats, and this red portion is adsorbed on this polysaccharide and is actually dissolved in water. It was not.
また、サーモライシンで加水分解後熱水抽出液した上清を３６５ｎｍの紫外線で励起したところ蛍光を発することが確認できた。 It was also confirmed that the supernatant obtained by hydrolyzing with thermolysin and then extracted with hot water was excited with 365 nm ultraviolet light to emit fluorescence.
実 施 例 ４.
クビレオゴノリからのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの精製：
容量２００ｍｌの三角フラスコに、実施例１のクビレオゴノリ粉末１ｇを入れ、蒸留水５０ｍｌを加えて攪拌した。これにサーモライシン５ｍｇを添加し、６０℃で３.５時間保温することで、タンパク質を加水分解した。
Example 4.
Purification of Phycoerythrobilin Oligopeptide from Kubireogori
Into a 200-ml Erlenmeyer flask, 1 g of the Kubireogonori powder of Example 1 was added, and 50 ml of distilled water was added and stirred. To this, 5 mg of thermolysin was added, and the protein was hydrolyzed by incubating at 60 ° C. for 3.5 hours.
反応後、この三角フラスコを沸騰水中に１０分間保持することで、熱水抽出を行った。抽出終了後直ちに氷冷し、１０,０００ｒｐｍで、１０分間の遠心分離を行って、上清およそ４６ｍｌを回収した。この上清のうち４０ｍｌについて分画分子量１０,０００の限外濾過膜を通過させ、この液を遠心エバポレータで減圧下に乾燥させることにより３４４ｍｇの固形物を得た。 After the reaction, hot water extraction was performed by holding the conical flask in boiling water for 10 minutes. Immediately after the completion of extraction, the mixture was ice-cooled and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to recover approximately 46 ml of the supernatant. Of this supernatant, 40 ml was passed through an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight of 10,000, and this liquid was dried under reduced pressure by a centrifugal evaporator to obtain 344 mg of a solid.
この固形物のうち２４０ｍｇをセファデックスＬＨ−２０カラム（内径２６×９００ミリメートル；ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）に負荷し、３０％メタノール水溶液で溶出した。７ｍｌ／フラクションで分画し、各フラクションの２２０ｎｍおよび５４０ｎｍの吸光度を測定した。 240 mg of this solid was loaded onto a Sephadex LH-20 column (inner diameter 26 × 900 mm; manufactured by GE Healthcare Japan, Inc.) and eluted with a 30% aqueous methanol solution. Fractionation was carried out at 7 ml / fraction, and the absorbance at 220 nm and 540 nm of each fraction was measured.
５４０ｎｍの吸収のあるピークのうちフラクションＮｏ.３４について、遠心エバポレータで濃縮後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製を行った。Ｃ３０逆相カラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＸＧ−Ｃ３０Ｍ−３ ４.６×２５０ｍｍ、野村化学株式会社製）に負荷し、０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配（流速１ｍｌ／分、０〜５２％の勾配を３０分間で行なう）により溶出し、５４０ｎｍに吸収のあるピーク（図４の矢印）を分取した。 Of the peak with absorption at 540 nm, fraction No. 34 was concentrated by a centrifugal evaporator and then purified by high performance liquid chromatography (HPLC). A C30 reverse phase column (Develosil XG-C30M-3 4.6 × 250 mm, manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) was loaded, and a linear concentration gradient of an aqueous acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (flow rate 1 ml / min, 0 to 0). Elution was performed at a gradient of 52% over 30 minutes), and an absorption peak at 540 nm (arrow in FIG. 4) was collected.
このピーク部分について、遠心エバポレータで溶媒を除去した後、Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ（Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS system）分析を行ったところ、プレカーサ−・イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋ １０４９.５１１５、ＭＳＭＳ プロダクト・イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７.２７９８のデータを得た。フィコエリスロビリンのモノアイソトピック質量が５８６.２７９１１４であるので、精製した成分はフィコエリスロビリンにアミノ酸４残基程度のペプチドが結合した物質であると推定できた。 After removing the solvent with a centrifugal evaporator, the peak portion was subjected to Q-TOF LC / MS (Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC / MS system) analysis. Data were obtained for ion, [M + H] + 1049.5115, MSMS product ion, [M + H] + 587.2798. Since the monoisotopic mass of phycoerythrovirin is 586.279114, it was estimated that the purified component was a substance in which a peptide having about 4 amino acids was bound to phycoerythrovirin.
