JP6601842B2 - Plant tissue clarifier - Google Patents
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Description
本発明は、植物組織透明化剤に関する。 The present invention relates to a plant tissue clarifying agent.
植物の個々の細胞及び組織の役割、さらには植物体全体の成り立ち等を明らかにするためには、植物の内部構造を詳細に観察する必要がある。現代では、目的の細胞や構造を蛍光タンパク質等の蛍光物質で選択的に標識し、細胞や組織を詳細に観察することが可能となっている。 In order to elucidate the role of individual cells and tissues of the plant, as well as the formation of the whole plant body, it is necessary to observe the internal structure of the plant in detail. Nowadays, it is possible to selectively label a target cell or structure with a fluorescent substance such as a fluorescent protein to observe the cell or tissue in detail.
しかし、植物は、クロロフィル等の色素を含み、光を逃さないために光を散乱させる構造（例えば、形状の異なる細胞や空気層の存在）を有し、さらには特にめしべ等においては複雑な組織構造を有しているので、通常、透明度が極めて低い。このため、上記蛍光物質による標識技術を用いても、外から観察できるのは植物の表面及びそれに近い部分のみであり、植物の内部構造を観察するには、器官の解剖や組織切片の作製等の煩雑で熟練を要する操作が必要であった。 However, plants contain pigments such as chlorophyll, have a structure that scatters light so as not to escape light (for example, the presence of cells and air layers with different shapes), and especially complex tissues such as pistil. Since it has a structure, transparency is usually very low. For this reason, only the surface of the plant and parts close to it can be observed from the outside even when using the labeling technique with the fluorescent substance. To observe the internal structure of the plant, organ dissection, preparation of tissue sections, etc. Therefore, an operation that requires skill is required.
植物を透明化すること自体は古くから行われており、代表的な植物透明化試薬としては抱水クロラール溶液が知られている。しかし、抱水クロラール溶液は、植物を透明化することはできるものの、蛍光タンパク質の蛍光特性を損ねてしまう。 Clearing the plant itself has been performed for a long time, and a chloral hydrate solution is known as a typical plant clearing reagent. However, the chloral hydrate solution can clear the plant, but impairs the fluorescent properties of the fluorescent protein.
このような状況の中、近年、動物研究においては、脳を透明化して蛍光観察する手法が、日本を始め国内外の多くの研究グループによって開発されている（特許文献１〜４）。一方、この動物透明化技術を利用した、新たな植物透明化技術の開発も進められている（非特許文献１〜２）。 Under such circumstances, in recent years, in animal research, a method for observing fluorescence with a transparent brain has been developed by many research groups in Japan and overseas (Patent Documents 1 to 4). On the other hand, development of a new plant transparency technology using this animal transparency technology is also being promoted (Non-Patent Documents 1 and 2).
しかしながら、これらの新たな植物透明化技術には、透明化の迅速性、簡便性等の観点から改善の余地がある。例えば、非特許文献１の植物透明化技術は、シロイヌナズナの葉の透明化に３週間も要してしまうし、非特許文献２の植物透明化技術は、シロイヌナズナの葉の透明化に４〜６週間も要し、さらに毎日透明化試薬を交換するという煩雑な作業までをも要してしまう。 However, these new plant clarification techniques have room for improvement from the viewpoints of rapidity and simplicity of clarification. For example, the plant clearing technique of Non-Patent Document 1 requires 3 weeks for clearing of Arabidopsis leaves, and the plant clearing technique of Non-Patent Document 2 is 4 to 6 for clearing Arabidopsis leaves. It takes a week, and it also requires a complicated work of exchanging the clearing reagent every day.
そこで、本発明は、より迅速に、且つより簡便に植物組織を透明化することができる植物組織透明化剤を提供することを課題とする。さらには、蛍光タンパク質の蛍光特性をより安定に保持しつつ植物組織を透明化できる植物組織透明化剤を提供することをも課題とする。 Then, this invention makes it a subject to provide the plant tissue clearing agent which can clarify a plant tissue more rapidly and more simply. It is another object of the present invention to provide a plant tissue clearing agent that can make plant tissue transparent while maintaining the fluorescence characteristics of the fluorescent protein more stably.
本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究を行った結果、アルコールアミン及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種の多価アルコール、並びにイオン性界面活性剤を含有する、植物組織透明化剤（本明細書において、「本発明の植物組織透明化剤」と示すこともある。）であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、完成されたものである。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that the plant tissue is transparent, containing at least one polyhydric alcohol selected from the group consisting of alcohol amines and sugar alcohols, and an ionic surfactant. It has been found that the above-mentioned problems can be solved by using an agent (sometimes referred to as “the plant tissue clarifying agent of the present invention” in the present specification). The present invention has been completed as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
項１． アルコールアミン及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種の多価アルコール、並びにイオン性界面活性剤を含有する、植物組織透明化剤．
項２． 前記イオン性界面活性剤が親水基として−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＭ（式中、Ｍはナトリウム原子又はカリウム原子、好ましくはナトリウム原子を示す。）を有する陰イオン性界面活性剤である、項１に記載の植物組織透明化剤．
項３． 前記イオン性界面活性剤が部分構造としてステロイド骨格を含む陰イオン性界面活性剤である、項１又は２に記載の植物組織透明化剤．
項４． 前記糖アルコールがペンチトールである、項１〜３のいずれかに記載の植物組織透明化剤．
項５． 前記アルコールアミンが一般式（１）：
Item 1. A plant tissue clearing agent comprising at least one polyhydric alcohol selected from the group consisting of alcohol amines and sugar alcohols, and an ionic surfactant.
Item 2. -C wherein the ionic surfactant as a hydrophilic group (= O) -O -, -C (= O) -OH, or -C (= O) -OM (wherein, M is sodium atom or potassium atom, Item 2. The plant tissue clarifier according to Item 1, which is an anionic surfactant having a sodium atom.
Item 3. Item 3. The plant tissue clearing agent according to Item 1 or 2, wherein the ionic surfactant is an anionic surfactant containing a steroid skeleton as a partial structure.
Item 4. Item 4. The plant tissue clarifier according to any one of Items 1 to 3, wherein the sugar alcohol is pentitol.
Item 5. The alcohol amine is represented by the general formula (1):
［一般式（１）中：Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なってヒドロキシアルキル基を示す。Ｒ３はヒドロキシアルキル基、又は一般式（２）： [In General Formula (1): R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydroxyalkyl group. R 3 is a hydroxyalkyl group or a general formula (2):
（一般式（２）中：Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。）で表される基を示す。］で表されるアルコールアミンである、項１〜４のいずれかに記載の植物組織透明化剤．
項６． 前記Ｒ３が一般式（２）で表される基である、項５に記載の植物組織透明化剤．
項７． 前記Ｒ３がヒドロキシアルキル基である、項５に記載の植物組織透明化剤．
項８． さらに尿素及び尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、項１〜７のいずれかに記載の植物組織透明化剤．
項９． アルコールアミン及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種の多価アルコール、並びにイオン性界面活性剤を含有する、蛍光タンパク質含有植物組織の透明化剤．
項１０． 項１〜９のいずれかに記載の植物組織透明化剤を植物組織と接触させることを含む、透明化植物組織の製造方法．
項１１． 前記植物組織が蛍光タンパク質を含有する、項１０に記載の製造方法。
(In General Formula (2): R 4 and R 5 are the same or different and each represents a hydroxyalkyl group. N represents an integer of 1 to 4). Item 5. A plant tissue clarifier according to any one of Items 1 to 4, which is an alcoholamine represented by the formula:
Item 6. Item 6. The plant tissue clarifier according to Item 5, wherein R 3 is a group represented by General Formula (2).
Item 7. Item 6. The plant tissue clarifier according to Item 5, wherein R 3 is a hydroxyalkyl group.
Item 8. Item 8. The plant tissue clearing agent according to any one of Items 1 to 7, further comprising at least one selected from the group consisting of urea and urea derivatives.
