JP6614916B2 - Bone formation promoter and bone formation promoter - Google Patents
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Description
本発明は、医薬品として有用な骨形成促進剤及び当該骨形成促進剤を利用する骨形成促進装置に関し、とりわけＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含有する骨形成促進剤に関する。 The present invention relates to an osteogenesis promoter useful as a pharmaceutical and an osteogenesis promoter using the osteogenesis promoter, and in particular, one or more selected from the group consisting of GPR81 ligands, agonists and precursors thereof as active ingredients It is related with the bone formation promoter contained as.
骨再生が必要な骨疾患の治癒には、骨形成を促進させることが重要である。骨形成の四大要素は、（１）細胞、（２）基質、（３）ミネラルイオン、（４）制御因子であり、このうち制御因子として、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、デキサメタゾン、β−グリセロフォスフェート等が知られている（非特許文献１、２）。
It is important to promote bone formation for healing bone diseases that require bone regeneration. The four major elements of bone formation are (1) cells, (2) substrates, (3) mineral ions, and (4) regulatory factors. Among these, as regulatory factors, bone morphogenetic proteins (BMPs belonging to the TGF-β superfamily) ), Dexamethasone, β-glycerophosphate and the like are known (Non-patent
従来、担体に担持された制御因子を含む組成物により骨形成を促進させるための技術が開発されてきた。例えば、特許文献１には、ＢＭＰ、グリセリルトリアセテートに代表されるグリセロールエステル類、及び担体からなる組成物が開示され、当該担体としてポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性ポリマーが列挙されている。また、特許文献２には、骨芽細胞増進分子としてＮ−アセチルシステイン、及び担体からなる組成物が開示され、当該担体としてポリ乳酸、ＰＬＧＡ等の生分解性ポリマーが列挙されている。
Conventionally, techniques for promoting bone formation have been developed with a composition containing a control factor carried on a carrier. For example,
また、ポリ乳酸以外のポリマーを担体として用いた技術としては、例えば、特許文献３が挙げられる。特許文献３では、制御因子としてケイ素を、担体として延伸性を備えた３−ヒドロキシ酪酸（β−ヒドロキシ酪酸）と４−ヒドロキシ酪酸（γ−ヒドロキシ酪酸）との共重合体を用いている。
Moreover, as a technique using a polymer other than polylactic acid as a carrier, for example,
一方、整形外科や歯科口腔外科分野における骨折部の整復用材料として、高い強度を有し、骨接合用プレート、ピン、ビス、スクリュー等に加工できる高分子量のポリ乳酸又はＰＬＧＡが開示されている（特許文献４）。また、特許文献５には、βリン酸三カルシウム多孔体からなる微小顆粒を保持する膜部材としてポリ乳酸、ＰＬＧＡ等が用いられている。
On the other hand, high-molecular-weight polylactic acid or PLGA that has high strength and can be processed into osteosynthesis plates, pins, screws, screws, etc. has been disclosed as a material for reducing fractures in the fields of orthopedics and dental and oral surgery. (Patent Document 4). In
近年、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）群が同定され、その中の１つであるＧＰＲ（Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）８１は脂肪細胞において特に多く認められるレセプターである。ＧＰＲ８１のリガンドが乳酸（特にはＬ−乳酸）であることは一般に知られているが、非特許文献３及び特許文献６によれば、ＧＰＲ８１のリガンドとしてＬ−乳酸以外にも多数の化合物が報告されている。非特許文献３及び特許文献６に記載のそれら化合物をまとめて列挙すると、Ｄ−乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸、プロピオン酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、クロロフルオロジ酢酸、２−クロロプロピオン酸である。
In recent years, a group of G protein-coupled receptors (GPCRs) has been identified, and one of them, GPR (G Protein-coupled Receptor) 81, is a receptor that is particularly frequently observed in adipocytes. Although it is generally known that the ligand of GPR81 is lactic acid (particularly L-lactic acid), according to Non-Patent
しかしながら、従来、担体に担持された制御因子を含む組成物による骨形成促進方法は、制御因子に適合する担体の選択、制御因子の放出特性の制御、担体の生分解性等の技術的課題が多いものであった。 However, conventional methods for promoting osteogenesis using a composition containing a control factor supported on a carrier have technical problems such as selection of a carrier that matches the control factor, control of the release characteristics of the control factor, and biodegradability of the carrier. There were many.
特に、乳酸に注目した場合に、従来の乳酸の利用方法は、上述のように、制御因子の担体又は骨整復用の部材としての利用であった。そして、本願の出願人が知る限り、乳酸そのものの作用に着目して、骨形成の促進について検討した事例は未だ報告されていない。 In particular, when attention is paid to lactic acid, the conventional method of using lactic acid has been to use it as a carrier of a control factor or a member for bone reduction as described above. And as far as the applicant of the present application knows, there has been no report yet of a case studying the promotion of bone formation by focusing on the action of lactic acid itself.
また、特許文献３においても、担体であるβ−ヒドロキシ酪酸とγ−ヒドロキシ酪酸との共重合体は骨形成には関与しないことが比較例１において示されている。
Also in
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、骨形成を効果的に促進する骨形成促進剤及び骨形成促進装置を提供することをその目的の一つとする。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide an osteogenesis promoting agent and an osteogenesis promoting apparatus that effectively promote osteogenesis.
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る骨形成促進剤は、下記のとおりである。
［１］ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含むことを特徴とする骨形成促進剤。
［２］前記リガンドは、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸及びプロピオン酸からなる群より選択される１以上である上記［１］記載の骨形成促進剤。
［３］前記リガンドは、乳酸である上記［１］又は［２］記載の骨形成促進剤。
［４］前記前駆体は、前記リガンド又は前記アゴニストを含む成分の重合体である上記［１］乃至［３］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
［５］前記重合体は、次の（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす：（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定されるポリスチレン換算の数平均分子量が３００〜２０００の範囲内である；（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、ポリスチレン換算の分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が５０％〜１００％の範囲内である；上記［４］記載の骨形成促進剤。
［６］流動性組成物である上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
［７］注入用組成物である上記［１］乃至［６］のいずれかに記載の骨形成促進剤。
The bone formation promoter according to one embodiment of the present invention for solving the above-described problems is as follows.
[1] An osteogenesis promoter comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of a ligand, an agonist and a precursor thereof of GPR81.
[2] The ligand is one or more selected from the group consisting of lactic acid, α-hydroxybutyric acid, γ-hydroxybutyric acid, α-hydroxyisobutyric acid, glycolic acid, α-hydroxycaproic acid, maleic acid, tartaric acid and propionic acid. The bone formation promoter according to [1] above, wherein
[3] The osteogenesis promoter according to [1] or [2] above, wherein the ligand is lactic acid.
[4] The osteogenesis promoter according to any one of [1] to [3], wherein the precursor is a polymer of a component containing the ligand or the agonist.
[5] The polymer satisfies the following (a) and / or (b): (a) The number average molecular weight in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography is in the range of 300 to 2,000; (B) In the chromatogram obtained by measurement by gel permeation chromatography, the ratio of the area in the molecular weight range of 250 to 2000 in terms of polystyrene to the total area is in the range of 50% to 100%; [4] above The bone formation promoter as described.
[6] The osteogenesis promoter according to any one of [1] to [5], which is a fluid composition.
[7] The bone formation promoter according to any one of [1] to [6], which is an injection composition.
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る骨形成促進装置は、下記のとおりである。
［８］上記［６］又は［７］に記載の骨形成促進剤を収容するリザーバ部と、前記リザーバ部の前記骨形成促進剤を患者の患部に注入する注入部と、を備えたことを特徴とする骨形成促進装置。
A bone formation promoting device according to an embodiment of the present invention for solving the above problems is as follows.
[8] A reservoir unit that houses the osteogenesis promoter according to [6] or [7], and an injection unit that injects the osteogenesis promoter of the reservoir unit into an affected area of a patient. A bone formation promoting device.
本発明によれば、骨形成を効果的に促進する骨形成促進剤及び骨形成促進装置が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the osteogenesis promoter and the osteogenesis promotion apparatus which accelerate bone formation effectively are provided.
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。また、以下の説明において、ゲル浸透クロマトグラフィー法（以下、「ＧＰＣ法」という。）によって得られる分子量、数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）は、特に指摘しない限り、ポリスチレン換算のものを意味する。 Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described. Note that the present invention is not limited to the present embodiment. In the following description, the molecular weight, number average molecular weight (Mn) and weight average molecular weight (Mw) obtained by gel permeation chromatography (hereinafter referred to as “GPC method”) are in terms of polystyrene unless otherwise indicated. Means things.
本発明の発明者らは、骨形成促進に関わる種々の制御因子について研究する中で、骨芽細胞等の細胞培養試験において、ヒトの静脈血中における正常値の上限より高い濃度の乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の存在下で、石灰化が促進すること及びコラーゲンの産生量が増加することを見出した。そして、これら石灰化促進及びコラーゲン産生量増加の作用が、乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がリガンドとして作用するＧＰＲ８１を介在したものであることを突き止めた。さらに研究を進めた結果、ＧＰＲ８１のリガンドが骨形成における制御因子として作用することを見出した。本発明は、これら独自の知見に基づき為されたものである。すなわち、本発明は、骨形成促進に関し、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体が有する未知の属性・機能・作用を見出したことに基づく発明である。 The inventors of the present invention are studying various control factors related to osteogenesis promotion, and in cell culture tests such as osteoblasts, lactic acid or α at a concentration higher than the upper limit of normal values in human venous blood. -In the presence of hydroxybutyric acid, it has been found that calcification is promoted and collagen production is increased. And it discovered that the effect | action of these calcification acceleration | stimulation and collagen production amount increase was what mediated GPR81 in which lactic acid and (alpha) -hydroxybutyric acid act as a ligand. As a result of further research, it was found that the ligand of GPR81 acts as a regulator in bone formation. The present invention has been made based on these unique findings. That is, the present invention relates to the promotion of bone formation and is based on the discovery of unknown attributes, functions, and actions of GPR81 ligands, agonists and their precursors.
次に、骨芽細胞においてＧＰＲ８１が存在することを確認した実験を紹介する。この実験では、骨芽細胞としてマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用い、１次抗体として抗マウスＧＰＲ８１抗体（ＳＩＧＭＡ社製、Anti-Mouse Gpr81-s296）を用い、ウェスタンブロット法で検出した。 Next, an experiment that confirms the presence of GPR81 in osteoblasts is introduced. In this experiment, mouse osteoblast cell line MC3T3-E1 was used as an osteoblast, and anti-mouse GPR81 antibody (manufactured by SIGMA, Anti-Mouse Gpr81-s296) was used as a primary antibody, and detection was performed by Western blotting.