実際、ペプチドと思われるピーク、［Ｍ＋Ｈ］＋ ４６３.２２５１のピークが確認できた。また、この物質のアミノ酸配列をアプライドバイオシステムズ社のプロテインシークエンサー（ニッピ株式会社に依頼分析）で解析したところ、Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓの配列まで確認できた。フィコエリスロビリンはＣｙｓに結合しているため、ペプチド部分をＶａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓとすると、分子量４６２.２２６１０となり、上記ペプチドのＭＳＭＳプロダクト・イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋ ４６３.２２５１と一致した。この配列は、オゴノリ属オゴノリ科の藻類、Gracilaria tenuistipitata liuiのＲ−フィコエリチリン・サブユニット アルファ（R-phycoerythrin, Subunit alpha）の配列上７９−８２に存在する。したがって、Ｃ３０逆相カラム（Develosil XG-C30M-3 4.6×250mm）で５４０ｎｍに吸収のあるピーク（図４の矢印）に含まれる物質は、フィコエリスロビリンとＶａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓが結合した下記式（II）に示す構造のフィコエリスロビリンテトラペプチドであると推定される。 In fact, the peak considered to be a peptide, the peak of [M + H] + 4633.2251 was confirmed. Further, when the amino acid sequence of this substance was analyzed by a protein sequencer (Applied to Nippi Co., Ltd.) of Applied Biosystems, the sequence of Val-Asn-Lys could be confirmed. Since phycoerythrovirin is bound to Cys, when the peptide portion is Val-Asn-Lys-Cys, the molecular weight is 4622.2610, which is consistent with the MSMS product ion of the peptide, [M + H] + 463.2251. This sequence is present on the 79-82 sequence of R-phycoerythrin, Subunit alpha of Gracilaria tenuistipitata liui, R-phycoerythrin, Subunit alpha. Therefore, phycoerythrovirin and Val-Asn-Lys-Cys were combined in the substance contained in the peak (arrow in FIG. 4) having an absorption at 540 nm on a C30 reverse phase column (Develosil XG-C30M-3 4.6 × 250 mm). It is presumed to be a phycoerythrovirin tetrapeptide having a structure represented by the following formula (II).
また、セファデックスＬＨ−２０カラムの代わりに、シメトリー・プレップ Ｃ１８カラム（SymmetryPrep C18 7.8×300mm；Ｗａｔｅｒｓ社製）により、フィコエリスロビリンオリゴペプチドを精製することもできる。すなわち、分画分子量１０,０００の限外濾過膜を通過させたて得た色素粗製物５００ｍｇを１ｍｌの精製水に溶解し、その１００μｌをカラムに負荷し、０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配（流速１.５ｍｌ／分、０〜７０％の勾配を５０分間で行なう）により溶出し、図５（Ａ）のピークＡを分取した。これを８回繰り返した。 Further, instead of the Sephadex LH-20 column, the phycoerythrobilin oligopeptide can also be purified by a Symmetry Prep C18 column (SymmetryPrep C18 7.8 × 300 mm; manufactured by Waters). That is, 500 mg of a crude pigment obtained by passing through an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 10,000 was dissolved in 1 ml of purified water, 100 μl thereof was loaded onto the column, and contained 0.1% trifluoroacetic acid. Elution was performed with a linear concentration gradient of an aqueous acetonitrile solution (flow rate: 1.5 ml / min, gradient of 0 to 70% was performed for 50 minutes), and peak A in FIG. 5 (A) was collected. This was repeated 8 times.
分取したピークＡについて、Ｃ３０逆相カラム（Develosil XG-C30M-3 4.6×250mm）に６回にわけて負荷し、０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配（流速１ｍｌ／分、０〜５２％の勾配を３０分間で行なう）により溶出し、図５（Ｂ）のピークＡ１とＡ２を分取した。Ａ２は図４の矢印ピークと同一であった。 For the collected peak A, a C30 reverse phase column (Develosil XG-C30M-3 4.6 × 250 mm) was loaded in six portions, and a linear concentration gradient of an aqueous acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (flow rate: 1 ml / And a gradient of 0-52% is performed in 30 minutes), and peaks A1 and A2 in FIG. A2 was identical to the arrow peak in FIG.
