JP6588765B2 - DNA adsorption carrier and method of using the same - Google Patents
DNA adsorption carrier and method of using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP6588765B2 JP6588765B2 JP2015157026A JP2015157026A JP6588765B2 JP 6588765 B2 JP6588765 B2 JP 6588765B2 JP 2015157026 A JP2015157026 A JP 2015157026A JP 2015157026 A JP2015157026 A JP 2015157026A JP 6588765 B2 JP6588765 B2 JP 6588765B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- apatite
- sample
- apatite particles
- strontium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
本発明は、試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法に関する。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着（溶出）することが可能なＤＮＡ吸着担体に関する。更に、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法に関する。 The present invention relates to a DNA adsorption carrier that can be effectively used for efficiently separating and purifying DNA contained in a sample, and a method for using the same. In particular, the present invention relates to a DNA adsorption carrier capable of selectively adsorbing DNA and easily desorbing (eluting) the adsorbed DNA. Furthermore, the present invention relates to a DNA adsorption carrier that can be suitably used for amplification of DNA by PCR (polymerase chain reaction) and a method for using the same.
細胞からＤＮＡを分離する方法として従来から広く用いられる方法として、最初に細胞壁を界面活性剤やタンパク質分解酵素、あるいはアルカリなどの薬品を用いて分解し、次いでフェノール・クロロホルム処理によりタンパク質を除去後、アルコールを添加してＤＮＡを沈殿回収する方法が用いられる。こうした方法では、試料中に含まれるＤＮＡの量が十分多く、試料中に例えば１００μｇから数ｍｇ程度のオーダーで含まれている場合には回収が可能であるが、これ以下の濃度で含まれている場合には回収が困難であり、更にはこうした方法では、定量性をもってＤＮＡを回収する必要がある場合に問題があった。加えて、操作方法において健康上及び環境上極めて有害なフェノール及びクロロホルムを使用すること自体が問題であり、取り扱い上、作業環境中における有機溶剤の吸入や皮膚への接触を防止する方策が必須であり、また発生する有機廃液の処理や保管についても問題があった。 As a widely used method for separating DNA from cells, the cell wall is first decomposed with a detergent, proteolytic enzyme, or a chemical such as alkali, and then the protein is removed by phenol / chloroform treatment. A method of precipitating and collecting DNA by adding alcohol is used. In such a method, if the amount of DNA contained in the sample is sufficiently large and contained in the sample on the order of, for example, about 100 μg to several mg, recovery is possible. In such a method, there is a problem when it is necessary to recover DNA with quantitativeness. In addition, the use of phenol and chloroform, which are extremely harmful to health and the environment, in the operation method itself is a problem. In handling, measures to prevent inhalation of organic solvents and contact with the skin in the work environment are essential. In addition, there was a problem with the processing and storage of the generated organic waste liquid.
上記の問題を解決するための手段として、例えば非特許文献１に示されるように、ヒドロキシアパタイト粒子を吸着剤として用い、細胞壁を溶解してＤＮＡを遊離した試料溶液にヒドロキシアパタイト粒子を加えることでＤＮＡをこれに吸着させ、ＤＮＡを吸着したヒドロキシアパタイト粒子を試料溶液から分離することで、ＤＮＡを選択的に試料溶液から分離する方法が知られている。しかしながら、こうした方法ではヒドロキシアパタイト表面にＤＮＡが強固に吸着するため、試料溶液からＤＮＡを吸着によって分離した後に、ＤＮＡをヒドロキシアパタイト粒子表面から脱着させることが困難であり、そのため０．５モル／Ｌ前後の高濃度のリン酸ナトリウム水溶液を用いてＤＮＡを脱着させる必要があった。こうした方法で単離されたＤＮＡを含む水溶液は高濃度でリン酸ナトリウムなどの無機物を含有するため、そのままではＰＣＲ法に利用することができず、無機物濃度を低下させる目的で、例えば透析などでリン酸ナトリウムなどの低分子の無機物を取り除く必要があり、その過程でＤＮＡの切断や変性が生じる問題があった。 As a means for solving the above problem, for example, as shown in Non-Patent Document 1, hydroxyapatite particles are used as an adsorbent, and the hydroxyapatite particles are added to a sample solution in which cell walls are dissolved to release DNA. A method is known in which DNA is selectively separated from the sample solution by adsorbing the DNA to this and separating the hydroxyapatite particles having adsorbed the DNA from the sample solution. However, in such a method, since DNA is strongly adsorbed on the surface of hydroxyapatite, it is difficult to desorb DNA from the surface of hydroxyapatite particles after separating the DNA from the sample solution by adsorption. It was necessary to desorb DNA using high-concentration sodium phosphate aqueous solutions before and after. Since the aqueous solution containing DNA isolated by such a method contains a high concentration of inorganic substances such as sodium phosphate, it cannot be used as it is in the PCR method. For the purpose of lowering the inorganic substance concentration, for example, by dialysis or the like. It was necessary to remove low-molecular inorganic substances such as sodium phosphate, and there was a problem that DNA was cleaved or denatured in the process.
これに対して、例えば特開平７−１４３８７９号公報（特許文献１）には、ヒドロキシアパタイトに吸着したＤＮＡを脱着する方法として、尿素を添加したリン酸ナトリウムで洗浄し、その後極めて高濃度のリン酸アンモニウム水溶液を用いてＤＮＡを脱着させた後に、アルコールを用いてＤＮＡを沈殿回収する方法も示されている。この場合、ＤＮＡ分子を溶解したリン酸アンモニウム水溶液中のリン酸アンモニウムは、アルコールに沈殿しないことからＤＮＡのみを沈殿回収することが可能であるが、やはり微量のＤＮＡを分離精製し、定量的に回収することは困難であった。また特開平１０−１５５４８１号公報（特許文献２）、特開平１１−９２４９４号公報（特許文献３）、特開２０００−２３６６８号公報（特許文献４）、特開２００７−２３８４７９号公報（特許文献５）等にも、ヒドロキシアパタイトに吸着したＤＮＡを脱着する方法が記載されているが、これらにおいても、表面にＤＮＡが強固に吸着するヒドロキシアパタイトを用いる方法であるため、微量のＤＮＡを分離精製し、定量的に回収することは困難であった。 On the other hand, for example, in JP-A-7-143879 (Patent Document 1), as a method for desorbing DNA adsorbed on hydroxyapatite, it is washed with sodium phosphate to which urea is added, and then an extremely high concentration of phosphorous. A method for precipitating and recovering DNA using alcohol after desorbing DNA using an aqueous ammonium acid solution is also shown. In this case, the ammonium phosphate in the aqueous ammonium phosphate solution in which the DNA molecules are dissolved does not precipitate in the alcohol, so it is possible to precipitate and recover only the DNA. It was difficult to recover. JP-A-10-155481 (Patent Document 2), JP-A-11-92494 (Patent Document 3), JP-A 2000-23668 (Patent Document 4), JP-A 2007-238479 (Patent Document). 5) etc. also describe a method for desorbing DNA adsorbed on hydroxyapatite. However, these methods also use hydroxyapatite on which DNA is strongly adsorbed on the surface. However, it was difficult to recover quantitatively.
更には、通常ヒドロキシアパタイトはＤＮＡだけでなく、様々なタンパク質に対しても相互作用を及ぼし、これらを強く吸着することが知られている。通常ＤＮＡを分離しようとする検体中には、ＤＮＡのみならず様々なタンパク質や糖類が存在し、これらがヒドロキシアパタイト粒子に競争的に吸着するため、ＤＮＡを選択的に吸着させ、これを分離精製することは困難である場合があった。 Furthermore, it is known that hydroxyapatite usually interacts not only with DNA but also with various proteins and strongly adsorbs them. Usually, in a sample to be separated from DNA, there are various proteins and saccharides as well as DNA, and these are adsorbed competitively to hydroxyapatite particles, so that DNA is selectively adsorbed and separated and purified. Sometimes it was difficult to do.
上記のようにタンパク質などの様々な夾雑物を含有する検体試料中から微量のＤＮＡを担体に吸着させて定量的に分離回収し、精製した後にこれを担体から脱着して得られたＤＮＡは、通常ＰＣＲ法等により増幅され、同定又は解析される。例えばＤＮＡの増幅による同定を行うＰＣＲ法の具体的な用途として、各種臨床診断への応用が挙げられる。例えば各種細菌やウィルスの保有するＤＮＡを同定することで、対象者がこれら細菌やウィルスに感染しているか否かの診断に利用することができる。特に近年リアルタイムＰＣＲ法の普及により、より迅速かつ正確に臨床診断が下されるようになり、例として、鳥インフルエンザ感染や各種ヘルペスウィルス感染の診断、麻疹の臨床診断、更に結核感染の診断法として既に広く普及している。これらのうちでも特に結核感染検査法としてリアルタイムＰＣＲ法を用いた検査方法（例えば非特許文献２）が保険適用されており、このようなリアルタイムＰＣＲ法やこれ以外にもＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの方法も含めた核酸増幅法は国内で年間１００万件程度の検査が行われている。リアルタイムＰＣＲ法を用いる結核感染検査法として、具体的には、喀痰２ｍＬを被験者から採取し、喀痰溶解剤を用いて、喀痰中に含まれる結核菌の細胞壁を溶解し均質化した後、前述したフェノール・クロロホルム処理でタンパク質を除き、次いでアルコール中にＤＮＡを析出させて分離する方法が用いられる。こうした方法では、結核菌を４〜８週間かけて培養し同定していたかつての標準方法と比較すると飛躍的に検査時間が短縮されてはいるものの、それでも検査に要する所要日数は３〜５日間と依然長期間を要するのが現状である。リアルタイムＰＣＲ法自体は数時間程度で完了するため、こうした長期間の検査は、もっぱら検体からのＤＮＡの分離精製に手間がかかることに起因している。 As described above, a small amount of DNA is adsorbed on a support from a sample sample containing various contaminants such as proteins, quantitatively separated and recovered, purified, and then desorbed from the support. Usually, it is amplified and identified or analyzed by the PCR method or the like. For example, specific uses of the PCR method for identification by DNA amplification include application to various clinical diagnoses. For example, by identifying DNAs possessed by various bacteria and viruses, it can be used for diagnosis of whether or not the subject is infected with these bacteria and viruses. In particular, with the spread of real-time PCR in recent years, clinical diagnosis has been made more quickly and accurately. Examples include diagnosis of avian influenza infection and various herpesvirus infections, clinical diagnosis of measles, and diagnosis of tuberculosis infection. Already widely used. Among these, in particular, a test method using a real-time PCR method (for example, Non-Patent Document 2) is applied as a test method for tuberculosis infection. In addition, nucleic acid amplification methods including methods such as TRC (translation reverse transcription conjugated reaction) and the like are inspected annually in Japan about 1 million cases. As a tuberculosis infection test method using a real-time PCR method, specifically, 2 mL of sputum was collected from a subject, and the cell wall of M. tuberculosis contained in the sputum was dissolved and homogenized using a sputum lysing agent, and then described above. A method is used in which protein is removed by phenol / chloroform treatment, and then DNA is precipitated in alcohol to separate it. In this method, although the test time is drastically shortened compared to the former standard method in which M. tuberculosis has been cultured and identified over 4 to 8 weeks, the time required for the test is still 3 to 5 days. The current situation is that it still takes a long time. Since the real-time PCR method itself is completed in about several hours, such a long-term test is mainly due to the time and effort required to separate and purify DNA from the specimen.
近年国内のみならず国際的にも、結核感染の有無に関し、迅速かつ見落としのない正確性をもって診断検査を行う必要性が改めて認識されており、国内外を問わず結核感染撲滅対策が精力的に施策されているにもかかわらず、現実的には一向に感染数が減少しないのが現状である。このため、感染拡大を防止するには一刻も早い診断検査法の確立と、検査精度の向上が必須であることは言うまでもない。 In recent years, not only in Japan but also internationally, the necessity of conducting diagnostic tests with the accuracy of speedy and overlookedness regarding the presence or absence of tuberculosis infection has been recognized again. Despite the measures being taken, the current situation is that the number of infections does not decrease in reality. For this reason, it goes without saying that the establishment of a diagnostic test method as soon as possible and the improvement of test accuracy are essential to prevent the spread of infection.
