JP6613526B2 - How to predict glioblastoma - Google Patents
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Description
本発明は、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting the development of glioblastoma in a subject.
神経膠腫（glioma）は脳に発生する悪性腫瘍の一つであり、全頭蓋内腫瘍の約２５％を占めている。
神経膠腫には多様な種類が存在するが、世界保健機関（ＷＨＯ）による分類が世界的に用いられている（非特許文献１）。ＷＨＯ分類は悪性度に基づいており、各神経膠腫がグレード１（悪性度が最も低い）〜グレード４（悪性度が最も高い）に分類されている。そして、各神経膠腫の治療方針も、このグレードに基づいて定められている。
膠芽腫（glioblastoma）は、ＷＨＯ分類でグレード４に分類される神経膠腫の一つである。膠芽腫は進行が早いため、膠芽腫であることを正確に判定し、膠芽腫に適した治療を開始することが患者の予後にとって重要である。Glioma is one of the malignant tumors that occur in the brain and accounts for about 25% of all intracranial tumors.
There are various types of glioma, but classification by the World Health Organization (WHO) is used worldwide (Non-patent Document 1). The WHO classification is based on the grade of malignancy, and each glioma is classified into grade 1 (lowest grade of malignancy) to grade 4 (highest grade of malignancy). And the treatment policy of each glioma is also defined based on this grade.
Glioblastoma is one of gliomas classified as
膠芽腫の確定診断は、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者から採取した脳組織を病理医が顕微鏡で観察（病理組織検査）することにより行われている。その際、診断の精度を高めるための補助的手段として、採取した脳組織中の細胞をネスチン（nestin）で染色することが行われている。具体的には、神経膠腫組織細胞のネスチン染色性と神経膠腫の悪性度とが相関していることに基づき、免疫組織化学染色法を用いた脳組織細胞のネスチン染色結果を、膠芽腫の診断で補助的に使用している（非特許文献２）。
尚、ネスチンが血液等の細胞外に存在することは知られていない。A definitive diagnosis of glioblastoma is performed by a pathologist observing a brain tissue collected from a subject suspected of having glioblastoma by CT or MRI with a microscope (pathological examination). At that time, as an auxiliary means for improving the accuracy of diagnosis, cells collected in brain tissue are stained with nestin. Specifically, based on the correlation between nestin staining of glioma tissue cells and malignancy of glioma, the results of nestin staining of brain tissue cells using immunohistochemical staining were analyzed. It is used as an auxiliary in the diagnosis of tumor (Non-patent Document 2).
It is not known that nestin exists outside cells such as blood.
しかしながら、被験者から採取した脳組織細胞をネスチン染色する方法は、複雑な免疫組織化学染色操作を必要とするため、結果を得るまでに時間がかかる。更に、この方法では、膠芽腫とは異なる疾患である転移性脳腫瘍や悪性リンパ腫との鑑別が困難であることが少なくない。
また、脳組織の採取は、被験者に対する侵襲性が大きく、危険性も少なくないため、通常の健康診断において膠芽腫の検査は行われていない。However, the method of nestin staining brain tissue cells collected from a subject requires a complicated immunohistochemical staining operation, and thus takes time to obtain the result. Furthermore, in this method, it is often difficult to differentiate from metastatic brain tumors and malignant lymphomas, which are diseases different from glioblastoma.
In addition, since the collection of brain tissue is highly invasive to the subject and is not dangerous, glioblastoma is not examined in normal health examinations.
本発明者等は、被験者に対する侵襲性や危険性が低く、簡便、迅速かつ正確に膠芽腫の発症を予測できる手段について鋭意検討したところ、被験者の血液中のネスチン濃度が膠芽腫の発症と関連していることを見いだした。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。 The inventors of the present invention have intensively studied a means of predicting the onset of glioblastoma in a simple, rapid and accurate manner with low invasiveness and risk to the subject. And found that it is related. The present invention has been made based on this finding.
