JP6583817B2 - Diagnostic markers for tumors in uterine smooth muscle - Google Patents
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Description
本発明は、子宮平滑筋における腫瘍を診断するためのデータを収集する方法や子宮平滑筋における腫瘍の診断用キットに関する。 The present invention relates to a method for collecting data for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle and a diagnostic kit for a tumor in uterine smooth muscle.
子宮肉腫は子宮平滑筋から発生する悪性腫瘍であり、比較的早期の症例でも肺や肝臓に転移を起こす極めて悪性度が高い難治性の腫瘍である。子宮平滑筋に由来する腫瘍には、良性である子宮平滑筋腫（子宮筋腫）と、悪性である子宮平滑筋肉腫（子宮肉腫）がある。子宮肉腫は、子宮筋腫と比較しその発症頻度は１％以下であるが、５年生存率が約３７％であり、極めて予後不良な腫瘍である。子宮肉腫に対して、既存の化学療法は殆ど延命効果が望めず、有効な治療法は現在、外科的手術以外に確立されていない。 Uterine sarcoma is a malignant tumor that arises from uterine smooth muscle, and is an intractable tumor with extremely high malignancy that causes metastasis to the lungs and liver even in relatively early cases. Tumors derived from uterine smooth muscle include benign uterine leiomyoma (uterine fibroids) and malignant uterine leiomyosarcoma (uterine sarcomas). Uterine sarcoma is a tumor with an extremely poor prognosis, although its onset frequency is 1% or less compared with uterine fibroids, and the 5-year survival rate is about 37%. With regard to uterine sarcoma, existing chemotherapy is hardly expected to have a life-prolonging effect, and no effective treatment is currently established other than surgical operation.
一方、子宮筋腫は良性腫瘍であり、性成熟期女性の３０％以上に認められる最も発症頻度の高い腫瘍である。近年、晩婚化や妊娠高齢化といった女性のライフスタイルの変化により、子宮筋腫治療の方法として、妊娠可能な状態で子宮を温存する子宮筋腫摘出手術（子宮核出術）が選択される機会が増えている。 Uterine fibroids, on the other hand, are benign tumors and are the most frequently occurring tumors observed in more than 30% of sexually mature women. In recent years, due to changes in women's lifestyles such as late marriage and aging of pregnancy, there is an increased chance of selecting hysteromyctomy surgery (uterine enucleation) that preserves the uterus as a method of uterine fibroid treatment. ing.
子宮肉腫は子宮筋腫に比較し発症頻度は低いが、両者は発生場所や形状が類似しているため、患者の子宮温存を決定する際には腫瘍の良性若しくは悪性の診断が非常に重要となる。しかしながら、現行の診断は病理標本における分裂細胞数、細胞異型、及び壊死の有無の３要因を元に総合的に判断するという形態学的基準に依っている。
形態学的基準は施設或いは診断した個人により判断が異なる場合があるため、客観性のある信頼性の高い診断法が望まれている。しかし、子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫を区別する有用なバイオマーカーは現状存在しない。
Uterine sarcoma is less frequent than uterine fibroids, but both are similar in location and shape, so it is very important to diagnose benign or malignant tumors when determining patient uterine preservation . However, the current diagnosis relies on morphological criteria that comprehensively judge based on three factors: the number of dividing cells in the pathological specimen, cell atypia, and the presence or absence of necrosis.
Since morphological criteria may differ depending on the facility or the diagnosed individual, an objective and reliable diagnostic method is desired. However, there is currently no useful biomarker that distinguishes between uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma.
現在、最も信頼性の高い子宮筋腫バイオマーカーはＭＥＤ１２遺伝子の突然変異であり、約７０％の子宮筋腫に遺伝子変異が検出されるという報告がある（非特許文献１：Science. 2011 Oct 14;334(6053):252-5.）。また、子宮肉腫が発症することにより発現が低下することが見出されているＬＭＰ２タンパクの免疫染色による診断が報告されている（非特許文献２：Sci Rep. 2011;1:180.）。しかしこれらの判定方法はいずれも、実際の診断に用いるには客観性及び信頼性に著しく欠ける。 Currently, the most reliable biomarker for uterine fibroids is a mutation in the MED12 gene, and it is reported that gene mutations are detected in about 70% of uterine fibroids (Non-patent Document 1: Science. 2011 Oct 14; 334). (6053): 252-5.). In addition, a diagnosis by immunostaining of LMP2 protein, which has been found to decrease in expression due to the development of uterine sarcoma, has been reported (Non-patent Document 2: Sci Rep. 2011; 1: 180.). However, both of these determination methods are extremely lacking in objectivity and reliability for use in actual diagnosis.
一方、近年、エピジェネティクス（クロマチンへの後天的な修飾により、遺伝子配列の変化を伴わずに遺伝子発現が制御されることに起因する遺伝学又は分子生物学の研究分野）への関心が高まり、がん等の疾患との関連についての研究が進められている。中でも、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子のメチル化が注目されている。高等真核生物のゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ（以下、ＣｐＧ）部位では、グアニン（Ｇ）の５’側に位置するシトシン（Ｃ）がメチル化修飾される現象が知られており、このＣｐＧのメチル化修飾は、遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられている。特にＣｐＧ部位に富む領域（ＣｐＧアイランド）が遺伝子のプロモーター領域内に存在する場合には、遺伝子発現に対して重要な影響を及ぼす。通常、ゲノム上の多くの遺伝子はこれらのメチル化修飾から保護されているが、何らかの原因により、遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧアイランドがメチル化された場合、遺伝子の転写が抑制されることになる。このため、ＣｐＧアイランドのメチル化異常によって、例えば、ヒト生体内におけるがん抑制遺伝子の転写が不活性化された場合、細胞増殖の制御が効かなくなり、がんなどの細胞増殖性疾患が進行してしまうことになる。実際、いくつかのがんにおいて、特定の遺伝子におけるメチル化頻度が上昇していることが報告されており、最近では、特定の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化頻度を、特定のがんの診断に利用する試みがいくつか行われている。例えば、ＢＡＳＰ１等の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化の程度を検出することによって、肝臓がんを診断する方法が知られている（特許文献１：特開２００８−２４５６３５号公報）。また、子宮がん等の婦人科がんにおいては、ｈＭＬＨ−1、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６の各遺伝子におけるメチル化頻度が上昇しているとの報告がなされている（非特許文献３：Eur J Gynaecol Oncol. 2009; 30:267-270.）。更に、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、子宮体がんの判定に用いる方法が報告されている（特許文献２：特開２０１１−１６０７１１号公報）。しかし、がんにおける遺伝子のメチル化頻度の上昇の程度は遺伝子等によって様々であり、実用的な婦人科がんの診断に耐え得る程度のメチル化頻度の上昇が生じる遺伝子はこれまで知られていない。また、本発明者らはこれまで、子宮筋腫と子宮平滑筋（正常筋層）のゲノムワイドなＤＮＡメチル化解析（ＤＮＡメチローム）を行い、ＤＮＡメチル化がｍＲＮＡ発現と比較し、より明確に正常筋層と子宮筋腫を区別できることを見出している（非特許文献４：PLoS One, 8(6): e66632, 2013）が、これは正常筋層と子宮筋腫とを区別するものであり、子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫とを区別するものではない。 On the other hand, in recent years, there has been a growing interest in epigenetics (genetics or molecular biology research fields resulting from the regulation of gene expression without alteration of gene sequence due to acquired modifications to chromatin). Research on the relationship with diseases such as cancer is underway. Among them, methylation of genes on genomic DNA has attracted attention. Phenomenon in which cytosine (C) located on the 5 ′ side of guanine (G) is methylated at a 5′-CG-3 ′ DNA (hereinafter, CpG) site present in the genomic DNA sequence of higher eukaryotes And this CpG methylation modification is thought to affect gene expression. In particular, when a region rich in CpG sites (CpG island) is present in the promoter region of a gene, it has an important influence on gene expression. Normally, many genes on the genome are protected from these methylation modifications, but if for some reason, CpG islands in the promoter region of the gene are methylated, transcription of the gene is suppressed. Become. For this reason, for example, when transcription of a tumor suppressor gene in the human body is inactivated due to abnormal methylation of CpG island, the control of cell proliferation becomes ineffective, and cell proliferative diseases such as cancer progress. It will end up. In fact, in some cancers, it has been reported that the methylation frequency of a specific gene is increased, and recently, the methylation frequency of a CpG island of a specific gene is used for diagnosis of a specific cancer. Several attempts have been made to use it. For example, a method for diagnosing liver cancer by detecting the degree of methylation of a CpG island of a gene such as BASP1 is known (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-245635). Moreover, in gynecological cancers such as uterine cancer, it has been reported that the methylation frequency of each gene of hMLH-1 and CDKN2A / p16 is increased (Non-Patent Document 3: Eur J Gynaecol Oncol). 2009; 30: 267-270.). Further, one or more genes selected from DCC, GHSR, AJAP1, ZNF560, FERD3L, FLJ23514, BXDC1, HKR1, DRD4, PENK, FAM12B, HIST1H4F, NEF3, SKIP, CX36, EOMES, and SOLCS3. A method of using the frequency of methylation at the CpG site of a gene for determination of endometrial cancer has been reported (Patent Document 2: JP 2011-160711 A). However, the degree of increase in the methylation frequency of genes in cancer varies depending on the gene, etc., and genes that cause an increase in the methylation frequency enough to withstand the diagnosis of practical gynecological cancer have been known so far. Absent. In addition, the present inventors have conducted genome-wide DNA methylation analysis (DNA methylome) of uterine fibroids and uterine smooth muscle (normal muscle layer), and DNA methylation is more clearly normal than mRNA expression. It has been found that muscle layers and uterine fibroids can be distinguished (Non-patent Document 4: PLoS One, 8 (6): e66632, 2013). There is no distinction between myoma and uterine leiomyosarcoma.