結核の最も重篤な病態の一つに結核性髄膜炎が挙げられる。この場合、初期には髄液所見が結核に典型的でない事例が多く、検出感度や検査に要する時間の長さに問題のある代表的な事例の一つに挙げられる。これに対する改良法として、近年、２組のプライマーペアを利用した２段階のＰＣＲ法を利用する高感度のＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法が開発されている。例えば非特許文献３には、高感度Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法と迅速リアルタイムＰＣＲ法を組み合わせた新たな臨床検査方法が示されている。しかしながら、この場合においても検体からのＤＮＡの分離精製方法は従来からの常法が用いられており、この部分における改良が必要であるのが現状である。
One of the most serious conditions of tuberculosis is tuberculous meningitis. In this case, there are many cases in which CSF findings are not typical of tuberculosis in the early stage, and one of the typical cases where there is a problem with the detection sensitivity or the length of time required for the examination. As an improved method for this, a highly sensitive nested PCR method using a two-step PCR method using two primer pairs has been developed in recent years. For example, Non-Patent
また最近、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法という、ＰＣＲ法のような装置を用いることなく簡便にＤＮＡを増幅する方式が開発され、比較的安価に結核やマイコプラズマなどの感染に対する診断検査に用いられている。この方法は、溶菌後に溶出したＤＮＡをそれ以外の夾雑物と分離するため、夾雑物に対する吸着剤を含んだチューブに検体を加えてＤＮＡを精製して用いる方法で、ＤＮＡを比較的高純度に含む場合においてその増幅を有効に行うことのできる方法である。こうしたＬＡＭＰ法は、検体に標的とするＤＮＡが含まれているか否かを定性的に判定することを主たる目的とし、定量性がないため、検出感度限界付近にあるＤＮＡ濃度で検体中に含まれる場合、時として誤って陰性の判定が下される可能性が指摘される。このＬＡＭＰ法を利用する場合においても、検体中に含まれる微量のＤＮＡを効率よく高純度に分離精製する方法が望まれているのが現状である。 Recently, a method of simply amplifying DNA called a LAMP (loop-mediated thermal amplification) method without using a device such as a PCR method has been developed, and it is used for diagnostic tests for infections such as tuberculosis and mycoplasma at a relatively low cost. It has been. In this method, the DNA eluted after lysis is separated from other contaminants. Therefore, the sample is added to a tube containing an adsorbent for the contaminants, and the DNA is purified and used. In this case, the amplification can be effectively performed. The LAMP method is mainly intended to qualitatively determine whether or not the target DNA is contained in the sample, and since it is not quantitative, it is contained in the sample at a DNA concentration near the detection sensitivity limit. In some cases, it is sometimes pointed out that a negative judgment may be made. Even when this LAMP method is used, there is a demand for a method for efficiently separating and purifying a minute amount of DNA contained in a sample with high purity.
本発明は、試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法を与えることを課題とする。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着することが可能なＤＮＡ吸着担体及び、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法を与えることを課題とする。 An object of the present invention is to provide a DNA adsorption carrier that can be effectively used for efficiently separating and purifying DNA contained in a sample, and a method for using the same. In particular, a DNA adsorption carrier capable of selectively adsorbing DNA and easily desorbing the adsorbed DNA, a DNA adsorption carrier that can be suitably used for amplification of DNA by the PCR method, and a method for using the same. The challenge is to give.
上記した本発明の課題は、下記１〜５に示す手段により本質的には解決される。
１．ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含むＤＮＡ吸着担体。
２．ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されている上記１に記載のＤＮＡ吸着担体。
３．液体採取用ピペットの吸液部内に設置される上記１または２に記載のＤＮＡ吸着担体。
４．上記１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着し、得られたＤＮＡを含む水溶液を試料としてＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。
５．上記１に記載のＤＮＡ吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法。
The above-described problems of the present invention are essentially solved by the means shown in the following 1 to 5.
1. A DNA adsorption carrier containing apatite particles containing strontium.
2. 2. The DNA adsorption carrier according to 1 above, wherein apatite particles containing strontium are fixed to a fiber matrix having liquid permeability.
3. 3. The DNA adsorption carrier according to 1 or 2 above, which is installed in a liquid absorption part of a liquid collecting pipette.
4). Using the DNA adsorption carrier according to any one of 1 to 3 above, DNA is adsorbed and separated from a sample solution containing DNA, and an aqueous solution containing phosphate at a concentration of 0.05 to 0.3 mol / L is obtained. A method for using a DNA adsorption carrier that is used for nucleic acid amplification by PCR using an aqueous solution containing the obtained DNA as a sample after desorbing the adsorbed DNA.
5). A method for using a DNA adsorption carrier, wherein the DNA adsorption carrier according to 1 is used as a fixed layer for liquid chromatography.
試料中に含まれるＤＮＡを効率的に分離し精製するために有効に用いることのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法が与えられる。特に、選択的にＤＮＡを吸着し、かつ吸着したＤＮＡを容易に脱着することが可能なＤＮＡ吸着担体を与え、更に、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅に好適に利用することのできるＤＮＡ吸着担体とその利用方法が与えられる。 A DNA adsorption carrier that can be used effectively for efficiently separating and purifying DNA contained in a sample and a method for using the same are provided. In particular, a DNA adsorption carrier capable of selectively adsorbing DNA and easily desorbing the adsorbed DNA is provided, and further a DNA adsorption carrier that can be suitably used for amplification of DNA by PCR method and its Usage instructions are given.
本発明のＤＮＡ吸着担体は、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を含む。
本発明は、ＤＮＡ吸着担体としてストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いることで、各種ＤＮＡを選択的に効率よく吸着するとともに、吸着したＤＮＡを比較的低濃度のリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着担体から脱着することができることを見出したことにより成された。すなわち、本発明者らは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子がタンパク質よりもＤＮＡを優先的に吸着し、かつ吸着したＤＮＡが、後述するように比較的低濃度のリン酸塩水溶液を用いることで容易に該アパタイト粒子から脱着することを見出した。このことは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対するＤＮＡの吸着が穏和な状態で維持されており、これに対して、該アパタイト粒子のタンパク質に対する吸着力が、ＤＮＡと比べて更にいっそう弱いことを意味している。具体的な吸着や脱着に関する条件については後述する実施例の中で詳しく説明する。
The DNA adsorption carrier of the present invention includes apatite particles containing strontium.
The present invention uses apatite particles containing strontium as a DNA adsorbing carrier, thereby selectively adsorbing various DNAs efficiently and using an aqueous solution containing a relatively low concentration of phosphate. It was made by finding that it can be desorbed from. That is, the present inventors easily adsorbed DNA over strontium-containing apatite preferentially over protein, and the adsorbed DNA was easily obtained by using a relatively low concentration phosphate aqueous solution as described later. It was found to desorb from the apatite particles. This means that the adsorption of DNA to the apatite particles containing strontium is maintained in a mild state, whereas the adsorption force of the apatite particles to the protein is much weaker than that of DNA. Yes. Specific conditions relating to adsorption and desorption will be described in detail in the examples described later.
本発明においてストロンチウムを含むアパタイト粒子とは、一般式Ｃａ１０−ｘＳｒｘ（ＰＯ４）６−ｙ（ＣＯ３）ｙＸ２において、ｘが１〜１０の範囲の任意の実数を表し、ｙが０〜２の範囲の任意の実数を表し、Ｘが水酸基またはハロゲン基である化合物からなる固体粒子を意味する。ｘが１未満である場合には、ストロンチウムを含む効果が顕著でなくなり、本発明の効果が認められない場合がある。また、本発明において用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子には炭酸イオンがリン酸イオンと置換する形で含まれるストロンチウムを含む炭酸アパタイトの粒子も好ましく用いることができ、この場合、式中においてｙの値は０＜ｙ≦２の範囲の任意の数値をとることが好ましい。ｙが２を超える場合には、炭酸ストロンチウムの形で不純物が含まれる場合があり、こうした場合にはＤＮＡを選択的に吸着する性質が認められない場合がある。ｘは、好ましくは７〜１０である。 In the present invention, apatite particles containing strontium represent an arbitrary real number in the range of 1 to 10 in the general formula Ca 10-x Sr x (PO 4 ) 6-y (CO 3 ) y X 2 , y Represents an arbitrary real number in the range of 0 to 2, and means a solid particle made of a compound in which X is a hydroxyl group or a halogen group. When x is less than 1, the effect including strontium is not significant, and the effect of the present invention may not be recognized. In addition, the strontium-containing apatite particles that can be used in the present invention can also be preferably used strontium-containing carbonate apatite particles in which carbonate ions are substituted for phosphate ions. The value of is preferably an arbitrary value in the range of 0 <y ≦ 2. When y exceeds 2, impurities may be contained in the form of strontium carbonate. In such a case, the property of selectively adsorbing DNA may not be observed. x is preferably 7 to 10.
本発明において用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子の合成方法については従来から知られている種々の合成方法を利用することが可能であり、例えば特開２０１４−１８０４９１号公報、特開２０１５−０８６０８１号公報、特開２０１５−０８６０８２号公報、特開２０１５−０８６０８４号公報、特開２０１５−０８６０９７号公報、特開２０１５−０９３８２５号公報などに開示される合成方法を利用して得られる各種ストロンチウムを含むアパタイト粒子を本発明に利用することが最も好ましい。 As a method for synthesizing apatite particles containing strontium that can be used in the present invention, various conventionally known synthesis methods can be used. For example, JP-A-2014-180491 and JP-A-2015-086081. Various strontium obtained by using a synthesis method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-060882, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-086084, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-086097, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-093825, etc. Most preferably, the apatite particles contained are utilized in the present invention.
本発明で用いることのできるストロンチウムを含むアパタイト粒子として、特開２０１５−０８６０８１号公報、特開２０１５−０８６０８２号公報、特開２０１５−０８６０８４号公報、特開２０１５−０８６０９７号公報などに記載される炭酸イオンを含む炭酸ストロンチウムアパタイトの粒子も好ましく用いることができる。あるいは、特開２０１５−０９３８２５号公報等に記載されるようなストロンチウムを含むフッ素アパタイト粒子を用いることも好ましく行われる。 Examples of apatite particles containing strontium that can be used in the present invention are described in JP-A No. 2015-060881, JP-A No. 2015-060882, JP-A No. 2015-086084, JP-A No. 2015-086097, and the like. Strontium carbonate apatite particles containing carbonate ions can also be preferably used. Alternatively, it is also preferable to use fluorapatite particles containing strontium as described in JP-A-2015-093825.
本発明においてストロンチウムを含むアパタイト粒子の大きさに関しては特に制限はないが、体積平均粒子径で１０μｍを超える場合には、顆粒状粒子としてこれをＤＮＡ吸着担体としてそのまま利用することも好ましく行うことができる。更にこれを液体クロマトグラフィーの固定層として用いることも好ましい。例えば、カラムに充填してカラムクロマトグラフィーの充填剤として利用することで、試料溶液からＤＮＡを吸着分離するために利用することも好ましく行うことができる。
ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径の上限は特に限定されないが、例えば、１０００μｍ以下であることが好ましい。なお本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径は、光回折法又は光散乱法により測定される。
In the present invention, the size of the apatite particles containing strontium is not particularly limited. However, when the volume average particle diameter exceeds 10 μm, it is preferable to use the particles as granulated particles as they are as a DNA adsorption carrier. it can. Furthermore, it is also preferable to use this as a fixed layer of liquid chromatography. For example, it can be preferably used for adsorbing and separating DNA from a sample solution by filling the column and using it as a packing material for column chromatography.
