JP6573800B2 - Nucleic acid, primer set, and detection method of Candidatus riviberactor solanakearum using the same - Google Patents
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本発明は、植物病原細菌として知られるカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum）を検出するための核酸、プライマーセットおよび検出方法に関する。 The present invention relates to a nucleic acid, a primer set and a detection method for detecting Candidatus Liberibacter solanacearum known as a phytopathogenic bacterium.
カンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum；以下「Lso」ともいう。）は、近年見つかった植物病原菌であり、吸汁性媒介虫によって宿主植物に伝播される。しかし、その生態についてはほとんど明らかとなっていない。 Candidatus Liberibacter solanacearum (hereinafter also referred to as “Lso”) is a phytopathogenic fungus found in recent years and is transmitted to host plants by sucking vectors. However, little is known about its ecology.
2008年以降、アメリカ合衆国、メキシコ、グアテマラ、ホンジュラス、ニカラグアおよびニュージーランドにおいて、この病原菌がジャガイモの現茎部（芋）に縞状の病徴を示すゼプラチップ病を引き起こすことが報告されている（非特許文献1）。また、ジャガイモと同じナス科植物においては、植物体に黄化症状等を引き起こすことも知られている（非特許文献1）。加えて、2010年以降には、欧州のラィンランド、ノルウェー、スウェーデン、フランスおよびスぺインにおいて、ニンジンおよび同じセリ科であるセロリーで葉の脱色化や茎や根の矮化といった病徴を引き起こすことが報告されている（非特許文献2)。 Since 2008, in the United States, Mexico, Guatemala, Honduras, Nicaragua and New Zealand, this pathogen has been reported to cause zebra chip disease that shows stripe-like symptoms on the current potato stem (芋) (non-patent literature) 1). In addition, it is also known that in the same solanaceous plant as potato, yellowing symptoms and the like are caused in the plant body (Non-patent Document 1). In addition, after 2010, carrots and celery, the same celery family, will cause symptoms such as leaf decolorization and stem and root dwarfing in the European Landlands, Norway, Sweden, France and Spain. Has been reported (Non-patent Document 2).
いずれの病徴についても生理障害や虫害と区別することが難しく、またファイトプラズマによる病害とも似ており、正確な病原体同定が立ち遅れていた。そのため、裁培現場において本病原菌による病害を適切に診断することが望まれている。また、種苗検査の場においては、感染種芋や感染種子の混入を迅速に診断することも望まれている。更には、多様な農作物について、これまで生理障害や虫害と考えられていた症状がLsoによる病害として再同定される可能性もある。 It was difficult to distinguish any symptom from physiological disorders and insect damage, and it was similar to that caused by phytoplasma, and accurate pathogen identification was delayed. Therefore, it is desired to appropriately diagnose the disease caused by this pathogenic bacterium at the cultivation site. Moreover, in the seedling inspection place, it is also desired to quickly diagnose contamination of infected seed pods and infected seeds. In addition, for various crops, symptoms previously considered to be physiological disorders and insect damage may be re-identified as diseases caused by Lso.
そこで従来、Lsoによる感染を診断するために、LsoのDNAが植物体DNAに混入しているかどうかをPCR法による核酸増幅技術を用いた遺伝子診断技術によって判定している。Lsoを検出するためのプライマーとして、いくつかのプライマーが報告されている（非特許文献2〜5；特許文献1）。しかし、これらの既存のプライマーでは、特異性が低く偽陽性が検出されやすいという問題があった。たとえば、類緑の植物病原体であるカンジダタス・リベリバクター・アシアティクス（Candidatus Liberibacter asiaticus；以下、「Las」ともいう。）などと区別して検出することが困難であった。 Therefore, conventionally, in order to diagnose infection caused by Lso, whether or not Lso DNA is mixed in plant body DNA is determined by a genetic diagnosis technique using a nucleic acid amplification technique by PCR. Several primers have been reported as primers for detecting Lso (Non-patent Documents 2 to 5; Patent Document 1). However, these existing primers have a problem of low specificity and easy detection of false positives. For example, it was difficult to detect and distinguish from Candidatus Liberibacter asiaticus (hereinafter also referred to as “Las”), which is a green plant pathogen.
また、既存のプライマーは、PCR反応後にアガロース電気泳動等で増幅断片を検出する一般的なPCR法（コンベンショナルPCR法）に適したものか、リアルタイムPCR法に適したものかのいずれかとなっており、コンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法のいずれにも利用可能なプライマーについては知られていなかった。このため、診断を行う者は、コンベンショナルPCR法またはリアルタイムPCR法のいずれの診断方法を採用するか、あらかじめ判断する必要がある。加えて、いずれかの診断方法を採用してLsoDNA混入の判定を行っても、外部組織や他の診断者が異なるプライマ一および異なる診断方法を採用していた場合、診断結果の再現性が得られないことがあり、量的な比較も不可能である。この結果、検査現場におけるLsoの診断精度の確実性が危ぶまれる。 In addition, existing primers are either suitable for general PCR methods (conventional PCR methods) that detect amplified fragments by agarose electrophoresis after PCR reaction, or suitable for real-time PCR methods. Primers that can be used for both the conventional PCR method and the real-time PCR method were not known. For this reason, a person who makes a diagnosis needs to determine in advance whether to adopt a conventional PCR method or a real-time PCR method. In addition, even if LsoDNA contamination is determined using any of the diagnostic methods, the reproducibility of the diagnostic results can be obtained if the external tissues or other diagnosticians employ different primers and different diagnostic methods. Cannot be done, and quantitative comparisons are also impossible. As a result, the reliability of Lso diagnostic accuracy at the inspection site is jeopardized.
本発明は、上述した従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物病原細菌であるカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Lso）をより特異的に検出することができる核酸、プライマーセットおよび検出方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is a nucleic acid and a primer capable of more specifically detecting Candidatus riviberactor solanakealum (Lso), which are plant pathogenic bacteria. It is to provide a set and detection method.
本発明者らは、上記課題を解決するために、LsoDNAを特異的に検出するためのプライマーの設計を新規に行った。本発明者らは、Lsoおよび類縁のLiberibacter属細菌を含む約60種もの細菌の16S rDNA配列を抽出してアラインメント解析を行い、Lso特有の塩基を見出した。そして、塩基長、GC含量およびTm値を考慮し、Lsoに特異的なプライマーとして利用可能な塩基配列を抽出して本発明を完成させた。 In order to solve the above problems, the present inventors have newly designed a primer for specifically detecting LsoDNA. The present inventors extracted 16S rDNA sequences of about 60 kinds of bacteria including Lso and related Liberibacter bacteria, and performed alignment analysis to find a base unique to Lso. Then, in consideration of the base length, GC content, and Tm value, a base sequence that can be used as a primer specific to Lso was extracted to complete the present invention.
本発明は、配列番号1で表される塩基配列に含まれる連続した16〜30塩基からなる塩基配列またはその相補配列からなり、配列番号1の塩基番号789、790、817、818、819、820、941、942、943、944、983、984、985、986、987、1060、1061、1062、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1210、1211、1248、1249、1250、1251および1252からなる群より選択される少なくとも1つの塩基を含む、核酸を提供する。 The present invention comprises a base sequence consisting of consecutive 16 to 30 bases included in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, and the base numbers 789, 790, 817, 818, 819, 820 of SEQ ID NO : , 941, 942, 943, 944, 983, 984, 985, 986, 987, 1060, 1061, 1062, 1084, 1085, 1086, 1087, 1088, 1089, 1090, 1091, 1092, 1210, 1211, 1248, 1249 , 1250, 1251 and 1252 , comprising at least one base selected from the group consisting of:
また本発明は、配列番号2〜18のいずれかで表される塩基配列またはその相補配列を含む上記核酸を提供する。 The present invention also provides the nucleic acid comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 18 or a complementary sequence thereof.
また本発明は、配列番号1で表される塩基配列に含まれる連続した16〜30塩基からなる塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号1で表される塩基配列に含まれる、フォワードプライマーより下流に位置する連続した16〜30塩基からなる塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットであって、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ配列番号1の塩基番号789、790、817、818、819、820、941、942、943、944、983、984、985、986、987、1060、1061、1062、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1210、1211、1248、1249、1250、1251および1252からなる群より選択される少なくとも1つの塩基を含む、プライマーセットを提供する。 The present invention also includes a forward primer composed of a base sequence consisting of consecutive 16 to 30 bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a downstream from the forward primer contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. A primer set consisting of a reverse primer consisting of a complementary sequence of a base sequence consisting of 16 to 30 bases located in the sequence, wherein the forward primer and the reverse primer are base numbers 789, 790, 817, 818 of SEQ ID NO: 1, respectively. , 819, 820, 941, 942, 943, 944, 983, 984, 985, 986, 987, 1060, 1061, 1062, 1084, 1085, 1086, 1087, 1088, 1089, 1090, 1091, 1092, 1210, 1211 , 1248, 1249, 1250, 1251 and 1252 provides a primer set comprising at least one base selected from the group consisting of:
また本発明は、上記プライマーセットにおいて、配列番号1で表される塩基配列からなるDNAを鋳型としてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてPCRを行った場合に、100bp以上350bp以下の長さのDNAが増幅される、プライマーセットを提供する。 Further, the present invention provides a DNA having a length of 100 bp or more and 350 bp or less when PCR is performed using a forward primer and a reverse primer using a DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a template in the primer set. A primer set to be amplified is provided.
また本発明は、上記プライマーセットにおいて、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、以下のいずれかの組み合わせである、請求項3または4に記載のプライマーセットを提供する：
（１）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号17で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（２）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（３）配列番号14で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（４）配列番号13で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（５）配列番号12で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、または
（６）配列番号11で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ。
The present invention also provides the primer set according to claim 3 or 4, wherein in the primer set, the forward primer and the reverse primer are any combination of the following:
(1) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17,
(2) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18,
(3) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(4) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(5) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, or (6) a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 A combination of a forward primer consisting of and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
また本発明は、上記プライマーセットにおいて、配列番号1で表される塩基配列を含まないDNAを鋳型としてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてPCRを40サイクル行った場合に、増幅断片が検出されない、プライマーセットを提供する。 Further, the present invention provides a primer that does not detect an amplified fragment when PCR is performed for 40 cycles using a forward primer and a reverse primer using a DNA that does not contain the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a template in the primer set described above. Provide set.
また本発明は、上記のいずれかのプライマーセットと、取り扱い説明書とを含む、カンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum）を検出するためのキットを提供する。 The present invention also provides a kit for detecting Candidatus Liberibacter solanacearum, comprising any of the above primer sets and an instruction manual.
また本発明は、試料中にカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum）が存在するか否かを検出する方法であって、試料またはその抽出物を鋳型として、上記のいずれかのプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、PCRにて増幅されたDNAを検出することにより試料中にカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルムが存在するか否かを判定する工程とを含む、方法を提供する。 The present invention also relates to a method for detecting whether or not Candidatus Liberibacter solanacearum is present in a sample, using any one of the above primer sets using the sample or an extract thereof as a template. And a step of determining whether or not Candidatus riviberactor solanakearum is present in the sample by detecting the DNA amplified by PCR.
本発明によれば、植物病原細菌であるカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Lso）をより特異的に検出することができる。また、本発明であれば、Lsoを特異的に検出でき、かつコンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法のいずれの診断方法にも利用可能なプライマーセットを提供することができる。したがって、本発明を利用することにより、共通のプライマーを用いてコンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法の両方の診断方法でLsoDNAを特異的に検出することが可能になる。そのため、診断方法を横断してLsoDNA検出結果の再現性を確認することができ、また量的な比較を行うことが可能であり、検査現場におけるLsoの診断精度を高めることができる。 According to the present invention, it is possible to more specifically detect Candidatus riviberactor solanakearum (Lso), which is a phytopathogenic bacterium. In addition, according to the present invention, it is possible to provide a primer set that can specifically detect Lso and can be used for any diagnostic method of conventional PCR method and real-time PCR method. Therefore, by utilizing the present invention, it becomes possible to specifically detect LsoDNA by a diagnostic method of both the conventional PCR method and the real-time PCR method using a common primer. Therefore, the reproducibility of the LsoDNA detection result can be confirmed across diagnostic methods, and quantitative comparison can be performed, thereby improving the accuracy of Lso diagnosis at the inspection site.
本発明は、核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドをさし、たとえばデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）およびこれらの類似体が含まれる。核酸の類似体には、たとえばペプチド核酸が含まれる。本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖の核酸を包含する。本発明の核酸は、たとえばオリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブ等であることができる。 The present invention provides nucleic acids. As used herein, “nucleic acid” refers to polynucleotides and oligonucleotides, and includes, for example, deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), and analogs thereof. Nucleic acid analogs include, for example, peptide nucleic acids. The nucleic acid of the present invention includes single-stranded and double-stranded nucleic acids. The nucleic acids of the present invention can be, for example, oligonucleotides, primers and probes.
本発明の核酸は、プライマー（核酸プライマー）であってもよい。本明細書において「プライマー」とは、遊離した3'OHを有する一本鎖のポリヌクレオチドであり、標的配列とハイブリダイズすることによって、DNAポリメラーゼによる標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進させる。本発明の核酸は、たとえば、植物病原細菌として知られるカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Lso）を検出するための核酸プライマーとして用いることができる。本発明の核酸は、PCR法のためのプライマーとして用いることができる。本発明の核酸は、たとえば、PCR反応後にアガロース電気泳動等で増幅断片を検出する一般的なPCR法（コンベンショナルPCR法）およびリアルタイムPCR法などに利用可能である。 The nucleic acid of the present invention may be a primer (nucleic acid primer). As used herein, a “primer” is a single-stranded polynucleotide having a free 3′OH, and promotes polymerization of a polynucleotide complementary to the target by a DNA polymerase by hybridizing with a target sequence. . The nucleic acid of the present invention can be used, for example, as a nucleic acid primer for detecting Candidatus riviberactor solanakealum (Lso) known as a phytopathogenic bacterium. The nucleic acid of the present invention can be used as a primer for PCR. The nucleic acid of the present invention can be used in, for example, a general PCR method (conventional PCR method) and a real-time PCR method for detecting an amplified fragment by agarose electrophoresis after a PCR reaction.
本発明の核酸は、LsoのCLso-ZC1 strainの16SrDNA配列（配列番号1）に含まれる連続した16〜30塩基からなる塩基配列またはその相補配列からなる。本発明の核酸は、以下の群から選択される少なくとも1つの塩基を含む：配列番号1の塩基番号66、167、168、169、170、171、198、199、200、201、202、231、232、250、251、252、432、433、445、534、535、543、544、545、546、589、590、591、592、593、603、604、605、606、645、789、790、817、818、819、820、941、942、943、944、983、984、985、986、987、1060、1061、1062、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1210、1211、1248、1249、1250、1251および1252からなる群。これらの塩基は、Lsoおよび類縁のLiberibacter属細菌を含む約60種の細菌の16SrDNA配列をアラインメント解析することにより抽出した、Lso特有の塩基である。これらの塩基群の少なくとも1つを含むことによって、本発明の核酸は、Lsoを特異的に検出することができる。 The nucleic acid of the present invention consists of a base sequence consisting of continuous 16 to 30 bases contained in the 16S rDNA sequence (SEQ ID NO: 1) of CLso-ZC1 strain of Lso or a complementary sequence thereof. The nucleic acid of the present invention comprises at least one base selected from the following group: base numbers 66, 167, 168, 169, 170, 171, 198, 199, 200, 201, 202, 231 of SEQ ID NO: 1 , 232, 250, 251, 252, 432, 433, 445, 534, 535, 543, 544, 545, 546, 589, 590, 591, 592, 593, 603, 604, 605, 606, 645, 789, 790, 817, 818, 819, 820, 941, 942, 943, 944, 983, 984, 985, 986, 987, 1060, 1061, 1062, 1084, 1085, 1086, 1087, 1088, 1089, 1090, 1091, 1092, A group consisting of 1210, 1211, 1248, 1249, 1250, 1251 and 1252 . These bases are Lso-specific bases extracted by alignment analysis of 16S rDNA sequences of about 60 bacteria including Lso and related Liberibacter bacteria. By including at least one of these base groups, the nucleic acid of the present invention can specifically detect Lso.
本発明の核酸は、たとえば、Lsoの16SrDNA配列（配列番号1）の塩基番号61〜82（配列番号2）、156〜175（配列番号3）、182〜203（配列番号4）、213〜233（配列番号5）、231〜252（配列番号6）、427〜448（配列番号7）、522〜546（配列番号8）、589〜611（配列番号9）、643〜666（配列番号10）、783〜802（配列番号11）、804〜824（配列番号12）、928〜950（配列番号13）、969〜992（配列番号14）、1056〜1077（配列番号15）、1084〜1104（配列番号16）、1410〜1228（配列番号17）もしくは1248〜1270（配列番号18）のいずれかの塩基配列またはその相補配列を含んでもよい。たとえば、本発明の核酸は、配列番号2〜18のいずれかで表される塩基配列またはその相補配列からなってもよい。配列番号2〜18の塩基配列およびLso16S rDNAにおける位置は、後述する表1に示される。 The nucleic acid of the present invention includes, for example, base numbers 61 to 82 (SEQ ID NO: 2), 156 to 175 (SEQ ID NO: 3), 182 to 203 (SEQ ID NO: 4), and 213 to 233 of the 16S rDNA sequence of Lso (SEQ ID NO: 1). (SEQ ID NO: 5), 231 to 252 (SEQ ID NO: 6), 427 to 448 (SEQ ID NO: 7), 522 to 546 (SEQ ID NO: 8), 589 to 611 (SEQ ID NO: 9), 643 to 666 (SEQ ID NO: 10) , 783 to 802 (SEQ ID NO: 11), 804 to 824 (SEQ ID NO: 12), 928 to 950 (SEQ ID NO: 13), 969 to 992 (SEQ ID NO: 14), 1056 to 1077 (SEQ ID NO: 15), 1084 to 1104 ( SEQ ID NO: 16), 1410-1228 (which may include any one of the nucleotide sequence or a complementary sequence of SEQ ID NO: 17) or 1248-1270 (SEQ ID NO: 18). For example, the nucleic acid of the present invention may consist of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 18 or a complementary sequence thereof. The nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 to 18 and positions in Lso16S rDNA are shown in Table 1 described later.
本発明の核酸は、1〜数塩基の付加配列をさらに含んでもよい。たとえば、本発明の核酸は、5’末端に制限酵素認識配列等の付加配列をさらに含んでもよい。 The nucleic acid of the present invention may further contain an additional sequence of 1 to several bases. For example, the nucleic acid of the present invention may further contain an additional sequence such as a restriction enzyme recognition sequence at the 5 'end.
本発明はまた、プライマーセットを提供する。本発明のプライマーセットは、Lsoを検出するためのプライマーセットとして用いることができる。 The present invention also provides a primer set. The primer set of the present invention can be used as a primer set for detecting Lso.
本発明のプライマーセットは、Lsoの16SrDNA配列（配列番号1）に含まれる連続した16〜30塩基からなる塩基配列からなるフォワードプライマーと、Lsoの16SrDNA配列（配列番号1）に含まれる連続した16〜30塩基からなる塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとからなる。リバースプライマーは、Lsoの16SrDNA配列において、フォワードプライマーより下流に位置する。 The primer set of the present invention comprises a forward primer composed of a base sequence consisting of 16 to 30 bases included in the 16S rDNA sequence of Lso (SEQ ID NO: 1) and a continuous 16 sequence included in the 16S rDNA sequence of Lso (SEQ ID NO: 1). It consists of a reverse primer consisting of a complementary sequence of a base sequence consisting of ˜30 bases. The reverse primer is located downstream of the forward primer in the 16S rDNA sequence of Lso.
フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ以下の群から選択される少なくとも1つの塩基を含む：配列番号1の塩基番号66、167、168、169、170、171、198、199、200、201、202、231、232、250、251、252、432、433、445、534、535、543、544、545、546、589、590、591、592、593、603、604、605、606、645、789、790、817、818、819、820、941、942、943、944、983、984、985、986、987、1060、1061、1062、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1210、1211、1248、1249、1250、1251および1252からなる群。 Each of the forward primer and the reverse primer includes at least one base selected from the following group: base numbers 66, 167, 168, 169, 170, 171, 198, 199, 200, 201, 202, SEQ ID NO: 1 . 231,232,250,251,252,432,433,445,534,535,543,544,545,546,589,590,591,592,593,603,604,605,606,645,789, 790, 817, 818, 819, 820, 941, 942, 943, 944, 983, 984, 985, 986, 987, 1060, 1061, 1062, 1084, 1085, 1086, 1087, 1088, 1089, 1090, 1091, A group consisting of 1092, 1210, 1211, 1248, 1249, 1250, 1251 and 1252 .
本発明のプライマーセットを用いて、Lsoの16SrDNAを含むDNAを鋳型としてPCRを行った場合に、DNAを増幅させることができる。本発明のプライマーセットを用いて増幅されるDNAは、PCR法により増幅され得る長さであれば特に限定されないが、100bp以上であれば容易に検出することができる。また、本発明のプライマーセットを用いて増幅されるDNAは、特に限定されないが、350bp以下であれば、コンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法のいずれにも好適に利用することができる。 When PCR is performed using the primer set of the present invention and a DNA containing 16S rDNA of Lso as a template, DNA can be amplified. The DNA amplified using the primer set of the present invention is not particularly limited as long as it can be amplified by the PCR method, but can be easily detected if it is 100 bp or more. The DNA amplified using the primer set of the present invention is not particularly limited, but can be suitably used for both the conventional PCR method and the real-time PCR method as long as it is 350 bp or less.
フォワードプライマーは、たとえば配列番号2〜18のいずれかで表される塩基配列を含んでもよく、リバースプライマーは、たとえば配列番号2〜18のいずれかで表される塩基配列の相補配列を含んでもよい。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Lsoの16SrDNAを含むDNAを鋳型としてPCRを行った場合に、DNAを増幅させることができる組み合わせであれば、いずれの組み合わせであってもよい。 The forward primer may include, for example, a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 18, and the reverse primer may include, for example, a complementary sequence of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 18 . The forward primer and the reverse primer may be any combination as long as the DNA can be amplified when PCR is performed using DNA containing Lso 16SrDNA as a template.
フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、たとえば以下のいずれかの組み合わせであってもよい：
（１）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号17で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（２）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（３）配列番号14で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（４）配列番号13で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（５）配列番号12で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、または
（６）配列番号11で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ。
The forward primer and the reverse primer may be, for example, any combination of the following:
(1) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17,
(2) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18,
(3) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(4) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(5) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, or (6) a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 A combination of a forward primer consisting of and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
本発明のプライマーセットは、Lsoの16S rDNA配列を含まないDNAを鋳型としてPCRを40サイクル行った場合に、増幅断片が検出されないものであってもよい。言い換えれば、本発明のプライマーセットは、Lsoの16S rDNA配列を含まないDNAを鋳型としたときのCt値が40より高いかまたは検出されないものであってもよい。Ct値とは、PCR増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表す値である。このようなプライマーセットであれば、非特異的増幅が起こりにくいため、偽陽性を防ぐことができる。したがって、Lsoの存在の有無をより正確に診断することができる。 The primer set of the present invention may be one in which an amplified fragment is not detected when PCR is carried out for 40 cycles using a DNA containing no Lso 16S rDNA sequence as a template. In other words, the primer set of the present invention may have a Ct value higher than 40 or not detected when DNA containing no Lso 16S rDNA sequence is used as a template. The Ct value is a value representing the number of cycles when the PCR amplification product reaches a certain amount. With such a primer set, non-specific amplification is unlikely to occur, and thus false positives can be prevented. Therefore, the presence or absence of Lso can be diagnosed more accurately.
本発明のプライマーセットは、コンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法などのPCR法のプライマーセットとして利用することができる。本発明のプライマーセットを用いて、試料を鋳型としてPCR法を行い、増幅断片を検出することによって、試料中にLsoが存在するか否かを容易かつ正確に診断することができる。 The primer set of the present invention can be used as a primer set for PCR methods such as conventional PCR methods and real-time PCR methods. By using the primer set of the present invention and performing a PCR method using a sample as a template and detecting an amplified fragment, it can be easily and accurately diagnosed whether Lso is present in the sample.
本発明はまた、Lsoを検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明のプライマーセットを含む。また、本発明のキットは、取り扱い説明書、PCR酵素、バッファー、dNTP混合物、蛍光色素およびLso 16S rDNAを含むDNA溶液などをさらに含んでもよい。 The present invention also provides a kit for detecting Lso. The kit of the present invention includes the primer set of the present invention. In addition, the kit of the present invention may further contain an instruction manual, a PCR enzyme, a buffer, a dNTP mixture, a DNA solution containing a fluorescent dye and Lso 16S rDNA, and the like.
本発明はまた、試料中にLsoが存在するか否かを検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、試料またはその抽出物を鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、PCRにて増幅されたDNAを検出することにより試料中にLsoが存在するか否かを判定する工程とを含む。 The present invention also provides a method for detecting whether Lso is present in a sample. The detection method of the present invention comprises a step of performing PCR using the primer set of the present invention using a sample or an extract thereof as a template, and whether Lso is present in the sample by detecting DNA amplified by PCR. Determining whether or not.
試料またはその抽出物としては、Lsoの感染または混入が疑われる植物体の一部またはその抽出物、たとえばDNA抽出物などを用いることができる。PCRを行う方法としては、公知の方法、たとえばコンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法などを用いることができる。リアルタイムPCR法を用いる場合、インターカレーター法およびハイブリダイゼーション法などを用いることができる。PCRの反応条件には、一般的な反応条件を用いることができ、たとえば96℃30秒、55℃30秒および72℃30秒の3ステップを35〜45サイクル行ってもよい。 As a sample or an extract thereof, a part of a plant suspected of being infected or contaminated with Lso or an extract thereof, such as a DNA extract, can be used. As a method for performing PCR, known methods such as a conventional PCR method and a real-time PCR method can be used. When the real-time PCR method is used, an intercalator method, a hybridization method, or the like can be used. As the reaction conditions for PCR, general reaction conditions can be used. For example, three steps of 96 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds may be performed for 35 to 45 cycles.
判定する工程では、アガロースゲル電気泳動法、SYBRグリーン法および蛍光プローブ法などの任意の方法により、所定の長さのDNA断片がPCRにて増幅されたか否かを検出する。その結果、増幅されたDNA断片が検出された場合には、試料中にLsoが存在すると判定することができる。 In the determining step, it is detected whether or not a DNA fragment having a predetermined length is amplified by PCR by an arbitrary method such as an agarose gel electrophoresis method, a SYBR green method, or a fluorescent probe method. As a result, when an amplified DNA fragment is detected, it can be determined that Lso is present in the sample.
本発明のプライマーセットは、従来のプライマーセットよりもLsoDNAの特異性や定量性に優れた検出を可能にする。また、本発明は、コンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法の両方に利用可能なプライマーセットを提供することができるため、診断者や検出方法が異なっている場合でも検出結果を客観的にとらえることが可能である。したがって、本発明は、Lso診断の現場において広く普及させることができる。 The primer set of the present invention enables detection with higher specificity and quantitativeness of LsoDNA than conventional primer sets. In addition, since the present invention can provide a primer set that can be used for both conventional PCR and real-time PCR, it is possible to objectively capture detection results even when the diagnostician or detection method is different. It is. Therefore, the present invention can be widely spread in the field of Lso diagnosis.
本発明は、国内外の植物検疫所、検疫行政、病害虫防除所、種苗会社および苗木業者などの現場での利用が想定される。本発明の普及に伴い、Lso診断法がさらに確立されることで、Lsoの感染あるいは混入が疑われる種子や苗等の植物体を適切に検査することができ、国内への侵入を未然に防ぐことができる。 The present invention is supposed to be used in the field of domestic and foreign plant quarantine stations, quarantine administrations, pest control stations, seedling companies and seedling companies. With the spread of the present invention, Lso diagnostic methods are further established, so that plants such as seeds and seedlings suspected of being infected or contaminated with Lso can be properly examined, and invasion into the country can be prevented. be able to.
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, examples will be shown and the embodiment of the present invention will be described in more detail. However, the present invention is not limited to the following examples.
〔１．Lso特有配列を抽出〕
米国生物工学情報センター（NCBI；Natinal Center for Biotechnology Information）が提供する塩基配列データベースであるGenBank等の公共のDNA配列データベースより、Lsoおよび類縁のLiberibacter属細菌を含む種々の細菌の16S rDNA配列を抽出し、アラインメント解析を行った。解析に用いた細菌群は、以下である；プロテオバクテリア門（Proteobacteria）から、Liberibacter solanacearum（Lso）；Liberibacter asiaticus（Las）；Liberibacter africanus；Liberibacter americanus；Rhizobium galegae；Agrobacterium tumefaciens；Shinorizobium sp；Bartonella bacilliformis；Acetobacter aceti；Bradyrhizobium japonicum；Ricketsia typhi；Wolbachia wMel；Burkholderia cepacia；Nitrosomonas europaea；Ralstonia solanacearum；Xylella fastidiosa；Xanthomonas axonopodis pv. citri；Xanthomonas citri subsp. malvacearum；Xanthomonas oryzae pv. oryzae；Legionella tucsonensis；Pseudomonas marginalis；Pseudomonas fluorescens；Pseudomonas syringae；Pseudomonas viridiflava；Buchnera aphidicola；Escherichia coli；Salmonella enterica subsp. enterica serover typhimurium；Klebsiella pneumoniae；Dickeya dadantii；Enterobacter nimipressuralis；Geobacter metallireducens；Desulfobacterium autotrophicum；Helicobacter pylori；およびCampylobacter jejuni；フィルミクテス門（Firmicutes）から、Streptococcus mutans；Streptococcus thermophilus；およびBacillus subtilis；テネリクテス門（Tenericutes）から、Ureaplasma parvum；Mycoplasma genitalium；Mycoplasma suis；およびPhytoplasma sp；放線菌門（Actinobacteria）から、Streptomyces rutgersensis；Streptomyces thermodiastaticus；Nocardia flavorosea；Mycobacterium smegmatis；Microlunatus phosphovorus；Friedmanniella antarctica；Luteococcus japonica；Nocardioides plantarum；Aeromicrobium fastidiosum；およびCorynebacterium glutamicum；その他より、Chlamydia trachomatis；Leptospira biflexa；Borrelia burgdorferi；Spirochaeta thermophila；Fusobacterium nucleatum；Bacteroides fragilis；およびThermococcus stetteri。
[1. (Lso specific sequence is extracted)
Extracts 16S rDNA sequences of various bacteria including Lso and related Liberibacter bacteria from public DNA sequence databases such as GenBank, which is a nucleotide sequence database provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI) The alignment analysis was performed. Bacterial groups used for analysis are as follows; from Proteobacteria to Liberibacter solanacearum (Lso); Liberibacter asiaticus (Las); Liberibacter africanus; Liberibacter americanus; Rhizobium galegae; Agrobacterium tumefacellas sp Bradyrhizobium japonicum; Ricketsia typhi; Wolbachia wMel; Burkholderia cepacia; Nitrosomonas europaea; Ralstonia solanacearum; Xylella fastidiosa; Xanthomonas axonopodis pv. Citri; Xanthomonas ciear Pseudomonas syringae; Pseudomonas viridiflava; Buchnera aphidicola; Escherichia coli; Salmonella enterica subsp. Enterica serover typhimurium; Klebsiella pneumoniae; Dickeya dadantii; pylobacter jejuni; from Firmicutes; Streptococcus mutans; Streptococcus thermophilus; and Bacillus subtilis; Tenericutes; Ureaplasma parvum; Mycoplasma genitalium; Mycoplasma suis; Streptomyces thermodiastaticus; Nocardia flavorosea; Mycobacterium smegmatis; Microlunatus phosphovorus; Friedmanniella antarctica; Luteococcus japonica; Nocardioides plantarum; Aeromicrobium fastidiosum; and Corynebacterium glutamicum; And Thermococcus stetteri.
アラインメント解析の結果、16S rDNA配列中でLso特有の塩基を見出した。そして、塩基長、GC含量およびTm値を考慮し、Lsoに特異的なプライマーとして利用可能な塩基配列を抽出した。抽出したプライマー配列を表1に示す。表1に示すプライマー配列において、Lso特有の塩基には下線を付した。 As a result of alignment analysis, a base unique to Lso was found in the 16S rDNA sequence. Then, in consideration of the base length, GC content, and Tm value, a base sequence that can be used as a primer specific to Lso was extracted. The extracted primer sequences are shown in Table 1. In the primer sequences shown in Table 1, bases unique to Lso are underlined.
〔２．コンベンショナルPCR〕
表1に示したプライマー配列からなるフォワードプライマー（F）と、表1に示したプライマー配列の相補配列からなるリバースプライマー（R）とを組み合わせたプライマーセットを用いて、コンベンショナルPCRを行った。表2は、使用したプライマーセットａ〜ｇを示す。
[2. (Conventional PCR)
Conventional PCR was performed using a primer set in which a forward primer (F) composed of the primer sequences shown in Table 1 and a reverse primer (R) composed of a complementary sequence of the primer sequences shown in Table 1 were combined. Table 2 shows the primer sets ag used.
PCR酵素には、タカラバイオ株式会社のTaKaRa ExTaqHSを用いた。鋳型DNAには、LsoDNAの約108コピー相当を含むジャガイモDNA溶液を用いた。PCR反応条件は、以下である：96℃10分；96℃30秒、55℃30秒および72℃30秒の3ステップを35サイクル；72℃7分。PCR反応後に、定法によってアガロースゲル電気泳動を行い、DNA増幅断片を確認した。 As a PCR enzyme, Takara Bio Inc. TaKaRa ExTaqHS was used. As a template DNA, a potato DNA solution containing about 10 8 copies of LsoDNA was used. PCR reaction conditions are as follows: 96 ° C for 10 minutes; 35 cycles of 3 steps of 96 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds; 72 ° C for 7 minutes. After the PCR reaction, agarose gel electrophoresis was performed by a conventional method to confirm the amplified DNA fragment.
図1は、本実施例のプライマーセットを用いたコンベンショナルPCR法によって増幅されたDNA断片を電気泳動した結果を示す図である。図1に示すように、いずれのプライマーセットを用いた場合でも、コンベンショナルPCR法により増幅されたLsoDNA断片が検出された。 FIG. 1 is a diagram showing a result of electrophoresis of a DNA fragment amplified by a conventional PCR method using the primer set of this example. As shown in FIG. 1, the LsoDNA fragment amplified by the conventional PCR method was detected when any primer set was used.
〔３．リアルタイムPCR〕
次に、本実施例のプライマーセットを用いて、インターカレーター法によるリアルタイムPCR法を行った。プライマーセットには、上記表2に示すプライマーセットｂ〜ｇを用いた。また、比較例として、従来のプライマーセットLsoF/HLBr（非特許文献4）およびCaLsppF/CaLsppR（非特許文献2）を用いた。PCR酵素には、タカラバイオ株式会社のSYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）を用いた。鋳型DNAには、ニンジン種子500粒から定法によって抽出したDNA溶液に、LsoDNAを添加したものを用いた。LsoDNAには、プライマーセットLsoOI1/LsoOI2-Rを用いたPCRによって増幅したDNA断片を用い、このDNA断片の濃度を測定してコピー数を計算し、希釈系列を調製したものを添加した。サーマルサイクラ―には、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）のStepOnePlusを用いた。PCR反応条件は、以下である：96℃10分；96℃30秒、55℃30秒および72℃30秒の3ステップを45サイクル；72℃7分。PCR反応後に、鋳型中のLsoDNAコピー数と、PCR増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を表すCt値とをプロットしてグラフ化した。
[3. Real-time PCR
Next, a real-time PCR method using an intercalator method was performed using the primer set of this example. As the primer set, primer sets b to g shown in Table 2 above were used. Further, as a comparative example, a conventional primer set LsoF / HLBr (Non-Patent Document 4) and CaLsppF / CaLsppR (Non-Patent Document 2) were used. As the PCR enzyme, SYBR (registered trademark) Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) manufactured by Takara Bio Inc. was used. As the template DNA, a DNA solution extracted from 500 carrot seeds by a conventional method and added with LsoDNA was used. As the LsoDNA, a DNA fragment amplified by PCR using the primer set LsoOI1 / LsoOI2-R was used, the concentration of this DNA fragment was measured, the copy number was calculated, and a dilution series prepared was added. For the thermal cycler, StepOnePlus of Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. (Life Technologies Japan Co., Ltd.) was used. The PCR reaction conditions are as follows: 96 ° C. for 10 minutes; 96 cycles of 30 ° C., 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds for 45 cycles; 72 ° C. for 7 minutes. After the PCR reaction, the number of LsoDNA copies in the template and the Ct value representing the number of cycles when the PCR amplification product reached a certain amount were plotted and graphed.
図2および図3は、従来のプライマーセットを用いたリアルタイムPCR法によるDNA増幅結果を示すグラフである。図4〜9は、本実施例のプライマーセットを用いたリアルタイムPCR法によるDNA増幅結果を示すグラフである。これらのグラフの縦軸はCt値を表し、横軸は鋳型中のLsoDNAコピー数を表す。また、グラフには、LsoDNAを含まない試料を鋳型としたときのCt値をNCとして示した。 2 and 3 are graphs showing the results of DNA amplification by the real-time PCR method using a conventional primer set. 4 to 9 are graphs showing the results of DNA amplification by the real-time PCR method using the primer set of this example. The vertical axis of these graphs represents the Ct value, and the horizontal axis represents the number of LsoDNA copies in the template. In the graph, the Ct value when a sample not containing LsoDNA was used as a template was shown as NC.
図4〜9に示すように、本実施例のプライマーセットｂ〜ｇのいずれを用いた場合でも、リアルタイムPCRによるLsoDNAの増幅が検出された。これらのプライマーセットを用いたLsoDNAの増幅は、鋳型中のLsoDNAコピー数と高い相関性を示しており、定量的な検出が可能であることが示された。特に、プライマーセットｂ（図4）、ｄ（図6）およびｅ（図7）を用いた場合には、LsoDNAを含まない試料を鋳型としたときのCt値（NC）が40より高いかまたは検出されないため、非特異的増幅が起こりにくく、より正確にLsoを検出可能であることが示された。 As shown in FIGS. 4 to 9, LsoDNA amplification by real-time PCR was detected when any of the primer sets b to g of this example was used. Amplification of LsoDNA using these primer sets showed a high correlation with the number of LsoDNA copies in the template, indicating that quantitative detection was possible. In particular, when primer sets b (FIG. 4), d (FIG. 6) and e (FIG. 7) are used, the Ct value (NC) when a sample not containing LsoDNA is used as a template is higher than 40 or Since it was not detected, nonspecific amplification was unlikely to occur, indicating that Lso can be detected more accurately.
一方、従来のプライマーセットを用いた場合には、図2および3に示すように、リアルタイムPCRによるLsoDNAの増幅が検出されたものの、LsoDNAを含まない試料を鋳型としたときのCt値（NC）が低く、非特異的増幅を避けられない。 On the other hand, when the conventional primer set was used, as shown in FIGS. 2 and 3, although the amplification of LsoDNA by real-time PCR was detected, the Ct value (NC) when a sample not containing LsoDNA was used as a template And non-specific amplification is inevitable.
以上の結果から、本実施例のプライマーセットｂ〜ｇは、コンベンショナルPCR法およびリアルタイムPCR法の両方に利用可能であることが示された。したがって、これらのプライマーセットを用いた場合、異なる実験系を利用して検出結果を客観的にとらえることが可能である。 From the above results, it was shown that the primer sets b to g of this example can be used for both the conventional PCR method and the real-time PCR method. Therefore, when these primer sets are used, it is possible to objectively capture the detection results using different experimental systems.
〔４．Lso特異性〕
本実施例のプライマーセットを用いて、Lsoおよび類縁の細菌のDNAを鋳型として、インターカレーター法によるリアルタイムPCR法を行った。プライマーセットには、上記表2に示すプライマーセットｄ〜ｇを用いた。また、比較例として、従来のプライマーセットLsoF/HLBr（非特許文献4）およびCaLsppF/CaLsppR（非特許文献2）を用いた。鋳型としては、Liberibacter solanacearum（Lso）、Liberibacter asiaticus（Las）、Liberibacter americanus（Lam）およびLiberibacter europaeus（Leu）のDNAを用いた。PCRの条件等は上述した方法を用いた。
[4. Lso specificity)
Using the primer set of this example, real-time PCR was performed by the intercalator method using Lso and related bacterial DNA as a template. As the primer set, primer sets d to g shown in Table 2 above were used. Further, as a comparative example, a conventional primer set LsoF / HLBr (Non-Patent Document 4) and CaLsppF / CaLsppR (Non-Patent Document 2) were used. As templates, DNA of Liberibacter solanacearum (Lso), Liberibacter asiaticus (Las), Liberibacter americanus (Lam) and Liberibacter europaeus (Leu) was used. The above-described method was used for PCR conditions.
その結果を表3に示す。強い増幅が見られた場合を「A」で、少ないが増幅が見られた場合を「B」で、全く増幅が確認されなかった場合を「−」で示した。表3に示すように、Lso以外の類縁の種のDNAを鋳型とした場合に、従来のプライマーセットでは少し増幅が見られたが、本実施例のプライマーセットでは全く増幅が確認されなかった。したがって、本実施例のプライマーセットは、従来のプライマーセットと比較してLso特異性に優れていることが示された。 The results are shown in Table 3. The case where strong amplification was observed was indicated by “A”, the case where amplification was observed although it was small, was indicated by “B”, and the case where amplification was not confirmed at all was indicated by “−”. As shown in Table 3, when DNA of a related species other than Lso was used as a template, a little amplification was observed with the conventional primer set, but no amplification was confirmed with the primer set of this example. Therefore, it was shown that the primer set of this example is superior in Lso specificity compared to the conventional primer set.
本発明は、植物病原細菌であるカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルムの定量性および特異性に優れた検出を可能にするため、国内外の植物検疫所、検疫行政、病害虫防除所、種苗会社および苗木業者などの現場で利用することができる。 The present invention enables the detection of phytopathogenic bacteria, Candidatus, Riberibacter and Soranakealum, with excellent quantification and specificity, so that domestic and foreign plant quarantine stations, quarantine administrations, pest control stations, seedling companies, seedling companies, etc. Can be used in the field.
Claims (5)
配列番号1で表される塩基配列に含まれる、前記フォワードプライマーより下流に位置する連続した16〜30塩基からなる塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットであって、
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、それぞれ配列番号1の塩基番号789、790、817、818、819、820、941、942、943、944、983、984、985、986、987、1060、1061、1062、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1210、1211、1248、1249、1250、1251および1252からなる群より選択される少なくとも1つの塩基を含み、
配列番号1で表される塩基配列からなるDNAを鋳型として前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーを用いてPCRを行った場合に、136bp以上322bp以下の長さのDNAが増幅される、プライマーセット。 A forward primer consisting of a base sequence consisting of consecutive 16 to 30 bases contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
A primer set consisting of a reverse primer consisting of a complementary sequence of a base sequence consisting of 16 to 30 bases located downstream from the forward primer, contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
The forward primer and the reverse primer are base numbers 789, 790, 817, 818, 819, 820, 941, 942, 943, 944, 983, 984, 985, 986, 987, 1060, 1061, SEQ ID NO: 1, respectively . see contains at least one base selected from the group consisting of 1062,1084,1085,1086,1087,1088,1089,1090,1091,1092,1210,1211,1248,1249,1250,1251 and 1252,
A primer set in which a DNA having a length of 136 bp or more and 322 bp or less is amplified when PCR is carried out using the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a template and the forward primer and the reverse primer .
（１）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号17で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（２）配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号18で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（３）配列番号14で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（４）配列番号13で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、
（５）配列番号12で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ、または
（６）配列番号11で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号16で表される塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーとの組み合わせ。 The primer set according to claim 1 , wherein the forward primer and the reverse primer are any combination of the following:
(1) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17,
(2) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18,
(3) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(4) A combination of a forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16,
(5) A combination of a forward primer composed of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a reverse primer composed of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, or (6) a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 A combination of a forward primer consisting of and a reverse primer consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16.
試料またはその抽出物を鋳型として、請求項1〜3のいずれかに記載のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、
前記PCRにて増幅されたDNAを検出することにより試料中にカンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルムが存在するか否かを判定する工程と
を含む、方法。 A method for detecting whether or not Candidatus Liberibacter solanacearum is present in a sample,
A step of performing PCR using the primer set according to any one of claims 1 to 3 , using a sample or an extract thereof as a template,
Determining whether or not Candidatus riviberactor solanakearum is present in the sample by detecting the DNA amplified by the PCR.
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