本発明の課題は、子宮平滑筋に生じた腫瘍が良性腫瘍（子宮平滑筋腫）か、悪性腫瘍（子宮平滑筋肉腫）のいずれかであるかを精度よく診断できる診断マーカーを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a diagnostic marker capable of accurately diagnosing whether a tumor generated in uterine smooth muscle is a benign tumor (uterine leiomyoma) or a malignant tumor (uterine leiomyosarcoma). .
発明者らはこれまで、子宮筋腫と子宮平滑筋（正常筋層）のゲノムワイドなＤＮＡメチル化解析（ＤＮＡメチローム）を行い、ＤＮＡメチル化がｍＲＮＡ発現と比較し、より明確に正常筋層と子宮筋腫を区別できることを見いだしている。これらＤＮＡメチル化が起こった遺伝子からまず、メチル化解析に基づき正常筋層と子宮筋腫とが判別可能かを検討したが、１遺伝子のメチル化レベル（度）を検出しただけでは判別することは難しいことが明らかとなった。そこで、判別精度を保ちつつメチル化解析の労力を最小限にできる遺伝子の組み合わせを検討したところ、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４の１０遺伝子（以下、これらを総称して「本件バイオマーカー遺伝子」ということがある）をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域をコードする領域（以下、「本件バイオマーカー遺伝子領域」ということがある）におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定し、多変量解析を行い、ＣｐＧメチル化に関する本件バイオマーカー遺伝子パネルを作製することにより、正常筋層と子宮筋腫とが明瞭に判別できるのみならず、腫瘍が子宮平滑筋腫か子宮平滑筋肉腫のいずれかであるかを判定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。 The inventors have so far performed genome-wide DNA methylation analysis (DNA methylome) of uterine fibroids and uterine smooth muscle (normal muscle layer), and DNA methylation is more clearly compared with normal muscle layer and compared with mRNA expression. It has been found that uterine fibroids can be distinguished. Based on the methylation analysis, we first examined whether the normal muscle layer and uterine fibroids can be distinguished from the genes in which these DNA methylation occurred. However, it is not possible to distinguish only by detecting the methylation level (degree) of one gene. It became clear that it was difficult. Therefore, when a combination of genes that can minimize the labor of methylation analysis while maintaining discrimination accuracy was examined, 10 genes of ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 (hereinafter referred to as “the genes”) CpG in a region that encodes these genes (sometimes referred to as “the present biomarker gene”) or a region that encodes the transcriptional control region of each gene (hereinafter also referred to as “the present biomarker gene region”) By measuring the frequency of methylation of the sequence, conducting multivariate analysis, and creating this biomarker gene panel for CpG methylation, not only can the normal muscle layer and uterine fibroids be clearly distinguished, but also the tumor is uterine smooth Can determine if it is myoma or uterine leiomyosarcoma They found the door, which resulted in the completion of the present invention.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を備えたことを特徴とする子宮平滑筋における腫瘍を診断するためのデータを収集する方法。
（Ａ）採取された子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫、及び正常子宮平滑筋層の組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で抽出した各組織のゲノムＤＮＡ中の、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定する工程；
（Ｃ）被検体から採取された腫瘍組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域をコードする領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定する工程；
（Ｅ）工程（Ｂ）で測定したＣｐＧ配列のメチル化頻度、及び工程（Ｄ）で測定したＣｐＧ配列のメチル化頻度に基づき多変量解析を行い、前記被検体における子宮平滑筋腫及び子宮平滑筋肉腫を診断するためのデータを収集する工程；
［２］多変量解析が階層的クラスタリング解析であることを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］工程（Ｂ）及び（Ｄ）において、
ＡＬＸ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１４４−１４５番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＢＬＮ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＯＲＩＮ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列であり、
ＦＯＸＰ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列であり、
ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列であり、
ＩＧＬＯＮ５遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＰＴＸ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＴＲＫ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列であり、
ＰＲＬ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする、子宮平滑筋における腫瘍の診断用キット。
［５］ＡＬＸ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１４４−１４５番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＢＬＮ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＯＲＩＮ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列であり、
ＦＯＸＰ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列であり、
ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列であり、
ＩＧＬＯＮ５遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＰＴＸ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＴＲＫ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列であり、
ＰＲＬ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする上記［４］記載のキット。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for collecting data for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle, comprising the following steps (A) to (E):
(A) extracting genomic DNA from the collected uterine leiomyoma, uterine leiomyosarcoma and normal uterine leiomyosarcoma tissue;
(B) Regions encoding ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 genes in the genomic DNA of each tissue extracted in step (A), or transcriptional control of the respective genes Measuring the methylation frequency of the CpG sequence in the region;
(C) a step of extracting genomic DNA from tumor tissue collected from a subject;
(D) A region encoding the ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 genes in the genomic DNA extracted in the step (C) or the transcriptional control region of each gene is encoded. Measuring the methylation frequency of the CpG sequence in the region to be treated;
(E) Multivariate analysis is performed based on the methylation frequency of the CpG sequence measured in step (B) and the methylation frequency of the CpG sequence measured in step (D), and uterine leiomyoma and uterine smooth muscle in the subject Collecting data for diagnosing a tumor;
[2] The method according to [1] above, wherein the multivariate analysis is a hierarchical clustering analysis.
[3] In steps (B) and (D),
The CpG sequence in the region encoding the ALX1 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 144th to 145th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1,
The CpG sequence in the region encoding the CBLN1 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 146 to 147 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
The CpG sequence in the region encoding the CORIN gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 181 to 182 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3,
The CpG sequence in the region encoding the FOXP1 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 67-68 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4,
The CpG sequence in the region encoding the GATA2 gene or the transcription control region of the gene is a nucleotide sequence from positions 171 to 172 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5,
The CpG sequence in the region encoding the IGLON5 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 377 to 378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6,
The CpG sequence in the region encoding the NPTX2 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 159 to 160 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7,
The CpG sequence in the region encoding the NTRK2 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence at positions 65-66 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8,
The CpG sequence in the region encoding the PRL gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 259 to 260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9,
[1] or [2] above, wherein the CpG sequence in the region encoding STEAP4 gene or the transcription control region of said gene is the nucleotide sequence at positions 102-103 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 the method of.
[4] Primer for measuring the methylation frequency of the CpG sequence in the region encoding the ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 genes or the transcription control region of each gene A kit for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle, comprising a probe or a label thereof.
[5] The CpG sequence in the region encoding the ALX1 gene or the transcription control region of the gene is the 144th to 145th nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1,
The CpG sequence in the region encoding the CBLN1 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 146 to 147 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
The CpG sequence in the region encoding the CORIN gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 181 to 182 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3,
The CpG sequence in the region encoding the FOXP1 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 67-68 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4,
The CpG sequence in the region encoding the GATA2 gene or the transcription control region of the gene is a nucleotide sequence from positions 171 to 172 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5,
The CpG sequence in the region encoding the IGLON5 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 377 to 378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6,
The CpG sequence in the region encoding the NPTX2 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 159 to 160 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7,
The CpG sequence in the region encoding the NTRK2 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence at positions 65-66 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8,
The CpG sequence in the region encoding the PRL gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 259 to 260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9,
The kit according to [4] above, wherein the CpG sequence in the region encoding the STEAP4 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence at positions 102 to 103 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10.