The upper limit of the volume average particle diameter of the apatite particles containing strontium is not particularly limited, but is preferably 1000 μm or less, for example. In the present invention, the volume average particle diameter of the apatite particles containing strontium is measured by a light diffraction method or a light scattering method.
ストロンチウムを含むアパタイト粒子の大きさとして体積平均粒子径が１０μｍ以下である場合にはこれを微粉体として繊維マトリックスに担持させて用いることも好ましく行うことができる。ここで繊維マトリックスとは、ポリエステル繊維、ナイロン繊維などの各種プラスチック繊維や、木綿、綿花などの天然繊維、あるいは、ガラス繊維や金属繊維などの繊維の集合体で構成されるシート状、綿状、布状、帯状、紐状、袋状などの形状を有する３次元マトリックスが挙げられる。繊維マトリックスは、通液性を有することが好ましい。繊維マトリックスに微粉体である該アパタイト粒子が担持されていると、これにＤＮＡを含む試料溶液を通液する際に、担持されている微粉体である該アパタイト粒子にＤＮＡが吸着保持されることで、試料溶液からＤＮＡを分離することが可能となる。この場合、該アパタイト粒子は繊維マトリックスから脱離しないように固定されていることが好ましい。
本発明においては、ストロンチウムを含むアパタイト粒子が、通液性を有する繊維マトリックスに固定されていることが好ましい。
When the volume average particle diameter of the apatite particles containing strontium is 10 μm or less, it can be preferably used as a fine powder supported on a fiber matrix. Here, the fiber matrix refers to various plastic fibers such as polyester fibers and nylon fibers, natural fibers such as cotton and cotton, or sheet-like, cotton-like, which are composed of aggregates of fibers such as glass fibers and metal fibers, Examples thereof include a three-dimensional matrix having a cloth shape, a belt shape, a string shape, a bag shape, or the like. The fiber matrix preferably has liquid permeability. When the apatite particles, which are fine powder, are supported on the fiber matrix, the DNA is adsorbed and held on the apatite particles, which are the supported fine powder, when the sample solution containing DNA is passed through the fiber matrix. Thus, DNA can be separated from the sample solution. In this case, the apatite particles are preferably fixed so as not to be detached from the fiber matrix.
In the present invention, it is preferable that the apatite particles containing strontium are fixed to a fiber matrix having liquid permeability.
繊維マトリックスとして各種繊維から構成されるシート状、綿状、布状、帯状、紐状、袋状などの形状を有する３次元マトリックスの具体的な例として、各種不織布や濾布、綿等の通液性の良好な繊維基材を利用することが好ましい。また、繊維マトリックスを構成する繊維の繊維径としては１〜５０μｍの範囲にあることが好ましい。繊維マトリックスは、目付が平米当たり１〜２００ｇの範囲にあるものが好ましい。 Specific examples of the three-dimensional matrix having a sheet-like, cotton-like, cloth-like, belt-like, string-like, or bag-like shape composed of various fibers as the fiber matrix include various nonwoven fabrics, filter cloths, cotton, etc. It is preferable to use a fiber substrate having good liquidity. Moreover, it is preferable that it is in the range of 1-50 micrometers as a fiber diameter of the fiber which comprises a fiber matrix. The fiber matrix preferably has a basis weight in the range of 1 to 200 g per square meter.
本発明において繊維マトリックスに固定されるストロンチウムを含むアパタイト粒子の量には好ましい範囲が存在する。繊維マトリックスの単位面積あたりに固定される該アパタイト粒子の固形分量を以て表した場合、単位平方メートル当たり０．１〜５０ｇの範囲にある場合が好ましく、０．５〜４０ｇの範囲にある場合がより好ましい。単位平方メートル当たり０．１ｇを下回る量で該アパタイト粒子を繊維マトリックスに固定した場合、検体試料溶液からＤＮＡを吸着し分離する際に、単位面積あたり吸着されるＤＮＡの量が少なく、分離担体としての効率や利便性が低下する場合がある。あるいは、逆に単位平方メートル当たり５０ｇを上回る量で該アパタイト粒子を繊維マトリックスに固定した場合、繊維マトリックスを構成する各繊維の間隙を該アパタイト粒子が埋めることで通液性が低下し、試料溶液が通液せず、ＤＮＡの回収に支障を来す場合がある。 In the present invention, there is a preferred range for the amount of apatite particles containing strontium fixed to the fiber matrix. When expressed as the solid content of the apatite particles fixed per unit area of the fiber matrix, it is preferably in the range of 0.1 to 50 g per unit square meter, more preferably in the range of 0.5 to 40 g. . When the apatite particles are fixed to the fiber matrix in an amount of less than 0.1 g per unit square meter, when adsorbing and separating DNA from the sample solution, the amount of adsorbed DNA per unit area is small, Efficiency and convenience may be reduced. Or conversely, when the apatite particles are fixed to the fiber matrix in an amount exceeding 50 g per unit square meter, the liquid permeability is lowered by filling the gaps between the fibers constituting the fiber matrix with the sample solution. In some cases, the solution does not pass through the solution and interferes with DNA recovery.
ストロンチウムを含むアパタイト粒子を繊維マトリックスに固定する方法として、例えば種々のバインダーを利用して繊維表面に該アパタイト粒子を接着する方法が好ましく利用される。特に、用いる該アパタイト粒子の大きさが体積平均粒子径で１μｍ以下である場合には、種々のバインダーを利用して繊維マトリックスを構成する繊維表面に接着することが極めて好ましい。こうした目的で利用可能であるバインダーとして、種々のアクリル樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、アセタール樹脂、ポリアミド樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂などの疎水性ポリマーや、あるいはポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等の水溶性合成樹脂や、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系樹脂を好ましく用いることができる。特に各種水溶性樹脂をバインダーに利用する場合には、これを耐水化することで、該アパタイト粒子を繊維マトリックスに耐水固定化することが好ましい。耐水化を付与するために用いることのできる耐水化剤として、各種エポキシ系架橋剤やイソシアネート系架橋剤を各種水溶性樹脂とともに用いることを好ましく行うことができる。 As a method for fixing the apatite particles containing strontium to the fiber matrix, for example, a method of adhering the apatite particles to the fiber surface using various binders is preferably used. In particular, when the size of the apatite particles to be used is 1 μm or less in terms of volume average particle diameter, it is extremely preferable to adhere to the fiber surface constituting the fiber matrix using various binders. Various binders that can be used for such purposes include hydrophobic polymers such as various acrylic resins, vinyl acetate resins, polyester resins, polyurethane resins, acetal resins, polyamide resins, phenol resins, epoxy resins, polystyrene resins, and polyolefin resins. Alternatively, water-soluble synthetic resins such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and polyacrylic acid, and cellulose resins such as carboxymethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose can be preferably used. In particular, when various water-soluble resins are used as a binder, it is preferable to make the apatite particles water resistant and fix to the fiber matrix by making them water resistant. As a water-proofing agent that can be used to impart water resistance, it is preferable to use various epoxy-based crosslinking agents and isocyanate-based crosslinking agents together with various water-soluble resins.
上記において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対してバインダーを用いてこれを繊維マトリックスに固定する場合、該アパタイト粒子に対するバインダーの比率に好ましい範囲が存在する。好ましくは、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に対してバインダーを１０〜１００質量％用いる。該アパタイト粒子に対してバインダーを１０質量％未満で用いた場合には、バインダーを用いた効果が現れにくく、繊維マトリックスから該アパタイト粒子が脱落する場合がある。あるいは、該アパタイト粒子に対してバインダーを１００質量％を超える範囲で用いた場合には、該アパタイト粒子の表面がバインダーで被覆されることからＤＮＡの吸着が阻害され、本発明の効果が認められない場合がある。 In the above, when the apatite particles containing strontium are fixed to the fiber matrix using a binder, there is a preferable range for the ratio of the binder to the apatite particles. Preferably, 10 to 100% by mass of a binder is used with respect to the apatite particles containing strontium. When the binder is used at less than 10% by mass with respect to the apatite particles, the effect of using the binder hardly appears, and the apatite particles may fall off from the fiber matrix. Alternatively, when the binder is used in an amount exceeding 100% by mass with respect to the apatite particles, the surface of the apatite particles is coated with the binder, so that the adsorption of DNA is inhibited, and the effect of the present invention is recognized. There may not be.
本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子は、体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子として用いることがより好ましい。該アパタイト粒子の粒子径が減少するに伴い、該アパタイト粒子の表面積が飛躍的に増大することから、該アパタイト粒子単位重量あたりに吸着保持できるＤＮＡの量が格段に増大することからきわめて好ましく利用することができる。ストロンチウムを含むアパタイト粒子の体積平均粒子径の下限は、例えば、５０ｎｍ以上であることが好ましい。これよりストロンチウムを含むアパタイト粒子の粒子径が小さい場合は、ＤＮＡ吸着後に、溶液から粒子を遠心分離などの方法で分離することが困難となる場合がある。 In the present invention, the apatite particles containing strontium are more preferably used as fine particles having a volume average particle diameter of 1 μm or less. As the particle diameter of the apatite particles decreases, the surface area of the apatite particles increases dramatically, so that the amount of DNA that can be adsorbed and held per unit weight of the apatite particles increases remarkably, so that it is very preferably used. be able to. The lower limit of the volume average particle diameter of the apatite particles containing strontium is preferably 50 nm or more, for example. When the particle diameter of the apatite particles containing strontium is smaller than this, it may be difficult to separate the particles from the solution by a method such as centrifugation after the DNA adsorption.
前述した各種合成方法を用いて得られるストロンチウムを含むアパタイト粒子は、これにボールミルなどを利用する乾式粉砕処理を施すことで、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子に加工することが可能である。あるいは、水中もしくは各種有機溶剤中において各種メディアミル装置を利用した湿式分散処理を施すことで、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは体積平均粒子径が１μｍ以下である微粒子に加工することも好ましく利用することができる。 The apatite particles containing strontium obtained by using the various synthesis methods described above are subjected to a dry pulverization process using a ball mill or the like, whereby a fine powder having a volume average particle size of 10 μm or less, or a volume average particle size of 1 μm. The following fine particles can be processed. Alternatively, it is processed into a fine powder having a volume average particle diameter of 10 μm or less or a fine particle having a volume average particle diameter of 1 μm or less by applying a wet dispersion process using various media mill apparatuses in water or various organic solvents. Can also be preferably used.
本発明においてメディアミル装置を利用した上記の湿式分散処理とは、具体的には、水もしくは各種有機溶剤中にストロンチウムを含むアパタイト粒子を添加し、これに、分散処理用のメディアとしてガラスビーズやアルミナビーズ、その他のセラミックビーズ等を加えて振盪や撹拌を行い、該アパタイト粒子と該ビーズが機械的に衝突し、微粉砕されることであって、このように該アパタイト粒子の湿式分散処理を行う方法が好ましい。メディアを含まないで例えば超音波照射下で湿式分散処理を行った場合には、分散が十分に進行せず、粒子径が１０μｍを超える粗大粒子が混在するため、該アパタイト粒子を性状が整った微粉体もしくは微粒子として利用したい場合に支障を来す場合がある。あるいは、ホモジナイザーなどの高速撹拌装置を使用した場合でも、同様に粗大粒子が混在する場合があることから該アパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子としての利用に支障を来す場合がある。 In the present invention, the above-mentioned wet dispersion treatment using a media mill device specifically includes apatite particles containing strontium in water or various organic solvents, and glass beads or the like as dispersion treatment media. Alumina beads, other ceramic beads, etc. are added and shaken or stirred, and the apatite particles and the beads mechanically collide and pulverize. Thus, the wet dispersion treatment of the apatite particles is performed in this way. The method of performing is preferred. For example, when wet dispersion treatment is performed under irradiation of ultrasonic waves without containing media, the dispersion does not proceed sufficiently, and coarse particles having a particle diameter exceeding 10 μm are mixed, so that the properties of the apatite particles are aligned. There are cases in which it is difficult to use as fine powder or fine particles. Alternatively, even when a high-speed stirring device such as a homogenizer is used, coarse particles may be mixed in the same manner, which may hinder the use of the apatite particles as fine powder or fine particles.