Item 9. A fluorescent protein-containing plant tissue clearing agent comprising at least one polyhydric alcohol selected from the group consisting of alcohol amines and sugar alcohols, and an ionic surfactant.
Item 10. Item 10. A method for producing a clarified plant tissue, which comprises contacting the plant tissue clarifier according to any one of Items 1 to 9 with a plant tissue.
Item 11. Item 11. The production method according to Item 10, wherein the plant tissue contains a fluorescent protein.
項１２． 項１０又は１１に記載の製造方法で得られた、透明化植物組織． Item 12. Item 12. A clarified plant tissue obtained by the production method according to Item 10 or 11.
本発明によれば、植物組織透明化剤を提供することができる。本発明の植物組織透明化剤によれば、植物組織をより迅速に、特に好適な態様において葉や根等であれば３〜４日間程度で、且つ簡便に、透明化することが可能である。さらに、本発明の植物組織透明化剤によれば、蛍光タンパク質の蛍光特性をより安定に保持しつつ植物組織を透明化でき、これにより、透明化に伴う自家蛍光の減少と相まって、蛍光タンパク質由来の蛍光をより明瞭に観察することができる。 According to the present invention, a plant tissue clarifying agent can be provided. According to the plant tissue clearing agent of the present invention, it is possible to clear plant tissue more quickly, in about 3 to 4 days, and in a simple manner, particularly in the case of leaves, roots, and the like. . Furthermore, according to the plant tissue clarifier of the present invention, the plant tissue can be made transparent while maintaining the fluorescent property of the fluorescent protein more stably, and this is coupled with the decrease in autofluorescence accompanying the transparency, and is derived from the fluorescent protein. Can be observed more clearly.
本明細書中において、「含有」なる表現については、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In this specification, the expression “containing” includes the concepts of “including”, “consisting essentially of”, and “consisting only of”.
１．植物組織透明化剤
本発明は、アルコールアミン及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種の多価アルコール、並びにイオン性界面活性剤を含有する、植物組織透明化剤に関する。以下、これについて説明する。
1. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plant tissue clearing agent comprising at least one polyhydric alcohol selected from the group consisting of alcohol amines and sugar alcohols, and an ionic surfactant. This will be described below.
多価アルコールは、アルコールアミン及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種である。 The polyhydric alcohol is at least one selected from the group consisting of alcohol amines and sugar alcohols.
アルコールアミンは、アミンの少なくとも２つの炭化水素基の水素原子がヒドロキシ基に置換してなる化合物であれば特に限定されない。 The alcohol amine is not particularly limited as long as it is a compound in which hydrogen atoms of at least two hydrocarbon groups of the amine are substituted with hydroxy groups.
アミンとしては、例えばモノアミン、ジアミン、トリアミン等、好ましくはモノアミン、ジアミン等が挙げられる。また、蛍光タンパク質の蛍光特性をより安定に保持できるという観点から、アミンは、窒素原子に結合する３つの原子がいずれも水素ではないこと、例えばモノアミンの場合は第３級アミンが好ましい。 Examples of amines include monoamines, diamines, and triamines, preferably monoamines and diamines. Further, from the viewpoint of maintaining the fluorescence characteristics of the fluorescent protein more stably, the amine is preferably a tertiary amine in which all three atoms bonded to the nitrogen atom are not hydrogen, for example, in the case of a monoamine.
アミンが有する炭化水素基としては、特に制限されず、例えば直鎖状又は分枝鎖状（好ましくは直鎖状）の炭素数１〜８、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４の鎖状炭化水素基が挙げられる。また、別の観点から、該炭化水素基としては、例えば飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基等が挙げられ、好ましくはアルキル基が挙げられる。該アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ｎ−へキシル基、イソへキシル基等が挙げられる。 The hydrocarbon group possessed by the amine is not particularly limited and is, for example, linear or branched (preferably linear) carbon number of 1 to 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4. A chain hydrocarbon group is mentioned. From another viewpoint, examples of the hydrocarbon group include a saturated hydrocarbon group and an unsaturated hydrocarbon group, and an alkyl group is preferable. Examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, Examples include t-pentyl group, n-hexyl group, isohexyl group and the like.
アミンがジアミンやトリアミンの場合、窒素原子間は、アルキレン基で連結されていることが好ましい。該アルキレン基としては、特に制限されず、例えば直鎖状又は分枝鎖状（好ましくは直鎖状）の炭素数１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２のアルキレン基が挙げられる。該アルキレン基としては、例えばエチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｎ−ヘキシレン基等が挙げられる。 When the amine is diamine or triamine, the nitrogen atoms are preferably linked by an alkylene group. The alkylene group is not particularly limited. For example, a linear or branched (preferably linear) alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms. Can be mentioned. Examples of the alkylene group include an ethylene group, an n-propylene group, an isopropylene group, an n-butylene group, an isobutylene group, and an n-hexylene group.
アルコールアミンにおけるヒドロキシ基の数は、２以上である限り特に制限されず、例えば２〜６、好ましくは２〜５、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは３〜４である。 The number of hydroxy groups in the alcohol amine is not particularly limited as long as it is 2 or more, and is, for example, 2 to 6, preferably 2 to 5, more preferably 2 to 4, and further preferably 3 to 4.
アルコールアミンとして、好ましくは、一般式（１）： The alcohol amine is preferably represented by the general formula (1):
［一般式（１）中：Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なってヒドロキシアルキル基を示す。Ｒ３はヒドロキシアルキル基、又は一般式（２）： [In General Formula (1): R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydroxyalkyl group. R 3 is a hydroxyalkyl group or a general formula (2):
（一般式（２）中：Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なってヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数を示す。）で表される基を示す。］
で表されるアルコールアミンが挙げられる。
(In General Formula (2): R 4 and R 5 are the same or different and each represents a hydroxyalkyl group. N represents an integer of 1 to 4). ]
The alcohol amine represented by these is mentioned.
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、又はＲ５で表されるヒドロキシアルキル基は、特に制限されず、例えば直鎖状又は分枝鎖状（好ましくは直鎖状）の炭素数１〜８、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４のヒドロキシアルキル基が挙げられる。該ヒドロキシアルキル基としては、例えばヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、１−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基等が挙げられる。 The hydroxyalkyl group represented by R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , or R 5 is not particularly limited, and for example, linear or branched (preferably linear) carbon number 1 to 1 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4 hydroxyalkyl groups. Examples of the hydroxyalkyl group include a hydroxymethyl group, 1-hydroxyethyl group, 2-hydroxyethyl group, 1-hydroxypropyl group, 2-hydroxypropyl group, 3-hydroxypropyl group, 1-hydroxybutyl group, 2- A hydroxybutyl group, 3-hydroxybutyl group, 4-hydroxybutyl group, etc. are mentioned.
ｎは、好ましくは１〜３の整数であり、より好ましくは１又は２である。 n is preferably an integer of 1 to 3, more preferably 1 or 2.
Ｒ３は、本発明の植物組織透明化剤に後述の尿素又はその誘導体が含まれない場合であれば、透明化能、蛍光タンパク質の蛍光特性の保持能等の観点から、好ましくは一般式（２）で表される基である。一方、Ｒ３は、本発明の植物組織透明化剤に後述の尿素又はその誘導体が含まれる場合であれば、透明化能、蛍光タンパク質の蛍光特性の保持能等の観点から、好ましくはヒドロキシアルキル基である。 R 3 is preferably a compound represented by the general formula (from the viewpoint of the transparency, the ability to retain the fluorescence properties of the fluorescent protein, etc., if the plant tissue clarifier of the present invention does not contain urea or a derivative thereof described later. It is group represented by 2). On the other hand, R 3 is preferably a hydroxyalkyl from the viewpoint of transparency, ability to retain fluorescence properties of fluorescent protein, etc., if the plant tissue clarifier of the present invention contains urea or a derivative thereof described later. It is a group.