まず、通常の方法でＧＰＲ８１の検出を試みたが、非特異的なバンドが多数検出された。そこで、ＧＰＲ８１をノックアウトしたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を対照として再度実験を行った。その結果、図１に示すように、３９．５ｋＤａ付近において、Wild Typeのレーン１ではバンドが検出されたのに対して、ノックアウト（GPR81 Knockout）のレーン２ではバンドが検出されなかった。この結果より、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＧＰＲ８１が存在することが確認された。なお、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＧＰＲ８１が存在することは、後述の実施例で説明する各種試験によっても直接・間接的に確認された。
First, an attempt was made to detect GPR81 by a normal method, but many non-specific bands were detected. Therefore, another experiment was performed using MC3T3-E1 cells knocked out of GPR81 as a control. As a result, as shown in FIG. 1, in the vicinity of 39.5 kDa, a band was detected in
本実施形態に係る骨形成促進剤（以下、「本剤」という。）は、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を有効成分として含む。すなわち、本剤は、患者の骨形成が必要な患部に投与されることにより、上記有効成分の作用によって、当該患部において骨形成を促進する。 The osteogenesis promoting agent (hereinafter referred to as “this agent”) according to the present embodiment contains, as an active ingredient, one or more selected from the group consisting of a ligand of GPR81, an agonist, and a precursor thereof. That is, this agent promotes bone formation in the affected area by the action of the above active ingredient by being administered to the affected area in need of bone formation of the patient.
このため本実施形態は、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上の、骨形成促進剤の有効成分としての使用を含む。このように、本剤は、骨形成が必要な骨疾患を治療するために使用される。すなわち、本実施形態は、本剤を、患者の骨形成が必要な患部（例えば、骨欠損部）に投与することにより、当該患部における骨形成を促進することを含む、骨疾患の治療方法をも含む。 For this reason, this embodiment includes use as an active ingredient of one or more osteogenesis promoters selected from the group consisting of ligands, agonists and precursors of GPR81. Thus, this agent is used to treat bone diseases that require bone formation. That is, the present embodiment provides a method for treating a bone disease, comprising administering the agent to an affected part (for example, a bone defect part) that requires bone formation of a patient to promote bone formation in the affected part. Including.
本剤に含まれるＧＰＲ８１のリガンドは、本剤が投与される生体内（例えば、血液中）に本来的に存在し、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す物質である。すなわち、このリガンドは、例えば、培養骨芽細胞に投与されることで、当該培養骨芽細胞における石灰化を促進する物質である。より具体的に、例えば、ヒト又はマウスの骨芽細胞培養系において、１ｍＭ〜８０ｍＭの範囲内の所定濃度で当該骨芽細胞における石灰化を促進する物質である。本剤は、１種のリガンドを含むこととしてもよいし、２種以上のリガンドを含むこととしてもよい。 The ligand of GPR81 contained in this drug is inherently present in the living body (for example, in blood) to which this drug is administered, and acts on GPR81 of cells that can differentiate into osteoblasts or osteoblasts. It is a substance that exhibits a forming effect. That is, for example, this ligand is a substance that promotes calcification in cultured osteoblasts by being administered to the cultured osteoblasts. More specifically, for example, in a human or mouse osteoblast culture system, a substance that promotes calcification in osteoblasts at a predetermined concentration in the range of 1 mM to 80 mM. This agent may contain one type of ligand or may contain two or more types of ligands.
ＧＰＲ８１のリガンドは、上述のとおり、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す物質であれば特に限られないが、例えば、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、α−ヒドロキシカプロン酸、マレイン酸、酒石酸及びプロピオン酸からなる群より選択される１以上であることが好ましく、乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、γ−ヒドロキシ酪酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸及びα−ヒドロキシカプロン酸からなる群より選択される１以上であることがより好ましい。リガンドとしては、乳酸が好ましく用いられ、生体内に存在するＬ−乳酸が特に好ましく用いられる。なお、本実施形態において、「乳酸」との用語は、特に断らない限り、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸を総称する用語として使用される。 The ligand of GPR81 is not particularly limited as long as it is a substance that acts on GPR81 of cells that can differentiate into osteoblasts or osteoblasts as described above, and exhibits an osteogenic effect. For example, lactic acid, α-hydroxybutyric acid , Γ-hydroxybutyric acid, α-hydroxyisobutyric acid, glycolic acid, α-hydroxycaproic acid, maleic acid, tartaric acid and propionic acid, and preferably at least one selected from the group consisting of lactic acid, α-hydroxybutyric acid, More preferably, it is one or more selected from the group consisting of γ-hydroxybutyric acid, α-hydroxyisobutyric acid, glycolic acid and α-hydroxycaproic acid. As the ligand, lactic acid is preferably used, and L-lactic acid present in the living body is particularly preferably used. In the present embodiment, the term “lactic acid” is used as a generic term for L-lactic acid, D-lactic acid, and DL-lactic acid unless otherwise specified.
本剤に含まれるＧＰＲ８１のアゴニストは、当該ＧＰＲ８１のリガンドではないが、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞のＧＰＲ８１に作用して骨形成効果を示す、上記リガンドの類似体である。リガンドの類似体は、例えば、ＧＰＲ８１に作用するための分子構造（具体的には、例えば、ＧＰＲ８１に対する結合部分の分子構造）として、当該リガンドの分子構造に類似した構造を有する物質である。より具体的に、リガンドの類似体は、例えば、当該リガンドの分子構造に１以上の原子又は化学基が付加された分子構造、又は当該リガンドの分子構造に含まれる１以上の原子又は化学基が置換又は欠失された分子構造を有する物質である。リガンドの類似体は、当該リガンドの分子構造に化学修飾（例えば、当該リガンドの分子構造に対する、１以上の原子又は化学基の付加、置換又は欠失を含む化学修飾）を施すことにより合成された物質（リガンドの誘導体）であることとしてもよい。本剤は、１種のアゴニストを含むこととしてもよいし、２種以上のアゴニストを含むこととしてもよい。 The agonist of GPR81 contained in this agent is an analog of the above-mentioned ligand that acts on GPR81 of osteoblasts or cells that can differentiate into osteoblasts and shows an osteogenic effect, although it is not a ligand of the GPR81. An analog of a ligand is a substance having a structure similar to the molecular structure of the ligand, for example, as a molecular structure for acting on GPR81 (specifically, for example, a molecular structure of a binding moiety to GPR81). More specifically, the ligand analog includes, for example, a molecular structure in which one or more atoms or chemical groups are added to the molecular structure of the ligand, or one or more atoms or chemical groups included in the molecular structure of the ligand. A substance having a substituted or deleted molecular structure. Analogs of ligands were synthesized by subjecting the molecular structure of the ligand to chemical modification (eg, chemical modification including addition, substitution or deletion of one or more atoms or chemical groups to the molecular structure of the ligand). It may be a substance (ligand derivative). The agent may contain one kind of agonist or may contain two or more kinds of agonists.
本剤に含まれる前駆体は、ＧＰＲ８１のリガンド又はアゴニストの前駆体である。この前駆体は、生体内（具体的には、患者の患部）においてリガンド又はアゴニストを放出する物質である。前駆体は、例えば、生体内で分解されてリガンド又はアゴニストを放出する物質である。この場合、前駆体は、加水分解されてリガンド又はアゴニストを放出する物質であってもよい。これらの前駆体は、生体内において、リガンド又はアゴニストを徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。リガンドの前駆体は、当該リガンドを放出するものであれば特に限られず、さらにアゴニスト等の他の成分を放出するものであってもよい。また、アゴニストの前駆体は、当該アゴニストを放出するものであれば特に限られず、さらにリガンド等の他の成分を放出するものであってもよい。 The precursor contained in this agent is a precursor of GPR81 ligand or agonist. This precursor is a substance that releases a ligand or an agonist in vivo (specifically, an affected area of a patient). A precursor is, for example, a substance that is degraded in vivo to release a ligand or agonist. In this case, the precursor may be a substance that is hydrolyzed to release the ligand or agonist. These precursors effectively promote bone formation by releasing the ligand or agonist in vivo. The precursor of the ligand is not particularly limited as long as it releases the ligand, and may release other components such as an agonist. The precursor of the agonist is not particularly limited as long as it releases the agonist, and may release other components such as a ligand.
前駆体は、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体であることとしてもよい。この重合体は、単独重合体であってもよいし、共重合体であってもよい。すなわち、重合体は、１種のリガンド又はアゴニストから構成される成分の重合体（単独重合体）であってもよいし、１種のリガンド又はアゴニストと他の１種以上の成分との共重合体であってもよい。共重合体は、２種以上のリガンド及び／又はアゴニストを含む成分の重合体であってもよい。 The precursor may be a polymer of components including a ligand or an agonist. This polymer may be a homopolymer or a copolymer. That is, the polymer may be a polymer of a component (homopolymer) composed of one type of ligand or agonist, or a co-polymerization of one type of ligand or agonist with one or more other types of components. It may be a coalescence. The copolymer may be a polymer of components including two or more kinds of ligands and / or agonists.
具体的に、共重合体は、２種以上のリガンドを含む成分の重合体であってもよいし、２種以上のアゴニストを含む成分の重合体であってもよいし、１種以上のリガンドと１種以上のアゴニストとを含む成分の重合体であってもよい。共重合体は、その構成成分の全てがＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストであることが好ましい。共重合体の種類は特に限られず、例えば、ランダム共重合、交互共重合、ブロック共重合、グラフト共重合のいずれであってもよい。 Specifically, the copolymer may be a polymer of a component containing two or more types of ligands, a polymer of a component containing two or more types of agonists, or one or more types of ligands. And a polymer of a component containing one or more kinds of agonists. It is preferable that all of the constituent components of the copolymer are GPR81 ligands and / or agonists. The type of the copolymer is not particularly limited, and may be any of random copolymerization, alternating copolymerization, block copolymerization, and graft copolymerization, for example.
より具体的に、共重合体は、２種以上のリガンド及び／又はアゴニストを含む成分の重合体であれば特に限られないが、例えば、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−εカプロラクトン共重合体、乳酸−εカプロラクトン共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、乳酸−グリコール酸−εカプロラクトン共重合体、乳酸−グリコール酸−εカプロラクトン共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体、及びグリコール酸−εカプロラクトン共重合体からなる群より選択される１以上であってもよい。 More specifically, the copolymer is not particularly limited as long as it is a polymer of components containing two or more kinds of ligands and / or agonists. For example, lactic acid-glycolic acid copolymer, lactic acid and polyethylene glycol Copolymer, Copolymer of lactic acid-glycolic acid copolymer and polyethylene glycol, Copolymer of lactic acid-ε caprolactone, Copolymer of lactic acid-ε caprolactone copolymer and polyethylene glycol, Lactic acid-glycolic acid-ε It may be one or more selected from the group consisting of a caprolactone copolymer, a lactic acid-glycolic acid-ε caprolactone copolymer and polyethylene glycol, and a glycolic acid-ε caprolactone copolymer.
重合体としては、乳酸を含む成分の重合体が好ましく使用され、上述のような乳酸を含む成分の共重合体や、単独重合体であるポリ乳酸が好ましく使用される。Ｌ−乳酸は生体内に存在するため、当該Ｌ−乳酸を含む成分の重合体（例えば、ポリＬ−乳酸及び／又はＬ−乳酸を含む成分の共重合体）が特に好ましく使用される。 As the polymer, a polymer of a component containing lactic acid is preferably used, and a copolymer of a component containing lactic acid as described above or polylactic acid which is a homopolymer is preferably used. Since L-lactic acid exists in the living body, a polymer of a component containing L-lactic acid (for example, a copolymer of a component containing poly L-lactic acid and / or L-lactic acid) is particularly preferably used.
リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体は、上述のとおり、生体内（具体的には、患者の患部）において分解されて当該リガンド又はアゴニストを放出する重合体であることが好ましい。すなわち、重合体は、加水分解されてリガンド又はアゴニストを放出する重合体であってもよい。分解可能（例えば、加水分解可能）な重合体は、生体内において、リガンド又はアゴニストを徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。したがって、重合体は、患者の患部において、リガンド又はアゴニストを持続的に放出する分解能を有することが好ましい。すなわち、上述のとおり、骨芽細胞等の細胞培養試験において、ヒトの静脈血中における正常値の上限より高い濃度で、ＧＰＲ８１のリガンドである乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸が存在することによって、石灰化及びコラーゲン産生が促進されることから、生体内、すなわち患者の患部においては、当該リガンドを恒常的に比較的高い局所濃度で存在させることが効果的と考えられる。なお、リガンド及びアゴニストは、その種類によって、十分な骨形成促進効果を示す濃度が異なるため、重合体の組成や、本剤の患部への投与量等を適宜調整することが好ましい。リガンドを含む成分の重合体は、分解されて当該リガンドを放出するものであれば特に限られず、さらにアゴニスト等の他の成分を放出するものであってもよい。また、アゴニストを含む成分の重合体は、分解されて当該アゴニストを放出するものであれば特に限られず、さらにリガンド等の他の成分を放出するものであってもよい。 As described above, the polymer of the component containing the ligand or agonist is preferably a polymer that is decomposed in vivo (specifically, the affected area of the patient) to release the ligand or agonist. That is, the polymer may be a polymer that is hydrolyzed to release the ligand or agonist. Degradable (eg, hydrolyzable) polymers effectively promote bone formation by slow release of a ligand or agonist in vivo. Therefore, the polymer preferably has a resolution capable of continuously releasing a ligand or an agonist in the affected area of the patient. That is, as described above, in cell culture tests such as osteoblasts, calcification is caused by the presence of lactic acid or α-hydroxybutyric acid which is a ligand of GPR81 at a concentration higher than the upper limit of normal value in human venous blood. Since collagen production is promoted, it is considered effective to make the ligand constantly present at a relatively high local concentration in a living body, that is, in an affected area of a patient. In addition, since the density | concentration in which a ligand and an agonist show sufficient bone formation promotion effect changes with kinds, it is preferable to adjust suitably the composition of a polymer, the dosage to the affected part, etc. of this agent. The polymer of the component containing the ligand is not particularly limited as long as it is decomposed and releases the ligand, and may further release other components such as an agonist. Moreover, the polymer of the component containing an agonist is not particularly limited as long as it is decomposed and releases the agonist, and may further release other components such as a ligand.
重合体の重合度は２以上であれば特に限られない。すなわち、重合体は、重合度が２〜２０程度のオリゴマーであってもよいし、重合度が２０超のポリマーであってもよい。重合度が比較的小さい重合体は、生体内において比較的分解されやすいため、リガンド及び／又はアゴニストを効果的に徐放することができる。 The degree of polymerization of the polymer is not particularly limited as long as it is 2 or more. That is, the polymer may be an oligomer having a degree of polymerization of about 2 to 20, or a polymer having a degree of polymerization of more than 20. Since a polymer having a relatively low degree of polymerization is relatively easily degraded in a living body, a ligand and / or an agonist can be effectively released slowly.
重合体における、ＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストに由来する構成成分の含有量（当該重合体がリガンドに由来する構成成分とアゴニストに由来する構成成分とを含む場合は、当該リガンドに由来する構成成分の含有量と、当該アゴニストに由来する構成成分の含有量との合計）は、本剤による骨形成促進効果が得られる範囲であれば特に限られないが、例えば、７０モル％以上であることとしてもよく、８０モル％以上であることが好ましく、９０モル％以上であることがより好ましい。 Content of component derived from ligand and / or agonist of GPR81 in the polymer (when the polymer includes a component derived from the ligand and a component derived from the agonist, the component derived from the ligand Is not particularly limited as long as the effect of promoting osteogenesis by this agent is obtained, but is, for example, 70 mol% or more. It is preferable that it is 80 mol% or more, more preferably 90 mol% or more.
上述のように重合体が、ＧＰＲ８１のリガンド及び／又はアゴニストに由来する構成成分を主要構成成分として含む場合、当該重合体を有効成分として含む本剤を、患者の骨形成の促進が必要な骨疾患等の部位又はその近傍に投与することによって、骨形成を促進し、効果的な骨再生を図ることができる。 As described above, when the polymer contains a component derived from a ligand and / or agonist of GPR81 as a main component, this drug containing the polymer as an active ingredient is used for bone that needs to promote bone formation in the patient. By administering at or near a site such as a disease, bone formation can be promoted and effective bone regeneration can be achieved.
重合体は、次の（ａ）及び／又は（ｂ）を満たすこととしてもよい：（ａ）ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜２０００の範囲内である；（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が５０％〜１００％の範囲内である。 The polymer may satisfy the following (a) and / or (b): (a) the number average molecular weight measured by GPC method is in the range of 300 to 2000; (b) gel permeation chromatography. In the chromatogram obtained by the measurement by the graphic method, the ratio of the area of the molecular weight in the range of 250 to 2000 to the total area is in the range of 50% to 100%.
また、上記（ａ）の条件は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜１５００の範囲内であり、上記（ｂ）の条件は、ＧＰＣ法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が６０％〜１００％の範囲内であることが好ましい。 In addition, the condition (a) is that the number average molecular weight measured by the GPC method is in the range of 300 to 1500, and the condition (b) is the total area in the chromatogram obtained by the measurement by the GPC method. It is preferable that the ratio of the area of the molecular weight in the range of 250 to 2000 is in the range of 60% to 100%.
また、上記（ａ）の条件は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が３００〜１０００の範囲内であり、上記（ｂ）の条件は、ＧＰＣ法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が７０％〜１００％の範囲内であることが特に好ましい。 The condition (a) is that the number average molecular weight measured by the GPC method is in the range of 300 to 1000, and the condition (b) is the total area in the chromatogram obtained by the measurement by the GPC method. It is particularly preferable that the ratio of the area of the molecular weight in the range of 250 to 2000 is in the range of 70% to 100%.
上記（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす重合体を有効成分として含む本剤は、骨形成促進が必要な部位又はその近傍に設置された場合において、当該重合体の分解によって、骨形成に資するリガンド及び／又はアゴニストを持続的に供給する（徐放する）ことができるという点で好ましい。 The present agent containing a polymer satisfying the above (a) and / or (b) as an active ingredient is used for bone formation by disintegrating the polymer when it is installed at or near the site where bone formation needs to be promoted. This is preferable in that a contributing ligand and / or agonist can be continuously supplied (controlled release).
また、重合体は、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比率として算出される分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．１〜３．０の範囲内であることが好ましい。 The polymer has a molecular weight distribution (Mw / Mn) calculated as a ratio of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) measured by the GPC method within a range of 1.1 to 3.0. It is preferable that
なお、本実施形態において、ＧＰＣ法による測定は、以下の条件で行う。
・測定装置：高速ＧＰＣ装置 ＨＬＣ−８１２０（東ソー株式会社製）
・ＧＰＣカラム：TSKgel G6000HXL、G5000HXL、G4000HXL、G2500HXL、G1000HXL、TSK guard column HXL-H（いずれも東ソー株式会社製、TSK guard column HXL-H以外は7.8mmI.D.×30cmL）
・ポリスチレン基準物質：F-128（1.09×106）、F-80（7.06×105）、F-40（4.27×105）、F-20（1.90×105）、F-10（9.64×104）、F-4（3.79×104）、F-2（1.81×104）、F-1（1.02×104）、A-5000（5.97×103）、A-2500（2.63×103）、A-1000（1.01×103）、A-500（5.0×102）（いずれも東ソー株式会社製） ※（ ）内は分子量の代表的値
・カラム温度：４０℃付近の一定温度
・移動相：ＴＨＦ
・流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
In the present embodiment, the measurement by the GPC method is performed under the following conditions.
-Measuring device: High-speed GPC device HLC-8120 (manufactured by Tosoh Corporation)
・ GPC column: TSKgel G6000HXL, G5000HXL, G4000HXL, G2500HXL, G1000HXL, TSK guard column HXL-H (all manufactured by Tosoh Corporation, except TSK guard column HXL-H, 7.8mmI.D. × 30cmL)
・ Polystyrene reference materials: F-128 (1.09 × 10 6 ), F-80 (7.06 × 10 5 ), F-40 (4.27 × 10 5 ), F-20 (1.90 × 10 5 ), F-10 (9.64) × 10 4 ), F-4 (3.79 × 10 4 ), F-2 (1.81 × 10 4 ), F-1 (1.02 × 10 4 ), A-5000 (5.97 × 10 3 ), A-2500 (2.63 × 10 3 ), A-1000 (1.01 × 10 3 ), A-500 (5.0 × 10 2 ) (all manufactured by Tosoh Corporation) * () is a typical value of molecular weight. Column temperature: around 40 ° C Constant temperature / mobile phase: THF
・ Flow rate: 0.8mL / min
本剤の形状は特に限られず、固形状、ゲル状、液状等、どのような形状であってもよいが、本剤は、流動性組成物であることが好ましい。すなわち、この場合、本剤は、流動性を有するため、患者の患部に投与する際の操作性に優れ、その結果、当該患部における骨形成を効果的に促進する。流動性組成物である本剤は、例えば、有効成分として、流動性を有する、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を含み、全体としても流動性を有する組成物であることとしてもよいし、有効成分として、流動性を有しない、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上を含み、全体としては流動性を有する組成物（例えば、当該流動性を有しない有効成分と、流動性を有する他の成分（溶媒等）との混合物）であることとしてもよい。 The shape of the agent is not particularly limited and may be any shape such as solid, gel, liquid, etc., but the agent is preferably a fluid composition. That is, in this case, since this agent has fluidity, it is excellent in operability when administered to an affected area of a patient, and as a result, effectively promotes bone formation in the affected area. This agent, which is a fluid composition, contains, as an active ingredient, for example, one or more selected from the group consisting of GPR81 ligands, agonists and precursors having fluidity, and has fluidity as a whole. A composition which may be a composition, and contains at least one selected from the group consisting of a ligand, an agonist and a precursor of GPR81, which does not have fluidity as an active ingredient, and has fluidity as a whole It is good also as being a thing (For example, the mixture of the active ingredient which does not have the said fluidity | liquidity, and the other components (solvent etc.) which have fluidity | liquidity).
具体的に、本剤は、例えば、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体を有効成分として含む流動性組成物であることとしてもよい。この場合、本剤は、患者の患部に投与する際の操作性に優れ、且つ当該患部において、リガンド及び／又はアゴニストを効果的に徐放することにより、骨形成を効果的に促進する。 Specifically, the present agent may be a fluid composition containing, as an active ingredient, a polymer of a component containing a ligand or an agonist, for example. In this case, the agent is excellent in operability when administered to the affected area of a patient, and effectively promotes bone formation by effectively releasing the ligand and / or agonist in the affected area.