メデイアミル装置の具体的な例を挙げると、少量をバッチ方式で湿式分散処理を行う場合には、メディアミル装置としてペイントコンディショナーを使用して数時間に亘る振盪を行うことで湿式分散処理を行うことができる。またメディアミル装置として、ダイノーミル（ＷＡＢ社製）に代表される横型ビーズミルのような連続方式での湿式分散処理が可能である装置を用いて、これを複数台用いて直列に配置して１パスで湿式分散処理を行っても良く、あるいは１台のメディアミルを用いて複数回処理を繰り返すことも好ましく行うことができる。このような湿式分散処理を行うことで、水または各種有機溶剤中においてストロンチウムを含むアパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子を製造することができる。メディアミル装置としては、これら以外にも様々な形状、タイプの装置が市販されるが、いずれの場合も、装置がメディアを用いて水中または各種有機溶剤中において湿式分散処理を行うことのできる装置であれば基本的には使用することができる。 To give a specific example of a media mill device, when a small amount is wet-dispersed in a batch system, the wet-dispersed processing is performed by shaking for several hours using a paint conditioner as a media mill device. Can do. In addition, as a media mill device, a device capable of wet dispersion processing in a continuous manner, such as a horizontal bead mill represented by Dino Mill (manufactured by WAB), is used in series with a plurality of units, and one pass. The wet dispersion treatment may be carried out at the same time, or the treatment may be preferably repeated a plurality of times using one media mill. By performing such wet dispersion treatment, fine powder or fine particles of apatite particles containing strontium in water or various organic solvents can be produced. In addition to these, various shapes and types of devices are commercially available as media mill devices. In any case, the device can perform wet dispersion processing in water or various organic solvents using media. Basically, it can be used.
上記したメディアを利用してストロンチウムを含むアパタイト粒子の湿式分散処理を行う場合に、使用するメディアはセラミックビーズを用いることが好ましい。特に、ビーズが研磨されるなどしてビーズ由来の不純物が該アパタイト粒子中に混入することを防止することが好ましく、仮に、微細に粉砕されたビーズ由来の成分が混入した場合であっても、これが該アパタイト粒子に対するＤＮＡの吸着挙動に影響を及ぼさないことが好ましい。こうした目的で利用できるセラミックビーズとして、具体的にはＺｒＯ、立方晶ジルコニア、イットリウム安定化ジルコニア、ジルコニア強化アルミナなどのジルコニアを含有するセラミックビーズを最も好ましく用いることができる。また、メディアの平均直径は０．０１〜１０ｍｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。こうしたメディアを使用したメディアミルを用いる湿式分散処理の条件は、通常行われる室温での処理であり、特に処理時間や温度等に関する制限は無い。また、パス回数については１回で十分である場合もあるが、２〜７回程度のパス回数で処理を行うことで、より粒子径分布が狭く、かつ分散安定性に優れたストロンチウムを含むアパタイト粒子の微粉体もしくは微粒子を製造することができる。 When performing wet dispersion treatment of apatite particles containing strontium using the above-mentioned media, it is preferable to use ceramic beads as the media to be used. In particular, it is preferable to prevent beads-derived impurities from being mixed into the apatite particles by polishing the beads, even if finely pulverized beads-derived components are mixed, It is preferable that this does not affect the adsorption behavior of DNA to the apatite particles. Specifically, ceramic beads containing zirconia such as ZrO, cubic zirconia, yttrium-stabilized zirconia, and zirconia-reinforced alumina can be most preferably used as the ceramic beads that can be used for such purposes. Moreover, it is preferable that the average diameter of a medium exists in the range of 0.01-10 mm, More preferably, it is 0.1-5 mm. The conditions for the wet dispersion treatment using a media mill using such media are treatments at room temperature that are usually performed, and there are no particular restrictions on treatment time, temperature, and the like. In addition, one pass may be sufficient for the number of passes, but by performing the treatment with about 2 to 7 passes, the apatite containing strontium having a narrower particle size distribution and excellent dispersion stability. Fine particles or fine particles of particles can be produced.
上記のような方法を利用して、体積平均粒子径が１０μｍ以下の微粉体、もしくは１μｍ以下の微粒子に加工したストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いて、これを繊維マトリックスに固定する具体的な方法としては、以下に述べる方法を好ましく用いることができる。例えば一つの方法として、該アパタイト粒子を水もしくは各種有機溶剤中に分散した液に必要に応じてバインダーを加えてこれを塗工液として用い、この塗工液中に繊維マトリックスを浸漬して引き上げ、余分な塗工液を除いた後、繊維マトリックスに保持された塗工液を乾燥して該アパタイト粒子を固定する方法を好ましく用いることができる。あるいは、スプレー噴霧やカーテン塗工などの方法で該塗工液を繊維マトリックスに満遍なく付着させ、その後に乾燥を行って該アパタイト粒子を固定する方法などを利用することが可能である。 Using the above method, as a specific method for fixing a fine powder having a volume average particle diameter of 10 μm or less or apatite particles containing strontium processed into fine particles of 1 μm or less to a fiber matrix The method described below can be preferably used. For example, as one method, if necessary, a binder is added to a liquid in which the apatite particles are dispersed in water or various organic solvents, and this is used as a coating liquid. The fiber matrix is immersed in the coating liquid and pulled up. A method of fixing the apatite particles by removing the excess coating solution and then drying the coating solution held on the fiber matrix can be preferably used. Alternatively, it is possible to use a method in which the coating liquid is uniformly attached to the fiber matrix by a method such as spraying or curtain coating, followed by drying to fix the apatite particles.
本発明のＤＮＡ吸着担体を用いると、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを効率的に分離し精製することができる。本発明のＤＮＡ吸着担体は、例えば、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ試料の調製等において好適に用いられる。
本発明のＤＮＡ吸着担体を用いてＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを分離し精製する方法は特に限定されない。例えば、ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、リン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着することにより、ＤＮＡを分離精製して回収することができる。
上記ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離する方法は特に限定されず、例えば、ＤＮＡを含む試料溶液と、該ＤＮＡ吸着担体とを接触させてＤＮＡ吸着担体にＤＮＡを吸着させ、次いで該ＤＮＡを吸着させたＤＮＡ吸着担体と、試料溶液とを分離することにより、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離することができる。
ＤＮＡ吸着担体に吸着したＤＮＡの脱着は、ＤＮＡを吸着したＤＮＡ吸着担体を、リン酸塩を含む水溶液と接触させることにより行うことができる。リン酸塩を含む水溶液とＤＮＡ吸着担体とを接触させることにより、吸着していたＤＮＡがストロンチウムを含むアタパイト粒子から脱着して、ＤＮＡを含む水溶液を得ることができる。
このような方法により、試料溶液に含まれるＤＮＡを分離し精製することができる。得られるＤＮＡを含む水溶液は、ＰＣＲ法による核酸増幅に用いる試料等として好適に用いることができる。
When the DNA adsorption carrier of the present invention is used, DNA can be efficiently separated and purified from a sample solution containing DNA. The DNA adsorption carrier of the present invention is suitably used, for example, for DNA purification and preparation of a DNA sample used for nucleic acid amplification by PCR.
A method for separating and purifying DNA from a sample solution containing DNA using the DNA adsorption carrier of the present invention is not particularly limited. For example, DNA can be separated and purified and recovered by adsorbing and separating DNA from a sample solution containing DNA using a DNA adsorption carrier and desorbing the adsorbed DNA using an aqueous solution containing phosphate. .
The method for adsorbing and separating DNA from a sample solution containing DNA using the DNA adsorption carrier is not particularly limited. For example, the sample solution containing DNA and the DNA adsorption carrier are brought into contact with each other to bring the DNA into the DNA adsorption carrier. By adsorbing and then separating the DNA adsorption carrier on which the DNA is adsorbed and the sample solution, the DNA can be adsorbed and separated from the sample solution containing DNA.
Desorption of the DNA adsorbed on the DNA adsorption carrier can be performed by bringing the DNA adsorption carrier adsorbed with DNA into contact with an aqueous solution containing a phosphate. By bringing the aqueous solution containing phosphate into contact with the DNA adsorption carrier, the adsorbed DNA is desorbed from the attatronite particles containing strontium, and an aqueous solution containing DNA can be obtained.
By such a method, DNA contained in the sample solution can be separated and purified. The obtained aqueous solution containing DNA can be suitably used as a sample or the like used for nucleic acid amplification by the PCR method.
本発明のＤＮＡ吸着担体は、例えば、ＤＮＡ吸着担体を液体採取用ピペット（液体を採取するピペット）の吸液部内に設置して使用することができる。このように液体採取用ピペットの吸液部内に設置されるＤＮＡ吸着担体は、本発明における好ましい実施態様の一つである。本発明のＤＮＡ吸着担体が吸液部内に設置された液体採取用ピペットを用いると、ＤＮＡを試料溶液から簡便な操作で効率よく分離し精製することができる。また、上述したようにＤＮＡ吸着担体を液体クロマトグラフィーの固定層として用いることもできる。このようなＤＮＡ吸着担体の利用方法も、本発明に包含される。 The DNA adsorption carrier of the present invention can be used, for example, by installing the DNA adsorption carrier in a liquid absorption part of a liquid collection pipette (a pipette for collecting a liquid). Thus, the DNA adsorption carrier installed in the liquid absorption part of the liquid sampling pipette is one of the preferred embodiments of the present invention. When a pipette for collecting liquid in which the DNA adsorption carrier of the present invention is installed in the liquid absorption part is used, DNA can be efficiently separated and purified from the sample solution by a simple operation. Further, as described above, the DNA adsorption carrier can also be used as a fixed layer for liquid chromatography. Such a method for using a DNA adsorption carrier is also encompassed by the present invention.
本発明において、ＤＮＡを試料溶液から分離回収するためにストロンチウムを含むアパタイト粒子を利用するための好ましい態様として、上記のように繊維マトリックスに該アパタイト粒子を固定した状態で、該繊維マトリックスを、液体採取用ピペットの吸液部内に設置して用いることを極めて好ましく行うことができる。この場合、液体採取用ピペットの吸液部として、例えば、各種分注器、ピペット、マイクロピペットの先端に取り付けて吸液を行うためのチップである場合が好ましいが、ピペット自体が吸液部を兼ねるガラスピペットやディスポーザブルタイプのプラスチック製ピペットも同様に用いることができる。このようなピペットの吸液部の内部に該アパタイト粒子を固定した繊維マトリックスを設置し、ピペット吸液部内部から該アパタイト粒子やこれを固定した繊維マトリックスが脱離することなく用いた場合、該ピペットにより試料溶液を採取することで該アパタイト粒子に試料溶液中に含まれるＤＮＡが吸着し、該ＤＮＡを分離精製することができる。後述する実施例において詳細に説明するように、具体的な手順として、下記（ｉ）〜（ｖ）を行うことで、検査しようとする試料溶液からＤＮＡを分離精製して回収することができる。
（ｉ）試料溶液を、該アパタイト粒子を設置したピペット吸液部に吸入する。
（ｉｉ）吸入した試料溶液をピペット吸液部外に排出する。
（ｉｉｉ）必要であれば手順（ｉ）及び（ｉｉ）を複数回繰り返す。
（ｉｖ）純水（イオン交換水や蒸留水など）を用いてピペット吸液部内部を洗浄する。
（ｖ）リン酸塩を溶解した水溶液を用いて、ピペット吸液部内部の該アパタイト粒子に吸着したＤＮＡを脱着させる。
特に（ｉｉｉ）の段階で、複数の試料溶液からＤＮＡの吸着を行うことで、これらに含まれるＤＮＡを濃縮した状態で分離回収することが可能である。
In the present invention, as a preferred embodiment for utilizing apatite particles containing strontium for separating and recovering DNA from a sample solution, the fiber matrix is fixed in a state where the apatite particles are fixed to the fiber matrix as described above. It is very preferable to install and use it in the liquid absorption part of the collecting pipette. In this case, the liquid collection pipette is preferably a tip for attaching a liquid to the tip of a dispenser, pipette, or micropipette, for example. A glass pipette or a disposable plastic pipette can also be used as well. When a fiber matrix in which the apatite particles are fixed is installed inside the liquid absorption part of such a pipette, and the apatite particles and the fiber matrix to which the apatite particles are fixed are used without being detached from the inside of the pipette liquid absorption part, By collecting the sample solution with a pipette, the DNA contained in the sample solution is adsorbed on the apatite particles, and the DNA can be separated and purified. As will be described in detail in the examples described later, by performing the following (i) to (v) as specific procedures, DNA can be separated and purified from the sample solution to be examined and recovered.