上記本発明の方法は、医師による子宮平滑筋における腫瘍の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。 The method of the present invention is a method for assisting a doctor in diagnosing a tumor in uterine smooth muscle, and does not include a diagnostic action by a doctor.
また、本発明の実施の他の形態として、子宮平滑筋における腫瘍の診断方法を挙げることができる。 Another embodiment of the present invention is a method for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle.
患者の子宮温存を決定する際には腫瘍の良性若しくは悪性の診断が非常に重要となるが、子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫を区別する有用なバイオマーカーは存在しなかった。ＣｐＧメチル化に関する本件バイオマーカー遺伝子パネルを用いることにより、平滑筋由来の腫瘍が生じた患者が子宮平滑筋腫か、子宮平滑筋肉腫のいずれかを罹患しているかについて精度よく判定することができる。 While determining benign or malignant tumors is very important in determining patient uterine preservation, there was no useful biomarker to distinguish between uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma. By using the present biomarker gene panel for CpG methylation, it is possible to accurately determine whether a patient with a smooth muscle-derived tumor suffers from uterine leiomyoma or uterine leiomyosarcoma.
本発明の子宮平滑筋における腫瘍を診断するためのデータを収集する方法（以下、「本件収集方法」ということがある）としては、子宮平滑筋腫及び子宮平滑筋肉腫、並びに正常子宮平滑筋層の組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程（Ａ）；工程（Ａ）で抽出した各組織のゲノムＤＮＡ中の本件バイオマーカー遺伝子領域におけるＣｐＧ配列（部位）（以下、「本件ＣｐＧ部位」とも表示する。）がメチル化されている度合い（レベル又は頻度）を測定する工程（Ｂ）；被検体から採取された腫瘍組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程（Ｃ）；工程（Ｃ）で抽出したゲノムＤＮＡ中の本件バイオマーカー遺伝子領域におけるＣｐＧ配列がメチル化されている頻度を測定する工程（Ｄ）；工程（Ｂ）で測定したメチル化頻度、及び工程（Ｄ）で測定したメチル化頻度に基づき多変量解析を行い、前記被検体における子宮平滑筋腫及び子宮平滑筋肉腫を診断するためのデータを収集する工程（Ｅ）；の工程（Ａ）〜（Ｅ）を備えた方法であれば特に制限はされない。子宮平滑筋腫の組織由来の本件ＣｐＧ部位は、正常子宮平滑筋層の組織由来の本件ＣｐＧ部位と比べメチル化頻度が変化し、また、子宮平滑筋肉腫組織由来の本件ＣｐＧ部位は、子宮平滑筋腫の組織由来の本件ＣｐＧ部位とは異なるメチル化頻度を示すため、上記工程（Ｅ）において多変量解析を行い、ＣｐＧメチル化に関する本件バイオマーカー遺伝子パネルを作成すると、メチル化頻度を指標とし腫瘍が子宮平滑筋腫か子宮平滑筋肉腫のいずれかであるかを判定することができる。なお、本明細書における本件バイオマーカー遺伝子領域におけるＣｐＧ部位とは、ゲノムＤＮＡ上で該ＣｐＧ部位に最も近い位置に存在する遺伝子が、その本件バイオマーカー遺伝子領域の遺伝子であることを意味する。また、本件ＣｐＧ部位が該遺伝子の近傍に複数存在し、ＣｐＧアイランドを形成している場合は、それら複数のＣｐＧ部位を子宮平滑筋腫と子宮平滑筋肉腫とを区別するバイオマーカーとして使用することが好ましいが、近傍のＣｐＧ部位のメチル化頻度は、相関が見られるとされているため、特定の１カ所のＣｐＧ部位のメチル化頻度が増加していれば、該ＣｐＧ部位が形成するＣｐＧアイランドにおけるメチル化頻度も増加していると評価することができる。 Methods for collecting data for diagnosing tumors in uterine smooth muscle of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the collection method”) include uterine leiomyoma, uterine leiomyosarcoma, and normal uterine smooth muscle layer. Step (A) of extracting genomic DNA from the tissue; CpG sequence (site) in the biomarker gene region of the subject biomarker gene region in the genomic DNA extracted in step (A) (hereinafter also referred to as “the subject CpG site”) A step (B) of measuring the degree (level or frequency) that is methylated; a step (C) of extracting genomic DNA from a tumor tissue collected from a subject; In the step (D) of measuring the frequency with which the CpG sequence in the biomarker gene region is methylated; in the step (D), the methylation frequency measured in the step (B) Comprising the steps (A) to (E) of performing a multivariate analysis based on the determined methylation frequency and collecting data for diagnosing uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma in the subject (E); There is no particular limitation as long as it is a new method. The CpG site derived from the uterine leiomyoma tissue has a different methylation frequency than the CpG site derived from the normal uterine smooth muscle layer tissue, and the CpG site derived from the uterine leiomyosarcoma tissue In order to show a different methylation frequency from this tissue-derived CpG site, multivariate analysis was performed in the above step (E), and when the present biomarker gene panel for CpG methylation was created, Whether uterine leiomyoma or uterine leiomyosarcoma can be determined. In addition, the CpG site in the present biomarker gene region in the present specification means that the gene present in the position closest to the CpG site on the genomic DNA is the gene in the present biomarker gene region. In addition, when a plurality of CpG sites are present in the vicinity of the gene and a CpG island is formed, the plurality of CpG sites may be used as a biomarker for distinguishing between uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma. Although it is said that there is a correlation between the methylation frequencies of neighboring CpG sites, if the methylation frequency of a specific CpG site is increased, the CpG island formed by the CpG site It can be evaluated that the methylation frequency is also increasing.
本発明において、「ＣｐＧ配列がメチル化されている」とは、シトシン（Ｃ）の次にグアニン（Ｇ）が現れる２塩基配列（ＣＧ又はＧＣ配列）において、シトシン塩基５位の炭素がメチル化された状態を意味する。 In the present invention, “the CpG sequence is methylated” means that the carbon at the 5th position of the cytosine base is methylated in a 2-base sequence (CG or GC sequence) in which guanine (G) appears next to cytosine (C). It means the state that was done.
本件収集方法において被検体の生物種としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。 Examples of the biological species of the subject in the collection method preferably include mammals such as humans, mice, rats, hamsters, guinea pigs, monkeys, cows, pigs, horses, rabbits, sheep, goats, cats and dogs. Among them, humans and mice can be illustrated more preferably, and humans can be particularly preferably illustrated.
上記（Ａ）工程及び（Ｃ）工程においてゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、組織からゲノムＤＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、MagNA PureLC DNA Isolation Kit I（ロシュ・ダイアグノスティックス製）やAllprep DNA/RNA mini kit、及びQIAamp DNA FFPE Tissue kit（QIAGEN社製）などの市販品を添付のプロトコールにしたがって用いる方法の他、後述の実施例に記載されているような、フェノール・クロロホルム処理、及びエタノールあるいはイソプロパノール沈殿等を利用した常法（Molecular Cloning第３版Volume1のプロトコール参照）を例示することができる。 The method for extracting genomic DNA in the steps (A) and (C) is not particularly limited as long as it is a method for extracting genomic DNA from a tissue. For example, MagNA PureLC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics) In addition to methods using commercially available products such as Allprep DNA / RNA mini kit and QIAamp DNA FFPE Tissue kit (QIAGEN) according to the attached protocol, phenol as described in the examples below. -The usual method (refer to the protocol of Molecular Cloning 3rd edition Volume 1) using chloroform treatment and ethanol or isopropanol precipitation can be exemplified.