一方、ピークＡ１は遠心エバポレータで溶媒を除去した後、Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ システム分析を行ったところ、さらに二つのピークに分かれた（量比は１：２ほど）。それぞれのプレカーサー・イオンは［Ｍ＋Ｈ］＋ １２４０.５１５９、［Ｍ＋Ｈ］＋１３１１.５５２５であった。また、フィコエリスロビリンの存在を支持するそれぞれのＭＳＭＳ プロダクト・イオン、［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７.２８９８、［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７.２８１０を確認した。すなわち、ピークＡ１は推定分子量１２３９と１３１０のフィコエリスロビリンオリゴペプチドがおよそ２：１の量比からなると推定できる。 On the other hand, when the peak A1 was subjected to Q-TOF LC / MS system analysis after removing the solvent with a centrifugal evaporator, it was further divided into two peaks (amount ratio was about 1: 2). The respective precursor ions were [M + H] + 1240.5159, [M + H] + 1311.5525. In addition, the respective MSMS product ions supporting the presence of phycoerythrobilin, [M + H] + 587.2898, [M + H] + 587.810 were confirmed. That is, it can be estimated that the peak A1 is composed of a phycoerythrovirin oligopeptide having an estimated molecular weight of 1239 and 1310 having an amount ratio of about 2: 1.
実 施 例 ５.
イソノハナからのフィコエリスロビリンオリゴペプチドの精製：
容量３００ｍｌの三角フラスコに実施例３のイソノハナ粉末３ｇを入れ、蒸留水１５０ｍｌを加えて攪拌、これにサーモライシン１５ｍｇを添加し、６０℃で３時間保温することで、タンパク質を加水分解した。
Example 5.
Purification of phycoerythrobilin oligopeptide from isonohana:
3 g of the isonohana powder of Example 3 was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask, 150 ml of distilled water was added and stirred, 15 mg of thermolysin was added thereto, and the mixture was kept at 60 ° C. for 3 hours to hydrolyze the protein.
反応後、この遠心チューブを沸騰水中に１０分間保持することで、熱水抽出を行った。抽出終了後直ちに氷冷し、１０,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を回収した。この上清のうち９０ｍｌを分画分子量３０,０００の限外濾過膜を通過させ、この液を遠心エバポレータで減圧下に乾燥させることにより１.３５ｇの固形物を得た。 After the reaction, this centrifugal tube was kept in boiling water for 10 minutes to perform hot water extraction. Immediately after the completion of extraction, the mixture was ice-cooled, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. 90 ml of this supernatant was passed through an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 30,000, and this liquid was dried under reduced pressure with a centrifugal evaporator to obtain 1.35 g of a solid.
これを１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶解した。次に、Ｃ１８カートリッジ（ISOLUTE SPE column 500 mgC18(EC) 3ml）による分画を行った。０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１ｍｌでカートリッジを洗浄後、上記試料０.５ｍｌを負荷し、２ｍｌの０.１％ＴＦＡでカートリッジを洗浄した。カートリッジにメタノールを０.５ｍｌ加えることで、赤色の色素を溶出した。この作業を合計１０回行なった。 This was dissolved in distilled water at a concentration of 150 mg / ml. Next, fractionation was carried out using a C18 cartridge (ISOLUTE SPE column 500 mg C18 (EC) 3 ml). After washing the cartridge with 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA), 0.5 ml of the above sample was loaded, and the cartridge was washed with 2 ml of 0.1% TFA. The red dye was eluted by adding 0.5 ml of methanol to the cartridge. This operation was performed a total of 10 times.
溶出液を合わせて遠心エバポレータで減圧下にメタノールを除去し、１３ｍｇの試料を得た。この試料に含有される色素についてＨＰＬＣにより精製した。Ｃ１８逆相カラム（Symmetry C18 3.5μm 4.6×100mm、ウオーターズ社製）に負荷し、０.１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配（流速１ｍｌ／分、０〜４０％の勾配を２０分間で行なう）により溶出した。それを図６に示す。 The eluates were combined and methanol was removed under reduced pressure with a centrifugal evaporator to obtain 13 mg of a sample. The dye contained in this sample was purified by HPLC. Loaded onto a C18 reverse phase column (Symmetry C18 3.5 μm 4.6 × 100 mm, manufactured by Waters), a linear concentration gradient of an aqueous acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (flow rate 1 ml / min, 0 to 40% gradient 20). Elution). This is shown in FIG.