すなわち、本発明は、下記１〜１１に関するものである。
１.被験者における膠芽腫の発症を予測する方法であって、
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含むことを特徴とする方法。
２.工程（２）において、ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する、前記１に記載の方法。
３.被験者が、膠芽腫が疑われている者である、前記１又は２に記載の方法。
４.被験者が、膠芽腫が疑われていない者である、前記１〜３のいずれかに記載の方法。
５.血液サンプルが血清サンプルである、前記１〜４のいずれかに記載の方法。
６.ネスチン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
７.ＥＬＩＳＡ法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、前記６に記載の方法。
８.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
９.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
１０.ネスチン濃度を測定する試薬がネスチン抗体を含む、前記８又は９に記載のキット。
１１.ネスチン濃度を測定する試薬がＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬を更に含む、前記１０に記載のキット。That is, the present invention relates to the following 1 to 11.
1. A method for predicting the onset of glioblastoma in a subject,
(1) a step of measuring a nestin concentration in a blood sample derived from a subject, and
(2) A method comprising a step of predicting that a subject is likely to have glioblastoma when the nestin concentration is 0.63 ng / ml or more.
2. The method according to 1 above, wherein in the step (2), when the nestin concentration is 1.00 ng / ml or more, it is predicted that the subject is likely to have glioblastoma.
3. The method according to 1 or 2 above, wherein the subject is a person suspected of having glioblastoma.
4. The method according to any one of 1 to 3, wherein the subject is a person who is not suspected of having glioblastoma.
5. The method according to any one of 1 to 4 above, wherein the blood sample is a serum sample.
6. The method according to any one of 1 to 5 above, wherein the nestin concentration is measured by an ELISA method.
7. The method according to 6 above, wherein the ELISA method is a sandwich ELISA method.
8. A kit for predicting the onset of glioblastoma,
A reagent for measuring the concentration of nestin in a blood sample, and
A kit comprising: an instruction describing that when a nestin concentration is 0.63 ng / ml or more, it is predicted that a subject is likely to have glioblastoma.
9. A kit for predicting the onset of glioblastoma,
A reagent for measuring the concentration of nestin in a blood sample, and
A kit comprising an instruction describing that a subject is predicted to have a high possibility of suffering from glioblastoma when the nestin concentration is 1.00 ng / ml or more.
10. The kit according to 8 or 9 above, wherein the reagent for measuring the nestin concentration contains a nestin antibody.
11. The kit according to 10 above, wherein the reagent for measuring the nestin concentration further comprises a reagent used in the ELISA method.
本発明は、後述する実施例で示されるように、被験者に対する侵襲性や危険性が低い手段により入手可能な血液を用いて膠芽腫の発症を簡便、迅速かつ正確に予測することができる。したがって、本発明を用いることにより、他の検査（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている被験者に対しては迅速かつ正確な膠芽腫の診断が可能になる。
更に、本発明を用いることにより、通常の健康診断の際に膠芽腫の検査を行うことが可能になる。The present invention can predict the onset of glioblastoma simply, quickly and accurately using blood that can be obtained by means of low invasiveness and risk to a subject, as shown in the examples described later. Therefore, by using the present invention, a glioblastoma can be diagnosed quickly and accurately for a subject suspected of having glioblastoma by other examination (for example, CT, MRI, etc.).
Furthermore, by using the present invention, glioblastoma can be examined during a normal health examination.
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法は、下記の工程：
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含んでいる。Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The method of predicting the development of glioblastoma in a subject according to the present invention comprises the following steps:
(1) a step of measuring a nestin concentration in a blood sample derived from a subject, and
(2) When the nestin concentration is 0.63 ng / ml or more, preferably 1.00 ng / ml or more, a step of predicting that the subject is likely to have glioblastoma is included.