上記（Ｂ）工程及び（Ｄ）工程中において、本件ＣｐＧ部位のメチル化頻度を測定する方法としては、本件ＣｐＧ部位のメチル化を検出・定量し得る方法である限り特に制限されず、本件ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド（プローブ）の標識物を用いたサザンハイブリダイゼーション法や、メチル化感受性制限酵素を用いて解析する方法や、亜硫酸水素塩（バイサルファイト）処理を利用したバイサルファイト法を例示することができる。上記ポリヌクレオチド（プローブ）のヌクレオチド数としては、本件ＣｐＧ部位にハイブリダイズし得る限り、特に制限されず、例えば７個以上を例示することができ、特異性の観点からは、１５個以上、より好ましくは２５個以上を好適に例示することができる。また、上記ポリヌクレオチド（プローブ）の標識物における標識物質としては、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。 In the steps (B) and (D), the method for measuring the methylation frequency of the CpG site is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting and quantifying methylation of the CpG site. Southern hybridization using a label of a polynucleotide (probe) that can specifically hybridize to the polynucleotide sequence of the site, analysis using a methylation-sensitive restriction enzyme, bisulfite (bisulfite) A bisulfite method using treatment can be exemplified. The number of nucleotides of the polynucleotide (probe) is not particularly limited as long as it can hybridize to the present CpG site, and for example, 7 or more can be exemplified. From the viewpoint of specificity, 15 or more, more Preferably, 25 or more can be suitably exemplified. The labeling substance in the labeled product of the polynucleotide (probe) includes peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase. , Enzymes such as malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate Substance, Green Fluorescence Protein (GFP), Cyan Fluorescence Protein (CFP), Blue Photoprotein (Blue Fluorescence Protein; BFP), yellow fluorescent protein (Yellow Fluorescence Protein; YFP), red fluorescent protein (Red Fluorescence Protein; RFP), luciferase (luciferase) fluorescent proteins, such as, 3 H, 14 C, 125 I or Mention may be made of radioisotopes such as 131 I, biotin, avidin or chemiluminescent substances.
上記メチル化感受性制限酵素を用いて解析する方法は、制限酵素の認識配列中のシトシンがメチル化されることで、ＤＮＡを切断できなくなる現象を利用したものである。必要な反応時間は、制限酵素の種類により異なるが、１〜数時間程度である。また、これまでは、制限酵素を用いていることから検出可能な配列が限られていたが、現在では、入手可能なメチル化感受性制限酵素は１００種類以上あり、認識配列も多彩であるため、本件ＣｐＧ部位のほとんどを標的とすることが可能である。メチル化感受性制限酵素により処理後、本件ＣｐＧ部位の切断効率は、サザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ（polymerase chain reaction）等の方法で解析することができる。 The analysis method using the methylation-sensitive restriction enzyme utilizes a phenomenon in which DNA cannot be cleaved by cytosine in the restriction enzyme recognition sequence being methylated. The required reaction time varies depending on the type of restriction enzyme, but is about 1 to several hours. In addition, until now, the number of sequences that can be detected has been limited because of the use of restriction enzymes. Currently, however, there are more than 100 methylation-sensitive restriction enzymes available, and the recognition sequences are also diverse. It is possible to target most of the present CpG sites. After treatment with a methylation sensitive restriction enzyme, the cleavage efficiency of the present CpG site can be analyzed by methods such as Southern hybridization and PCR (polymerase chain reaction).
また、上記バイサルファイト処理を利用したバイサルファイト法とは、バイサルファイト処理によって、本件ＣｐＧ部位における非メチル化シトシンのみをウラシルに変換するバイサルファイト反応を利用した方法であり、現在最も一般的に用いられている方法である。具体的には、以下の（i）〜（iv）の４つの方法等を例示することができる。 The bisulfite method using the bisulfite treatment is a method using a bisulfite reaction in which only unmethylated cytosine in the present CpG site is converted into uracil by bisulfite treatment, which is currently most commonly used. It is the method that has been. Specifically, the following four methods (i) to (iv) can be exemplified.
（i）バイサルファイトシーケンシング法
サンプルであるゲノムＤＮＡに対してバイサルファイト処理を行うことによって、ゲノムＤＮＡにおける、メチル化修飾を受けたシトシンはそのまま変換せず、非メチル化シトシンのみをウラシルに変換させる。このゲノムＤＮＡについてシーケンス反応を行うと、ウラシルはチミンとして表現されることとなる。バイサルファイト処理前後のゲノムＤＮＡの配列データを比較し、バイサルファイト処理前後のいずれもシトシンである部位はメチル化シトシンであることが分かり、バイサルファイト処理前にシトシンでありバイサルファイト処理後にチミンとなった部位は非メチル化シトシンであることが分かる。
(I) Bisulfite sequencing method By performing bisulfite treatment on the sample genomic DNA, methylated cytosine in the genomic DNA is not converted as it is, but only unmethylated cytosine is converted into uracil. Let When sequence reaction is performed on this genomic DNA, uracil is expressed as thymine. Comparing the sequence data of genomic DNA before and after bisulfite treatment, it was found that the site that was cytosine before and after bisulfite treatment was methylated cytosine. It was cytosine before bisulfite treatment and became thymine after bisulfite treatment. The site is found to be unmethylated cytosine.
（ii）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ、Methylation-Specific PCR)法
サンプルであるゲノムＤＮＡに対してバイサルファイト処理を行うと、メチル化ＣｐＧ部位と非メチル化ＣｐＧ部位とは、異なった塩基配列が生じることとなる。このことを利用して、各々において異なる塩基配列の部位に特異的なＰＣＲプライマーを設計して、ＰＣＲ産物の有無でメチル化状態を検出する方法である。このＭＳＰ法では、バイサルファイト処理をしたＤＮＡをそのまま解析に使うことができるため、短時間で結果を確認することが可能である。
(Ii) Methylation-specific PCR (MSP) method When bisulfite treatment is performed on genomic DNA, which is a sample, different base sequences are obtained between methylated CpG sites and unmethylated CpG sites. Will occur. By utilizing this fact, a PCR primer specific to each site of a different base sequence is designed in each, and a methylation state is detected by the presence or absence of a PCR product. In this MSP method, since the bisulfite-treated DNA can be used as it is for analysis, the result can be confirmed in a short time.
（iii）ＣＯＢＲＡ（COmbined Bisulfite Restriction Analysis）法
バイサルファイト処理によりＤＮＡメチル化状態依存的に特定の制限酵素認識配列の塩基配列が変化することを利用し、バイサルファイト−ＰＣＲ後に酵素処理したＰＣＲ産物を電気泳動することでメチル化頻度を測定する方法であり、後述の実施例で用いている方法でもある。特定の認識配列におけるメチル化頻度を、ＰＣＲ産物の切断の有無の量比にて定量的に解析できる。
(Iii) COBRA (COmbined Bisulfite Restriction Analysis) method By utilizing the fact that the base sequence of a specific restriction enzyme recognition sequence changes depending on the DNA methylation state by bisulfite treatment, This is a method of measuring the methylation frequency by electrophoresis, and is also a method used in Examples described later. The methylation frequency in a specific recognition sequence can be quantitatively analyzed by the quantitative ratio of the presence or absence of cleavage of the PCR product.
（iv）HumanMethylation450BeadChip（イルミナ株式会社製）を用いた方法
この方法は、バイサルファイトシーケンシング法の１種であるバイサルファイトパイロシークエンシング法を基盤とした、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化（ＤＮＡメチローム）解析法である。サンプルから抽出したゲノムＤＮＡについてバイサルファイト処理を行った後、制限酵素によってＤＮＡを断片化し、該ＤＮＡ断片上の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度（メチル化レベル）を、付属のBeadChipを用いて検出する。このBeadChipには、本件ＣｐＧ部位を含む約４５万個の各ＣｐＧ部位におけるシトシンがウラシルに変換したＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（非メチル検出用プローブ）の標識物と、変換していないＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（メチル検出用プローブ）の標識物がそれぞれ固定されている。それぞれのプローブにハイブリダイズしたＤＮＡ断片の量を蛍光で簡便に検出することによって、ゲノムＤＮＡ上の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定することができる。本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度の好適な指標として、β値を挙げることができる。β値とは、例えば、標識物質が蛍光物質や蛍光タンパク質の場合、測定によって得られた、各ＣｐＧ部位に対応する非メチル検出用プローブの蛍光値（signal A）、及び、メチル検出用プローブの蛍光値（signal B）について、以下の計算式により算出される値である。
β＝（本件ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値）／（本件ＣｐＧ部位におけるsignal Aの最大値＋本件ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値＋１００）；
この計算式によると、各ＣｐＧ部位のメチル化頻度が、０（完全非メチル化）〜１（完全メチル化）の範囲で算出されることとなる。
(Iv) Method using HumanMethylation450BeadChip (manufactured by Illumina Co., Ltd.) This method is a genome-wide DNA methylation analysis based on the bisulfite pyrosequencing method, which is one of the bisulfite sequencing methods. Is the law. After bisulfite treatment is performed on genomic DNA extracted from the sample, the DNA is fragmented with restriction enzymes, and the methylation frequency (methylation level) at the CpG site on the DNA fragment is detected using the attached BeadChip. . In this BeadChip, a label of an oligonucleotide probe (non-methyl detection probe) that can specifically hybridize to a DNA sequence in which cytosine in each CpG site including the present CpG site is converted to uracil, Labels of oligonucleotide probes (methyl detection probes) that can specifically hybridize to unconverted DNA sequences are immobilized. By simply detecting the amount of the DNA fragment hybridized with each probe by fluorescence, the methylation frequency at the present CpG site on the genomic DNA can be measured. As a suitable index of the methylation frequency at the present CpG site, β value can be mentioned. For example, when the labeling substance is a fluorescent substance or a fluorescent protein, the β value is the fluorescence value (signal A) of the non-methyl detection probe corresponding to each CpG site obtained by measurement, and the methyl detection probe. The fluorescence value (signal B) is a value calculated by the following calculation formula.