５４０ｎｍに吸収のある複数のピークを分取し、それぞれについて、遠心エバポレータで溶媒を除去した後、Ｑ−ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム分析を行ったところ、図６のピーク１は［Ｍ＋Ｈ］＋ １０６３.５２６０、ＭＳＭＳ プロダクト・イオン［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７.２８１６のデータを得た。 A plurality of peaks having absorption at 540 nm were collected, and after removing the solvent with a centrifugal evaporator, Q-TOF LC / MS system analysis was performed. As a result, peak 1 in FIG. 6 was [M + H] + 1063. 5260, MSMS product ion [M + H] + 587.2816 data.
フィコエリスロビリンのモノアイソトロピック質量が５８６.２７９１１４であるので、精製した成分はフィコエリスロビリンにアミノ酸４残基程度のペプチドが結合した物質であると推定できる。 Since the monoisotropic mass of phycoerythrovirin is 586.227914, it can be estimated that the purified component is a substance in which a peptide having about 4 amino acids is bound to phycoerythrovirin.
また、図６のピーク２は［Ｍ＋Ｈ］＋ ８５０.３７７５、ＭＳＭＳ プロダクト・オン［Ｍ＋Ｈ］＋ ５８７.２７９５のデータを得た。フィコエリスロビリンのアイソトロピック質量が５８６.２７９１１４であるので、精製した成分はフィコエリスロビリンにアミノ酸数残基のペプチドが結合した物質であると推定できる。 In addition, as for peak 2 in FIG. 6, data of [M + H] + 850.3775 and MSMS product on [M + H] + 587.2795 were obtained. Since the isotropic mass of phycoerythrovirin is 586.279114, it can be presumed that the purified component is a substance in which a peptide having several amino acid residues is bound to phycoerythrovirin.
実施例４および５で精製したフィコエリスロビリンオリゴペプチドを下記表１に整理した。
実 例 例 ６.
クビレオゴノリのフィコエリスロビリンオリゴペプチドのタンパク質糖化抑制
作用：
実施例４で得られた、ピークＡ１（推定分子量１２３９と１３１０のフィコエリスロビリンオリゴペプチドがおよそ２：１の量比からなる）の物質について、タンパク質糖化抑制効果を試験した。
Examples Example 6.
Inhibition of protein glycation of phycoerythrobilin oligopeptide of Kubileogonori
The substance of peak A1 (the phycoerythrovirin oligopeptide having an estimated molecular weight of 1239 and 1310 having a quantitative ratio of about 2: 1) obtained in Example 4 was tested for protein glycation-inhibiting effect.
本実施例では、グルコースと牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を６０℃で３日間インキュベートすることにより糖化反応を行い、その蛍光発色を検出することによりタンパク質糖化抑制効果を評価した。 In this example, saccharification reaction was performed by incubating glucose and bovine serum albumin (BSA) at 60 ° C. for 3 days, and the protein saccharification inhibitory effect was evaluated by detecting the fluorescence color development.
具体的には、ＰＢＳ（−）溶液に溶解した５０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン０.０５ｍｌ、ＰＢＳ（−）溶液に溶解した１.７Ｍブドウ糖０.１５ｍｌ、蒸留水または希釈した上記色素溶液０.０５ｍｌを１.５ｍｌのチューブに入れ、６０℃で３日間静置した。次いで、各チューブの溶液０.１ｍｌを９６穴マイクロプレートに移し、蛍光マイクロプレートリーダーにて、蛍光発生（励起波長Ｅｘ：３５５ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ：４６０ｎｍ）を測定した。また、終濃度１ｍＭのアミノグアニジンを添加した場合についても同様の試験を行い陽性対照とした。 Specifically, 0.05 ml of bovine serum albumin 50 mg / ml dissolved in PBS (−) solution, 0.15 ml of 1.7 M glucose dissolved in PBS (−) solution, distilled water or 0.1 ml of the above dye solution diluted. 05 ml was placed in a 1.5 ml tube and allowed to stand at 60 ° C. for 3 days. Next, 0.1 ml of the solution in each tube was transferred to a 96-well microplate, and fluorescence generation (excitation wavelength Ex: 355 nm, fluorescence wavelength Em: 460 nm) was measured with a fluorescence microplate reader. The same test was performed as a positive control when aminoguanidine having a final concentration of 1 mM was added.