アルコールアミンの具体例としては、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（１−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（１−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（３−ヒドロキシプロピル）エチレンジアミン、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシブチル）エチレンジアミン、ジエタノールアミン、メチルジエタノールアミン等が挙げられる。 Specific examples of alcohol amines include triethanolamine, tripropanolamine, tributanolamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (1-hydroxyethyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxyethyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (1-hydroxypropyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (3-hydroxypropyl) ethylenediamine, N, N, N ′, N′-tetrakis (hydroxybutyl) ethylenediamine, diethanolamine, methyldiethanolamine and the like can be mentioned.
アルコールアミンは、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。 Alcoholamines can be used singly or in combination of any two or more.
糖アルコールは、アルドースの還元によって生じるもの（アルジトール、好ましくはＤ−アルジトール）であれば特に制限されない。糖アルコールとしては、例えばグリセリンなどのトリトール（Ｃ３Ｈ５（ＯＨ）３）； エリトリトール、Ｄ−トレイトール、Ｌ−トレイトール等のテトリトール（Ｃ４Ｈ６（ＯＨ）４）； Ｄ−アラビニトール、Ｌ−アラビニトール、キシリトール、リビトール等のペンチトール（Ｃ５Ｈ７（ＯＨ）５）； アリトール、Ｄ−イジトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール等のヘキシトール（Ｃ６Ｈ８（ＯＨ）６）； ボレミトール、ペルセイトール等のヘプチトール（Ｃ７Ｈ９（ＯＨ）７）等が挙げられる。これらの中でも、透明化能、自家蛍光消失化能、蛍光タンパク質の蛍光特性の保持能等の観点から、好ましくはペンチトール、ヘキシトール（好ましくはソルビトール）等が挙げられれ、より好ましくはペンチトールが挙げられ、さらに好ましくはペンチトールの中でもキシリトールが挙げられる。 The sugar alcohol is not particularly limited as long as it is produced by reduction of aldose (alditol, preferably D-alditol). Examples of the sugar alcohol include tritol such as glycerin (C 3 H 5 (OH) 3 ); tetritol (C 4 H 6 (OH) 4 ) such as erythritol, D-threitol, and L-threitol; D-arabinitol, Pentitols such as L-arabinitol, xylitol, ribitol (C 5 H 7 (OH) 5 ); hexitols such as allitol, D-iditol, galactitol, sorbitol, mannitol (C 6 H 8 (OH) 6 ); Examples include heptitol (C 7 H 9 (OH) 7 ) such as perseitol. Among these, pentitol, hexitol (preferably sorbitol), and the like are preferable from the viewpoints of transparency, autofluorescence extinction ability, ability to retain fluorescent properties of fluorescent proteins, and the like, more preferably pentitol. More preferably, among pentitol, xylitol is mentioned.
糖アルコールは、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。 Sugar alcohol can also be used individually by 1 type, and can also be used in combination of arbitrary 2 or more types.
多価アルコールは、後述の尿素類と（好ましくは、さらに後述のステロイド骨格を含むイオン性界面活性剤と）組み合わせることにより、より高い自家蛍光消失化能を発揮できるという観点から、好ましくは糖アルコールである。 The polyhydric alcohol is preferably a sugar alcohol from the viewpoint that a higher autofluorescence quenching ability can be exhibited by combining with a urea described later (preferably, an ionic surfactant containing a steroid skeleton described later). It is.
多価アルコールの含有量は、特に制限されない。該含有量は、本発明の効果をより確実に発揮させるという観点から、本発明の植物組織透明化剤の総量に対して、例えば１〜６０ｗ／ｖ％、好ましくは２〜５０ｗ／ｖ％、より好ましくは５〜３５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは８〜３０ｗ／ｖ％である。 The content of the polyhydric alcohol is not particularly limited. The content is, for example, 1 to 60 w / v%, preferably 2 to 50 w / v%, based on the total amount of the plant tissue clarifying agent of the present invention, from the viewpoint of more reliably exerting the effects of the present invention. More preferably, it is 5-35 w / v%, More preferably, it is 8-30 w / v%.
イオン性界面活性剤は、特に制限されず、例えば陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等が挙げられる。 The ionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, and a cationic surfactant.
これらの中でも、透明化能、自家蛍光消失化能、蛍光タンパク質の蛍光特性の保持能等の観点から、好ましくは陰イオン性界面活性剤が挙げられ、より好ましくは陰イオン性基として−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＭ（式中、Ｍはナトリウム原子又はカリウム原子、好ましくはナトリウム原子を示す。）を有する陰イオン性界面活性剤が挙げられる。 Among these, from the viewpoints of transparency, autofluorescence extinction ability, ability to retain fluorescence properties of fluorescent proteins, and the like, anionic surfactants are preferable, and -C ( = O) -O -, -C ( = O) -OH, or -C (= O) -OM (wherein, M is sodium atom or potassium atom, preferably anionic with display sodium atom). Surfactant is mentioned.
同様の観点から、イオン性界面活性剤としては、好ましくは部分構造としてステロイド骨格を含むイオン性界面活性剤が挙げられる。なお、ステロイド骨格とは、以下の式（ａ）で表される。 From the same viewpoint, the ionic surfactant preferably includes an ionic surfactant containing a steroid skeleton as a partial structure. The steroid skeleton is represented by the following formula (a).
該ステロイド骨格を含むイオン性界面活性剤として、好ましくは一般式（３）： The ionic surfactant containing the steroid skeleton is preferably represented by the general formula (3):
［一般式（３）中：Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９は、同一又は異なってヒドロキシ基又は水素原子を示す（但し、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９の内少なくとも１つ以上はヒドロキシ基を示す。）。］
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
[In General Formula (3): R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 are the same or different and represent a hydroxy group or a hydrogen atom (provided that R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 At least one or more represents a hydroxy group.) ]
Or a salt thereof.
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９の内、好ましくは２〜３つ、より好ましくは２つがヒドロキシ基を示し、その他は水素原子を示す。また、Ｒ８は好ましくは水素である。 Among R 6 , R 7 , R 8 and R 9 , preferably 2 to 3, more preferably 2 represent a hydroxy group, and the other represents a hydrogen atom. R 8 is preferably hydrogen.
一般式（３）で表される化合物の塩は、カルボキシル基と塩を形成できるものであれば特に制限されない。該塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等、好ましくはナトリウム塩が挙げられる。 The salt of the compound represented by the general formula (3) is not particularly limited as long as it can form a salt with a carboxyl group. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt, preferably sodium salt.
イオン性界面活性剤がステロイド骨格を含まない場合、疎水性部分として長鎖炭化水素鎖（好ましくは長鎖アルキル鎖）を有することが好ましい。該長鎖炭化水素鎖の主鎖上の炭素原子数は特に制限されず、例えば７〜３０、好ましくは８〜２０、より好ましくは９〜１５である。 When the ionic surfactant does not contain a steroid skeleton, it preferably has a long hydrocarbon chain (preferably a long alkyl chain) as the hydrophobic moiety. The number of carbon atoms on the main chain of the long-chain hydrocarbon chain is not particularly limited, and is, for example, 7 to 30, preferably 8 to 20, and more preferably 9 to 15.
長鎖アルキル鎖を有するイオン性界面活性剤として、好ましくは一般式（４）： The ionic surfactant having a long alkyl chain is preferably represented by the general formula (4):
［一般式（４）中：Ｒ１０は、単結合、又は一般式（５）： [In General Formula (4): R 10 is a single bond, or General Formula (5):
（一般式（５）中：Ｒ１１は、水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を示す。）で表される２価の基を示す。ｍは、６〜２９の整数を示す。］
で表される化合物又はその塩が挙げられる。
(In the general formula (5): R 11 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.) m represents an integer of 6 to 29. ]
Or a salt thereof.
Ｒ１０は、好ましくは一般式（５）で表される２価の基である。 R 10 is preferably a divalent group represented by the general formula (5).
ｍは、好ましくは７〜１９の整数、より好ましくは８〜１４の整数である。 m is preferably an integer of 7 to 19, more preferably an integer of 8 to 14.
Ｒ１１は、好ましくは炭素原子数１〜４（より好ましくは１〜２、さらに好ましくは１）のアルキル基を示す。該アルキル基は、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよい。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。 R 11 preferably represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms (more preferably 1 to 2 and even more preferably 1). The alkyl group may be linear or branched. Specific examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, t-butyl group and the like.