β = (maximum value of signal B at the present CpG site) / (maximum value of signal A at the present CpG site + maximum value of signal B at the present CpG site + 100);
According to this calculation formula, the methylation frequency of each CpG site is calculated in the range of 0 (completely unmethylated) to 1 (completely methylated).
上記（Ｅ）工程中における、ＤＮＡメチル化頻度に基づき多変量解析を行う方法としては、抽出した各組織のゲノムＤＮＡのメチル化状態の類似度を統計的に解析できる手法であれば特に制限されないが、階層的クラスタリング、自己組織化マッピングあるいは主成分分析等を好適に例示することができ、なかでも一般に広く認識されている階層的クラスタリングを用いることが好ましい。 The method for performing multivariate analysis based on the DNA methylation frequency in the step (E) is not particularly limited as long as it is a technique that can statistically analyze the similarity of the methylation state of the extracted genomic DNA of each tissue. However, hierarchical clustering, self-organizing mapping, principal component analysis, and the like can be suitably exemplified, and it is preferable to use hierarchical clustering that is generally widely recognized.
上記工程（Ｂ）及び（Ｄ）において、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する領域は特に制限されないが、好ましくは、
配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１４４−１４５番目のヌクレオチド配列、
配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列、
配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列、
配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列、
配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列、
配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列、
配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列、
配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列、
配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列、
配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列、
のメチル化頻度を測定することが好ましい。
In the steps (B) and (D), the region for measuring the frequency of methylation in the present CpG site is not particularly limited, but preferably,
Nucleotide sequence 144-145 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1,
Nucleotide sequence from positions 146 to 147 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
Nucleotide sequence 181 to 182 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3,
Nucleotide sequences 67-68 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Nucleotide sequences 171 to 172 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5,
Nucleotide sequences 377-378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6,
Nucleotide sequence from positions 159 to 160 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7,
Nucleotide sequence 65-66 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8,
Nucleotide sequence 259-260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9,
Nucleotide sequences 102 to 103 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10,
It is preferable to measure the methylation frequency.
上記（Ｅ）工程は、「工程（Ｂ）において測定した本件ＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、ＤＮＡメチル化頻度に基づき多変量解析を行い、バイオマーカー遺伝子パネルを作製する工程」である。ここで、上記工程（Ａ）において用いた検体組織と、上記工程（Ｃ）において用いた検体組織とは同種の組織であることが好ましい。また、該検体組織は、被検体と同じ生物種のもの（被検体がヒトである場合にはヒトのもの）を用いることが好ましい。 The above step (E) is “a step of producing a biomarker gene panel by performing multivariate analysis on the methylation frequency at the present CpG site measured in step (B) based on the DNA methylation frequency”. Here, the sample tissue used in the step (A) and the sample tissue used in the step (C) are preferably the same type of tissue. Moreover, it is preferable to use the specimen tissue of the same biological species as the subject (or human if the subject is human).
このように、検体組織から抽出したゲノムＤＮＡ中の、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度に基づいて、該検体組織が子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫、及び子宮平滑筋層のいずれにあたるかを判定することができる。より具体的には、工程（Ｄ）において測定した被検体組織におけるメチル化頻度データを、基準となる工程（Ｂ）で測定したメチル化頻度データと共に、工程（Ｅ）による多変量解析に供することで、前記被検体が子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫、及び子宮平滑筋層のいずれにあたるかを区別することができる。 As described above, based on the methylation frequency at the CpG site in the genomic DNA extracted from the specimen tissue, it is determined whether the specimen tissue corresponds to uterine leiomyoma, uterine leiomyosarcoma, or uterine smooth muscle layer. be able to. More specifically, the methylation frequency data in the subject tissue measured in the step (D) is subjected to multivariate analysis in the step (E) together with the methylation frequency data measured in the reference step (B). Thus, it can be distinguished whether the subject is a uterine leiomyoma, uterine leiomyosarcoma, or uterine leiomyosarcoma layer.
本発明の子宮平滑筋における腫瘍の診断用キット（以下、「本件診断用キット」ということがある）としては、本件バイオマーカー遺伝子領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定するためのプライマー若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えた、子宮平滑筋における腫瘍を診断するためのキットであれば特に制限されず、ここで本件診断用キットは、子宮平滑筋における腫瘍を診断するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書、子宮平滑筋における腫瘍を診断するための説明書等の添付文書が通常含まれる。 As a kit for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the present diagnostic kit”), a primer or a probe for measuring the methylation frequency of a CpG sequence in the present biomarker gene region, Or a kit for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle provided with such a label, wherein the diagnostic kit is a use invention relating to a kit for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle In addition to the components generally used in this type of diagnostic kit, for example, carriers, pH buffers, stabilizers, etc., this kit is accompanied by instruction manuals, instructions for diagnosing tumors in uterine smooth muscle, etc. Documents are usually included.
本件診断用キットにおけるプライマーとしては、本件ＣｐＧ部位のメチル化頻度を測定することができ、かつ、ＰＣＲにより増幅可能なプライマーであればよく、例えば、本件ＣｐＧ部位の上流のヌクレオチド配列の相補配列にアニールするフォワードプライマーと、本件ＣｐＧ部位の下流のヌクレオチド配列にアニールするリバースプライマーとのプライマーセットや、本件ＣｐＧ部位の上流のヌクレオチド配列の相補配列にアニールし、かつ本件ＣｐＧ部位のシトシンで３’末端がアニールするフォワードプライマーと、本件ＣｐＧ部位の下流のヌクレオチド配列にアニールするリバースプライマーとのプライマーセットや、本件ＣｐＧ部位の上流のヌクレオチド配列の相補配列にアニールするフォワードプライマーと、本件ＣｐＧ部位のシトシンで３’末端がアニールするリバースプライマーとのプライマーセットや、本件ＣｐＧ部位の上流のヌクレオチド配列の相補配列にアニールし、かつ本件ＣｐＧ部位のシトシンがウラシルに変換された場合にかかるウラシルの部位で３’末端がアニールするフォワードプライマーと、本件ＣｐＧ部位の下流のヌクレオチド配列にアニールするリバースプライマーとのプライマーセットや、本件ＣｐＧ部位の上流のヌクレオチド配列の相補配列にアニールするフォワードプライマーと、本件ＣｐＧ部位のシトシンがウラシルに変換された場合にかかるウラシルの部位で３’末端がアニールするリバースプライマーとのプライマーセットを挙げることができる。また、プライマー配列の長さ、アニーリングする部位等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１０〜３０塩基を選択することができる。なお、ＮＣＢＩのデータベースに登録されている本件バイオマーカー遺伝子のヌクレオチド配列の５’末端側を上流とし、３’末端側を下流とする。 The primer in the present diagnostic kit may be any primer that can measure the methylation frequency of the present CpG site and can be amplified by PCR. For example, a primer sequence complementary to the nucleotide sequence upstream of the present CpG site. A primer set consisting of a forward primer that anneals and a reverse primer that anneals to the nucleotide sequence downstream of the CpG site, or a complementary sequence of the nucleotide sequence upstream of the CpG site, and the 3 ′ end with cytosine of the CpG site A primer set of a forward primer that anneals with a reverse primer that anneals to a nucleotide sequence downstream of the CpG site, a forward primer that anneals to a complementary sequence of a nucleotide sequence upstream of the CpG site, and the CpG site A primer set with a reverse primer that anneals at the 3 ′ end with cytosine, or a uracil site that anneals to the complementary sequence of the nucleotide sequence upstream of the CpG site and the cytosine of the CpG site is converted to uracil. A primer set of a forward primer that anneals at the 3 ′ end and a reverse primer that anneals to the nucleotide sequence downstream of the CpG site, a forward primer that anneals to a complementary sequence of the nucleotide sequence upstream of the CpG site, and the CpG site A primer set with a reverse primer that anneals at the 3 'end at the uracil site when the cytosine is converted to uracil. Further, the length of the primer sequence, the site to be annealed, etc. can be appropriately selected in consideration of the DNA amplification efficiency and specificity. For example, 10 to 30 bases can be selected as the length of the primer sequence. The 5 'terminal side of the nucleotide sequence of the present biomarker gene registered in the NCBI database is upstream, and the 3' terminal side is downstream.