さらに、本剤は、上記（ａ）及び／又は（ｂ）を満たす、リガンド又はアゴニストを含む成分の重合体等、それ自身が流動性を有する重合体を有効成分として含む流動性組成物であることとしてもよい。 Furthermore, the present agent is a fluid composition containing, as an active ingredient, a polymer that itself has fluidity, such as a polymer of a component containing a ligand or an agonist that satisfies the above (a) and / or (b). It is good as well.
ただし、本剤は、上述のとおり、それ自身が流動性を有しない重合体を有効成分として含む流動性組成物であってもよい。具体的に、本剤は、固形状の重合体の微粒子を有効成分として含む流動性組成物（例えば、当該固形状の重合体の微粒子と、他の液状成分（例えば、溶媒）とを含む懸濁液である流動性組成物）であってもよい。 However, as described above, the agent may be a fluid composition containing a polymer that does not have fluidity as an active ingredient. Specifically, the agent contains a fluid composition containing, as an active ingredient, solid polymer fine particles (for example, a solid polymer fine particle and other liquid components (eg, a solvent)). It may be a fluid composition which is a turbid liquid.
本剤は、本発明の効果を損なわない範囲内において、上述した有効成分以外の成分を含むこととしてもよい。具体的に、本剤は、薬理学的に許容される各種の材料、例えば、担体、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤及び骨補填材からなる群より選択される１以上をさらに含んでもよい。骨補填材は特に限られないが、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムセメント及びβ−リン酸三カルシウムからなる群より選択される１以上が使用されてもよい。 This agent is good also as containing components other than the active ingredient mentioned above in the range which does not impair the effect of this invention. Specifically, the agent is one or more selected from the group consisting of various pharmacologically acceptable materials, such as carriers, lubricants, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and bone filling materials. May further be included. The bone filling material is not particularly limited, and for example, one or more selected from the group consisting of hydroxyapatite, calcium phosphate cement, and β-tricalcium phosphate may be used.
本剤の剤形は、当該本剤に含まれる有効成分の特性や、当該本剤の投与方法等の条件に応じて適宜設計されれば特に限られず、例えば、液剤（溶液、懸濁液、エマルジョン等を含む）、注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、カプセル剤、徐放剤、リポソーム製剤であることとしてもよい。 The dosage form of this agent is not particularly limited as long as it is appropriately designed according to the characteristics of the active ingredient contained in the agent and the conditions such as the administration method of the agent, for example, liquid agents (solutions, suspensions, Emulsions, etc.), injections, powders, granules, tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), capsules, sustained-release agents, and liposome preparations.
本剤を患者の骨形成の促進が必要な部位に投与する方法として、例えば、注射器等の注入器具を使用して当該部位に本剤を注入する方法、及び／又は切開された当該部位に本剤を埋め込む方法が挙げられる。また、状況に応じて、骨形成の促進が必要な部位の近傍に投与してもよい。患者に対する負担を軽減する観点からは、切開を伴わない注入による投与方法を用いることが望ましい。 As a method of administering this agent to a site where it is necessary to promote bone formation of a patient, for example, a method of injecting this agent into the site using an injection device such as a syringe and / or a method of injecting the agent into the incised site. The method of embedding an agent is mentioned. Moreover, you may administer to the vicinity of the site | part which needs promotion of bone formation according to a condition. From the viewpoint of reducing the burden on the patient, it is desirable to use an administration method by injection without incision.
この点、本剤は、注入用組成物であることが好ましい。注入用組成物である本剤の剤形は、ゲル状、液状又は懸濁液が好ましい。すなわち、本剤は、注入用の流動性組成物であることが好ましい。この場合、本剤は、上述した流動性組成物であって、且つ患者の患部に注入される組成物である。具体的に、本剤は、例えば、それ自身が流動性を有する重合体を有効成分として含む、ゲル状又は液状の注入用流動性組成物であることとしてもよい。また、本剤は、例えば、固形状の重合体（それ自身は流動性を有しない重合体）の微粒子を含む懸濁液である、注入用流動性組成物であることとしてもよい。 In this regard, the agent is preferably an injection composition. The dosage form of the present agent which is an injection composition is preferably a gel, liquid or suspension. That is, this agent is preferably a fluid composition for injection. In this case, this agent is a fluid composition as described above, and is a composition that is injected into the affected area of a patient. Specifically, the present agent may be, for example, a gel or liquid flowable composition for injection containing a polymer having flowability as an active ingredient. Moreover, this agent is good also as a fluid composition for injection | pouring which is a suspension containing the microparticles | fine-particles of a solid polymer (polymer which does not have fluidity itself), for example.
また、本実施形態は、流動性組成物又は注入用組成物である本剤を収容するリザーバ部と、当該リザーバ部の当該本剤を患者の患部に注入する注入部と、を備えた骨形成促進装置（以下、「本装置」という。）を含む。すなわち、この場合、本装置を用いた注入により、本剤を患者の患部に投与する。 In addition, the present embodiment provides a bone formation comprising a reservoir portion that contains the present agent that is a fluid composition or an injectable composition, and an injection portion that injects the present agent in the reservoir portion into an affected area of a patient. Includes a promotion device (hereinafter referred to as “this device”). That is, in this case, the agent is administered to the affected area of the patient by injection using the apparatus.
本装置を用いた投与における本剤の供給方法は、患部における骨形成が促進される限りにおいて、連続的供給であってもよいし、間欠的供給であってもよい。すなわち、本装置が、本剤を収容するタンク又はバッグを含むリザーバ部と、一方端が当該リザーバ部に接続され、他方の先端部に注射針等の挿入部を備えた送液管を含む注入部とを備える場合、当該注射針を患部に挿入して、重力を利用した自然落下により、本剤を連続的に当該患部に供給することとしてもよい。 As long as bone formation in the affected area is promoted, the supply method of this agent in administration using this apparatus may be continuous supply or intermittent supply. That is, the injection device includes a reservoir unit including a tank or bag for storing the agent, and a liquid supply tube having one end connected to the reservoir unit and the other end having an insertion unit such as an injection needle. When this part is provided, the injection needle may be inserted into the affected part, and this agent may be continuously supplied to the affected part by natural fall using gravity.
また、本装置が、さらに輸液ポンプ等の送液機器を含む注入部を備える場合には、当該送液機器を作動させることにより、本剤を連続的に又は間欠的に当該患部に供給することとしてもよい。 In addition, when the device further includes an injection part including a liquid delivery device such as an infusion pump, the agent is continuously or intermittently supplied to the affected area by operating the liquid delivery device. It is good.
注入部は、患部における本剤の拡散度、本剤の供給方法等の諸条件を考慮して、形状、材質等を適宜選択することが望ましい。例えば、ノズルの先端にスポンジ状のものを取り付けてもよい。先端部を長期に体内に留置するときは、生分解性の材質のものを用いてもよい。本装置に用いる各機器は、医療用のものから選択することが好ましい。また、注入時に必要に応じて適度に加温することも好ましい。 It is desirable to select the shape, material, etc. of the injection part as appropriate in consideration of various conditions such as the degree of diffusion of this drug in the affected area and the method for supplying this drug. For example, a sponge-like object may be attached to the tip of the nozzle. When the tip is left in the body for a long time, a biodegradable material may be used. Each device used in the apparatus is preferably selected from medical devices. Moreover, it is also preferable to warm appropriately as needed at the time of injection | pouring.
本剤の作用機序の詳細は明らかではないが、後述の実施例で示すように、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト又はこれらの前駆体が骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用することによって、石灰化が促進されるものと推定される。したがって、本剤は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞に作用し、石灰化を促進する化合物を有効成分として含有する骨形成促進剤であって、当該化合物がＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト及びこれらの前駆体からなる群より選択される１以上であることを特徴とするものである、ともいえる。骨芽細胞に分化し得る細胞に関しては、ＧＰＲ８１のリガンド、アゴニスト又はこれらの前駆体が当該細胞の分化・成熟にも関与している可能性が考えられる。ここで、骨芽細胞に分化し得る細胞としては、骨芽細胞への分化能を有する細胞であれば特に限られず、例えば、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞及び筋芽細胞からなる群より選択される１種以上であることとしてもよい。 Although the details of the mechanism of action of this drug are not clear, as shown in the examples below, GPR81 ligands, agonists or precursors thereof act on osteoblasts or cells that can differentiate into osteoblasts. Thus, it is estimated that calcification is promoted. Therefore, the present agent is an osteogenesis promoting agent containing as an active ingredient a compound that acts on osteoblasts or cells that can differentiate into osteoblasts and promotes calcification, and the compound is a GPR81 ligand, agonist And at least one selected from the group consisting of these precursors. Regarding cells that can differentiate into osteoblasts, it is possible that a ligand, agonist or precursor thereof of GPR81 is also involved in the differentiation / maturation of the cells. Here, cells that can differentiate into osteoblasts are not particularly limited as long as they have the ability to differentiate into osteoblasts. For example, osteoprogenitor cells, mesenchymal stem cells, stromal cells, and myoblasts It is good also as being 1 or more types selected from the group which consists of.
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例においては、特に断らない限り％は全て質量％を示す。また、以下に示すグラフにおいて、「*」は有意水準５％未満、「**」は有意水準１％未満、「***」は有意水準０．１％未満での有意差を示す（Studentのt検定）。以下に示すグラフにおいて比較対象の図示が無い場合は、Control群との間に有意差があったことを示す。 Next, specific examples according to the present embodiment will be described. In addition, this invention is not limited to the Example shown below. In the following examples, all percentages are by mass unless otherwise specified. In the graphs below, “*” indicates a significance level of less than 5%, “**” indicates a significance level of less than 1%, and “***” indicates a significance level of less than 0.1% (Student T test). In the graph shown below, when the comparison target is not shown, it indicates that there was a significant difference from the Control group.
［試験１：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］骨芽細胞として、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を用いて、Ｌ−乳酸が石灰化に及ぼす影響について検討した。試験には、２４ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数は、１×１０４個とした。 [Test 1: Cell culture test / Promoting calcification / L-lactic acid / MC3T3-E1 cell] The effect of L-lactic acid on calcification was examined using mouse osteoblast cell line MC3T3-E1 as an osteoblast. . A 24-well plate was used for the test, and the number of cells per well was 1 × 10 4 .
培地として、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸と、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを添加したα−ＭＥＭを用いた。この培地に、Ｌ−乳酸を終濃度が４０ｍＭとなるように添加するとともに、ｐＨを、インキュベーター内での５％ＣＯ２の気相下で平衡化した時に、血中の正常範囲である７．４になるように１０Ｎ水酸化ナトリウムで調整後、１０％ウシ胎児血清を添加して使用した（以下の試験でも同様）。なお、Ｌ−乳酸の４０ｍＭという濃度は、ヒトの静脈血中におけるＬ−乳酸の正常値上限である２ｍＭ（１８ｍｇ／ｄＬ）よりも高濃度である。 As the medium, α-MEM supplemented with 50 μg / mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate, and 10 mM HEPES was used. When L-lactic acid is added to this medium to a final concentration of 40 mM and the pH is equilibrated in a gas phase of 5% CO 2 in an incubator, it is in the normal range in blood. After adjusting with 10N sodium hydroxide so that it became 4, 10% fetal bovine serum was added and used (the same applies to the following tests). The concentration of L-lactic acid at 40 mM is higher than 2 mM (18 mg / dL), which is the upper limit of the normal value of L-lactic acid in human venous blood.