一般式（４）で表される化合物の塩は、カルボキシル基と塩を形成できるものであれば特に制限されない。該塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等、好ましくはナトリウム塩が挙げられる。 The salt of the compound represented by the general formula (4) is not particularly limited as long as it can form a salt with a carboxyl group. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt, preferably sodium salt.
イオン性界面活性剤の具体例としては、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、ヒオコール酸、リトコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、５α-シプリノール、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ等のステロイド骨格を含む化合物又はこれらの塩（例えばカリウム塩、ナトリウム塩等、好ましくはナトリウム塩）； オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン等の長鎖炭化水素鎖を有する化合物又はこれらの塩（例えばカリウム塩、ナトリウム塩等、好ましくはナトリウム塩）等が挙げられる。 Specific examples of the ionic surfactant include deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, hyocholic acid, lithocholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, 5α. -Compounds containing a steroid skeleton such as cyprinol, CHAPS, BIGCHAP, deoxy-BIGCHAP or salts thereof (for example, potassium salt, sodium salt, etc., preferably sodium salt); octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid , Compounds having a long-chain hydrocarbon chain such as stearic acid and N-lauroylsarcosine, or salts thereof (for example, potassium salt, sodium salt, etc., preferably sodium salt).
イオン性界面活性剤は、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。 An ionic surfactant can also be used individually by 1 type, and can also be used in combination of arbitrary 2 or more types.
イオン性界面活性剤の含有量は、特に制限されない。該含有量は、本発明の効果をより確実に発揮させるという観点から、本発明の植物組織透明化剤の総量に対して、例えば１〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは２〜２５ｗ／ｖ％、より好ましくは５〜２５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは１０〜２０ｗ／ｖ％である。 The content of the ionic surfactant is not particularly limited. The content is, for example, 1 to 30 w / v%, preferably 2 to 25 w / v%, based on the total amount of the plant tissue clarifying agent of the present invention, from the viewpoint of more reliably exerting the effects of the present invention. More preferably, it is 5-25 w / v%, More preferably, it is 10-20 w / v%.
本発明の植物組織透明化剤は、さらに尿素及び尿素誘導体からなる群より選択される少なくとも１種（本明細書において、「尿素類」と示すこともある。）を含有することが好ましい。尿素類を組み合わせることにより、透明化能、自家蛍光消失化能、蛍光タンパク質の蛍光特性の保持能等をより高めることができる。 The plant tissue clarifying agent of the present invention preferably further contains at least one selected from the group consisting of urea and urea derivatives (sometimes referred to as “ureas” in the present specification). By combining ureas, the transparency, autofluorescence extinction ability, ability to retain the fluorescence properties of the fluorescent protein, and the like can be further enhanced.
尿素誘導体としては、特に制限されず、公知の尿素誘導体、例えば特許文献２に記載の尿素誘導体を使用することができる。尿素誘導体として、好ましくはウレインが挙げられる。 The urea derivative is not particularly limited, and a known urea derivative such as the urea derivative described in Patent Document 2 can be used. Urea is preferably used as the urea derivative.
尿素類としては、好ましくは尿素が挙げられる。 Urea is preferably urea.
尿素類は、１種単独で用いることもできるし、任意の２種以上を組み合わせて用いることもできる。 Ureas can be used singly or in combination of any two or more.
尿素類の含有量は、特に制限されない。該含有量は、本発明の効果をより確実に発揮させるという観点から、本発明の植物組織透明化剤の総量に対して、例えば５〜６０ｗ／ｖ％、好ましくは１０〜５０ｗ／ｖ％、より好ましくは１５〜４０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは２０〜３０ｗ／ｖ％である。 The urea content is not particularly limited. The content is, for example, 5 to 60 w / v%, preferably 10 to 50 w / v%, based on the total amount of the plant tissue clarifying agent of the present invention, from the viewpoint of more reliably exerting the effects of the present invention. More preferably, it is 15-40 w / v%, More preferably, it is 20-30 w / v%.
本発明の植物組織透明化剤は、通常、さらに溶媒を含有する。溶媒は、植物組織内の蛍光タンパク質の蛍光特性をより安定に保持するという観点から、水であることが好ましい。 The plant tissue clarifier of the present invention usually further contains a solvent. The solvent is preferably water from the viewpoint of more stably maintaining the fluorescence characteristics of the fluorescent protein in the plant tissue.
溶媒の含有量は、特に制限されない。該含有量は、本発明の植物組織透明化剤の総量に対して、例えば５〜９５ｗ／ｖ％、好ましくは１５〜８５ｗ／ｖ％、より好ましくは３０〜７５ｗ／ｖ％、さらに好ましくは４０〜７０ｗ／ｖ％、よりさらに好ましくは４５〜６５ｗ／ｖ％である。 The content of the solvent is not particularly limited. The content is, for example, from 5 to 95 w / v%, preferably from 15 to 85 w / v%, more preferably from 30 to 75 w / v%, still more preferably 40, based on the total amount of the plant tissue clarifying agent of the present invention. It is -70 w / v%, More preferably, it is 45-65 w / v%.
本発明の植物組織透明化剤は、上記した成分のみからなるものであってもよい。また、本発明の効果を著しく損ねない限りにおいて、上記した成分以外の他の成分を含んでいてもよい
他の成分としては、例えば緩衝剤、浸透圧調整剤等が挙げられる。
The plant tissue clearing agent of the present invention may be composed of only the above-described components. In addition, as long as the effects of the present invention are not significantly impaired, other components that may contain other components than the above-described components include, for example, a buffer, an osmotic pressure adjusting agent, and the like.
なお、本明細書において、「透明化」とは、植物組織が完全に透明になることのみを意味するものではなく、透明化処理前に比べてより透明度が高くなることを意味する。 In the present specification, “transparency” does not only mean that the plant tissue becomes completely transparent, but means that the transparency becomes higher than before the transparency treatment.
本発明の植物組織透明化剤の透明化対象である植物組織は、特に制限されない。ただ、より効率的に透明化可能であるという観点から、透明化剤の浸透が容易な植物組織が好ましい。該植物組織としては、例えば根、葉、茎、頂芽、側芽、花弁、がく、めしべ、おしべ等の植物体の一部分、及び植物体の全部が挙げられる。 The plant tissue which is the object to be clarified by the plant tissue clarifying agent of the present invention is not particularly limited. However, from the viewpoint that it can be transparentized more efficiently, a plant tissue that allows easy penetration of the clearing agent is preferable. Examples of the plant tissue include roots, leaves, stems, top buds, side buds, petals, gargles, pistils, stamens, and other parts of plants, and all of the plants.
また、本願試験例においては、コケ植物から被子植物に至るまで種々の植物の植物組織を透明化できたことが実証されている。このように、透明化対象である植物組織の由来種は、特に制限されず、例えばコケ植物、シダ植物、裸子植物、被子植物等のあらゆる種を広く挙げることができる。 Moreover, in the test example of the present application, it has been demonstrated that plant tissues of various plants from moss plants to angiosperms could be made transparent. Thus, the origin species of the plant tissue to be clarified is not particularly limited, and can include a wide variety of species such as moss plants, fern plants, gymnosperms, angiosperms.