(I) The sample solution is sucked into a pipette sucking part provided with the apatite particles.
(Ii) The inhaled sample solution is discharged out of the pipette suction part.
(Iii) Repeat steps (i) and (ii) multiple times if necessary.
(Iv) The inside of the pipette liquid absorption part is washed with pure water (ion exchange water, distilled water, etc.).
(V) Desorbing the DNA adsorbed on the apatite particles inside the pipette liquid absorption part using an aqueous solution in which phosphate is dissolved.
In particular, by adsorbing DNA from a plurality of sample solutions at the stage (iii), it is possible to separate and recover the DNA contained therein in a concentrated state.
従来技術では、既存のアパタイトを利用した場合に、試料中の各種タンパク質や糖類がアパタイトの表面に競争的に吸着するため、試料中のＤＮＡの吸着を阻害し、ＤＮＡの回収を困難にする場合があった。更には、既存のアパタイトにＤＮＡが強固に吸着することから、吸着したＤＮＡを脱着するために極めて高濃度のリン酸塩を溶解した水溶液を用いることが必要とされ、このことがＰＣＲ法などで回収したＤＮＡの増幅や分析を行う際に妨げになる場合があった。 In the conventional technology, when existing apatite is used, various proteins and saccharides in the sample are competitively adsorbed on the surface of the apatite, thus inhibiting the adsorption of DNA in the sample and making it difficult to recover the DNA. was there. Furthermore, since DNA strongly adsorbs to existing apatite, it is necessary to use an aqueous solution in which a very high concentration phosphate is dissolved in order to desorb the adsorbed DNA. In some cases, the recovered DNA may be hindered in amplification or analysis.
試料溶液からＤＮＡを分離する際に、試料溶液の温度には好ましい範囲が存在し、２０〜８０℃の範囲に調節した試料溶液に対して該アパタイト粒子もしくはこれを担持した繊維マトリックス、あるいは上記したピペット吸液部を接触させることで、該アパタイト粒子にＤＮＡを吸着させることが好ましく行われる。例えば、ＤＮＡ吸着担体として該アパタイト粒子を単体で用いる場合には、試料溶液中に該アパタイト粒子を懸濁させ、適当な時間を経て該アパタイト粒子を濾過により回収し、次いで粒子表面に吸着したＤＮＡをリン酸塩水溶液を用いて脱着し、回収することが行われる。ＤＮＡ吸着担体として該アパタイト粒子を担持した繊維マトリックスを用いる場合も、同様にして試料溶液からＤＮＡを分離回収することが行われる。 When DNA is separated from the sample solution, there is a preferable range for the temperature of the sample solution, and the apatite particles or the fiber matrix carrying the apatite particles or the above-described sample matrix adjusted to the range of 20 to 80 ° C. It is preferable to adsorb DNA to the apatite particles by bringing the pipette liquid-absorbing part into contact. For example, when the apatite particles are used alone as a DNA adsorption carrier, the apatite particles are suspended in a sample solution, the apatite particles are collected by filtration after an appropriate time, and then adsorbed on the particle surface. Is desorbed and recovered using an aqueous phosphate solution. When a fiber matrix carrying the apatite particles is used as the DNA adsorption carrier, DNA is separated and recovered from the sample solution in the same manner.
本発明において、ストロンチウムを含むアパタイト粒子に吸着したＤＮＡを脱着する際に用いることのできるリン酸塩を含む水溶液として、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素アンモニウム等から選ばれるリン酸塩を全体で０．３モル／Ｌ以下の濃度で含む水溶液を用いることができる。好ましくは、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を使用する。こうした場合においては、ＤＮＡとともに含まれるリン酸塩の影響は、ＰＣＲ法などの分析方法において妨げとはならず、上記濃度のリン酸塩を含むＤＮＡ水溶液をＰＣＲ法の試料として好ましく利用することができる。 In the present invention, sodium phosphate, potassium phosphate, ammonium phosphate, sodium hydrogen phosphate, hydrogen phosphate are used as an aqueous solution containing phosphate that can be used when desorbing DNA adsorbed on apatite particles containing strontium. An aqueous solution containing a total of 0.3 mol / L or less of a phosphate selected from potassium, ammonium hydrogen phosphate, and the like can be used. Preferably, an aqueous solution containing a phosphate at a concentration of 0.05 to 0.3 mol / L is used. In such a case, the influence of the phosphate contained together with the DNA does not hinder the analysis method such as the PCR method, and it is preferable to use the aqueous DNA solution containing the phosphate at the above concentration as a sample for the PCR method. it can.
上記ＤＮＡ吸着担体を用いて、ＤＮＡを含む試料溶液からＤＮＡを吸着分離し、濃度０．０５〜０．３モル／Ｌでリン酸塩を含む水溶液を用いて吸着したＤＮＡを脱着し、得られたＤＮＡを含む水溶液を試料としてＰＣＲ法による核酸増幅に用いるＤＮＡ吸着担体の利用方法も、本発明に包含される。 It is obtained by adsorbing and separating DNA from a sample solution containing DNA using the above DNA adsorption carrier and desorbing the adsorbed DNA using an aqueous solution containing phosphate at a concentration of 0.05 to 0.3 mol / L. A method of using a DNA adsorption carrier used for nucleic acid amplification by PCR using an aqueous solution containing DNA as a sample is also included in the present invention.
本発明のＤＮＡ吸着担体は、上記した製造方法により製造され、その後に好ましくは滅菌処理されることが好ましい。滅菌方法としては、従来から行われているオートクレーブを用いた加熱滅菌処理や、エチレンオキサイドガスによる化学的滅菌処理、あるいはガンマ線照射や電子線照射による放射線滅菌処理方法など、いずれの方法によっても滅菌処理が可能である。 The DNA adsorption carrier of the present invention is preferably produced by the production method described above, and then preferably sterilized. Sterilization can be performed by any of the conventional methods such as heat sterilization using an autoclave, chemical sterilization using ethylene oxide gas, or radiation sterilization using gamma irradiation or electron beam irradiation. Is possible.
以下に実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率は断りのない限り質量基準である。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. In addition, the percentage in an Example is a mass reference | standard unless there is a notice.
（実施例１〜４及び比較例１）
（各種アパタイトの合成）
１Ｌの三角フラスコ内に、塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）をそれぞれ表１に示す割合で秤取り、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍＬのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ中で、５０℃に調整した水浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を１時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に１時間加熱攪拌を行った。その後水浴上から三角フラスコを移し、室温まで冷却した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、６０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物の収量は、各々の理論収量に対してほぼ１００％の収量であった。生成物を、Ｘ線回折装置（ミニフレックス、リガク社製）を用いて広角Ｘ線回折により解析した結果、アパタイトに特有の結晶回折パターンを示し、結晶性は比較的低いもののアパタイトに帰属される以外の回折ピークは認められなかった。更に、ＦＴ−ＩＲ測定において何れの試料も１４６０ｃｍ−１、１４０５ｃｍ−１及び８７０ｃｍ−１付近にＢ型炭酸アパタイトに特有の吸収が認められた。
(Examples 1-4 and Comparative Example 1)
(Synthesis of various apatites)
In a 1 L Erlenmeyer flask, strontium chloride hexahydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and calcium chloride dihydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were weighed at the ratios shown in Table 1, respectively, and ion-exchanged water was used. 350 g was added and dissolved. Separately, 40 g (0.3 mol) of diammonium hydrogen phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 16 g (0.15 mol) of sodium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) are placed in a 500 mL glass beaker. Weighed and dissolved by adding 300 g of ion exchange water. Dissolve diammonium hydrogen phosphate and sodium carbonate in an Erlenmeyer flask using a dropping funnel while stirring the aqueous solution in which both strontium chloride and calcium chloride prepared above were stirred in a water bath adjusted to 50 ° C. The aqueous solution was gradually added dropwise over 1 hour. The pH of the reaction system during the reaction was 6.5. After completion of the dropwise addition, the mixture was further heated and stirred for 1 hour. Thereafter, the Erlenmeyer flask was transferred from above the water bath and cooled to room temperature, and then the white precipitate formed using a glass filter was suction filtered. The white precipitate on the filter was further washed repeatedly with ion-exchanged water, and then dried for one day in a drier adjusted to 60 ° C. to obtain a white powder. The product yield was almost 100% of each theoretical yield. As a result of analyzing the product by wide-angle X-ray diffraction using an X-ray diffractometer (Miniflex, manufactured by Rigaku Corporation), the product shows a crystal diffraction pattern peculiar to apatite and is attributed to apatite although the crystallinity is relatively low. No diffraction peaks other than those were observed. Furthermore, FT-IR any sample in the measurement even 1460 cm -1, were observed absorption specific to B-type carbonate apatite around 1405cm -1 and 870 cm -1.
各々の実施例及び比較例で得られたアパタイトである粉体をメノウ乳鉢で磨り潰すことで体積平均粒子径が１００〜３００μｍの範囲にある粒子を得た。これらを各々試験管に１ｇずつ添加した。濃度１モル／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム（和光純薬工業社製）及びウシ血清由来アルブミン（和光純薬工業社製）を各々５００ｐｐｍの濃度に溶解した溶液を、それぞれの試験管に１０ｍＬずつ添加し、４０℃に調節した水浴中において十分に攪拌し、静置後、上澄み液を濾過して吸着処理後の試料溶液とし、次のＨＰＬＣ測定を行った。また、サケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液を濾過したものを吸着処理前の試料溶液とし、ＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣ測定条件として、カラムは水系ＧＰＣ用カラム３本（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ５０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬ、Ｇ２５００ＰＷＸＬ、全て東ソー製）を連結して使用し、移動相はｐＨ６．７のリン酸緩衝液（濃度０．１モル／ＬでＮａ２ＨＰＯ４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ２ＰＯ４を含有。）を用い、流速１ｍＬ／分、カラム温度４０℃で測定を行った。サンプルの導入量は２０μＬで行い、検出器は波長２８０ｎｍにおける紫外検出器を用いた。各々のサンプルのＨＰＬＣ測定を行った結果を図１〜５に示す。図１〜５中、実線が吸着処理前の試料のチャートであり、破線が吸着処理後の試料のチャートである。なお、アパタイト粒子の体積平均粒子径は、アパタイト粒子を水に添加し光散乱回折式粒度分布計（粒度分布測定装置ＬＡ−９２０、堀場製作所社製）を使用して測定した。 The apatite powder obtained in each example and comparative example was ground in an agate mortar to obtain particles having a volume average particle diameter in the range of 100 to 300 μm. 1 g of each was added to each test tube. Dissolve salmon semen-derived deoxyribonucleic acid sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and bovine serum-derived albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 500 ppm in Tris-HCl buffer (pH 8.0) at a concentration of 1 mol / L. 10 mL of each solution was added to each test tube, stirred well in a water bath adjusted to 40 ° C., allowed to stand, and the supernatant was filtered to obtain a sample solution after adsorption treatment, and the next HPLC measurement was performed. went. In addition, HPLC measurement was performed using a filtered solution of Tris-HCl buffer containing salmon semen-derived deoxyribonucleic acid sodium and bovine serum-derived albumin as a sample solution before the adsorption treatment. As HPLC measurement conditions Column the aqueous GPC column three (TSK-GEL G5000PW XL, G3000PW XL, G2500PW XL, all manufactured by Tosoh Corporation) was used in conjunction with phosphate buffer mobile phase pH 6.7 (concentration Using Na 2 HPO 4 at a concentration of 0.1 mol / L and KH 2 PO 4 at a concentration of 0.1 mol / L, the measurement was performed at a flow rate of 1 mL / min and a column temperature of 40 ° C. The amount of sample introduced was 20 μL, and an ultraviolet detector at a wavelength of 280 nm was used as the detector. The result of having performed the HPLC measurement of each sample is shown in FIGS. 1 to 5, the solid line is a chart of the sample before the adsorption treatment, and the broken line is a chart of the sample after the adsorption treatment. The volume average particle diameter of the apatite particles was measured by adding the apatite particles to water and using a light scattering diffraction type particle size distribution analyzer (particle size distribution measuring device LA-920, manufactured by Horiba, Ltd.).