マルチウエル培養プレート（24well）の各ウェル内の骨芽細胞における石灰化部分を、培養２１日後にはAlizarin Red S染色により、また、培養２４日後にはvon Kossa染色により、それぞれ１ウェルあたりの染色強度で評価した。一方、比較例として、Ｌ−乳酸以外の有機酸の作用を調べるため、乳酸脱水素酵素によって乳酸と相互変換の関係にあるピルビン酸（終濃度４０ｍＭ）をＬ−乳酸に代えて添加した以外は同様にして調製された培地も使用した。また、他の比較例として、Ｌ−乳酸及びピルビン酸のいずれも添加しない以外は同様にして調製された培地（Control）も使用した（以下の試験でも同様）。
Calcified portions of osteoblasts in each well of a multiwell culture plate (24 well) were stained per well by Alizarin Red S staining after 21 days of culture and von Kossa staining after 24 days of culture. The strength was evaluated. On the other hand, as a comparative example, in order to investigate the action of an organic acid other than L-lactic acid, pyruvic acid (
図２Ａには、石灰化部分を染色した結果を示す。図２Ｂには、図２Ａに示すAlizarin Red S染色された石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す（各群の試験数は３個）。この定量化は、染色後のウェルをデジタルカメラで撮影して得られた写真を、デンシトメーターで数値化することにより行った。図２Ｂにおいて、縦軸は、Controlを１としたときの相対値である（以下の同様のグラフにおいても同じ）。 FIG. 2A shows the result of staining the calcified portion. FIG. 2B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion stained with Alizarin Red S shown in FIG. 2A (the number of tests in each group is 3). This quantification was performed by digitizing a photograph obtained by photographing the well after staining with a digital camera using a densitometer. In FIG. 2B, the vertical axis represents the relative value when Control is set to 1 (the same applies to the following similar graphs).
図２Ａ及び図２Ｂより、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）ではControl群に比べて有意に高い石灰化促進が認められた。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸が石灰化を促進することが確認された。これに対し、ピルビン酸添加群（ＰＡ）ではむしろ石灰化が抑制された。 From FIG. 2A and FIG. 2B, the calcification promotion significantly higher was recognized in the L-lactic acid addition group (LA) compared with the Control group. That is, it was confirmed that L-lactic acid promotes calcification in MC3T3-E1 cells. On the other hand, calcification was rather suppressed in the pyruvic acid addition group (PA).
［試験２：細胞培養試験／石灰化促進／α−ヒドロキシ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］培地にＬ−乳酸に代えてα−ヒドロキシ酪酸を添加した以外は、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。培地におけるα−ヒドロキシ酪酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、試験１と同様に、Ｌ−乳酸を終濃度４０ｍＭで添加した培地を使用してＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した（Ｌ−乳酸添加群）。培養２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色にて評価した（以下の試験では、同様に、石灰化の評価として、Alizarin Red S染色を用いた。）。
[Test 2: Cell culture test / Acceleration of calcification / α-hydroxybutyric acid / MC3T3-E1 cells] MC3T3-E1 under the same conditions as in
図３Ａには、石灰化部分を染色した結果を示す。図３Ｂには、図２Ｂと同様に、図３Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図３Ａ及び図３Ｂより、α−ヒドロキシ酪酸（α−ＨＢ）の４０ｍＭ添加群では、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同等の高い石灰化促進が認められた。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸が石灰化を促進することが確認された。 FIG. 3A shows the result of staining the calcified portion. FIG. 3B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 3A as in FIG. 2B. From FIG. 3A and FIG. 3B, in the 40 mM addition group of (alpha) -hydroxybutyric acid ((alpha) -HB), the high calcification promotion equivalent to the L-lactic acid addition group (LA) was recognized. That is, it was confirmed that L-lactic acid and α-hydroxybutyric acid promote calcification in MC3T3-E1 cells.
［試験３．細胞培養試験／コラーゲン合成／Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞において、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がコラーゲン合成に及ぼす影響について検討した。試験には、６ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数を４×１０４個とした以外は、試験１と同様の条件で試験を行った。なお、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸の終濃度はそれぞれ４０ｍＭとした。
[
Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の添加１２日後のコラーゲン発現量をウェスタンブロット法により調べた。なお、ＧＡＰＤＨをloading controlとして用いた。 The expression level of collagen 12 days after the addition of L-lactic acid or α-hydroxybutyric acid was examined by Western blotting. GAPDH was used as loading control.
図４Ａには、ウェスタンブロット法で得られたバンドの画像を示す。図４Ｂには、図４Ａに示すＩ型コラーゲンのバンドを定量化した結果を示す。図４Ｃには、図４Ａに示すＩＩＩ型コラーゲンのバンドを定量化した結果を示す。 FIG. 4A shows an image of a band obtained by Western blotting. FIG. 4B shows the result of quantifying the type I collagen band shown in FIG. 4A. FIG. 4C shows the result of quantifying the type III collagen band shown in FIG. 4A.
図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃより、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸添加群（α−ＨＢ）のいずれにおいても、Control群に比べて、Ｉ型コラーゲン、及びＩ型コラーゲン線維形成の足場として先行して合成されるＩＩＩ型コラーゲンの発現量が有意に高かった。この結果より、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がそれぞれ骨芽細胞によるコラーゲン合成を促進することが確認された。 From FIG. 4A, FIG. 4B, and FIG. 4C, in both the L-lactic acid addition group (LA) and the α-hydroxybutyric acid addition group (α-HB), type I collagen and type I collagen fibers are compared to the control group. The expression level of type III collagen synthesized earlier as a scaffold for formation was significantly high. From this result, it was confirmed that L-lactic acid and α-hydroxybutyric acid each promote collagen synthesis by osteoblasts.
骨組織においては特にＩ型コラーゲンが多く存在し、コラーゲンが石灰化の基質になるなど骨形成においてコラーゲンが重要な役割を果たしていることが知られている。上述の結果より、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸による石灰化機序の１つとして、コラーゲン合成の促進が寄与しているものと考えられた。 It is known that collagens play an important role in bone formation, especially in bone tissue where a large amount of type I collagen exists and collagen becomes a calcification substrate. From the above results, it was considered that promotion of collagen synthesis contributed as one of the calcification mechanisms by L-lactic acid and α-hydroxybutyric acid.
［試験４：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸／ＳＴ２細胞］ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に代えて、当該ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞より未分化なマウス骨髄間質細胞株ＳＴ２を用いた以外は試験１と同様の条件で試験を行った。ただし、ピルビン酸添加の試験例は設けなかった。また、ＳＴ２細胞は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に比べると石灰化速度が遅いため、添加４０日後に石灰化を評価した。
[Test 4: Cell culture test / promoting mineralization / L-lactic acid / ST2 cell]
図５Ａには、石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図５Ｂには、図５Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図５Ａ及び図５Ｂより、ＳＴ２細胞においても、Ｌ−乳酸添加群（１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ）において、Control群に比べて有意に高い石灰化促進が認められた。この結果より、骨芽細胞だけでなく、骨芽細胞に分化し得る細胞においても、Ｌ−乳酸によって石灰化が促進されることが確認された。 FIG. 5A shows the result of staining the calcified portion with Alizarin Red S. FIG. 5B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 5A. From FIG. 5A and FIG. 5B, significantly higher calcification promotion was recognized also in ST2 cells in the L-lactic acid addition group (10 mM, 20 mM, 40 mM) compared with the Control group. From these results, it was confirmed that L-lactic acid promotes calcification not only in osteoblasts but also in cells that can differentiate into osteoblasts.
［試験５＆６：細胞培養試験／骨芽細胞における石灰化促進の作用機序の検証］骨芽細胞に乳酸が作用する経路として、ＭＣＴ１（Monocarboxylate Transporter 1)とＧＰＲ８１とがある。そこで、ＭＣＴ１及びＧＰＲ８１のいずれが石灰化促進に関与しているかについて検証した。 [Tests 5 and 6: Cell culture test / verification of action mechanism for promoting calcification in osteoblasts] MCT1 (Monocarboxylate Transporter 1) and GPR81 are pathways through which lactic acid acts on osteoblasts. Therefore, it was verified which of MCT1 and GPR81 is involved in calcification promotion.
［試験５：ＭＣＴ１に関する検証］まず、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ１の存在を確認するために、ウェスタンブロットを行った。図６Ａには、ウェスタンブロット法で得られたバンドの画像を示す。図６Ｂには、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＭＣＴ遺伝子発現量を逆転写後にリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）にて定量化した結果を示す。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞においてＭＣＴ１の存在が確認された。 [Test 5: Verification for MCT1] First, Western blot was performed to confirm the presence of MCT1 in MC3T3-E1 cells. FIG. 6A shows an image of a band obtained by Western blotting. FIG. 6B shows the results of quantifying the MCT gene expression level in MC3T3-E1 cells by reverse transcription and real-time PCR (RT-qPCR). As shown in FIGS. 6A and 6B, the presence of MCT1 was confirmed in MC3T3-E1 cells.
次に、ＭＣＴ１のインヒビターであるＣＨＣ(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に作用させた以外は、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養し、Ｌ−乳酸添加２１日後にAlizarin Red S染色を行った。なお、Ｌ−乳酸の終濃度は４０ｍＭとした。
Next, MC3T3-E1 cells were cultured under the same conditions as in
図７Ａには、Ｌ−乳酸添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図７Ｂには、図７Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図７Ａ及び図７Ｂより、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果のＣＨＣ添加による阻害は小さかった。よって、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果は、ＭＣＴ１を介したものである可能性が小さいことが示唆された。 FIG. 7A shows the result of staining the calcified portion with Alizarin Red S 21 days after the addition of L-lactic acid. FIG. 7B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 7A. From FIG. 7A and FIG. 7B, the inhibition by the CHC addition of the calcification promotion effect by L-lactic acid was small. Therefore, it was suggested that the calcification promoting effect by L-lactic acid is less likely to be via MCT1.