本件診断用キットにおけるプローブとしては、本件ＣｐＧ部位を含むヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするプローブや、本件ＣｐＧ部位のシトシンがウラシルに変換された上記ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするプローブを挙げることができ、プローブの長さ、ハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。 Examples of the probe in the present diagnostic kit include a probe that hybridizes to a nucleotide sequence including the present CpG site, and a probe that hybridizes to the nucleotide sequence obtained by converting cytosine of the present CpG site to uracil. The length, the site to hybridize, and the like can be appropriately selected in consideration of the efficiency and specificity of hybridization.
本件診断用キットの標識物における標識物質としては、前述したように、ペルオキシダーゼ（例えば、horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質を挙げることができる。 As described above, the labeling substance in the labeling product of the diagnostic kit includes peroxidase (for example, horseradish peroxidase), alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenation. Enzymes, malic acid dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase, acetylcholinesterase and other enzymes, fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride, tetramethylrhodamine isothiocyanate, etc. Fluorescent substance, Green Fluorescence Protein (GFP), Cyan Fluorescence Protein (CFP), Blue Fluorescence Protein Park protein (Blue Fluorescence Protein; BFP), yellow fluorescent protein (Yellow Fluorescence Protein; YFP), red fluorescent protein (Red Fluorescence Protein; RFP), luciferase (luciferase) fluorescent proteins, such as, 3 H, 14 C, 125 I or Mention may be made of radioisotopes such as 131 I, biotin, avidin or chemiluminescent substances.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［サンプル組織の採取及びＤＮＡの抽出］
山口大学医学部、及び医学部附属病院遺伝子解析研究に関する倫理審査委員会の承認のもと、医学的適応により子宮全摘術を受けた患者より、組織サンプルを得た。用いた検体は、正常筋層１８検体、子宮筋腫１８検体、及び子宮肉腫１２検体だった。また、これとは別にヒト平滑筋肉腫由来細胞株２種（ヒト子宮肉腫細胞株ＳＫＮ、及びヒト卵巣肉腫細胞株ＲＫＮ）（独立行政法人医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を用いた。
組織検体からゲノムＤＮＡを抽出した。組織片１０〜３０ｍｇを、液体窒素で凍結後、粉砕し粉末状にした。ＤＮＡ抽出は一般的な方法で行った。粉末状組織片をProteinase K（QIAGEN社製）で処理した後、フェノール／クロロフォルムを用いて抽出を行い、エタノール沈殿で精製した。
[Sample tissue collection and DNA extraction]
Tissue samples were obtained from patients who underwent total hysterectomy due to medical indications, with the approval of the Ethics Review Committee on Genetic Analysis Research at Yamaguchi University School of Medicine and Hospitals. The specimens used were 18 specimens of normal muscle layer, 18 specimens of uterine fibroids, and 12 specimens of uterine sarcoma. In addition, two human leiomyosarcoma-derived cell lines (human uterine sarcoma cell line SKN and human ovarian sarcoma cell line RKN) (purchased from JCRB Cell Bank, Incorporated Administrative Agency) were used.
Genomic DNA was extracted from the tissue specimen. Ten to 30 mg of tissue pieces were frozen in liquid nitrogen and then pulverized into powder. DNA extraction was performed by a general method. The powdered tissue piece was treated with Proteinase K (QIAGEN), extracted with phenol / chloroform, and purified by ethanol precipitation.
［筋腫特異的バイオマーカー候補遺伝子の選定］
出願人はこれまでに、子宮筋腫と正常筋層それぞれ各３検体のＤＮＡメチロームデータをもとに、子宮筋腫特異的にメチル化変異が生じている１２０遺伝子を抽出している（PLoS One, 8(6): e66632, 2013）。ＤＮＡメチル化パターンは組織・細胞種ごとに特異的である。子宮筋腫と子宮肉腫はともに子宮平滑筋に由来するが本質的には異なる腫瘍であるため、出願人は、子宮筋腫特異的にメチル化変異が生じている遺伝子群が子宮筋腫と子宮肉腫とを明確に区別するバイオマーカーとなり得る可能性は高いと考えた。そこで、前記１２０遺伝子のうち、ＤＮＡメチル化解析用プライマーの構築に成功した３３遺伝子を子宮筋腫特異的メチル化変異遺伝子の候補として選出した。３３遺伝子を表１に示す。
[Selection of candidate genes for myoma-specific biomarkers]
To date, the applicant has extracted 120 genes with specific methylation mutations based on DNA methylome data of 3 samples each of uterine fibroids and normal muscle layers (PLoS One, 8 (6): e66632, 2013). The DNA methylation pattern is specific for each tissue / cell type. Since both uterine fibroids and uterine sarcomas are derived from uterine smooth muscle but are essentially different tumors, the applicant has identified a group of genes with uterine fibroid-specific methylation mutations as uterine fibroids and uterine sarcomas. We thought that there was a high possibility that the biomarker could be clearly distinguished. Therefore, of the 120 genes, 33 genes that were successfully constructed as primers for DNA methylation analysis were selected as candidates for uterine fibroid-specific methylation mutant genes. 33 genes are shown in Table 1.
［ＤＮＡメチル化頻度の測定］
ＤＮＡメチル化頻度の測定には、ＣＯＢＲＡ法を用いた。ゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理した後にバイサルファイト−ＰＣＲを行うと、非メチル化シトシンはチミンに変換され、他方、メチル化シトシンはシトシンのままで変換されないという反応が生じる。この反応により、特定の制限酵素認識配列の塩基配列がメチル化状態に依存して変化することを利用し、酵素処理したＰＣＲ産物を電気泳動することでメチル化頻度を解析する。
バイサルファイト処理は、EpiTect(R) Bisulfite kit（Qiagen社製）を用い、キット付属の説明書に基づいて行った。１μｇのゲノムＤＮＡに対し、バイサルファイト反応を、９５℃ ５分間、６５℃ ８５分間、９５℃ ５分間、及び６５℃ １７５分間の条件で行った。バイサルファイト−ＰＣＲは、１／１００量のバイサルファイトＤＮＡをテンプレートとし、Biotaq HS DNA polymerase（Bioline社製）を用いて、９５℃ １０分間、［９５℃ ０．５分間、６０℃ ０．５分間、７２℃ ０．５分間］×３５サイクル、７２℃ ７分間の反応条件で行った。制限酵素は配列TCGAを認識するTaqI、及び配列ACGTを認識するHpyCH4IVを使用した。制限酵素処理には半量のＰＣＲ産物を使用し、TaqIは３７℃、HpyCH4IVは６５℃でそれぞれ２時間以上反応した。制限酵素処理したＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で分離し、メチル化率を算出した。
[Measurement of DNA methylation frequency]
The COBRA method was used to measure the DNA methylation frequency. When bisulfite-PCR is performed after bisulfite treatment of genomic DNA, a reaction occurs in which unmethylated cytosine is converted to thymine, while methylated cytosine remains cytosine and not converted. By utilizing the fact that the base sequence of a specific restriction enzyme recognition sequence changes depending on the methylation state by this reaction, the methylation frequency is analyzed by electrophoresis of the PCR product treated with the enzyme.