結果は下式により、タンパク質糖化抑制率（％）として算出したものを表２に示す。なお、各試料添加区は２連で、蒸留水添加区は４連で行い、それぞれの平均値を結果として記載した。 Table 2 shows the results calculated as protein glycation inhibition rate (%) according to the following formula. Each sample addition group was performed in duplicate, and the distilled water addition group was performed in quadruplicate, and the average value of each was recorded as a result.
タンパク質糖化抑制率（％）＝
［１ − （Ａ１−ＢＬ）／ （Ａ０−ＢＬ）］×１００
Ａ１：色素溶液添加における蛍光測定値
Ａ０：蒸留水添加における蛍光測定値
ＢＬ：蒸留水添加、反応時間ゼロにおける蛍光測定値
Protein glycation inhibition rate (%) =
[1- (A 1 -B L ) / (A 0 -B L )] × 100
A 1 : Fluorescence measurement value when dye solution is added
A 0 : Fluorescence measurement value when distilled water is added
B L : Fluorescence measurement value when distilled water is added and reaction time is zero
この結果から、クビレオゴノリから得たフィコエリスロビリンオリゴペプチドはタンパク質糖化抑制効果を有することが示された。 From this result, it was shown that the phycoerythrobilin oligopeptide obtained from Kubireogonori has a protein glycation inhibitory effect.
実 施 例 ７.
フィコエリスロビリンオリゴペプチド含有画分のタンパク質糖化抑制作用：
実施例５の方法により、Ｃ１８カートリッジで分画した色素成分について、５０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液として、タンパク質糖化抑制効果を試験した。
Example 7.
Protein glycation-inhibiting action of phycoerythrobilin oligopeptide-containing fractions:
By the method of Example 5, the protein saccharification inhibitory effect was tested as an aqueous solution having a concentration of 50 mg / ml with respect to the pigment component fractionated with the C18 cartridge.
まず、ＰＢＳ（−）溶液に溶解した５０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン０.１ｍｌ、ＰＢＳ（−）溶液に溶解した１.７Ｍブドウ糖０.３ｍｌ、蒸留水または希釈した上記色素溶液０.１ｍｌを１.５ｍｌのチューブに入れ、６０℃で３日間静置した。 First, 0.1 ml of 50 mg / ml bovine serum albumin dissolved in PBS (−) solution, 0.3 ml of 1.7M glucose dissolved in PBS (−) solution, 0.1 ml of distilled water or the above dye solution diluted to 1 Placed in a 0.5 ml tube and allowed to stand at 60 ° C. for 3 days.
次いで、各チューブの溶液０.１ｍｌを９６穴マイクロプレートに移し、蛍光マイクロプレートリーダーにて、蛍光発生（励起波長 Ｅｘ：３５５ｎｍ、蛍光波長 Ｅｍ：４６０ｎｍ）を測定した。また、終濃度１ｍＭのアミノグアニジンを添加した場合についても同様の試験を行い陽性対照とした。 Next, 0.1 ml of the solution in each tube was transferred to a 96-well microplate, and fluorescence generation (excitation wavelength Ex: 355 nm, fluorescence wavelength Em: 460 nm) was measured with a fluorescence microplate reader. The same test was performed as a positive control when aminoguanidine having a final concentration of 1 mM was added.
結果は、実施例６と同様にタンパク質糖化抑制率（％）として算出し、表３に示した。 The results were calculated as protein glycation inhibition rate (%) in the same manner as in Example 6, and are shown in Table 3.
この結果、イソノハナから得たフィコエリスロビリンオリゴペプチドを含む画分は濃度依存的にタンパク質糖化抑制効果を示すことが明らかとなった。
As a result, it was revealed that the fraction containing phycoerythrobilin oligopeptide obtained from Isonohana exhibits a protein glycation-inhibiting effect in a concentration-dependent manner.
Claims (10)
で表される請求項１ないし３の何れかの項記載のタンパク質糖化抑制剤の製造方法。 The phycoerythrobilin oligopeptide has the following formula (I)
The manufacturing method of the protein saccharification inhibitor of any one of Claims 1 thru | or 3 represented by these.
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