図１は、比較例１において、ストロンチウムを含まないアパタイト粒子である炭酸アパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。吸着処理前では、ＤＮＡ及びアルブミンは図中に示す位置に分離して溶出されるが、吸着処理後においては、ＤＮＡはアパタイト粒子に吸着して溶出されず、一方アルブミンも、その大部分が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。この例では、ストロンチウムを含まないアパタイト粒子はＤＮＡ及びアルブミンの両方に対して高い吸着能力を示すことが明らかとなった。 FIG. 1 shows an HPLC measurement chart of a sample solution before and after adsorption treatment of DNA and albumin when carbonate apatite particles, which are apatite particles not containing strontium, are used in Comparative Example 1. Before adsorption treatment, DNA and albumin are separated and eluted at the positions shown in the figure, but after adsorption treatment, DNA is adsorbed on apatite particles and is not eluted, while albumin is mostly adsorbed. Was found to have been removed from the sample solution. In this example, it was revealed that the apatite particles containing no strontium showed a high adsorption ability for both DNA and albumin.
図２は、実施例１において、カルシウムを含まずストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡの大部分はアパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれており（約８０％程度吸着して試料溶液から取り除かれている）、一方アルブミンは、その大部分がアパタイト粒子に吸着せずに試料溶液に残されていることが分かった。この実施例１では、ストロンチウムを含むアパタイト粒子はＤＮＡに対する高い吸着能力を示す一方で、アルブミンに対する吸着能力が顕著に低下しており、ＤＮＡに対する高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。 FIG. 2 shows an HPLC measurement chart of the sample solution before and after the adsorption treatment of DNA and albumin when using apatite particles not containing calcium but containing strontium in Example 1. In this case, most of the DNA is adsorbed on the apatite particles after the adsorption treatment and removed from the sample solution (about 80% is adsorbed and removed from the sample solution), whereas albumin is mostly composed of It was found that the sample solution was not adsorbed on the apatite particles. In Example 1, it was revealed that the apatite particles containing strontium showed high adsorption ability for DNA, while the adsorption ability for albumin was remarkably reduced, and showed high selective adsorption property for DNA.
図３は、実施例２において、カルシウムとストロンチウムを１：４のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡの大部分は該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンは、該アパタイト粒子に吸着せずにほぼ全量が試料溶液中に取り残されていることが明らかとなった。この実施例２では、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対する極めて高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。 FIG. 3 shows an HPLC measurement chart of the sample solution before and after the adsorption treatment of DNA and albumin when using apatite particles containing calcium and strontium in a molar ratio of 1: 4 in Example 2. In this case, after the adsorption treatment, most of the DNA is adsorbed on the apatite particles and removed from the sample solution, while albumin is not adsorbed on the apatite particles and almost all the amount is left in the sample solution. It became clear. In Example 2, it was revealed that when apatite particles containing strontium were used, extremely high selective adsorption property to DNA was exhibited.
図４は、実施例３において、カルシウムとストロンチウムを１：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡはほぼ３５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンは、該アパタイト粒子に吸着せずにほぼ全量が試料溶液中に取り残されていることが明らかとなった。この実施例３でも、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対する高い選択吸着性を示すことが明らかとなった。 FIG. 4 shows an HPLC measurement chart of the sample solution before and after the adsorption treatment of DNA and albumin when using apatite particles containing calcium and strontium in a molar ratio of 1: 1 in Example 3. In this case, approximately 35% of DNA is adsorbed to the apatite particles after the adsorption treatment and removed from the sample solution, while albumin is not adsorbed to the apatite particles and almost the entire amount remains in the sample solution. It became clear. Also in this Example 3, it was revealed that when apatite particles containing strontium were used, a high selective adsorption property to DNA was exhibited.
図５は、実施例４において、カルシウムとストロンチウムを４：１のモル比で含むアパタイト粒子を用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。この場合、吸着処理後においてＤＮＡはほぼ３５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれ、一方アルブミンはほぼ１５％程度が該アパタイト粒子に吸着して試料溶液より取り除かれていることが明らかとなった。この実施例４でも、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合、ＤＮＡに対するある程度の選択吸着性を示すことが明らかとなった。 FIG. 5 shows an HPLC measurement chart of the sample solution before and after the adsorption treatment of DNA and albumin when using apatite particles containing calcium and strontium in a molar ratio of 4: 1 in Example 4. In this case, about 35% of the DNA is adsorbed on the apatite particles after the adsorption treatment and removed from the sample solution, while about 15% of the albumin is adsorbed on the apatite particles and removed from the sample solution. Became clear. Also in Example 4, it was revealed that when apatite particles containing strontium were used, a certain degree of selective adsorption to DNA was exhibited.
（比較例２）
比較例２として、市販されるヒドロキシアパタイトであるＨＡＰ−１００（医薬品グレード高純度ヒドロキシアパタイト：Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、太平化学産業社製）を用いて、先の実施例及び比較例と同様にして試料作製及びＨＰＬＣ測定を行った。図６に結果を示す。図６は比較例２において、市販のヒドロキシアパタイトを用いた際の、ＤＮＡ及びアルブミンの吸着処理前後の試料溶液のＨＰＬＣ測定チャートを示す。図６中、実線が吸着処理前の試料のチャートであり、破線が吸着処理後の試料のチャートである。この場合、吸着処理後においてＤＮＡは該アパタイトに少量吸着されており、一方アルブミンに対する吸着性がより高い結果であった。この例では、試料溶液中からＤＮＡを選択的に吸着分離することはできなかった。
(Comparative Example 2)
As Comparative Example 2, using the commercially available hydroxyapatite HAP-100 (pharmaceutical grade high purity hydroxyapatite: Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , manufactured by Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Sample preparation and HPLC measurement were performed in the same manner as in the comparative example. The results are shown in FIG. FIG. 6 shows HPLC measurement charts of the sample solution before and after the adsorption treatment of DNA and albumin when using commercially available hydroxyapatite in Comparative Example 2. In FIG. 6, the solid line is a chart of the sample before the adsorption treatment, and the broken line is a chart of the sample after the adsorption treatment. In this case, a small amount of DNA was adsorbed to the apatite after the adsorption treatment, while the adsorptivity to albumin was higher. In this example, it was not possible to selectively adsorb and separate DNA from the sample solution.
（実施例５）
実施例２で用いたカルシウムとストロンチウムを１：４のモル比で含むアパタイト粒子を用いて、乾式ボールミルにより微粉砕を行い、体積平均粒子径が５μｍである微粉体を得た。次に、ガラス製パスツールピペットの先端内面部分にカット綿を詰めて層とし、これに水中でスラリーにした上記アパタイト微粉体を通液してカット綿上でろ過を行い、該アパタイト微粉体をカット綿の上面及び内部に固定化した。蒸留水を用いて数回このパスツールピペットの内部を洗浄した場合、内部に固定化された該アパタイト微粉体が流出しないことを確認した。次に、先の実施例及び比較例で使用したサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液１０ｍＬを液温２０℃にして、このパスツールピペットのアパタイト微粉体を含むカット綿の層に通液し、回収した液について先と同様にしてＨＰＬＣ測定を行った。その結果、試料溶液に含まれていたＤＮＡのうち約５０％が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。
(Example 5)
Using apatite particles containing calcium and strontium in a molar ratio of 1: 4 used in Example 2, fine pulverization was performed by a dry ball mill to obtain a fine powder having a volume average particle diameter of 5 μm. Next, cut cotton is packed into the inner surface of the tip of a glass Pasteur pipette to form a layer, and the apatite fine powder slurried in water is passed through this and filtered on the cut cotton. Immobilized on the top and inside of cut cotton. When the interior of this Pasteur pipette was washed several times with distilled water, it was confirmed that the apatite fine powder immobilized inside did not flow out. Next, 10 mL of Tris-HCl buffer solution containing deoxyribonucleic acid sodium salt derived from salmon semen and albumin derived from bovine serum used in the previous examples and comparative examples was brought to a liquid temperature of 20 ° C., and the apatite fine powder of this Pasteur pipette was included. The solution was passed through a cut cotton layer, and the collected liquid was subjected to HPLC measurement in the same manner as described above. As a result, it was found that about 50% of the DNA contained in the sample solution was removed from the sample solution by adsorption. On the other hand, the effect of adsorption was not observed for albumin, and almost the entire amount was left in the sample solution.
次に、上記と同様にして作製した該アパタイト微粉体をカット綿に固定化して吸液部内部に設置したパスツールピペットを用いて、サケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液の液温を５０℃として通液する以外は上記と同様にして試料作製及びＨＰＬＣ測定を行った。その結果、試料溶液に含まれていたＤＮＡの全量が吸着により試料溶液から取り除かれていることが分かった。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。 Next, Tris containing salmon semen-derived deoxyribonucleic acid sodium and bovine serum-derived albumin using a Pasteur pipette in which the apatite fine powder prepared in the same manner as above was fixed to cut cotton and placed inside the liquid absorption part Sample preparation and HPLC measurement were performed in the same manner as above except that the hydrochloric acid buffer solution was passed at a temperature of 50 ° C. As a result, it was found that the entire amount of DNA contained in the sample solution was removed from the sample solution by adsorption. On the other hand, the effect of adsorption was not observed for albumin, and almost the entire amount was left in the sample solution.
上記で、試料溶液を液温５０℃で通液したパスツールピペットの内部を、蒸留水を用いて繰り返し洗浄を行った場合、洗浄液中にはＤＮＡが含まれず、蒸留水による該アパタイト微粉体からのＤＮＡの脱着は生じないことを確認した。次に、試料溶液を液温５０℃で通液したパスツールピペット内部に、濃度０．１モル／ＬでＮａ２ＨＰＯ４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ２ＰＯ４を含むリン酸塩水溶液５０ｍＬを通液し回収したところ、回収液中にＤＮＡが含まれていることがＨＰＬＣ測定により明らかとなった。回収液中にはアルブミンは含まれておらず、かつ回収されたＤＮＡの量は元の試料溶液中に含まれているＤＮＡの量とほぼ一致していたことから、試料溶液中のＤＮＡがほぼ定量的に上記パスツールピペット内の該アパタイト微粉体に吸着され、吸着したＤＮＡを比較的低濃度のリン酸塩を含む水溶液を用いて容易に脱着できることが明らかとなった。 In the above, when the interior of the Pasteur pipette through which the sample solution was passed at a liquid temperature of 50 ° C. was repeatedly washed with distilled water, DNA was not contained in the washing liquid, and the apatite fine powder with distilled water was used. It was confirmed that no desorption of DNA occurred. Next, phosphoric acid containing Na 2 HPO 4 at a concentration of 0.1 mol / L and KH 2 PO 4 at a concentration of 0.1 mol / L inside a Pasteur pipette through which the sample solution was passed at a liquid temperature of 50 ° C. When 50 mL of an aqueous salt solution was passed and collected, it was revealed by HPLC measurement that DNA was contained in the recovered solution. The recovered solution contained no albumin, and the amount of recovered DNA was almost the same as the amount of DNA contained in the original sample solution. It was revealed that the DNA adsorbed quantitatively by the apatite fine powder in the Pasteur pipette can be easily desorbed using an aqueous solution containing a relatively low concentration of phosphate.