前述したように、本発明の植物組織透明化剤は、蛍光タンパク質の蛍光特性をより安定に保持しつつ植物組織を透明化することができる。このため、本発明の植物組織透明化剤は、蛍光タンパク質を含有する植物組織に対して、好適に用いられる。なお、蛍光タンパク質は、特定波長の励起光に対して蛍光を発することができるタンパク質である限り特に制限されず、公知の蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｌｏｖｅｒ、ｍＴＦＰ、ｓＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲＦＰ、ＧＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｓＲｅｄ、ＲＣＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＡｃＧＦＰ１、ＨｃＲｅｄ１、ＣｏｐＧＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ、ＥＹＦＰ、ＫＦＰ−Ｒｅｄ等）に加えて、該蛍光タンパク質と他の非蛍光タンパク質との融合タンパク質も包含する。 As described above, the plant tissue clearing agent of the present invention can make plant tissue transparent while maintaining the fluorescence characteristics of the fluorescent protein more stably. For this reason, the plant tissue clarifier of the present invention is suitably used for plant tissues containing fluorescent proteins. The fluorescent protein is not particularly limited as long as it is a protein that can emit fluorescence with respect to excitation light of a specific wavelength, and is a known fluorescent protein (for example, mClover, mTFP, sGFP, Venus, mApple, mRFP, GFP, In addition to AmCyan, ZsGreen, ZsYellow, AsRed, RCFP, DsRed, AcGFP1, HcRed1, CopGFP, PhiYFP, PhiYFP-m, EYFP, KFP-Red, and the like, and fusion proteins of the fluorescent protein with other non-fluorescent proteins To do.
２．透明化植物組織の製造方法
本発明は、本発明の植物組織透明化剤を植物組織と接触させることを含む、透明化植物組織の製造方法（本明細書において、「本発明の製造方法」と示すこともある。）に関する。
2. A method for producing a transparent plant tissue The present invention relates to a method for producing a transparent plant tissue comprising contacting the plant tissue clarifying agent of the present invention with a plant tissue (herein referred to as “the production method of the present invention”). May also be indicated).
植物組織は、本発明の植物組織透明化剤との接触前に、固定処理されていることが好ましい。固定処理は、植物組織を、固定液に浸漬することによって行うことができる。 The plant tissue is preferably fixed before contact with the plant tissue clarifier of the present invention. The fixing treatment can be performed by immersing the plant tissue in a fixing solution.
固定液は、植物組織を固定できる限り特に限定されず、公知の固定液、例えばパラホルムアルデヒドを含有する水性溶媒系の固定液や、エタノール及び酢酸を含有する有機溶媒系の固定液を挙げることができる。透明化対象の植物組織が蛍光タンパク質を含んでいる場合、該蛍光タンパク質の蛍光特性をできる限り損ねないという観点から、固定液としては、パラホルムアルデヒドを含有する水性溶媒系の固定液（例えば４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水溶液）が好ましい。 固定処理の時間は、特に限定されず、固定処理対象の植物組織に応じて、適宜設定することができる。該固定処理の時間は、実生であれば例えば２０〜４０分間、葉の場合は例えば９０〜１５０分間、めしべの場合は例えば４０〜８０分間である。 The fixing solution is not particularly limited as long as it can fix a plant tissue, and examples thereof include known fixing solutions, for example, aqueous solvent-based fixing solutions containing paraformaldehyde, and organic solvent-based fixing solutions containing ethanol and acetic acid. it can. When the plant tissue to be clarified contains a fluorescent protein, from the viewpoint of not damaging the fluorescent property of the fluorescent protein as much as possible, the fixing solution is an aqueous solvent-based fixing solution containing paraformaldehyde (for example, 4% Paraformaldehyde / phosphate buffered saline solution) is preferred. The time for the fixing treatment is not particularly limited, and can be appropriately set according to the plant tissue to be fixed. The time for the fixing treatment is, for example, 20 to 40 minutes for seedlings, 90 to 150 minutes for leaves, and 40 to 80 minutes for pistil, for example.
固定処理後は、必要に応じて、水や緩衝液で植物組織を洗浄することが好ましい。 After the fixing treatment, it is preferable to wash the plant tissue with water or a buffer as necessary.
本発明の植物組織透明化剤を植物組織と接触させる態様は、本発明の植物組織透明化剤が植物組織に浸透し得る態様であれば特に限定されない。例えば、本発明の植物組織透明化剤に植物組織を浸漬することにより、両者を接触させることができる。 The aspect in which the plant tissue clarifier of the present invention is brought into contact with the plant tissue is not particularly limited as long as the plant tissue clarifier of the present invention can penetrate into the plant tissue. For example, both can be contacted by immersing the plant tissue in the plant tissue clarifying agent of the present invention.
接触時間は、植物組織の透明化が起こる程度の時間である限り特に限定されず、固定処理対象の植物組織に応じて、適宜設定することができる。該接触時間は、葉、根及びコケ植物の場合は例えば２〜７日間であり、実生の場合は例えば５〜１０日間であり、めしべの場合は例えば１〜３週間であり、茎の場合は例えば２〜６週間である。 The contact time is not particularly limited as long as the plant tissue is transparent, and can be appropriately set according to the plant tissue to be fixed. The contact time is, for example, 2 to 7 days for leaves, roots and moss plants, 5 to 10 days for seedlings, 1 to 3 weeks for pistil, and 1 to 3 weeks for stems. For example, 2-6 weeks.
接触後は、必要に応じて、公知の方法に従って、例えば核や細胞壁を化学染色してもよい。 After contact, if necessary, for example, the nucleus and the cell wall may be chemically stained according to a known method.
このようにして得られた透明化植物組織は、観察（例えば目視観察、光学顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察等）することによって、植物内部構造や植物内部での生命現象等の解析に用いることができる。 The transparent plant tissue thus obtained can be used for analysis of the plant internal structure and life phenomena in the plant by observing (eg, visual observation, optical microscope observation, fluorescence microscope observation, etc.). .
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
試験例１．植物組織透明化剤の調製、及びその評価
＜試験例1-1．植物組織透明化剤の調製＞
表１に示す配合に従って植物組織透明化剤（実施例１〜１４）を調製した。
Test Example 1 Preparation of plant tissue clarifying agent and evaluation thereof <Test Example 1-1. Preparation of plant tissue clarifying agent>
Plant tissue clarifying agents (Examples 1 to 14) were prepared according to the formulation shown in Table 1.
＜試験例1-2．評価試験用植物組織片の調製＞
シロイヌナズナUBQ10遺伝子（At4g05320）の5’側に隣接する634 bpのUBQ10プロモーター領域、mCloverコード領域が(SGGGG)2リンカーを介して融合したH2B遺伝子（At1g07790）全長コード領域、及びNOSターミネーター領域を、バイナリーベクターpPZP211（Hajdukiewicz et al., (1994), Plant Mol. Biol. 25, 989-994.）にクローニングした。得られたバイナリーベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）EHA105株に導入した。得られたアグロバクテリウムを用いて、定法に従って、mClover融合H2Bタンパク質を発現するシロイヌナズナ形質転換体を得た。該形質転換体から葉を採取し、この葉を、4 w/v% PFA（パラホルムアルデヒド）／PBS（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を用いて、室温脱気下で120分間、固定処理した。得られた葉を、PBSで洗浄（1分間×2回）し、評価試験用植物組織片を得た。
<Test Example 1-2. Preparation of plant tissue piece for evaluation test>
The 634 bp UBQ10 promoter region adjacent to the 5 'side of the Arabidopsis UBQ10 gene (At4g05320), the H2B gene (At1g07790) full-length coding region fused with the mClover coding region via the (SGGGG) 2 linker, and the NOS terminator region It was cloned into the vector pPZP211 (Hajdukiewicz et al., (1994), Plant Mol. Biol. 25, 989-994.). The obtained binary vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain. Using the obtained Agrobacterium, an Arabidopsis transformant expressing mClover fusion H2B protein was obtained according to a conventional method. A leaf was collected from the transformant, and the leaf was fixed with a 4 w / v% PFA (paraformaldehyde) / PBS (phosphate buffered saline) solution at room temperature under aeration for 120 minutes. . The obtained leaves were washed with PBS (1 minute × 2 times) to obtain a plant tissue piece for evaluation test.
＜試験例1-3．植物組織透明化剤の評価＞
評価試験用植物組織片を植物組織透明化剤（実施例１〜１４）に浸漬し、室温下で3日間インキュベーションして、評価用植物組織片を得た。一方で、植物組織透明化剤に代えてPBSを用いる以外は同様にインキュベーションして、コントロール植物組織片を得た。
<Test Example 1-3. Evaluation of plant tissue clarifying agent>
The plant tissue piece for evaluation test was immersed in a plant tissue clarifying agent (Examples 1 to 14) and incubated at room temperature for 3 days to obtain a plant tissue piece for evaluation. On the other hand, a control plant tissue piece was obtained by incubation in the same manner except that PBS was used instead of the plant tissue clarifying agent.