工程（１）
膠芽腫（glioblastoma）は、神経膠細胞から発生する神経膠腫である。ＷＨＯ分類では、グレード４に分類されている悪性度の高い神経膠腫である。膠芽腫は、４５〜６５歳の男性の大脳半球で多く発生することや、症状として頭痛、痙攣、性格変化、認知症や運動麻痺などがあることや、悪性度が高いため症状の進行が早いことが知られている。
被験者は、膠芽腫を発症する可能性のあるあらゆる動物が含むが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。
被験者は、公知の膠芽腫の検査手段（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている者であってもよく、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）であってもよい。
また、被験者の性別や年齢は問わない。 Process (1)
Glioblastoma is a glioma that arises from glial cells. In the WHO classification, it is a high-grade glioma classified as
The subject includes any animal that may develop glioblastoma, but is preferably a mammal, particularly preferably a human.
The subject may be a person who is suspected of having glioblastoma by a known glioblastoma examination means (for example, CT, MRI, etc.), or who is not suspected of having glioblastoma (for example, normal health A person who receives a diagnosis).
In addition, the subject's gender and age do not matter.
被験者由来の血液サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。
血液サンプルは、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいが、被験者から採取した血液を加工したもの（例えば、血清や血漿等）を使用することが好ましい。ネスチン濃度をより正確かつ迅速に測定できる点で、血清サンプルを用いることが好ましい。
血清サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。例えば、被験者から血液（例えば静脈血）を採取し、これを室温下で静置（例えば３０分間）した後、遠心分離（例えば３５００ｒｐｍで１０分間）することで調製することができる。調製した血清サンプルは、本発明の方法に使用するまで凍結保存（例えば−８０℃）してもよい。The preparation of a blood sample derived from a subject can be performed without particular limitation using a technique generally used in the technical field.
As a blood sample, blood collected from a subject may be used as it is, but it is preferable to use a blood sample obtained from a subject (for example, serum or plasma). A serum sample is preferably used because the nestin concentration can be measured more accurately and rapidly.
The serum sample can be prepared using a method generally used in the technical field without any particular limitation. For example, it can be prepared by collecting blood (eg, venous blood) from a subject, allowing it to stand at room temperature (eg, 30 minutes), and then centrifuging (eg, 3500 rpm for 10 minutes). The prepared serum sample may be stored frozen (eg, -80 ° C.) until used in the method of the present invention.
ネスチン（nestin）は、IV型中間系フィラメントに分類される公知の細胞骨格タンパク質である。また、ネスチンは、未分化の神経幹細胞では特異的に発現しているが、ニューロン（neuron）や星状膠細胞（astrocyte）へ分化すると発現が消失することが知られている。
血液サンプル中のネスチン濃度の測定は、当該技術分野で一般的に用いられているネスチン測定方法、検出方法や定量方法を特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、酵素結合免疫吸着検定法）があり、これはネスチンに対する特異性が高くかつ定量性に優れている。
したがって、工程（１）は、当該技術分野で公知の血中ネスチン濃度測定手段、例えばネスチン抗体を含むネスチン検出キット、好ましくはネスチン用ＥＬＩＳＡキットを用いて実施することができる。Nestin is a known cytoskeletal protein classified as a type IV intermediate filament. In addition, nestin is specifically expressed in undifferentiated neural stem cells, but it is known that its expression disappears when differentiated into neurons and astrocytes.
The measurement of the nestin concentration in the blood sample can be performed without particular limitation using a nestin measurement method, a detection method, and a quantification method that are generally used in the technical field. As a specific example, there is an ELISA method (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, enzyme-linked immunosorbent assay) using a nestin-specific antibody, which has high specificity for nestin and excellent quantification.
Accordingly, step (1) can be performed using a blood nestin concentration measuring means known in the art, for example, a nestin detection kit containing a nestin antibody, preferably a nestin ELISA kit.
工程（１）に好適なＥＬＩＳＡ法としては、サンドイッチ法、直接吸着法が挙げられる。ネスチンに対する特異性が高い点でサンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は下記の工程で行うことができる。
１．ネスチン抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。
２．固相をブロッキングする。
３．ネスチンを含む血液サンプルを固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンとのコンジュゲートを形成させる。
４．ビオチン標識されたネスチンに対する抗体（一次抗体）を固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体とのコンジュゲートを形成させる。
５．アビジン標識された酵素を添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体と酵素とのコンジュゲートを形成させる。
６．酵素基質を添加して、酵素反応生成物を検出する。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる一次抗体は、捕獲抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識するネスチンに対する抗体である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてネスチンを測定するキットは市販されており（例えば、商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan））、これらの市販品を特に制限なく工程（１）に用いることができる。Examples of the ELISA method suitable for the step (1) include a sandwich method and a direct adsorption method. The sandwich ELISA method is preferable because of its high specificity for nestin.