（実施例６）
実施例２で用いたカルシウムとストロンチウムをモル比で各々１：４の比率で含むアパタイト粒子を用いて、メディアミルにより湿式分散処理を行い、ストロンチウムを含むアパタイトの微粒子を作製した。すなわち、上記の実施例２で得たストロンチウムを含むアパタイト２０ｇを０．２リットルのポリプロピレン容器に移し、更にポリメタクリル酸メチル４ｇとテトラヒドロフラン７６ｇ及び粒径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して６時間湿式分散処理を行った。その後、濾布を使用して分散物からジルコニアビーズを分離した。得られた分散液に含まれる、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の大きさを測定するために、光散乱回折式粒度分布計（粒度分布測定装置ＬＡ−９２０、堀場製作所社製）を使用して測定したところ、体積平均粒子径は０．８μｍであった。
(Example 6)
Apatite particles containing calcium and strontium used in Example 2 in a molar ratio of 1: 4 were each subjected to a wet dispersion treatment with a media mill to produce apatite fine particles containing strontium. That is, 20 g of apatite containing strontium obtained in Example 2 above was transferred to a 0.2 liter polypropylene container, and 4 g of polymethyl methacrylate, 76 g of tetrahydrofuran and 160 g of zirconia beads having a particle size of 0.3 mm were added and sealed. The wet dispersion treatment was performed for 6 hours using a paint conditioner. Thereafter, zirconia beads were separated from the dispersion using a filter cloth. In order to measure the size of the apatite fine particles containing strontium contained in the obtained dispersion, measurement was performed using a light scattering diffraction type particle size distribution analyzer (particle size distribution measuring device LA-920, manufactured by Horiba, Ltd.). However, the volume average particle diameter was 0.8 μm.
上記で得られたストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液中に、平均繊維径２０μｍのポリエステル長繊維を使用して湿式不織布法で製造した厚み１００μｍ、目付１５ｇ／ｍ２の不織布を浸漬し、引き上げて余分な液を落下させながら乾燥を行い、繊維表面にバインダーとしてポリメタクリル酸メチルを用いて上記アパタイト微粒子を固定化した不織布試料を得た。蛍光Ｘ線測定装置によりこの不織布試料の解析を行ったところ、不織布１平方メートル当たり約１０ｇのストロンチウムを含むアパタイト微粒子が担持されていることが分かった。得られた不織布試料を直径１ｃｍの円形に切り抜き、これを丸めてマイクロピペット用チップ（２００μＬ）の内部に装填した。このようにして作製したチップを用いて、先の実施例及び比較例で使用したサケ精液由来デオキシリボ核酸ナトリウム及びウシ血清由来アルブミンを含有するトリス塩酸緩衝液を液温５０℃にして、マイクロピペットを利用してチップ内に吸液し、１分間吸液した状態を保ってから排液した。排液した試料について、先と同様にしてＨＰＬＣ測定を行ったところ、試料溶液中から大部分のＤＮＡが取り除かれていることが判明した。一方、アルブミンについては吸着の影響は認められず、ほぼ全量が試料溶液中に残されていた。次に、ＤＮＡを吸着して含むチップ内を、濃度０．１モル／ＬでＮａ２ＨＰＯ４と、濃度０．１モル／ＬでＫＨ２ＰＯ４を含むリン酸塩水溶液１ｍＬを用いて、繰り返し洗浄を行なったところ、ほぼ定量的にＤＮＡが溶出し、アルブミンを含まない状態でリン酸溶液中に回収されていることが分かった。 In a dispersion of apatite fine particles containing strontium obtained above, a nonwoven fabric having a thickness of 100 μm and a basis weight of 15 g / m 2 manufactured by using a polyester long fiber having an average fiber diameter of 20 μm is dipped and pulled up. Drying was performed while dropping excess liquid, and a nonwoven fabric sample in which the apatite fine particles were immobilized on the fiber surface using polymethyl methacrylate as a binder was obtained. When this nonwoven fabric sample was analyzed by a fluorescent X-ray measurement apparatus, it was found that apatite fine particles containing about 10 g of strontium per square meter of the nonwoven fabric were supported. The obtained non-woven fabric sample was cut out into a circle having a diameter of 1 cm, rounded and loaded into the inside of a micropipette tip (200 μL). Using the thus prepared chip, the tris-hydrochloric acid buffer solution containing sodium salmon semen-derived deoxyribonucleic acid sodium and bovine serum-derived albumin used in the previous examples and comparative examples was brought to a liquid temperature of 50 ° C., and a micropipette was used. The solution was absorbed into the chip using the solution and discharged after maintaining the state of absorption for 1 minute. When the drained sample was subjected to HPLC measurement in the same manner as described above, it was found that most of the DNA was removed from the sample solution. On the other hand, the effect of adsorption was not observed for albumin, and almost the entire amount was left in the sample solution. Next, in the chip containing the adsorbed DNA, 1 mL of an aqueous phosphate solution containing Na 2 HPO 4 at a concentration of 0.1 mol / L and KH 2 PO 4 at a concentration of 0.1 mol / L is used. After repeated washing, it was found that DNA was eluted almost quantitatively and recovered in the phosphoric acid solution without albumin.
（実施例７及び比較例３）
（ＢＣＧ菌を利用したＰＣＲ法による結核菌ＤＮＡの増幅試験）
ＢＣＧ菌を利用した結核菌ＰＣＲ検査に対するモデル試験を以下のように実施した。マクファーランドＮｏ．１．０に調製したＢＣＧ菌液（ＢＣＧ菌濃度３×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）０．１ｍＬを喀痰０．９ｍＬに加えてＢＣＧ菌株含有喀痰Ａ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０７ｃｆｕ／ｍＬ）を調製した。次いで、菌濃度が段階的に１／１０ずつ低下するよう、喀痰にて希釈した喀痰液を調製し、順にＢ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０６ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｃ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０５ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｄ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０４ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｅ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０３ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｆ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０２ｃｆｕ／ｍＬ）、Ｇ液（ＢＣＧ菌濃度３×１０ｃｆｕ／ｍＬ）とし、比較（ブランク）としてＢＣＧ菌液を加えない喀痰液をＨ液として使用した。これらの１００μＬを、各々ビーズ入りのマイクロチューブに加え、次いで濃度２％の水酸化ナトリウム１００μＬと濃度１モル／Ｌのジチオスレイトール２０μＬをそれぞれに加えて１分間振盪撹拌した。これを３７℃で１０分間加温後、濃度１モル／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μＬをそれぞれに加えて中和し、各々の試料溶液とした。次いで、各試料溶液２００μＬに対して実施例２で得られた、カルシウムとストロンチウムをモル比で１：４の比率で含むアパタイト粒子を５０ｍｇ添加して攪拌しながら、３７℃で１０分間加温した。その後、アパタイト粒子を濾過により分離し、該粒子を１ｍＬのＴＥ緩衝液で３回洗浄を行った。次いで、濃度０．１５モル／ＬでＮａ２ＨＰＯ４と、濃度０．１５モル／ＬでＫＨ２ＰＯ４を含むリン酸塩水溶液（ｐＨ６．８）を１００μＬ用いて吸着したＤＮＡを溶出（脱着）し、得られたＤＮＡ溶出液中のＢＣＧ菌株ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で定量した。プライマー及びプローブはアプライドバイオシステムズ社製ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブキット（蛍光色素：ＦＡＭ）を使用した。結果を図７に示した。図７は、実施例７において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子を示す。この図より、ＢＣＧ菌株含有喀痰のＢＣＧ菌濃度がＥ液に相当する３×１０３ｃｆｕ／ｍＬ以上であれば、本方法で菌体の存在を検出することが可能であることが分かった。
(Example 7 and Comparative Example 3)
(Amplification test of Mycobacterium tuberculosis DNA by PCR method using BCG bacteria)
A model test for Mycobacterium tuberculosis PCR test using BCG bacteria was performed as follows. McFarland No. BCG bacterial solution (concentrated 3 × 10 8 cfu / mL) of BCG prepared to 1.0 is added to 0.9 mL of 喀 痰 and BCG strain-containing 喀 痰 A solution (BCG bacterium concentration of 3 × 10 7 cfu / mL) Was prepared. Next, a lysate diluted with a cocoon is prepared so that the bacterium concentration gradually decreases by 1/10 step by step. In order, B solution (
一方、比較例３として、市販されるヒドロキシアパタイト吸着担体（バイオゲル（登録商標）ＨＴＰハイドロキシアパタイト、バイオラッド社製）をＤＮＡの吸着担体として用いて、上記実施例７と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法によるＢＣＧ菌の検出感度を調べる実験を行ったところ、図８に示す結果を得た。図８は比較例３において、段階的に希釈した濃度でＢＣＧ菌を含む試料から分離したＢＣＧ菌ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で増幅を行った際の、サイクル数に対する蛍光強度の増加の様子を示す。この図より、ＢＣＧ菌株含有喀痰のＢＣＧ菌濃度がＣ液に相当する３×１０５ｃｆｕ／ｍＬ以上であれば、菌体の存在を検出することが可能であることが分かった。なお、図７及び図８において、太い横線より蛍光強度が上回れば、菌体の存在を検出することが可能な程度にＤＮＡが増幅されたことを示す。実施例７と比較例３を比較することで、本発明のストロンチウムを含むアパタイト粒子をＤＮＡ吸着担体として利用することで、ＰＣＲ法において検出感度が１００倍程度向上することが明らかとなった。なお、図７及び図８において測定に用いたＣ液の結果がＢ液の結果と近接する数値を与えているが、これは試料溶液を調整する際の濃度に若干のフレが存在したためと推定される。 On the other hand, as Comparative Example 3, a commercially available hydroxyapatite adsorption carrier (Biogel (registered trademark) HTP hydroxyapatite, manufactured by Bio-Rad) was used as a DNA adsorption carrier, and the real-time PCR method was used in the same manner as in Example 7 above. When the experiment which investigates the detection sensitivity of BCG bacteria was conducted, the result shown in FIG. 8 was obtained. FIG. 8 shows an increase in fluorescence intensity with respect to the number of cycles when BCG DNA separated from a sample containing BCG at a stepwise diluted concentration was amplified by the real-time PCR method in Comparative Example 3. From this figure, it was found that if the BCG bacterium concentration in the BCG strain-containing cocoon is 3 × 10 5 cfu / mL or more corresponding to the C solution, the presence of the microbial cells can be detected. 7 and 8, if the fluorescence intensity exceeds the thick horizontal line, it indicates that the DNA has been amplified to such an extent that the presence of the bacterial cells can be detected. Comparison of Example 7 and Comparative Example 3 revealed that the detection sensitivity was improved about 100 times in the PCR method by using the apatite particles containing strontium of the present invention as a DNA adsorption carrier. 7 and 8, the result of the liquid C used for the measurement gives a numerical value close to the result of the liquid B. This is presumed to be due to the presence of slight fluctuations in the concentration when adjusting the sample solution. Is done.