＜試験例1-3-1．葉細胞における蛍光タンパク質輝度の評価＞
評価用植物組織片及びコントロール植物組織片中のmClover融合H2Bタンパク質の蛍光像を、蛍光ミラーユニットU-FBNA（オリンパス社製、励起フィルター：470-495 nm、吸収フィルター：510-550 nm）をセットしたシステム生物顕微鏡BX53（オリンパス社製）で観察し、Image Jで蛍光強度を測定した。測定した蛍光強度に基づいて、蛍光タンパク質輝度を4段階（+++：蛍光強度が高い、++：蛍光強度が中程度、+：蛍光強度が低い、-：蛍光が確認できない）で評価した。評価結果を上記表１に示す。
<Test Example 1-3-1. Evaluation of fluorescent protein brightness in leaf cells>
Set fluorescence mirror unit U-FBNA (Olympus, Excitation filter: 470-495 nm, Absorption filter: 510-550 nm) with fluorescence image of mClover fusion H2B protein in plant tissue piece for evaluation and control plant tissue piece Was observed with a system biological microscope BX53 (manufactured by Olympus), and fluorescence intensity was measured with Image J. Based on the measured fluorescence intensity, fluorescent protein brightness was evaluated in 4 stages (+++: high fluorescence intensity, ++: moderate fluorescence intensity, +: low fluorescence intensity,-: fluorescence cannot be confirmed) . The evaluation results are shown in Table 1 above.
＜試験例1-3-2．残存自家蛍光の評価＞
評価用植物組織片及びコントロール植物組織片の、クロロフィル由来の自家蛍光を、蛍光ミラーユニットU-FGW（オリンパス社製、励起フィルター：530-550 nm、吸収フィルター：> 575 nm）をセットしたシステム生物顕微鏡BX53（オリンパス社製）で観察した。観察結果に基づいて、残存自家蛍光を3段階（++：自家蛍光が確認できない、+：自家蛍光がコントロールより弱い、-：自家蛍光がコントロールと同程度）で評価した。評価結果を上記表１に示す。
<Test Example 1-3-2. Evaluation of residual autofluorescence>
Autologous fluorescence derived from chlorophyll of the evaluation plant tissue piece and the control plant tissue piece, a system organism in which the fluorescence mirror unit U-FGW (Olympus, excitation filter: 530-550 nm, absorption filter:> 575 nm) is set The images were observed with a microscope BX53 (Olympus). Based on the observation results, the remaining autofluorescence was evaluated in three stages (++: autofluorescence could not be confirmed, +: autofluorescence was weaker than control,-: autofluorescence was comparable to control). The evaluation results are shown in Table 1 above.
＜試験例1-3-3．透明度の評価＞
評価用植物組織片及びコントロール植物組織片の透明度をシステム生物顕微鏡BX53（オリンパス社製）を用いて目視で観察した。観察結果に基づいて、透明度を4段階（+++：透明度が高い、++：透明度が中程度、+：透明度が低い、-：コントロールと同じ）で評価した。評価結果を上記表１に示す。
<Test Example 1-3-3. Evaluation of transparency>
The transparency of the evaluation plant tissue piece and the control plant tissue piece was visually observed using a system biological microscope BX53 (manufactured by Olympus). Based on the observation results, the transparency was evaluated in four stages (+++: high transparency, ++: medium transparency, +: low transparency,-: same as control). The evaluation results are shown in Table 1 above.
試験例２．既存の植物透明化試薬との比較
既存の植物透明化試薬として、Warner et al.(2014)（Plant Physiol. 166, 1684-1687.）で報告された透明化試薬（6M 尿素、30 % (v/v) グリセロール、0.1 % (v/v) Triton X-100、残部は水）、及び抱水クロラールを含む透明化試薬（抱水クロラール、グリセロール及び水が、8：1：3（抱水クロラール：グリセロール：水）で配合された溶液）が知られている。これらの既存の植物透明化試薬と本発明の植物組織透明化剤との間で、透明化能等を比較した。
Test Example 2 Comparison with existing plant clearing reagent As an existing plant clearing reagent, the clearing reagent reported in Warner et al. (2014) (Plant Physiol. 166, 1684-1687.) (6M urea, 30% (v / v) Glycerol, 0.1% (v / v) Triton X-100, balance water, and clarification reagent containing chloral hydrate (chloral hydrate, glycerol and water 8: 1: 3 chloral hydrate) : Glycerol: water) is known. The clearing ability and the like were compared between these existing plant clearing reagents and the plant tissue clearing agent of the present invention.
試験例1-2で得た評価試験用植物組織片を、PBS、上記した既存の植物透明化試薬、又は実施例の植物組織透明化剤に浸漬し、室温下で4日間インキュベーションした。得られた植物組織片を目視又は顕微鏡で観察した。縦横のグリッド線が引かれたシート状に載せた植物組織片の目視観察像を図１の最上段に示し、植物組織片の顕微鏡明視野像を図１の中段に示し、試験例1-3-1と同様の方法で得られた、植物組織片中のmClover融合H2Bタンパク質の蛍光像を図１の最下段に示す。なお、図１中、「発明した透明化試薬」は実施例13の植物組織透明化剤を示す。 The plant tissue piece for evaluation test obtained in Test Example 1-2 was immersed in PBS, the above-described existing plant clearing reagent, or the plant tissue clearing agent of Example, and incubated at room temperature for 4 days. The obtained plant tissue piece was observed visually or with a microscope. A visual observation image of a plant tissue piece placed on a sheet with vertical and horizontal grid lines drawn is shown at the top of FIG. 1, a microscopic bright-field image of the plant tissue piece is shown in the middle of FIG. The fluorescence image of the mClover fusion H2B protein in the plant tissue piece obtained by the same method as in -1 is shown in the bottom of FIG. In FIG. 1, “invented clearing reagent” represents the plant tissue clearing agent of Example 13.
図１に示されるように、本発明の植物組織透明化剤で処理した植物組織片は、4日間という非常に短い期間の処理にも関わらず、完全に透明化されており（図１の最上段）、且つ蛍光タンパク質の蛍光を確認することもできた（図１の最下段）。これに対して、既存の透明化試薬で処理した植物組織片は、蛍光タンパク質の蛍光はわずかに確認できるものの、全く透明化されていない（図１の右から２つ目の列）、或いは透明化されてはいるものの、蛍光タンパク質の蛍光が確認できなかった（図１の最右列）。 As shown in FIG. 1, the plant tissue piece treated with the plant tissue clearing agent of the present invention is completely transparent despite the treatment for a very short period of 4 days (the highest in FIG. 1). It was also possible to confirm the fluorescence of the fluorescent protein (bottom row in FIG. 1). On the other hand, in the plant tissue piece treated with the existing clearing reagent, although the fluorescence of the fluorescent protein can be slightly confirmed, it is not clear at all (second row from the right in FIG. 1) or transparent. Although it has been converted, the fluorescence of the fluorescent protein could not be confirmed (the rightmost column in FIG. 1).