Bisulfite treatment was performed using EpiTect (R) Bisulfite kit (manufactured by Qiagen) based on the instructions attached to the kit. Bisulfite reaction was performed on 1 μg of genomic DNA under the conditions of 95 ° C. for 5 minutes, 65 ° C. for 85 minutes, 95 ° C. for 5 minutes, and 65 ° C. for 175 minutes. Bisulfite-PCR uses 1/100 amount of bisulfite DNA as a template and Biotaq HS DNA polymerase (manufactured by Bioline) using 95 ° C for 10 minutes [95 ° C for 0.5 minutes, 60 ° C for 0.5 minutes. , 72 ° C., 0.5 minute] × 35 cycles, 72 ° C. for 7 minutes. The restriction enzymes used were TaqI that recognizes the sequence TCGA and HpyCH4IV that recognizes the sequence ACGT. Half of the PCR product was used for restriction enzyme treatment, and TaqI reacted at 37 ° C and HpyCH4IV at 65 ° C for 2 hours or longer. PCR products treated with restriction enzymes were separated by agarose gel electrophoresis, and the methylation rate was calculated.
まずは、表１に記載の遺伝子において、ＣＯＢＲＡ法による１遺伝子のメチル化解析に基づき、正常筋層と子宮筋腫とを判別可能かを検討したが、１遺伝子のメチル化頻度だけでは多数の症例を明瞭に区別することは難しいことが明らかとなった。１例として各１８症例の正常筋層検体、及び子宮筋腫検体を用い、ＡＬＸ１遺伝子のメチル化頻度を解析した結果を図１に示す。 First, based on the methylation analysis of one gene by the COBRA method for the genes listed in Table 1, it was examined whether normal muscle layer and uterine fibroids could be distinguished. It became clear that it was difficult to distinguish clearly. FIG. 1 shows the results of analyzing the methylation frequency of the ALX1 gene using 18 normal muscle layer specimens and uterine fibroid specimens as an example.
［筋腫特異的バイオマーカーの選出］
実施例１を踏まえ、筋腫特異的バイオマーカー遺伝子パネルを構築するにあたり、判別精度を保ちつつメチル化解析の労力を最小限にできる遺伝子数を検討した。
子宮筋腫特異的メチル化変異遺伝子の候補として選出した上記３３遺伝子について、３症例の子宮筋腫検体を用いて１遺伝子のメチル化頻度をＣＯＢＲＡ法により解析した。その結果、全ての筋腫検体で高メチル化変異或いは低メチル化変異が生じている、１７個の遺伝子を筋腫特異的バイオマーカー遺伝子として同定した。更に、子宮筋腫検体を１１症例に増やし同様の解析を行い、７割以上の筋腫検体で共通して高メチル化変異あるいは低メチル化変異が生じた１０個の遺伝子（ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４）を特定した。
特定した筋腫特異的バイオマーカー遺伝子について、バイサルファイト−ＰＣＲに用いたＰＣＲプライマーを表２に示す。表２に示したプライマー配列は、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンがウラシル（チミン）に変換された配列を増幅できるように設計したものである。また、本件バイオマーカー遺伝子のバイサルファイト−ＰＣＲにて増幅されたゲノム領域のヌクレオチド配列を、配列番号１〜１０に示す（配列番号１：ＡＬＸ１、配列番号２：ＣＢＬＮ１、配列番号３：ＣＯＲＩＮ、配列番号４：ＦＯＸＰ１、配列番号５：ＧＡＴＡ２、配列番号６：ＩＧＬＯＮ５、配列番号７：ＮＰＴＸ２、配列番号８：ＮＴＲＫ２、配列番号９：ＰＲＬ、配列番号１０：ＳＴＥＡＰ４）。ＣＯＢＲＡ法にてメチル化頻度を解析したＣｐＧ部位は、以下のとおりである。
配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１４４−１４５番目のヌクレオチド配列
配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列
配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列
配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列
配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列
配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列
配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列
配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列
配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列
配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列
[Selection of myoma-specific biomarkers]
Based on Example 1, in constructing a myoma-specific biomarker gene panel, the number of genes that can minimize the labor of methylation analysis while maintaining discrimination accuracy was examined.
For the 33 genes selected as candidates for uterine fibroid-specific methylation mutant genes, the methylation frequency of one gene was analyzed by the COBRA method using three cases of uterine fibroid specimens. As a result, 17 genes having hypermethylation mutations or hypomethylation mutations in all myoma specimens were identified as myoma-specific biomarker genes. Furthermore, the number of uterine fibroid specimens was increased to 11 cases, and the same analysis was performed. Ten genes (ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1) in which 70% or more of the myoma specimens had hypermethylation mutations or hypomethylation mutations commonly occurred. , GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4).
Table 2 shows the PCR primers used for bisulfite-PCR for the identified myoma-specific biomarker gene. The primer sequences shown in Table 2 are designed so that a sequence in which unmethylated cytosine is converted to uracil (thymine) by bisulfite treatment can be amplified. Moreover, the nucleotide sequence of the genomic region amplified by bisulfite-PCR of the present biomarker gene is shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 (SEQ ID NO: 1 ALX1, SEQ ID NO: 2: CBLN1, SEQ ID NO: 3: CORIN, sequence) No. 4: FOXP1, SEQ ID NO: 5: GATA2, SEQ ID NO: 6: IGLON5, SEQ ID NO: 7: NPTX2, SEQ ID NO: 8: NTRK2, SEQ ID NO: 9: PRL, SEQ ID NO: 10: STEAP4). The CpG sites analyzed for methylation frequency by the COBRA method are as follows.
144-145th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 146-147th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 181-182nd nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: Nucleotide sequence 67-68 of the nucleotide sequence shown in 4 nucleotide sequence 171-172 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO 5 nucleotide sequence 377-378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO 6 Nucleotide sequence 159-160 of the nucleotide sequence shown nucleotide sequence 65-66 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 nucleotide sequence 259-260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 102-103 nt sequence of the nucleotide sequence shown in ID NO: 10
［ＤＮＡメチル化変異子宮筋腫特異的バイオマーカー遺伝子パネルの構築］
各症例のメチル化状態の類似度を測る尺度としてピアソン相関を用い、クラスタリングのアルゴリズムとして平均連結法を採用したクラスタリングを行った。実際の階層的クラスタリングには、オープンリソースソフトであるMultiExperiment Viewer（ＭｅＶ）を使用し、症例方向のクラスタリングを行った。
各１８症例の正常筋層検体、及び子宮筋腫検体における階層的クラスタリングの結果を図２に示す。選出した前述の１０遺伝子により、１８症例の正常筋層と子宮筋腫がクラスタリングにより完全に異なるクラスターに区別された。一方で、筋腫検体においては樹形図（デンドログラム）の約半分の高さ（点線）で切り取った場合、メチル化パターンが若干異なる３つのサブグループ（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）に分類されることも示された。
[Construction of DNA methylation mutant uterine fibroid-specific biomarker gene panel]
Clustering was performed using Pearson correlation as a measure to measure the similarity of methylation status of each case, and using average linkage as a clustering algorithm. In the actual hierarchical clustering, open resource software MultiExperiment Viewer (MeV) was used to perform case-direction clustering.
FIG. 2 shows the results of hierarchical clustering in the normal muscle layer specimen and the uterine fibroid specimen in each of 18 cases. Based on the selected 10 genes, 18 cases of normal muscle layers and uterine fibroids were distinguished into completely different clusters by clustering. On the other hand, when the myoma specimen is cut at about half the height (dotted line) of the dendrogram, it is classified into three subgroups (L1, L2, and L3) with slightly different methylation patterns. Was also shown.
［クラスタリングによる子宮肉腫検体の分別］
１２症例の子宮肉腫検体、及び肉腫細胞株４サンプル（ヒト子宮肉腫細胞株ＳＫＮ、及びヒト卵巣肉腫細胞株ＲＫＮをそれぞれ２サンプルずつ）を、実施例２にて構築した各１８症例の正常筋層検体、及び子宮筋腫検体における階層的クラスタリングの結果と共に示した結果を図３に示す。
８症例の肉腫検体と４株の肉腫細胞株は、筋腫・筋層とは異なるクラスターに分別された。一方、４症例の肉腫検体は筋腫のサブグループＬ２に分別された。筋腫を含まないクラスターに分類された検体のうち、筋層のクラスターに含まれなかったものは肉腫と判断できる。筋腫を含むクラスターに分類された検体のうち、サブグループＬ１およびＬ３にクラスタリングされたものは筋腫と判断でき、サブグループＬ２にクラスタリングされたものは４０％の確率で肉種の可能性を持つ検体と判断できる。
[Separation of uterine sarcoma specimens by clustering]
12 cases of uterine sarcoma specimens and 4 samples of sarcoma cell lines (2 samples each of human uterine sarcoma cell line SKN and human ovarian sarcoma cell line RKN), normal muscle layer of 18 cases each constructed in Example 2 FIG. 3 shows the results shown together with the results of the hierarchical clustering in the specimen and the uterine fibroid specimen.
Eight cases of sarcoma specimens and 4 sarcoma cell lines were separated into clusters different from the myoma / muscle layer. On the other hand, the sarcoma specimens of 4 cases were separated into the myoma subgroup L2. Among specimens classified as clusters that do not include myoma, those not included in the muscle layer cluster can be judged as sarcomas. Among the samples classified into clusters containing myomas, those clustered into subgroups L1 and L3 can be judged as myomas, and those clustered into subgroup L2 have a 40% probability of being a meat species It can be judged.
［階層的クラスタリングによる子宮肉腫の診断］
追加した新規の症例データが肉腫、筋腫、及び筋層検体を含むどのクラスターに分類されるかを調べることで、その症例が肉腫であるか否かを診断することができる。新規な２症例（検体Ｘ、及びＹ）について、ＣＯＢＲＡ法により前述の１０遺伝子領域のメチル化データを取得し、そのデータを実施例３にて示した肉腫、筋腫および筋層検体のメチル化データに追加して階層的クラスタリングを行った。検体Ｘ、及びＹは病理診断により、それぞれ子宮筋腫、及び子宮肉腫と診断されている。階層的クラスタリングの結果を図４に示す。
検体Ｘ、及びＹは階層的クラスタリングにより、それぞれ子宮筋腫、及び子宮肉腫に分別された。これより、本願筋腫特異的バイオマーカー遺伝子パネルは、子宮肉腫の診断に応用可能であることが示された。
[Diagnosis of uterine sarcoma by hierarchical clustering]
It can be diagnosed whether the case is a sarcoma by investigating to which cluster the added new case data is classified into sarcoma, myoma, and muscle layer specimen. For two new cases (specimens X and Y), the methylation data of the 10 gene regions described above were obtained by the COBRA method, and the methylation data of the sarcoma, myoma and muscle layer samples shown in Example 3 were used. In addition to the above, hierarchical clustering was performed. Samples X and Y are diagnosed as uterine fibroids and uterine sarcomas, respectively, by pathological diagnosis. The result of hierarchical clustering is shown in FIG.
Samples X and Y were classified into hysteromyoma and uterine sarcoma, respectively, by hierarchical clustering. From this, it was shown that this myoma specific biomarker gene panel is applicable to the diagnosis of uterine sarcoma.
本発明によると、子宮平滑筋における腫瘍が良性腫瘍（子宮平滑筋腫）か、悪性腫瘍（子宮平滑筋肉腫）のいずれかであるかを精度よく診断できるため、子宮平滑筋における腫瘍の悪性度をより正確に分類し、効果的な治療が可能となり、ＱＯＬ（Quality of Life）の向上や医療費削減、及び妊娠可能な子宮温存による少子化問題の解消等の効果が期待される。 According to the present invention, it is possible to accurately diagnose whether a tumor in uterine smooth muscle is a benign tumor (uterine leiomyoma) or a malignant tumor (uterine leiomyosarcoma). More accurate classification and effective treatment become possible, and the effects such as improvement of QOL (Quality of Life), reduction of medical expenses, and elimination of the declining birthrate due to uterus preservation that can be expected are expected.
Claims (4)
（Ａ）採取された子宮平滑筋腫、子宮平滑筋肉腫、及び正常子宮平滑筋層の組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で抽出した各組織のゲノムＤＮＡ中の、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定する工程；
（Ｃ）被検体から採取された子宮平滑筋における腫瘍組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ１、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ２、ＩＧＬＯＮ５、ＮＰＴＸ２、ＮＴＲＫ２、ＰＲＬ、及びＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記各遺伝子の転写制御領域をコードする領域におけるＣｐＧ配列のメチル化頻度を測定する工程；
（Ｅ）前記被検体における子宮平滑筋腫及び子宮平滑筋肉腫を診断するためのデータを収集するため、工程（Ｄ）で測定したＣｐＧ配列のメチル化頻度データを、基準となる工程（Ｂ）で測定したＣｐＧ配列のメチル化頻度データとともに階層的クラスタリングを行う工程； A method for collecting data for diagnosing a tumor in uterine smooth muscle, comprising the following steps (A) to (E):
(A) extracting genomic DNA from the collected uterine leiomyoma, uterine leiomyosarcoma and normal uterine leiomyosarcoma tissue;
(B) Regions encoding ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 genes in the genomic DNA of each tissue extracted in step (A), or transcriptional control of the respective genes Measuring the methylation frequency of the CpG sequence in the region;
(C) a step of extracting genomic DNA from tumor tissue in uterine smooth muscle collected from a subject;
(D) A region encoding the ALX1, CBLN1, CORIN, FOXP1, GATA2, IGLON5, NPTX2, NTRK2, PRL, and STEAP4 genes in the genomic DNA extracted in the step (C) or the transcriptional control region of each gene is encoded. Measuring the methylation frequency of the CpG sequence in the region to be treated;
(E) In order to collect data for diagnosing uterine leiomyoma and uterine leiomyosarcoma in the subject, the methylation frequency data of the CpG sequence measured in step (D) is used as a reference in step (B). Performing hierarchical clustering with the measured methylation frequency data of the CpG sequence ;
ＡＬＸ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の１４４−１４５番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＢＬＮ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＯＲＩＮ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列であり、
ＦＯＸＰ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列であり、ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列であり、
ＩＧＬＯＮ５遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＰＴＸ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＴＲＫ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列であり、ＰＲＬ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列であり、ＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１記載の方法。 In steps (B) and (D),
The CpG sequence in the region encoding the ALX1 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 144th to 145th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1,
The CpG sequence in the region encoding the CBLN1 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 146 to 147 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
The CpG sequence in the region encoding the CORIN gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 181 to 182 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3,
The CpG sequence in the region encoding the FOXP1 gene or the transcription control region of the gene is the 67th to 68th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the region encoding the GATA2 gene or the transcription control region of the gene The CpG sequence in 171 to 172 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5,
The CpG sequence in the region encoding the IGLON5 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 377 to 378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6,
The CpG sequence in the region encoding the NPTX2 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 159 to 160 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7,
The region encoding the NTRK2 gene or the CpG sequence in the transcription control region of the gene is the 65-66th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the region encoding the PRL gene or the transcription control region of the gene The CpG sequence is the nucleotide sequence 259-260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the CpG sequence in the region encoding the STEAP4 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 claim 1 Symbol mounting method characterized in that it is a 102-103 nt sequences.
ＣＢＬＮ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列の１４６−１４７番目のヌクレオチド配列であり、
ＣＯＲＩＮ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列の１８１−１８２番目のヌクレオチド配列であり、
ＦＯＸＰ１遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列の６７−６８番目のヌクレオチド配列であり、ＧＡＴＡ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の１７１−１７２番目のヌクレオチド配列であり、
ＩＧＬＯＮ５遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列の３７７−３７８番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＰＴＸ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列の１５９−１６０番目のヌクレオチド配列であり、
ＮＴＲＫ２遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列の６５−６６番目のヌクレオチド配列であり、ＰＲＬ遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号９に示されるヌクレオチド配列の２５９−２６０番目のヌクレオチド配列であり、ＳＴＥＡＰ４遺伝子をコードする領域又は前記遺伝子の転写制御領域におけるＣｐＧ配列が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１０２−１０３番目のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項３記載のキット。 The CpG sequence in the region encoding the ALX1 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 144th to 145th of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1,
The CpG sequence in the region encoding the CBLN1 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 146 to 147 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2,
The CpG sequence in the region encoding the CORIN gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence 181 to 182 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3,
The CpG sequence in the region encoding the FOXP1 gene or the transcription control region of the gene is the 67th to 68th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the region encoding the GATA2 gene or the transcription control region of the gene The CpG sequence in 171 to 172 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5,
The CpG sequence in the region encoding the IGLON5 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence of positions 377 to 378 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6,
The CpG sequence in the region encoding the NPTX2 gene or the transcriptional regulatory region of the gene is the nucleotide sequence at positions 159 to 160 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7,
The region encoding the NTRK2 gene or the CpG sequence in the transcription control region of the gene is the 65-66th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the region encoding the PRL gene or the transcription control region of the gene The CpG sequence is the nucleotide sequence 259-260 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the CpG sequence in the region encoding the STEAP4 gene or the transcription control region of the gene is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 The kit according to claim 3 , wherein the nucleotide sequence is from 102 to 103.
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