［試験６−１：ｃＡＭＰを用いたＧＰＲ８１に関する検証］ＧＰＲ８１に乳酸が作用すると、細胞内ではAdenylyl Cyclase活性の低下によりＡＴＰからのｃＡＭＰへの代謝が抑制され、その結果として細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下することが知られている。そこで、ｃＡＭＰとしてｃＡＭＰの細胞膜透過型アナログであるＣＰＴ−ｃＡＭＰを用いることにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を維持させた場合に、乳酸による石灰化促進作用が減弱される可能性について検証した。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内にＣＰＴ−ｃＡＭＰを導入した後、試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。なお、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸の終濃度は、それぞれ４０ｍＭとした。
[Test 6-1: Verification of GPR81 using cAMP] When lactic acid acts on GPR81, the metabolism of ATP to cAMP is suppressed by the decrease in Adenylyl Cyclase activity in the cell, resulting in a decrease in intracellular cAMP concentration. It is known to do. Then, when CPT-cAMP which is a cell membrane permeation | transmission type | mold analog of cAMP was used as cAMP, when the intracellular cAMP density | concentration was maintained, possibility that the calcification promotion effect by lactic acid was attenuated was verified. That is, after introducing CPT-cAMP into MC3T3-E1 cells, MC3T3-E1 cells were cultured under the same conditions as in
図８Ａには、Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図８Ｂには、図８Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。 FIG. 8A shows the result of staining the calcified portion with Alizarin Red S 21 days after the addition of L-lactic acid or α-hydroxybutyric acid. FIG. 8B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 8A.
図８Ａ及び図８Ｂより、ＣＰＴ−ｃＡＭＰを導入した系において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸添加群（α−ＨＢ）の石灰化促進効果はControl群よりも有意に低かった。 From FIG. 8A and FIG. 8B, in the system which introduce | transduced CPT-cAMP, the mineralization promotion effect of the L-lactic acid addition group (LA) and the alpha-hydroxybutyric acid addition group (alpha-HB) was significantly lower than the Control group. .
［試験６−２：ＧＰＲ８１の発現減少による検証］試験５及び試験６−１によって、Ｌ−乳酸による石灰化促進効果はＧＰＲ８１を介したものである可能性が示唆されたが、さらにＧＰＲ８１の関与を確かめるため、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）により制御されるＲＮＡ干渉法を用いて検証した。すなわち、ＤｏｘによってＧＰＲ８１に対するｓｈＲＮＡを発現させるためのｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築し、これをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に導入し、ｓｈＲＮＡが安定発現するクローン細胞株（ＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞）を作製した。得られたＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞は、Ｄｏｘ添加時にのみＧＰＲ８１の発現が低下する反応を示すことも確認した。
[Test 6-2: Verification due to decreased expression of GPR81]
ＧＰＲ８１−ｓｈＲＮＡ細胞を用いて、Ｄｏｘの存在下又は非存在下におけるＬ−乳酸による石灰化促進効果について、試験１と同様の条件で試験を行った。なお、Ｌ−乳酸の終濃度は４０ｍＭとした。
Using GPR81-shRNA cells, the calcification promoting effect by L-lactic acid in the presence or absence of Dox was tested under the same conditions as in
図９Ａには、Ｌ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図９Ｂには、図９Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。 FIG. 9A shows the results of staining the calcified portion with Alizarin Red S 21 days after the addition of L-lactic acid. FIG. 9B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 9A.
図９Ａ及び図９Ｂより、Ｄｏｘ非存在下のＬ−乳酸添加群（Ｄｏｘ：−、ＬＡ：＋）では有意な石灰化促進効果が認められた。これに対し、Ｄｏｘ存在下のＬ−乳酸添加群（Ｄｏｘ：＋、ＬＡ：＋）では石灰化促進効果が認められなかった。 From FIG. 9A and FIG. 9B, the significant calcification promotion effect was recognized in the L-lactic acid addition group (Dox:-, LA: +) in the absence of Dox. On the other hand, in the L-lactic acid addition group (Dox: +, LA: +) in the presence of Dox, the calcification promoting effect was not recognized.
試験５、試験６−１及び試験６−２の結果より、Ｌ−乳酸による石灰化促進は、ＭＣＴ１を介したＬ−乳酸の細胞内への取り込みではなく、Ｌ−乳酸がＧＰＲ８１に作用して起こったものであることが確認された。
From the results of
［試験７：細胞培養試験／石灰化促進／α−ヒドロキシイソ酪酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてα−ヒドロキシイソ酪酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。α−ヒドロキシイソ酪酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ又は８０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
[Test 7: Cell culture test / promoting calcification / α-hydroxyisobutyric acid / MC3T3-E1 cells] MC3T3-E1 cells under the same conditions as in
図１０Ａには、α−ヒドロキシイソ酪酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１０Ｂには、図１０Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。 FIG. 10A shows the results of staining the calcified portion with Alizarin Red S 21 days after the addition of α-hydroxyisobutyric acid or L-lactic acid. FIG. 10B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 10A.
図１０Ａ及び図１０Ｂより、２０ｍＭ〜８０ｍＭのα−ヒドロキシイソ酪酸添加群（α−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められ、当該石灰化促進効果は、特に４０ｍＭにおいて顕著であった。 From FIG. 10A and FIG. 10B, in the 20 mM to 80 mM α-hydroxyisobutyric acid added group (α-Hydroxyisobutyric Acid), a significant calcification promoting effect was recognized as compared to the Control group, similar to the L-lactic acid added group (LA). The calcification promoting effect was particularly remarkable at 40 mM.
［試験８：細胞培養試験／石灰化促進／グリコール酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてグリコール酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。グリコール酸の終濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ又は８０ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
[Test 8: Cell culture test / promoting mineralization / glycolic acid / MC3T3-E1 cells] MC3T3-E1 cells were cultured under the same conditions as in
図１１Ａには、グリコール酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１１Ｂには、図１１Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。 FIG. 11A shows the result of Alizarin Red S staining of the calcified portion 21 days after addition of glycolic acid or L-lactic acid. FIG. 11B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 11A.
図１１Ａ及び図１１Ｂより、１０ｍＭ及び２０ｍＭのグリコール酸添加群（Ｇｌｙｃｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められ、当該石灰化促進効果は、特に２０ｍＭにおいて顕著であった。 From FIG. 11A and FIG. 11B, in the 10 mM and 20 mM glycolic acid added groups (Glycolic Acid), as in the L-lactic acid added group (LA), a significant calcification promoting effect was recognized compared to the Control group. The effect was particularly pronounced at 20 mM.
［試験９．細胞培養試験／石灰化促進／マレイン酸／ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞］Ｌ−乳酸に代えてマレイン酸を使用した以外は試験１と同様の条件でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を培養した。マレイン酸の終濃度は、０．６３ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ又は５ｍＭとした。また、ポジティブコントロールとして、Ｌ−乳酸添加群（終濃度：４０ｍＭ）についても試験を行った。
[Test 9. Cell culture test / promoting mineralization / maleic acid / MC3T3-E1 cells] MC3T3-E1 cells were cultured under the same conditions as in
図１２Ａには、マレイン酸又はＬ−乳酸の添加２１日後に石灰化部分をAlizarin Red S染色した結果を示す。図１２Ｂには、図１２Ａに示す石灰化部分における染色の強さを定量化した結果を示す。図１２Ａ及び図１２Ｂより、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ及び５ｍＭのマレイン酸添加群（Ｍａｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）において、Ｌ−乳酸添加群（ＬＡ）と同様、Control群よりも有意な石灰化促進効果が認められた。 FIG. 12A shows the result of Alizarin Red S staining of the calcified portion 21 days after the addition of maleic acid or L-lactic acid. FIG. 12B shows the result of quantifying the intensity of staining in the calcified portion shown in FIG. 12A. From FIG. 12A and FIG. 12B, in the 1.25 mM, 2.5 mM and 5 mM maleic acid addition groups (Male Acid), a significant calcification promoting effect was recognized as compared to the Control group, as in the L-lactic acid addition group (LA). It was.
［試験１０：細胞培養試験／石灰化促進／Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸／ＳａＭ−１細胞］骨芽細胞として、ヒト骨芽細胞株ＳａＭ−１を用いて、Ｌ−乳酸及びα−ヒドロキシ酪酸がヒト骨芽細胞における石灰化に及ぼす影響について検討した。試験には、２４ウェルプレートを用い、１ウェル当たりの細胞数は、３×１０４個とした。 [Test 10: Cell culture test / promoting calcification / L-lactic acid and α-hydroxybutyric acid / SaM-1 cell] As an osteoblast, human osteoblast cell line SaM-1 was used, and L-lactic acid and α-hydroxy were used. The effect of butyric acid on calcification in human osteoblasts was investigated. In the test, a 24-well plate was used, and the number of cells per well was 3 × 10 4 .
なお、ＳａＭ−１細胞は、東京都老人総合研究所の腰原康子氏が樹立したヒト骨芽細胞株である。本試験では、愛知学院大学歯学部薬理学の戸苅彰史氏より分与されたＳａＭ−１細胞を使用した。 SaM-1 cells are a human osteoblast cell line established by Yasuko Koshihara of the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. In this test, SaM-1 cells distributed by Aki Gakuin University School of Dentistry, Department of Pharmacology, Toshiaki Akashi were used.
培地として、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸と、１０ｍＭのβ-グリセロリン酸と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳとを添加したα−ＭＥＭを用いた。この培地に、Ｌ−乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸を終濃度が２０ｍＭ又は４０ｍＭとなるように添加するとともに、ｐＨを、インキュベーター内での５％ＣＯ２の気相下で平衡化した時に、血中の正常範囲である７．４になるように１０Ｎ水酸化ナトリウムで調整後、１０％ウシ胎児血清を添加して使用した。 As the medium, α-MEM supplemented with 50 μg / mL ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate, and 10 mM HEPES was used. When L-lactic acid or α-hydroxybutyric acid was added to this medium to a final concentration of 20 mM or 40 mM, and the pH was equilibrated in a gas phase of 5% CO 2 in an incubator, After adjusting with 10N sodium hydroxide so as to be 7.4, which is the normal range, 10% fetal bovine serum was added and used.
図１３Ａには、石灰化部分をAlizarin Red S染色した後の培養ＳａＭ−１細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図１３Ｂには、図１３Ａに示す位相差顕微鏡画像において石灰化部分を示すノズール（nodule）の数をウェルあたりでカウントした結果を示す。図１３Ａ及び図１３Ｂより、Ｌ−乳酸（ＬＡ）及びα−ヒドロキシ酪酸（α−ＨＢ）のいずれもが、ヒト骨芽細胞における石灰化を促進することが確認された。 FIG. 13A shows a phase contrast micrograph of cultured SaM-1 cells after the calcified portion is stained with Alizarin Red S. FIG. 13B shows the result of counting the number of nodule indicating a calcified portion per well in the phase contrast microscope image shown in FIG. 13A. 13A and 13B confirmed that both L-lactic acid (LA) and α-hydroxybutyric acid (α-HB) promote calcification in human osteoblasts.
［細胞培養試験のまとめ］以上の骨芽細胞を用いた細胞培養試験によって、ＧＰＲ８１の様々なリガンドが、当該骨芽細胞における石灰化及びコラーゲン合成を促進することが確認された。 [Summary of Cell Culture Test] From the above cell culture test using osteoblasts, it was confirmed that various ligands of GPR81 promote mineralization and collagen synthesis in the osteoblasts.