試験例３．多光子励起顕微鏡による植物組織深部の蛍光観察
試験例1-2で得た評価試験用植物組織片を、PBS又は実施例の植物組織透明化剤に浸漬し、室温下で4日間インキュベーションした。得られた植物組織片の蛍光3D画像を、高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システム（A1R MP、ニコン社製）の多光子モードを用いて得た。具体的には、波長950 nmの励起光によってmClover融合H2Bタンパク質の蛍光を励起させ、葉の厚み方向1.0μm毎の100枚のzスタックから蛍光3D画像を得た。得られた蛍光3D画像（上下が葉の厚み方向である）を図２に示す。なお、図２中、「発明した透明化試薬」は実施例13の植物組織透明化剤を示し、右側のカラーバーは葉の表面からの深さを示す。
Test Example 3 The plant tissue piece for evaluation test obtained in the fluorescence observation test example 1-2 in the deep fluorescence of the plant tissue with a multiphoton excitation microscope was immersed in PBS or the plant tissue clarifier of the example and incubated at room temperature for 4 days. A fluorescent 3D image of the obtained plant tissue piece was obtained using the multiphoton mode of a high-speed multiphoton confocal laser microscope system (A1R MP, manufactured by Nikon Corporation). Specifically, the fluorescence of the mClover fusion H2B protein was excited by excitation light having a wavelength of 950 nm, and fluorescence 3D images were obtained from 100 z-stacks every 1.0 μm in the leaf thickness direction. FIG. 2 shows the obtained fluorescent 3D image (upper and lower sides are the thickness direction of the leaves). In FIG. 2, “invented clearing reagent” indicates the plant tissue clearing agent of Example 13, and the color bar on the right indicates the depth from the leaf surface.
図２に示されるように、本発明の植物組織透明化剤で処理した植物組織片の蛍光3D画像においては、葉の裏面（厚み方向で葉の表面から約100μm）まで、mClover融合H2Bタンパク質由来の蛍光が観察された。 As shown in FIG. 2, in the fluorescence 3D image of the plant tissue piece treated with the plant tissue clarifying agent of the present invention, the mClover fusion H2B protein is derived from the leaf back surface (about 100 μm from the leaf surface in the thickness direction). Fluorescence was observed.
試験例４．共焦点顕微鏡による植物組織深部の蛍光観察
高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システムの共焦点モード（励起光の波長は488 nm）を用いる以外は、試験例３と同様に行った。なお、図３中、「発明した透明化試薬」は実施例13の植物組織透明化剤を示し、右側のカラーバーは葉の表面からの深さを示す。
Test Example 4 This was performed in the same manner as in Test Example 3 except that the confocal mode (wavelength of excitation light was 488 nm) of the fluorescence observation high-speed multiphoton confocal laser microscope system in the deep part of the plant tissue with a confocal microscope was used. In FIG. 3, “invented clearing reagent” indicates the plant tissue clearing agent of Example 13, and the color bar on the right side indicates the depth from the leaf surface.
図３に示されるように、本発明の植物組織透明化剤で処理した植物組織片の3D画像においては、葉の裏面（厚み方向で葉の表面から約100μm弱）まで、mClover融合H2Bタンパク質由来の蛍光が観察された。 As shown in FIG. 3, in the 3D image of the plant tissue piece treated with the plant tissue clarifying agent of the present invention, the mClover fusion H2B protein is derived from the leaf back surface (thickness direction, less than about 100 μm from the leaf surface). Fluorescence was observed.
試験例５．めしべの蛍光観察
葉の代わりにめしべを用い、且つ固定処理時間を60分間とする以外は、試験例1-2と同様にしてめしべ観察用組織片を得た。この組織片を、PBS又は実施例13の植物組織透明化剤に浸漬し、6日間インキュベーションした。得られた組織片の蛍光3D画像を、試験例３と同様にして、めしべの先端から基部方向1.0μm毎の401枚のzスタックから得た。得られた蛍光3D画像の縦断面図及び横断面図を図４に示す。
Test Example 5. A tissue piece for pistil observation was obtained in the same manner as in Test Example 1-2 except that a pistil was used instead of the fluorescence observation leaf of pistil and the fixing treatment time was 60 minutes. This tissue piece was immersed in PBS or the plant tissue clarifier of Example 13 and incubated for 6 days. In the same manner as in Test Example 3, fluorescent 3D images of the obtained tissue pieces were obtained from 401 z-stacks from the tip of the pistil every 1.0 μm in the base direction. FIG. 4 shows a longitudinal sectional view and a transverse sectional view of the obtained fluorescent 3D image.
通常、めしべは内部に複雑な構造を有しているので、その内部、更には内部で起こる現象を観察することは困難である。しかし、図４に示されるように、本発明の植物組織透明化剤で処理しためしべの3D画像においては、内部構造まで明瞭に観察することができた。このように、本発明の植物組織透明化剤を用いれば、めしべのような複雑な内部構造を有する植物組織でも、切片を作製することなく、内部を観察することができ、ひいては内部で起こる現象を観察することも可能であることが示された。 Usually, pistil has a complicated structure inside, and it is difficult to observe the phenomenon occurring inside and further inside. However, as shown in FIG. 4, in the stamen 3D image treated with the plant tissue clarifying agent of the present invention, the internal structure could be clearly observed. Thus, by using the plant tissue clarifying agent of the present invention, even a plant tissue having a complicated internal structure such as pistil can be observed inside without preparing a section, and thus a phenomenon occurring inside It was shown that it is also possible to observe.
試験例６．花粉管の蛍光観察
＜試験例6-1．花粉管観察用組織片の調製＞
LAT52プロモーター制御下で蛍光タンパク質（mTFP1、sGFP、Venus、又はmApple）を発現するシロイヌナズナ形質転換体を、先行文献A（Mizuta et al., (2015), Protoplasma 252, 1231-1240.）に記載の方法に従って得た。該形質転換体の花粉を野生型シロイヌナズナのめしべに受粉させ、受粉から６時間後に、めしべを4 w/v% PFA／PBS溶液を用いて、室温脱気下で60分間、固定処理した。得られためしべを、PBSで洗浄（1分間×2回）し、花粉管観察用組織片を得た。
Test Example 6. Fluorescence observation of pollen tube <Test Example 6-1. Preparation of tissue pieces for pollen tube observation>
An Arabidopsis transformant expressing a fluorescent protein (mTFP1, sGFP, Venus, or mApple) under the control of the LAT52 promoter is described in Prior Document A (Mizuta et al., (2015), Protoplasma 252, 1231-1240.). Obtained according to the method. The pollen of the transformant was pollinated by wild type Arabidopsis pistil, and 6 hours after pollination, the pistil was fixed with a 4 w / v% PFA / PBS solution at room temperature for 60 minutes under deaeration. The resulting stamen was washed with PBS (1 minute × 2 times) to obtain a tissue piece for pollen tube observation.
＜試験例6-2．花粉管の蛍光観察＞
花粉管観察用組織片を、デオキシコール酸ナトリウム濃度を7.5%(w/v)とする以外は実施例13と同様にして得られた植物組織透明化剤に浸漬し、室温下で5ヵ月間インキュベーションした。得られた組織片（透明化処理あり）、及び透明化処理なしのコントロール組織片の蛍光3D画像を、励起光波長を990 nmとする以外は試験例５と同様にして、めしべの先端から基部方向3.0μm毎のzスタックから得た。得られた蛍光3D画像の縦断面図を図５に示す。
<Test Example 6-2. Fluorescence observation of pollen tube>
The tissue piece for pollen tube observation was immersed in a plant tissue clarifier obtained in the same manner as in Example 13 except that the sodium deoxycholate concentration was 7.5% (w / v), and was kept at room temperature for 5 months. Incubated. Fluorescence 3D images of the obtained tissue piece (with clearing treatment) and the control tissue piece without clearing treatment were treated from the tip of the pistil in the same manner as in Test Example 5 except that the excitation light wavelength was 990 nm. Obtained from z-stacks in every 3.0 μm direction. FIG. 5 shows a longitudinal sectional view of the obtained fluorescent 3D image.
図５に示されるように、透明化処理ありの方では、花粉由来の花粉管がめしべ柱頭から伸びている様子が観察できた。さらに、4種の蛍光タンパク質（mTFP1、sGFP、Venus、及びmApple）それぞれを発現する花粉管同士を区別することもできた。また、5カ月間もの長期間の透明化処理にも関わらず、蛍光タンパク質由来の蛍光を明瞭に観察することができた。このことから、植物組織透明化剤は、蛍光タンパク質を含有する植物組織を、その蛍光タンパク質の蛍光能を損なうことなく、長期間保存できることが示された。 As shown in FIG. 5, it was observed that the pollen tube derived from the pollen extended from the pistil stigma in the direction with the clearing treatment. Furthermore, pollen tubes expressing each of the four fluorescent proteins (mTFP1, sGFP, Venus, and mApple) could be distinguished from each other. In addition, despite the long-term clearing treatment for 5 months, the fluorescence derived from the fluorescent protein could be clearly observed. From this, it was shown that the plant tissue clarifier can store a plant tissue containing a fluorescent protein for a long time without impairing the fluorescence ability of the fluorescent protein.