For example, the sandwich ELISA method can be performed by the following steps.
1. A nestin antibody (capture antibody) is adsorbed to a solid phase.
2. Block the solid phase.
3. A blood sample containing nestin is added to the solid phase to form a conjugate of the capture antibody and nestin.
4). A biotin-labeled antibody against nestin (primary antibody) is added to the solid phase to form a conjugate of the capture antibody, nestin and primary antibody.
5. Avidin labeled enzyme is added to form a conjugate of capture antibody, nestin, primary antibody and enzyme.
6). Enzyme substrate is added to detect enzyme reaction products.
The primary antibody used in the sandwich ELISA method is an antibody against nestin that recognizes an epitope different from the epitope recognized by the capture antibody.
Kits for measuring nestin using a sandwich ELISA method are commercially available (for example, trade name: SEA500Hu (Uscn Life Science Inc. Wuhan)), and these commercially available products can be used in step (1) without particular limitation. .
工程（２）
工程（２）では、工程（１）で測定された血液サンプル中のネスチン濃度に基づいて、被験者が膠芽腫を患っている可能性を予測する。具体的には、血液サンプル中のネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する。
「１．００ｎｇ／ｍｌ以上」の値を用いると、膠芽腫と健常者とを識別することに加えて、更に膠芽腫と他の悪性腫瘍とを識別することができる。 Step (2)
In step (2), the possibility that the subject suffers from glioblastoma is predicted based on the nestin concentration in the blood sample measured in step (1). Specifically, when the nestin concentration in the blood sample is 0.63 ng / ml or more, preferably 1.00 ng / ml or more, it is predicted that the subject is likely to have glioblastoma.
Using a value of “1.00 ng / ml or more”, in addition to distinguishing glioblastoma from healthy individuals, it is possible to further distinguish glioblastoma from other malignant tumors.
本発明にしたがい得られた予測結果は、下記の様に利用することができる。
本発明を、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者に対して実施した場合、本発明により得られた予測結果を他の膠芽腫の診断基準（病理組織検査結果等）と組み合わせることにより、より迅速かつ正確な確定診断を行うことができる。また、被験者の健康状態等により脳組織の採取が困難な場合には、本発明による予測結果をより有効に活用することができる。
本発明を、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）に対して実施した場合、本発明にしたがって得られた予測結果を用いて、膠芽腫に関する二次検査（精密検査）の要否を判定することができる。したがって、被験者に対する侵襲性及び危険性が低い血液サンプルを用い、かつ、簡便な手段で実施できる本発明を用いることで、従来は行われていなかった膠芽腫の検査を通常の健康診断における検査項目とすることができる。The prediction results obtained according to the present invention can be used as follows.
When the present invention is applied to a subject suspected of having glioblastoma by CT or MRI, the prediction results obtained by the present invention are combined with other glioblastoma diagnostic criteria (histopathological examination results, etc.) Thus, a more rapid and accurate definitive diagnosis can be performed. In addition, when it is difficult to collect brain tissue due to the health condition of the subject, the prediction result according to the present invention can be used more effectively.
When the present invention is carried out on a person who is not suspected of having glioblastoma (for example, a person who undergoes a normal medical examination), the prediction result obtained according to the present invention is used to obtain a second order related to glioblastoma. It is possible to determine whether or not an inspection (fine inspection) is necessary. Therefore, by using the present invention that can be performed by a simple means using a blood sample that is less invasive and less dangerous to a subject, a glioblastoma test that has not been conventionally performed can be performed in a normal health examination. It can be an item.
更に本発明は、上述の膠芽腫の予測方法を行うためのキットに関する。具体的には、本発明の膠芽腫の発症を予測するためのキットは、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキットである。
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬は、血液中のネスチンを検出し、定量するために当該技術分野で一般的に用いられているものを特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体が挙げられる。
本発明のキットは、好ましくは、前述のＥＬＩＳＡ法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いるものである。この場合、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いられる固相ブロッキング剤、ネスチン抗体（捕獲抗体）、一次抗体、酵素や酵素基質等）を含むことができる。Furthermore, this invention relates to the kit for performing the prediction method of the above-mentioned glioblastoma. Specifically, the kit for predicting the onset of glioblastoma of the present invention,
A reagent for measuring the concentration of nestin in a blood sample, and
Characterized in that it contains instructions describing that if the nestin concentration is 0.63 ng / ml or higher, preferably 1.00 ng / ml or higher, the subject is likely to have glioblastoma. It is a kit to do.
The reagent for measuring the nestin concentration in the blood sample can be used without particular limitation, as it is generally used in the art for detecting and quantifying nestin in the blood. Specific examples include nestin-specific antibodies.
The kit of the present invention preferably uses the above-mentioned ELISA method, particularly the sandwich ELISA method. In this case, the kit of the present invention can contain a reagent used in the ELISA method (for example, a solid phase blocking agent used in the sandwich ELISA method, a nestin antibody (capture antibody), a primary antibody, an enzyme, an enzyme substrate, etc.). .
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Next, the effect of the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to the examples.
実施例１
膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：１２名
グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：３名
グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：６名
グループ５
転移性脳腫瘍（神経膠腫ではない疾患）：２名
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：１名
グループ０以外の各被験者は、2013年5月〜2013年12月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。 Example 1
Nestin concentrations in blood samples derived from glioblastoma patients, glioma patients other than
(1) Subjects Subjects were classified into the following groups.
Healthy volunteers: 12
Diffuse astrocytoma (
Anaplastic astrocytoma (
Glioblastoma (
Metastatic brain tumor (non-glioma disease): 2 malignant lymphoma (non-glioma disease): 1
Individuals other than
（２）血液サンプルの調製
各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（−８０℃）した。(2) Preparation of blood sample Venous blood was collected from each subject, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged (3500 rpm for 10 minutes) to prepare a serum sample. The prepared serum sample was stored frozen (−80 ° C.) until the nestin concentration was measured.
（３）ネスチン濃度の測定
凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
測定結果を図１に示す。(3) Measurement of nestin concentration A frozen serum sample was thawed at 4 ° C. Next, sandwich ELISA was performed using a commercially available nestin measurement kit (trade name: SEA500Hu (Uscn Life Science Inc. Wuhan)) according to the protocol attached to the kit, and the nestin concentration in the serum sample was measured.
The measurement results are shown in FIG.
各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。
Student-t testでのペアごとの比較
Pairwise comparison in Student-t test
この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。 This statistical evaluation result shows that the serum nestin concentration of group 4 (glioblastoma) is significantly different (p <0.05) from the serum nestin concentration of other groups.
上記の結果より、グループ４（膠芽腫）の血清サンプル中のネスチン濃度の平均値０．９９７６ｎｇ／ｍｌよりも大きい血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。 Based on the above results, glioblastoma and other factors were evaluated using the serum nestin concentration value “1.00 ng / ml” larger than the average value of 0.9976 ng / ml in the serum samples of group 4 (glioblastoma) as an index. It is understood that the malignant tumor and the healthy person can be distinguished from each other.
実施例２
膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：２７名
グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：３名
グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名
グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：２８名
グループ５
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：４名
グループ０以外の各被験者は、2013年5月〜2014年6月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。 Example 2
Nestin concentrations in blood samples derived from glioblastoma patients, glioma patients other than
(1) Subjects Subjects were classified into the following groups.
Healthy volunteers: 27
Diffuse astrocytoma (
Anaplastic astrocytoma (
Glioblastoma (
Malignant lymphoma (non-glioma): 4
Individuals other than
（２）血液サンプルの調製
各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（−８０℃）した。(2) Preparation of blood sample Venous blood was collected from each subject, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and then centrifuged (3500 rpm for 10 minutes) to prepare a serum sample. The prepared serum sample was stored frozen (−80 ° C.) until the nestin concentration was measured.
（３）ネスチン濃度の測定
凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
測定結果を図２に示す。(3) Measurement of nestin concentration A frozen serum sample was thawed at 4 ° C. Next, sandwich ELISA was performed using a commercially available nestin measurement kit (trade name: SEA500Hu (Uscn Life Science Inc. Wuhan)) according to the protocol attached to the kit, and the nestin concentration in the serum sample was measured.
The measurement results are shown in FIG.
各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。
Student-t testでのペアごとの比較
Pairwise comparison in Student-t test
この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。 This statistical evaluation result shows that the serum nestin concentration of group 4 (glioblastoma) is significantly different (p <0.05) from the serum nestin concentration of other groups.
上記の結果より、血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。 From the above results, it is understood that glioblastoma can be distinguished from other malignant tumors and healthy individuals using the serum nestin concentration value “1.00 ng / ml” as an index.
次に、グループ０（健常者）とグループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度のデータを用いてROC曲線を作成した（図３）。ROC曲線は検査の信頼度を示す。ROC曲線において、Y軸の「感度（陽性率）」は、膠芽腫に罹患している集団に対して検査を行ったとき陽性（異常値）を示す割合を示し、X軸の「1-特異度（偽陽性率）」は、膠芽腫でない健常者（陰性）を陽性として検出してしまう割合を示す。したがって、ある検査法のROC曲線の曲線下面積（AUC）が1に近いほど、当該検査法の信頼性は高くなる。実施例２のROC曲線のAUCは０．８５であった。この結果より、血清ネスチン濃度を指標とする本発明は、膠芽腫の発症予測に関して信頼性の高い方法であることが理解される。
更に、統計ソフトJMP Pro11を用いてカットオフ値（膠芽腫発症予測において陽性と陰性とを分ける値）を算出したところ、カットオフ値となる血清ネスチン濃度は０．６３ｎｇ／ｍｌであった。この結果より、血清ネスチン濃度値「０．６３ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と健常者とを識別することができることが理解される。Next, ROC curves were created using serum nestin concentration data of group 0 (healthy subjects) and group 4 (glioblastoma) (FIG. 3). The ROC curve shows the reliability of the test. In the ROC curve, “sensitivity (positive rate)” on the Y-axis indicates the percentage that shows a positive (abnormal value) when testing a population affected with glioblastoma. “Specificity (false positive rate)” indicates the rate at which healthy individuals who are not glioblastoma (negative) are detected as positive. Therefore, the closer the area under the ROC curve (AUC) of an inspection method is to 1, the higher the reliability of the inspection method. The AUC of the ROC curve of Example 2 was 0.85. From this result, it is understood that the present invention using serum nestin concentration as an index is a reliable method for predicting the onset of glioblastoma.
Furthermore, when the cut-off value (a value that separates positive and negative in glioblastoma onset prediction) was calculated using statistical software JMP Pro11, the serum nestin concentration that gave the cut-off value was 0.63 ng / ml. From this result, it is understood that glioblastoma can be distinguished from a healthy person using the serum nestin concentration value “0.63 ng / ml” as an index.
本発明は、膠芽腫の発症を予測することができる。したがって、本発明は、膠芽腫の診断に利用することができる。 The present invention can predict the onset of glioblastoma. Therefore, the present invention can be used for diagnosis of glioblastoma.
Claims (7)
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）工程（１）の測定結果を、ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いという基準と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。 A method of testing a subject for the possibility of suffering from glioblastoma ,
(1) a step of measuring a nestin concentration in a blood sample derived from a subject, and
(2) comparing the measurement results of (1), when the nestin concentration is 0.63ng / ml or more, characterized in that it comprises the step of comparing a reference called likely the subject is suffering from glioblastoma And how to.
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