［試験１１：動物実験（１）／重合体を用いた骨再生試験］まずＬ−乳酸の重合体を作製した。すなわち、温度計、窒素導入管を備えた内容積１００ｍＬの反応容器に、Ｌ−乳酸（Ｐｕｒａｃ製）６０ｇを加え、２００ｍＬ／分の窒素気流下、１８５℃で１時間重合化反応させた。その後、得られた重合体を、その濃度が１０ｗ／ｖ％となるようにアセトンに溶解し、体積比で約４倍量のヘキサン中で析出させることにより精製処理を行い、ポリＬ−乳酸（以下「ＰＬ１」という）４８ｇを得た。ＰＬ１をＧＰＣ法によって測定したところ、数平均分子量は５１０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２）であった。ＰＬ１は、粘性のあるゲル状であり、流動性を有する組成物であった。 [Test 11: Animal experiment (1) / Bone regeneration test using polymer] First, a polymer of L-lactic acid was prepared. That is, 60 g of L-lactic acid (manufactured by Purac) was added to a reaction vessel having an internal volume of 100 mL equipped with a thermometer and a nitrogen introduction tube, and a polymerization reaction was performed at 185 ° C. for 1 hour in a nitrogen stream of 200 mL / min. Thereafter, the obtained polymer is dissolved in acetone so that the concentration becomes 10 w / v%, and purified in a volume ratio of about 4 times by volume in hexane to obtain a poly L-lactic acid ( 48 g) was obtained. When PL1 was measured by the GPC method, the number average molecular weight was 510 (Mw / Mn = 1.2). PL1 was a viscous gel and a fluid composition.
図１４には、ＧＰＣ法による測定で得られたＰＬ１のクロマトグラムを示す。ＰＬ１について、図１４に示すクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合は、９９．６％であった。この面積の割合は、ＧＰＣ測定装置に内蔵の方法によって求めた。すなわち、ＧＰＣ測定装置による上記面積の割合の算出方法の概要は次のとおりである：（ｉ）まず、ポリスチレン基準物質により作成された校正曲線において、分子量２５０に該当する溶出時間及び分子量２０００に該当する溶出時間を取得する；、及び（ｉｉ）次いで、測定対象のポリマーについて得られたクロマトグラムにおいて、上記（ｉ）で取得した２つの溶出時間の各々と一致する溶出時間を取得し、（ｉｉｉ）さらに、当該クロマトグラム上の当該２つの溶出時間の垂線で区切られた部分の面積を全面積で除することにより、上記面積の割合を算出する。 FIG. 14 shows a chromatogram of PL1 obtained by measurement by the GPC method. About PL1, the ratio of the area of the range of molecular weight 250-2000 with respect to the total area in the chromatogram shown in FIG. 14 was 99.6%. The area ratio was obtained by a method built in the GPC measuring apparatus. That is, the outline of the method for calculating the above-mentioned area ratio by the GPC measurement device is as follows: (i) First, in the calibration curve created with the polystyrene reference material, the elution time corresponding to the molecular weight 250 and the molecular weight corresponding to 2000 And (ii) Next, in the chromatogram obtained for the polymer to be measured, an elution time corresponding to each of the two elution times obtained in (i) above is obtained, and (iii) ) Further, the ratio of the area is calculated by dividing the area of the portion separated by the perpendicular line of the two elution times on the chromatogram by the total area.
また、反応時間を１．５時間とした以外は、ＰＬ１の場合と同様にして、ポリＬ−乳酸（以下「ＰＬ２」という）４９ｇを得た。ＰＬ２の数平均分子量は９７０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４）であった。また、ＧＰＣ法による測定で得られたＰＬ２のクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合は、８１．１％であった。ＰＬ２は、脆い固体であった。 Further, 49 g of poly L-lactic acid (hereinafter referred to as “PL2”) was obtained in the same manner as in the case of PL1, except that the reaction time was 1.5 hours. The number average molecular weight of PL2 was 970 (Mw / Mn = 1.4). Moreover, the ratio of the area of the range of molecular weight 250-2000 with respect to the total area in the chromatogram of PL2 obtained by the measurement by GPC method was 81.1%. PL2 was a brittle solid.
なお、数平均分子量が１５７０（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）のポリＬ−乳酸も作製したが、当該ポリＬ−乳酸は硬い固体であったため、投与する上で必ずしも好ましくないとの判断により、使用しなかった。ただし、このように硬い固体のポリＬ−乳酸であっても、例えば、粉砕して微粒子とすることにより、投与することが可能である。 In addition, although poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 1570 (Mw / Mn = 1.5) was also prepared, since the poly L-lactic acid was a hard solid, it was determined that it was not necessarily preferable for administration. Not used. However, even such a hard solid poly-L-lactic acid can be administered, for example, by pulverizing into fine particles.
動物実験は、奥羽大学動物実験規程に従って実施した。エストロゲンの影響をできるだけ排除するために、閉経後の高齢雌ラット（ＳＤラット（日本クレア株式会社） 平均体重：４５５．９±９．５ｇ）を用いた。また、荷重負荷による骨形成の影響をできるだけ排除するために、頭蓋骨で試験を行った。 The animal experiment was conducted according to the rules of animal experiments at Ouha University. In order to eliminate the effect of estrogen as much as possible, postmenopausal elderly female rats (SD rats (CLEA Japan, Inc.) average body weight: 455.9 ± 9.5 g) were used. In order to eliminate as much as possible the effect of bone formation due to load loading, a test was conducted on the skull.
ラット９頭を用い、各ラットの頭蓋骨に歯科用ドリルで孔径２ｍｍの孔を空けた。３頭はControl群としてそのまま切開部を縫合して閉じた。残り６頭については、３頭の孔の近傍に０．１ｇのＰＬ１を埋め込み、他の３頭の孔の近傍に０．１ｇのＰＬ２を埋め込んだ後、それぞれ切開部を縫合して閉じた。なお、ＰＬ１は流動性を有していたが、注射器は使用せず、孔の近傍に埋め込んだ。固体の粒子であったＰＬ２は、そのまま孔の近傍に埋め込んだ。３０日後にラットを屠殺し、試験部位を肉眼及びＣＴ（東芝ＩＴコントロールシステム株式会社製 Ｘ線ＣＴ装置 TOSCANER 32251μhd）で評価した。 Nine rats were used, and a hole with a diameter of 2 mm was drilled in the skull of each rat with a dental drill. Three of the heads were closed as sutures as the Control group. For the remaining 6 heads, 0.1 g of PL1 was embedded in the vicinity of the holes of the 3 heads, and 0.1 g of PL2 was embedded in the vicinity of the holes of the other 3 heads, and then the incisions were sutured and closed. Although PL1 had fluidity, a syringe was not used and it was embedded in the vicinity of the hole. PL2 which was a solid particle was embedded in the vicinity of the hole as it was. After 30 days, the rats were sacrificed, and the test sites were evaluated with the naked eye and CT (X-ray CT apparatus TOSCANER 32251 μhd manufactured by Toshiba IT Control System Co., Ltd.).
肉眼による評価では、Control群のラットでは孔の大きさにほとんど変化が無く、骨形成、骨再生の痕跡がほとんど認められなかった。これに対し、ＰＬ１群とＰＬ２群のラットでは孔が粗造な石灰化物（新生骨の可能性も考えられた）によって塞がれており、また、孔の大きさも外周部からの骨形成、骨再生によって小さくなっていた。また、ＰＬ１群及びＰＬ２群において、ＰＬ１及びＰＬ２による切開部周辺組織の損傷は認められなかった。すなわち、例えば、ＰＬ１及びＰＬ２の分解によって周辺組織の局所ｐＨが急激に低下して細胞が損傷を受けたといった問題は認められなかった。 In the evaluation by the naked eye, the size of the hole was hardly changed in the rats of the Control group, and there was hardly any trace of bone formation or bone regeneration. On the other hand, in the rats of the PL1 group and the PL2 group, the hole is closed with a rough calcified product (possible possibility of new bone), and the size of the hole is the bone formation from the outer periphery, It was getting smaller with bone regeneration. Further, in the PL1 group and the PL2 group, damage to the tissue around the incision due to PL1 and PL2 was not observed. That is, for example, the problem that the local pH of the surrounding tissue rapidly decreased due to the degradation of PL1 and PL2 and the cells were damaged was not recognized.
図１５には、Control群、ＰＬ１を使用した例、及びＰＬ２を使用した例のそれぞれについて、ＣＴによる画像を示す。図１６には、図１５に示す画像における再生部分のＣＴ値をグラフ化した結果を示す。なお、Control群のＣＴ値は約７５であったが、これは軟組織等が埋入したためであった。図１６には、参考として、Control群、ＰＬ１を使用した例、及びＰＬ２を使用した例に加え、軟組織（Soft Tissue）及び骨（Bone）のそれぞれのＣＴ値も示す。 FIG. 15 shows CT images for each of the Control group, the example using PL1, and the example using PL2. FIG. 16 shows the graph of the CT value of the reproduction portion in the image shown in FIG. Note that the CT value of the Control group was about 75, which was due to the embedded soft tissue and the like. In FIG. 16, in addition to the control group, the example using PL1, and the example using PL2, each CT value of soft tissue (Soft Tissue) and bone (Bone) is also shown.
以上の動物実験の結果より、分解能の高い乳酸ポリマーによる骨形成、骨再生の作用効果が生体において認められた。 From the results of the above animal experiments, the effects of bone formation and bone regeneration by lactic acid polymers with high resolution were recognized in the living body.
［試験１２：動物実験（２）／重合体を用いた骨再生試験］まずＬ−乳酸の重合体を作製した。すなわち、試験１１と同様にして、図１７に示すように、ＧＰＣ法により測定される数平均分子量が異なる７種類のポリＬ−乳酸を得た。なお、図１７には、各ポリＬ−乳酸サンプルについて、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、当該数平均分子量（Ｍｎ）に対する当該重量平均分子量（Ｍｗ）の比率（Ｍｗ／Ｍｎ）、及びＧＰＣ法による測定で得られたクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合（％）を示す。 [Test 12: Animal experiment (2) / Bone regeneration test using polymer] First, a polymer of L-lactic acid was prepared. That is, as in Test 11, as shown in FIG. 17, seven types of poly L-lactic acid having different number average molecular weights measured by the GPC method were obtained. FIG. 17 shows the number average molecular weight (Mn), the weight average molecular weight (Mw), and the ratio of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) (Mw / Mn) for each poly L-lactic acid sample. ) And the ratio (%) of the area having a molecular weight in the range of 250 to 2,000 with respect to the total area in the chromatogram obtained by the measurement by the GPC method.
なお、図１７において、「Ｌ−１００−０．５」は、上述の試験１１で使用したＰＬ１と同一のポリＬ−乳酸であった。また、「Ｌ−１００−０．５」、「ＯＬＡ−１００１」、「ＯＬＡ−１００２」及び「ＯＬＡ−１００４」は、粘性のあるゲル状であり、流動性を有する組成物であった。「ＯＬＡ−１００１」は、分子量が２５０未満の割合が大きかったため、ＧＰＣ法による測定で得られたクロマトグラムにおける、全面積に対する、分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が比較的小さくなった。 In FIG. 17, “L-100-0.5” was the same poly L-lactic acid as PL1 used in Test 11 described above. Further, “L-100-0.5”, “OLA-1001”, “OLA-1002” and “OLA-1004” were viscous gel-like compositions having fluidity. Since the ratio of “OLA-1001” having a molecular weight of less than 250 was large, the ratio of the area having a molecular weight in the range of 250 to 2,000 with respect to the total area in the chromatogram obtained by measurement by the GPC method was relatively small.
動物実験は、試験１１と同様、奥羽大学動物実験規程に従って実施した。エストロゲンの影響をできるだけ排除するために、閉経後の高齢雌ラット（ＳＤラット（日本クレア株式会社） 平均体重：５３９．１±１１．２ｇ）を用いた。また、荷重負荷による骨形成の影響をできるだけ排除するために、頭蓋骨で試験を行った。 The animal experiment was carried out in accordance with the Oku University Animal Experiment Regulations as in Test 11. In order to eliminate the influence of estrogen as much as possible, postmenopausal elderly female rats (SD rats (CLEA Japan, Inc.) average body weight: 539.1 ± 11.2 g) were used. In order to eliminate as much as possible the effect of bone formation due to load loading, a test was conducted on the skull.
ラット４０頭を用い、各ラットの頭蓋骨に歯科用ドリルで孔径２ｍｍの孔を空けた。５頭はControl群としてそのまま切開部を縫合して閉じた。残り３５頭については、５頭ずつの７つのグループに分け、各グループにおいて、図１７に示す７種類のポリＬ−乳酸のそれぞれを、上述の試験１１と同様、５頭の孔の近傍に０．１ｇずつ投与した後、それぞれ切開部を縫合して閉じた。 Forty rats were used, and a hole with a diameter of 2 mm was drilled in the skull of each rat with a dental drill. Five heads were closed as sutures as the Control group. The remaining 35 heads are divided into 7 groups of 5 heads, and in each group, each of the 7 types of poly L-lactic acid shown in FIG. After administration of 1 g each, the incision was sutured and closed.
３０日後にラットを屠殺し、試験部位をｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）装置（ＳＴＲＡＴＥＣ社製、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ＋）で解析した。 After 30 days, the rats were sacrificed, and the test sites were analyzed with a pQCT (peripheral Quantitative Computated Tomography) apparatus (XTRA Research SA +, manufactured by STRATEC).
具体的に、各試験部位について、計測領域の体積（ＴＶ）に対する、当該計測領域における石灰化物の体積（ＢＶ）の割合（％）をＢＶ／ＴＶ値として算出した。試験部位が完全に閉塞された場合、ＢＶ／ＴＶ値は１００％となる。 Specifically, for each test site, the ratio (%) of the volume (BV) of the calcified product in the measurement region to the volume (TV) of the measurement region was calculated as a BV / TV value. If the test site is completely occluded, the BV / TV value is 100%.
なお、計測領域の体積（ＴＶ）は、試験部位における直径２．００ｍｍ、高さ１．７２ｍｍのシリンダー状領域の体積とした。また、ｐＱＣＴ解析においては、軟組織由来のバックグラウンドを考慮して、計測を行った。 The volume of the measurement area (TV) was the volume of a cylindrical area having a diameter of 2.00 mm and a height of 1.72 mm at the test site. In pQCT analysis, measurement was performed in consideration of the background derived from soft tissue.
図１８には、ｐＱＣＴ解析により算出されたＢＶ／ＴＶ値を示す。図１８において、「Ｃｏｎｔ」は、ポリＬ−乳酸を使用しなかったControl群の結果を示し、「Ｌ−１００−０．５」は、数平均分子量が５１０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００１」は、数平均分子量が３２０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００２」は、数平均分子量が４２０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００４」は、数平均分子量が５６０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００６」は、数平均分子量が７１０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００７」は、数平均分子量が７７０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示し、「ＯＬＡ−１００８」は、数平均分子量が８３０のポリＬ−乳酸を使用した例の結果を示す。 FIG. 18 shows BV / TV values calculated by pQCT analysis. In FIG. 18, “Cont” indicates the result of the Control group that did not use poly L-lactic acid, and “L-100-0.5” represents an example in which poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 510 was used. "OLA-1001" shows the result of an example using poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 320, and "OLA-1002" uses poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 420. "OLA-1004" shows the result of an example using poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 560, and "OLA-1006" shows poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 710. "OLA-1007" shows the result of an example using poly L-lactic acid having a number average molecular weight of 770, and "OLA-1008" shows the result of poly L having a number average molecular weight of 830. -Shows the results of an example using lactic acid The
図１８に示すように、ポリＬ−乳酸を投与しなかったControl群において、ＢＶ／ＴＶ値は、１．８７％〜６．２０％であった。これに対し、ポリＬ−乳酸を投与した例のＢＶ／ＴＶ値は、「Ｌ−１００−０．５」において１００％が１頭及び９８．９３％が１頭、「ＯＬＡ−１００１」において１００％が３頭、「ＯＬＡ−１００６」において１００％が２頭、「ＯＬＡ−１００８」において１００％が１頭であった。 As shown in FIG. 18, in the Control group to which poly L-lactic acid was not administered, the BV / TV value was 1.87% to 6.20%. On the other hand, the BV / TV value of the example in which poly-L-lactic acid was administered was 100% in “L-100-0.5”, one in 100% and one in 98.93%, and 100 in “OLA-1001”. % Were 3 animals, 100% were 2 animals in “OLA-1006” and 100% in “OLA-1008”.
このように、増殖因子やスキャッホールドを投与することなく、ポリＬ−乳酸を投与するだけで、重力等のメカニカルストレスを受けにくい頭蓋骨において、ＢＶ／ＴＶ値が９８％〜１００％であったことは、驚くべき結果であった。 As described above, the BV / TV value was 98% to 100% in the skull that is not easily subjected to mechanical stress such as gravity only by administering poly-L-lactic acid without administering a growth factor or a scaffold. That was a surprising result.
また、ポリＬ−乳酸を投与した他の例についても、「ＯＬＡ−１００６」において１９．５３％〜２８．０５％が２頭、「ＯＬＡ−１００７」において１６．９２％〜３２．４６％が３頭、「ＯＬＡ−１００８」において１０．９６％〜１３．９６％が２頭であり、Control群に比べて高いＢＶ／ＴＶ値が得られた。 In addition, regarding other examples in which poly-L-lactic acid was administered, “19.53% to 28.05% in“ OLA-1006 ”were 2 animals and 16.92% to 32.46% in“ OLA-1007 ”. In 3 heads, "OLA-1008", 10.96% to 13.96% were 2 heads, and a higher BV / TV value was obtained compared to the Control group.
なお、「ＯＬＡ−１００２」及び「ＯＬＡ−１００４」においては、Control群との差異が認められなかった。この結果は、動物実験に特有の手技的な難しさに起因するものと考えられた。すなわち、例えば、頭蓋骨に孔を開けるために、比較的広い範囲で切開を行い、重合体を埋め込むが、その後の縫合時に当該重合体の位置がずれる等、予期しない不都合が生じることがある。そして、この予期しない不都合の発生により、一部の条件では、正確な評価ができなかった可能性が考えられた。 In “OLA-1002” and “OLA-1004”, no difference from the Control group was observed. This result was attributed to the technical difficulty inherent in animal experiments. That is, for example, in order to make a hole in the skull, an incision is made in a relatively wide range and the polymer is embedded, but unexpected problems may occur such as the position of the polymer being shifted at the time of subsequent suturing. Then, due to this unexpected inconvenience, there was a possibility that accurate evaluation could not be performed under some conditions.
Claims (5)
前記単独重合体は、生体内において分解されてＬ−乳酸を放出する単独重合体であり、
前記単独重合体は、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を満たす：
（ａ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定されるポリスチレン換算の数平均分子量が３００〜１０００の範囲内である；
（ｂ）ゲル浸透クロマトグラフィー法による測定で得られるクロマトグラムにおいて、全面積に対する、ポリスチレン換算の分子量２５０〜２０００の範囲の面積の割合が７０％〜１００％の範囲内である；
（ｃ）ゲル浸透クロマトグラフィー法により測定される、ポリスチレン換算の数平均分子量に対するポリスチレン換算の重量平均分子量の比率として算出される分子量分布が、１．１〜３．０の範囲内である；
ことを特徴とする骨形成促進剤（ただし、ステレオコンプレックスを形成する液状のＬ−オリゴ乳酸及び液状のＤ−オリゴ乳酸と、リン酸カルシウム粉末または顆粒とを混合してなる骨補填材を除き、（Ｉ）乳酸及び／又はグリコール酸の重合体又は共重合体、（ＩＩ）乳酸及び／又はグリコール酸の重合体又は共重合体（Ａ）とポリエチレングリコール（Ｂ）との共重合体であって、当該成分（Ａ）の数平均分子量が４００〜５０００の範囲にあり、且つ成分（Ｂ）の数平均分子量が１５０〜２０００の範囲にある共重合体、（ＩＩＩ）骨形成因子を使用し、当該（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を（Ｉ）／（ＩＩ）（重量比）で０．１５〜７．０の範囲で混合してなる医用組成物を除く。）。 A homopolymer of L-lactic acid which is a ligand of GPR81 as an active ingredient,
The homopolymer is a homopolymer that is decomposed in vivo to release L-lactic acid,
The homopolymer satisfies the following (a) , (b) and (c) :
(A) The number average molecular weight in terms of polystyrene measured by gel permeation chromatography is in the range of 300 to 1,000 ;
(B) In the chromatogram obtained by the measurement by the gel permeation chromatography method, the ratio of the area of the molecular weight 250 to 2000 in terms of polystyrene to the total area is in the range of 70 % to 100%;
(C) The molecular weight distribution calculated as a ratio of the polystyrene-equivalent weight average molecular weight to the polystyrene-equivalent number average molecular weight, measured by gel permeation chromatography, is in the range of 1.1 to 3.0;
The bone formation promoter characterized by the above (except for the bone filling material formed by mixing liquid L-oligolactic acid and liquid D-oligolactic acid forming a stereocomplex with calcium phosphate powder or granules (I ) A polymer or copolymer of lactic acid and / or glycolic acid, (II) a polymer or copolymer of lactic acid and / or glycolic acid (A) and a copolymer of polyethylene glycol (B), A copolymer in which the number average molecular weight of the component (A) is in the range of 400 to 5000 and the number average molecular weight of the component (B) is in the range of 150 to 2000, (III) I), (II) and (III) are excluded in the medical composition formed by mixing (I) / (II) (weight ratio) in the range of 0.15 to 7.0) .
請求項１に記載の骨形成促進剤。The osteogenesis promoter according to claim 1.
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の骨形成促進剤。 The osteogenesis promoter according to claim 1 or 2 , wherein the composition is a fluid composition.
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の骨形成促進剤。 The osteogenesis promoter according to any one of claims 1 to 3 , which is an injection composition.
前記リザーバ部の前記骨形成促進剤を患者の患部に注入する注入部と、
を備えたことを特徴とする骨形成促進装置。 A reservoir portion containing the osteogenesis promoter according to claim 3 or 4 ;
An injection part for injecting the osteogenesis promoter of the reservoir part into an affected area of a patient;
A bone formation promoting device comprising:
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