試験例７．ヒメツリガネゴケ茎葉体の蛍光観察
＜試験例7-1．茎葉体観察用組織片の調製＞
ヒメツリガネゴケGransden 2004野生株（Rensing, et al., (2008), Science 319, 64-69.）のH2B遺伝子領域にmRFPタンパク質コード領域を挿入し、mRFP融合H2Bタンパク質を発現するヒメツリガネゴケ形質転換体を得た。該形質転換体の茎葉体組織片を、4 w/v% PFA／PBS溶液を用いて、室温脱気下で60分間、固定処理した。得られた組織片を、PBSで洗浄（1分間×2回）し、茎葉体観察用組織片を得た。
Test Example 7 Fluorescence observation of Physcomitrella spp . <Test Example 7-1. Preparation of tissue pieces for foliage observation>
The mRFP protein coding region is inserted into the H2B gene region of Gransden 2004 wild strain (Rensing, et al., (2008), Science 319, 64-69.) To obtain a tiger moss transformant expressing mRFP-fused H2B protein. It was. The foliar tissue pieces of the transformant were fixed with a 4 w / v% PFA / PBS solution for 60 minutes under room temperature deaeration. The obtained tissue piece was washed with PBS (1 minute × 2 times) to obtain a tissue piece for foliage observation.
＜試験例7-2．茎葉体の蛍光観察＞
茎葉体観察用組織片を実施例13の植物組織透明化剤に浸漬し、室温で4日間インキュベーションした。得られた組織片（透明化処理あり）、及び上記固定処理前の茎葉体組織片の蛍光3D画像を、共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 780、カールツァイス社製）を用いて得た。具体的には、波長561 nmの励起光によって、波長570-668 nmの蛍光（mRFP融合H2Bタンパク質由来の蛍光）及び672-701 nmの蛍光（自家蛍光）それぞれを別々に得て、1.0μm毎の325枚のzスタックから蛍光3D画像を得た。得られた蛍光3D画像を図６に示す。なお、図６中、「蛍光タンパク質」がmRFP融合H2Bタンパク質由来の蛍光像を示し、「クロロフィル蛍光」が自家蛍光像を示し、「重ね合わせ像」はこれら２つの像を重ね合わせた像を示す。
<Test Example 7-2. Fluorescence observation of foliage>
The tissue piece for foliage observation was immersed in the plant tissue clarifier of Example 13 and incubated at room temperature for 4 days. Fluorescence 3D images of the obtained tissue piece (with clearing treatment) and the foliage tissue piece before the fixing treatment were obtained using a confocal laser scanning microscope (LSM 780, manufactured by Carl Zeiss). Specifically, fluorescence of wavelength 570-668 nm (fluorescence derived from mRFP fusion H2B protein) and fluorescence of 672-701 nm (autofluorescence) were obtained separately by excitation light of wavelength 561 nm, and each 1.0 μm Fluorescent 3D images were obtained from 325 z-stacks. The obtained fluorescence 3D image is shown in FIG. In FIG. 6, “fluorescent protein” indicates a fluorescent image derived from mRFP fusion H2B protein, “chlorophyll fluorescence” indicates an autofluorescent image, and “superimposed image” indicates an image obtained by superimposing these two images. .
ヒメツリガネゴケ等のコケ植物の原糸体は単一層構造であるが故に観察に適しているが、茎葉体は、複雑な構造及び自家蛍光によって、通常は観察が困難である。実際、図６上段に示されるように、透明化処理なしの場合では、強い自家蛍光が観察され、また先端部においてはmRFP融合H2Bタンパク質由来の蛍光はほとんど確認できなかった。しかし、図６下段に示されるように、透明化処理ありの場合では、自家蛍光が弱く、また先端部におけるmRFP融合H2Bタンパク質由来の蛍光を明瞭に確認することができた。 Although the protozoa of moss plants such as Physcomitrella is a single-layer structure, it is suitable for observation, but the foliage is usually difficult to observe due to its complicated structure and autofluorescence. In fact, as shown in the upper part of FIG. 6, strong autofluorescence was observed in the case without the clearing treatment, and almost no fluorescence derived from the mRFP fusion H2B protein could be confirmed at the tip. However, as shown in the lower part of FIG. 6, autofluorescence was weak in the case of the clearing treatment, and the fluorescence derived from the mRFP-fused H2B protein at the tip could be clearly confirmed.
試験例８．種々の植物の透明化処理
トレニア、ペチュニア等の園芸植物、及びタバコ、トマト、キュウリ等の作物の葉を、4 w/v% PFA／PBS溶液を用いて、室温脱気下で60分間、固定処理した。得られためしべを、PBSで洗浄（1分間×2回）した。得られた葉を、実施例13の植物組織透明化剤に浸漬し、室温下で6日間インキュベーションした。得られた組織片（透明化処理あり）、及び透明化処理なしのコントロール組織片の写真を、図７に示す。図７中、各植物の２枚の写真の内、左側の写真がコントロール組織片の写真を示し、右側の写真が透明化処理された組織片の写真を示す。
Test Example 8. Clarification of various plants Horticultural plants such as Torenia and Petunia, and leaves of crops such as tobacco, tomato and cucumber were fixed with 4 w / v% PFA / PBS solution for 60 minutes under room temperature deaeration Processed. The resulting stamens were washed with PBS (1 minute x 2). The obtained leaves were immersed in the plant tissue clarifier of Example 13 and incubated at room temperature for 6 days. A photograph of the obtained tissue piece (with clearing treatment) and a control tissue piece without the clearing treatment is shown in FIG. In FIG. 7, among the two photographs of each plant, the left photograph shows a photograph of the control tissue piece, and the right photograph shows a photograph of the tissue piece subjected to the transparent treatment.
図７より、本発明の植物組織透明化剤は、種を問わず植物組織を透明化できることが示された。 From FIG. 7, it was shown that the plant tissue clearing agent of the present invention can clear plant tissues regardless of species.
試験例９．透明化処理済み組織片の化学染色
試験例1-2で得た評価試験用植物組織片の細胞核をヘキスト33342を用いて定法に従って染色し、染色後の組織片の蛍光3D画像を、励起波長を800 nmとする以外は試験例３と同様にして得た。一方で、試験例1-2で得た評価試験用植物組織片の細胞壁をカルフロールを用いて定法に従って染色し、染色後の組織片の蛍光3D画像を試験例３と同様にして得た。得られた蛍光3D画像（上下が葉の厚み方向である）を図８に示す。
Test Example 9 The cell nucleus of the plant tissue piece for evaluation test obtained in chemical staining test example 1-2 of the transparently treated tissue piece was stained according to a standard method using Hoechst 33342, and the fluorescence 3D image of the tissue piece after staining was determined using the excitation wavelength. It was obtained in the same manner as in Test Example 3 except that the thickness was 800 nm. On the other hand, the cell wall of the plant tissue piece for evaluation test obtained in Test Example 1-2 was dyed according to a conventional method using Calflor, and a fluorescent 3D image of the tissue piece after staining was obtained in the same manner as Test Example 3. FIG. 8 shows the obtained fluorescent 3D image (upper and lower sides are the thickness direction of the leaves).
図８より、本発明の植物組織透明化剤で処理した植物組織は、化学染色可能であることが示された。 FIG. 8 shows that the plant tissue treated with the plant tissue clarifying agent of the present invention can be chemically stained.
Claims (12)
で表されるアルコールアミンである、請求項１〜４のいずれかに記載の植物組織透明化剤。 The alcohol amine is represented by the general formula (1):
The plant tissue clarifier according to any one of claims 1 to 4, which is an alcoholamine represented by the formula:
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