（実施例８〜１０及び比較例４、５）
（ＤＮＡ吸着担体からのＤＮＡの溶出性試験）
実施例８、９及び１０として、各々実施例１、実施例２及び実施例４の合成方法で得られたストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた。実施例７と同様にして、ＢＣＧ菌液を喀痰に加えて調整したＢＣＧ菌株含有喀痰を水酸化ナトリウムとジチオスレイトールで処理後、トリス塩酸緩衝液で中和処理を行った試料溶液を調製し、その試料溶液７００μＬ中に、各々のアパタイト粒子０．２ｇを添加して３７℃で１０分間加温しながら撹拌を行い、試料中に含まれるＤＮＡの吸着を行った。同様に、比較例４として比較例１の合成法で得られた炭酸アパタイトを用い、比較例５として比較例３で用いたヒドロキシアパタイトを用いて、上記と同様にして用いてＤＮＡの吸着を行った。得られたそれぞれのＤＮＡを吸着したアパタイト粒子に対し、リン酸塩濃度を０．１モル／Ｌ、０．２モル／Ｌ及び０．３モル／Ｌに調節した３水準の濃度のリン酸塩水溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４をモル比１／１で含有）を用いて溶出（脱着）処理を行い、得られた溶出液を試料として用いて実施例７と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅試験を行った。その結果、比較例４では、濃度０．２モル／Ｌと濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が確認されたが、濃度０．１モル／Ｌの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したＤＮＡ濃度が希薄なため、ＰＣＲ法でサイクル数を増加させてもＤＮＡの増幅は確認されなかった。また、比較例５では濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料からは、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が確認されたが、濃度０．２モル／Ｌと濃度０．１モル／Ｌの緩衝液を用いて溶出した場合には、溶出したＤＮＡ濃度が希薄なため、ＰＣＲ法でサイクル数を増加させてもＤＮＡの増幅は確認されなかった。これに対して実施例８〜１０では、何れの濃度のリン酸緩衝液を用いて溶出した試料でもＰＣＲ法で顕著なＤＮＡの増幅が確認された。
(Examples 8 to 10 and Comparative Examples 4 and 5)
(Elution test of DNA from DNA adsorption carrier)
As Examples 8, 9, and 10, apatite particles containing strontium obtained by the synthesis methods of Example 1, Example 2, and Example 4 were used. In the same manner as in Example 7, a BCG strain-containing cocoon prepared by adding a BCG bacterial solution to the cocoon was treated with sodium hydroxide and dithiothreitol, and then a sample solution was prepared that was neutralized with Tris-HCl buffer. Then, 0.2 g of each apatite particle was added to 700 μL of the sample solution and stirred while heating at 37 ° C. for 10 minutes to adsorb the DNA contained in the sample. Similarly, using the carbonate apatite obtained by the synthesis method of Comparative Example 1 as Comparative Example 4 and the hydroxyapatite used in Comparative Example 3 as Comparative Example 5, DNA adsorption was performed in the same manner as described above. It was. Three levels of phosphate with the phosphate concentration adjusted to 0.1 mol / L, 0.2 mol / L, and 0.3 mol / L for the obtained apatite particles adsorbing each DNA Elution (desorption) treatment was performed using an aqueous solution (containing Na 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 at a molar ratio of 1/1), and real-time PCR was performed in the same manner as in Example 7 using the obtained eluate as a sample. The DNA amplification test was performed using this method. As a result, in Comparative Example 4, amplification of DNA by PCR was confirmed from the sample eluted using a phosphate buffer solution having a concentration of 0.2 mol / L and a concentration of 0.3 mol / L. When elution was carried out using a 1 mol / L buffer, amplification of DNA was not confirmed even when the number of cycles was increased by the PCR method because the eluted DNA concentration was dilute. In Comparative Example 5, amplification of DNA by PCR was confirmed from the sample eluted with a phosphate buffer solution having a concentration of 0.3 mol / L, but the concentration was 0.2 mol / L and the concentration was 0.1. When elution was carried out using a mol / L buffer, amplification of DNA was not confirmed even when the number of cycles was increased by the PCR method because the eluted DNA concentration was dilute. On the other hand, in Examples 8 to 10, significant amplification of DNA was confirmed by the PCR method in the samples eluted with any concentration of phosphate buffer.
更に、比較例４で濃度０．２モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料と、比較例５で濃度０．３モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料、及び実施例８〜１０で、濃度０．１モル／Ｌのリン酸緩衝液を用いて溶出した試料について、それぞれ紫外線分光光度計により２６０ｎｍ吸光度、２８０ｎｍ吸光度を測定し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比を求めた。２６０ｎｍ吸光度は試料中に含まれるＤＮＡ濃度に比例し、２８０ｎｍ吸光度は試料中に含まれるタンパク質濃度に比例する値である。更に、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比は、タンパク質に対するＤＮＡの濃度比を表し、この値が大きいほどＤＮＡ吸着担体の選択吸着性が高いことを表す。結果を表２に示した。表２より、ストロンチウムを含むアパタイト粒子を用いた場合には、比較例の場合と比べ、より選択性が高くＤＮＡを吸着することが明らかとなり、更に担体に吸着したＤＮＡを溶出できるリン酸緩衝液中のリン酸塩濃度も０．３モル／Ｌ以下の濃度で可能であることが実証された。 Furthermore, a sample eluted with a phosphate buffer solution having a concentration of 0.2 mol / L in Comparative Example 4, a sample eluted with a phosphate buffer solution with a concentration of 0.3 mol / L in Comparative Example 5, and In Examples 8 to 10, the samples eluted with a 0.1 mol / L phosphate buffer were each measured for 260 nm absorbance and 280 nm absorbance with an ultraviolet spectrophotometer to determine the 260 nm / 280 nm absorbance ratio. . The 260 nm absorbance is proportional to the DNA concentration contained in the sample, and the 280 nm absorbance is a value proportional to the protein concentration contained in the sample. Further, the 260 nm / 280 nm absorbance ratio represents the concentration ratio of DNA to protein, and the larger this value, the higher the selective adsorption property of the DNA adsorption carrier. The results are shown in Table 2. From Table 2, it is clear that when apatite particles containing strontium are used, it is clear that the DNA is adsorbed with higher selectivity than in the comparative example, and the phosphate buffer solution that can elute the DNA adsorbed on the carrier. It was demonstrated that the phosphate concentration in the medium is also possible at a concentration of 0.3 mol / L or less.
本発明のＤＮＡ吸着担体はＰＣＲ法への利用以外にも、アフィニティークロマトグラフィーをはじめとする様々なカラムクロマトグラフィーの充填剤等の、液体クロマトグラフィー用固定層に利用することで、核酸やタンパク質の分離に利用することが可能である。更には、遺伝子導入に際して利用される遺伝子のキャリヤーとしての遺伝子ベクターとしての利用にも用いることが可能である。 The DNA adsorption carrier of the present invention can be used for a fixed layer for liquid chromatography, such as packing for various column chromatography including affinity chromatography, in addition to the use for PCR method. It can be used for separation. Furthermore, it can also be used as a gene vector as a carrier for a gene used for gene introduction.
Claims (4)
A method for using a DNA adsorption carrier, wherein the DNA adsorption carrier according to claim 1 is used as a fixed layer for liquid chromatography.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015157026A JP6588765B2 (en) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | DNA adsorption carrier and method of using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015157026A JP6588765B2 (en) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | DNA adsorption carrier and method of using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017035651A JP2017035651A (en) | 2017-02-16 |
| JP6588765B2 true JP6588765B2 (en) | 2019-10-09 |
Family
ID=58048479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015157026A Active JP6588765B2 (en) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | DNA adsorption carrier and method of using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6588765B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7446576B2 (en) | 2020-02-28 | 2024-03-11 | 学校法人常翔学園 | Nucleic acid isolation method and amplification method |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01135792A (en) * | 1987-11-20 | 1989-05-29 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Separation and purification of nucleic acid |
| EP0393723B1 (en) * | 1989-04-21 | 1997-07-16 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | A functional paper and its use as a deodorant, filtering medium or adsorbent |
| JPH0751209B2 (en) * | 1991-06-06 | 1995-06-05 | ベステクス株式会社 | Filter material manufacturing method |
| US6136197A (en) * | 1998-05-27 | 2000-10-24 | Battelle Memorial Institute | Systems for column-based separations, methods of forming packed columns, and methods of purifying sample components |
| JP2981548B1 (en) * | 1998-07-08 | 1999-11-22 | 農林水産省水産庁養殖研究所長 | DNA purification method |
| AU2002350258A1 (en) * | 2001-11-27 | 2003-06-23 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Composite chromatographic sorbent of mineral oxide beads with hydroxyapatite-filled pores |
| AU2003279570A1 (en) * | 2002-11-12 | 2004-06-03 | The Circle For The Promotion Of Science And Engineering | Delivery agent, method of delivering a target substance to cells, method for producing delivery agent, composition for producing delivery agent, and kit for producing delivery agent |
| JP4328664B2 (en) * | 2004-03-27 | 2009-09-09 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Chemical biosensor and manufacturing method thereof |
| WO2007021037A1 (en) * | 2005-08-19 | 2007-02-22 | Kyoto University | Inorganic porous object and process for producing the same |
| JP5878308B2 (en) * | 2011-06-20 | 2016-03-08 | ジーエルサイエンス株式会社 | Porous material and method for producing the same |
| JP2016186036A (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | 三菱製紙株式会社 | Production method of strontium apatite fine particle dispersion liquid |
-
2015
- 2015-08-07 JP JP2015157026A patent/JP6588765B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017035651A (en) | 2017-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2723536C (en) | Highly simplified lateral flow-based nucleic acid sample preparation and passive fluid flow control | |
| CN106085863B (en) | Microorganism concentration process and be used for concentration agent therein | |
| Sim et al. | Development and evaluation of antimicrobial activated carbon fiber filters using Sophora flavescens nanoparticles | |
| MXPA06001646A (en) | Sample preparation methods and devices. | |
| CN105462956B (en) | The sample-pretreating method of microorganism total DNA in a kind of extraction bioaerosol | |
| JP6588765B2 (en) | DNA adsorption carrier and method of using the same | |
| US8691559B2 (en) | Micro channel, device for recovering nucleic acid and method for recovering nucleic acid | |
| JP2003210158A (en) | Method for concentrating microorganism | |
| WO2015159979A1 (en) | Method for recovering short-chain nucleic acids | |
| JP2009065849A (en) | Method for extracting nucleic acid | |
| Deng et al. | N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis | |
| KR20210045452A (en) | Nucleic Acid Isolation and Related Methods | |
| Ariya et al. | Bio-organic materials in the atmosphere and snow: Measurement and characterization | |
| EP2251409B1 (en) | Material for capturing microbes or the like, device for capturing microbes or the like, method of capturing microbes or the like and method of producing material for capturing microbes or the like | |
| JP4904973B2 (en) | Nucleic acid recovery method, nucleic acid recovery apparatus, and nucleic acid supply apparatus | |
| JP7446576B2 (en) | Nucleic acid isolation method and amplification method | |
| Tian et al. | Study on the Collection Efficiency of Bioaerosol Nanoparticles by Andersen-Type Impactors | |
| CN117046441B (en) | Magnetic graphene oxide particles, preparation method and application thereof | |
| JP2021133347A (en) | Nucleic acid adsorbent | |
| Samineni et al. | Highly effective nanoparticle removal in plant-based water filters | |
| JP2006308508A (en) | Simple method for purifying cylindrospermopsin | |
| RU2653130C1 (en) | Magnetic sorbent, a method for its production and a method for separation of molecules of nucleic acids | |
| KR101897177B1 (en) | Pretreatment method and nucleic acid extraction kit used in said method | |
| US6268183B1 (en) | Method of purifying thuringiensin | |
| Won et al. | The simple and fast isolation of Escherichia coli O157: H7 using magnet nanoparticle embedded silica nanotube for the nucleic acid based detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180629 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20180629 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180629 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190422 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190507 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190704 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190820 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190913 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6588765 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |