JP6565010B2 - Early diagnosis method for Parkinson's disease - Google Patents
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Description
本発明は、パーキンソン病を早期診断するため、血液を用いて、クロマトグラフ装置を用いることにより、パーキンソン病の早期診断のための方法に関する。 The present invention relates to a method for early diagnosis of Parkinson's disease by using blood and using a chromatographic apparatus for early diagnosis of Parkinson's disease.
現状のパーキンソン病の診断は、脳ＭＲＩでもＭＩＢＧ心筋シンチでも不可能で、特異的診断マーカは未だ開発されていない。左右差のあるパーキンソン症状といった臨床徴候と、抗パーキンソン病薬に対する反応性による診断によるのみである。
上記に定義するパーキンソン病とは、黒質緻密層ドパミン神経細胞の変性を主病変とし、緩徐進行性に運動４徴候（安静時振戦、固縮、運動緩慢および無動、姿勢反射障害）を発現する特発性、進行性の疾患であり、通常孤発性で、家族発症例は約5％程度である。日本における有病率は人口１０万人に対して１１０人程度、欧米白人の有病率はわが国の約１．５〜２．５倍と高いと言われている。
また、発症年齢は５０歳代後半から６０歳代にかけての年齢が最も多く、２０歳代から８０歳代まで幅広く見られ、早期診断の実現が期待されている。
The current diagnosis of Parkinson's disease is impossible with brain MRI or MIBG myocardial scintigraphy, and no specific diagnostic marker has been developed yet. It is only based on clinical signs such as Parkinson's symptoms with left-right differences and diagnosis by reactivity to anti-Parkinson's drugs.
Parkinson's disease as defined above is mainly caused by degeneration of substantia nigra dopamine neurons, and slowly progressing 4 signs of movement (rest tremor, stiffness, slowness and agitation, postural reflex disorder) It is an idiopathic and progressive disease that develops and is usually sporadic, with about 5% of family-onset cases. The prevalence rate in Japan is about 110 per 100,000 population, and the prevalence rate of whites in Europe and America is said to be about 1.5 to 2.5 times higher than in Japan.
Moreover, the onset age is the most frequent from the late 50s to the 60s and is widely seen from the 20s to the 80s, and the realization of early diagnosis is expected.
従来、皮膚ガスの微量成分を定量するためには、皮膚ガスを採取して、濃縮して次いでガスクロマトグラフにより測定することが実施されている。これまでに皮膚ガスについては、採集については、指からの採取（特許文献１）、腕からの採取（特許文献２）、が実施されており、これらのサンプリングを用いて得た皮膚ガス成分の測定は、皮膚ガス濃度が薄いために、試料皮膚ガスを低温装置に導入し濃縮したのち、ガスクロマトグラフにより皮膚ガス成分を測定している。（非特許文献１）。この方法により、皮膚ガス中のアセトンが糖尿病疾患においてコントロールの２倍の値をとることが分かり、非侵襲である皮膚ガス採集から疾病を見出すことが示された。（非特許文献１）。皮膚ガスを用いてパーキンソン病の疾病マーカが本出願者らにより提案された（特許文献４）。
しかしながらこれまで血液からのパーキンソン病に関する測定は実施されていない。
Conventionally, in order to quantify trace components of skin gas, it has been practiced to collect skin gas, concentrate it, and then measure it with a gas chromatograph. So far, skin gas has been collected from the finger (Patent Document 1) and from the arm (Patent Document 2), and the skin gas components obtained using these samplings have been collected. Since the skin gas concentration is low, the sample skin gas is introduced into a low-temperature apparatus and concentrated, and then the skin gas component is measured by a gas chromatograph. (Non-Patent Document 1). By this method, it was found that acetone in skin gas takes twice the value of control in diabetic disease, and it was shown to find disease from non-invasive skin gas collection. (Non-Patent Document 1). Applicants proposed a disease marker for Parkinson's disease using skin gas (Patent Document 4).
However, no measurement of Parkinson's disease from blood has been conducted so far.
これまでに汗の採集法については、本出願による指からの採集方法〈非特許文献３〉が提案され、汗中のナトリウム/カリウム比が多汗症の治療の指標として有効であることが示された。（非特許文献２）。また汗中の塩素イオン濃度が慢性膵炎の指標として用いられることが示された。（非特許文献３）。汗中のアミノ酸比を用いたパーキンソン病の疾病マーカが本出願者らにより提案された。(特許文献４)。しかしながらこれまで血液からのパーキンソン病に関する測定は実施されていない。 So far, a method for collecting sweat from the finger < Non-Patent Document 3 > according to the present application has been proposed, and it has been shown that the sodium / potassium ratio in sweat is effective as an index for the treatment of hyperhidrosis. It was done. (Non-patent document 2). It was also shown that the chloride concentration in sweat was used as an indicator of chronic pancreatitis. (Non-Patent Document 3). Applicants have proposed a disease marker for Parkinson's disease using the amino acid ratio in sweat. (Patent Document 4). However, no measurement of Parkinson's disease from blood has been conducted so far.
パーキンソン病の診断として、特表２００４−５１７６３４号公報（特許文献３）が提案されているが、この提案は神経変性疾患である脊髄小脳性運動失調１（ＳＣＡ−１）のショウジョウバエモデルに関する。特に、ＳＣＡ−１治療のための、正常ヒトアタキシン−１又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体ヒトアタキシン−１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエに関するものであり、さらに、ＳＣＡ−１を発症することへの素因の診断に関するものである。さらに、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするために遺伝子組換えショウジョウバエを使用する方法に関し、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療及び診断用途のため、ならびに治療薬をスクリーニングするための、アタキシン−１の過剰発現によって生じるＳＣＡ−１表現型の変更遺伝子の同定に関するもので、さらに、正常アタキシン−１の過剰発現を検出することを含む、ＳＣＡ−１への素因の診断に関するものである。このことにより診断は可能となるがこの測定法は測定手順も煩雑で本発明の目的である一般的な適用は困難である。 As a diagnosis of Parkinson's disease, Japanese Patent Publication No. 2004-517634 (Patent Document 3) has been proposed. This proposal relates to a Drosophila model of spinocerebellar ataxia 1 (SCA-1), which is a neurodegenerative disease. In particular, it relates to transgenic Drosophila expressing normal human ataxin-1 or mutant human ataxin-1 having an extended polyglutamine repeat for the treatment of SCA-1, and further to develop SCA-1 It relates to the diagnosis of predisposition to Furthermore, it relates to a method of using genetically modified Drosophila to screen therapeutic agents for SCA-1 and other neurodegenerative diseases, for therapeutic and diagnostic applications of SCA-1 and other neurodegenerative diseases, and therapeutic agents. Identification of a gene that alters the SCA-1 phenotype caused by overexpression of ataxin-1 for screening and further comprising a predisposition to SCA-1 comprising detecting overexpression of normal ataxin-1 It is about diagnosis. Although this makes it possible to diagnose, this measurement method also involves a complicated measurement procedure and is difficult to apply in general, which is the object of the present invention.
パーキンソン病の臨床的な有効なマーカとして本出願者らにより皮膚ガスおよび汗からの疾病マーカが提案されているが、まだ実用に供されてなく、また臨床現場では血液の採取が日常的に実施されているので、血液中の化学物質によるパーキンソン病の疾病マーカが用いられるのが望ましいが、現状では有効な疾病マーカが現在見出されていないために、多くのパーキンソン病患者が５０％の進行状態で初めて治療が開始される状態にあるので、血液中の化学物質を用いたパーキンソン病のマーカが開発されることは重要な課題である。 Applicants have proposed a disease marker from skin gas and sweat as a clinically effective marker of Parkinson's disease, but it has not been put to practical use, and blood sampling is routinely performed in clinical settings. Therefore, it is desirable to use a disease marker for Parkinson's disease caused by a chemical substance in the blood. However, since no effective disease marker has been found at present, many Parkinson's disease patients progress 50%. It is an important issue to develop a marker for Parkinson's disease using chemical substances in the blood because it is in a state where treatment is started for the first time.
パーキンソン病診断、治療ツールとしての血液中のアミノ酸に着目し、該アミノ酸の測定によりパーキンソン病の早期診断を可能としたものである。パーキンソン病診断には、血液中のアミノ酸のチロシン（Ｔｈ）とフェニルアラニン（Ｐｈ）、プロリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシンを測定することによりパーキンソン病に特異的な関係を検討することであり、また血中各種アミノ酸の濃度を統計処理により疾患の重度との関連を見出すことから、これにより疾患の診断や進行度の使用に供することが課題である。 It focuses on amino acids in blood as a diagnostic and therapeutic tool for Parkinson's disease, and enables early diagnosis of Parkinson's disease by measuring the amino acids. The diagnosis of Parkinson's disease is to examine the specific relationship to Parkinson's disease by measuring the amino acids tyrosine (Th) and phenylalanine (Ph), proline, threonine, leucine, and isoleucine in the blood. Since the relationship between the concentration of various amino acids and the severity of the disease is found by statistical processing, it is a subject to be used for the diagnosis of the disease and the use of the degree of progression.
本発明は血液中に、パーキンソン病と関連の有る化合物を複数みいだし、これらの化合物単独あるいはそれらの相対比あるいは複数の因子として取扱い、パーキンソン病疾患の新疾病マーカとして使用できることを見出した。このマーカを用いてパーキンソン病の早期発見のための測定方法を発明し、パーキンソン病の診断の手段を提供するものである。 The present invention has found that a plurality of compounds associated with Parkinson's disease are found in the blood, and these compounds can be used as single disease markers, their relative ratios or multiple factors, and used as new disease markers for Parkinson's disease. Using the marker invented measuring method for early detection of Parkinson's disease, there is provided a diagnostic hand stages of Parkinson's disease.
パーキンソン病を早期診断するために、ヒトの血液のサンプリングを行い、アミノ酸を分離分析し、アミノ酸のチロシンとフェニルアラニンを計測し、あらかじめ求められた診断基準を用いてパーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定することを特徴とするパーキンソン病の早期診断方法である。測定方法は、血液２０マイクロリットルに有機溶媒アセトニトリルおよびメタノールを加え、次いで１００００ｇで遠心分離を行い、上澄み液を２０マイクロリットル取り出し、蛍光誘導化試薬 ＮＢＤ−Ｆ（4-Fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole）を加えて反応させ、次いで液体クロマトグラフィーを行い、血液中のアミノ酸分析を行い、各種アミノ酸の濃度が得られた。測定された各種アミノ酸の内チロシンとフェニルアラニンの相対比を求め、アミノ酸のパーキンソン病疾マーカとした。また各種アミノ酸の濃度とパーキンソン病の重度との統計処理による関連を求め関係式を得て、パーキンソン病の疾患の診断を行った。統計処理の方法は本特許出願者らによる特許文献４の手法に従った。すなわち因子(x)として各種アミノ酸濃度カウントを当て、係数（a）を見出し、疾患の重度（ｙ）のカウント数を求める方法である。
上記測定方法により血液中のアミノ酸を液体クロマトグラフまたは液体クロマトクロマトグラフ/質量分析計を用いて測定を行い、血液中のアミノ酸中のチロシンとフェニルアラニン成分の濃度による比率（Ｔｈ／Ｐｈ）を得た。あらかじめ疾病マーカを定め、それら比率から作成した判定基準を用いてパーキンソン病の早期発見を行った。
また、クロマトグラフ/質量分析計による測定から得られたアミノ酸濃度のカウント数に、あらかじめパーキンソン病疾患から得られた統計処理を加えてパーキンソン病重度の指標のカウント数を算出した。これによりアミノ酸濃度測定からパーキンソン病を診断することの方法を発見した。
In order to diagnose Parkinson's disease at an early stage , human blood is sampled, amino acids are separated and analyzed, amino acids tyrosine and phenylalanine are measured, and early diagnosis of Parkinson's disease or progression of the disease is performed using previously determined diagnostic criteria. It is an early diagnosis method for Parkinson's disease characterized by calculating the degree. In the measurement method, organic solvent acetonitrile and methanol were added to 20 microliters of blood, and then centrifuged at 10,000 g, and 20 microliters of supernatant was taken out, and fluorescence derivatization reagent NBD-F (4-Fluoro-7-nitro-2 , 1,3-benzoxadiazole), followed by liquid chromatography, amino acid analysis in blood, and various amino acid concentrations were obtained. The relative ratio of tyrosine and phenylalanine among the various amino acids measured was determined and used as a Parkinson's disease marker for amino acids. In addition, the relation between various amino acid concentrations and the severity of Parkinson's disease was obtained by statistical processing, and a relational expression was obtained to diagnose Parkinson's disease. The method of statistical processing in accordance with the technique of Patent Document 4 according to the present patent application have found. That is, it is a method of finding the coefficient (a) and finding the count number of disease severity (y) by applying various amino acid concentration counts as the factor (x).
The amino acid in the blood was measured by the above-described measurement method using a liquid chromatograph or a liquid chromatograph / mass spectrometer, and the ratio (Th / Ph) depending on the concentration of tyrosine and phenylalanine component in the amino acid in the blood was obtained. . Disease markers were determined in advance, and Parkinson's disease was detected at an early stage using the criteria created from these ratios.
In addition, the count of the index of the severity of Parkinson's disease was calculated by adding statistical processing obtained from Parkinson's disease in advance to the count of amino acid concentration obtained from the measurement by the chromatograph / mass spectrometer. This was discovered a method to diagnose Parkinson's disease from the amino acid concentration measurement.
パーキンソン病を早期診断するために、血液のサンプリングを行い、採血した血液中のアミノ酸測定を実施し、アミノ酸中のチロシンとフェニルアラニン濃度を計測し、あらかじめ測定された診断基準を用いてパーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定した。 In order to diagnose Parkinson's disease at an early stage, blood sampling is performed, amino acids in the collected blood are measured, tyrosine and phenylalanine concentrations in the amino acids are measured, and early diagnosis of Parkinson's disease is performed using pre-measured diagnostic criteria. The degree of diagnosis or disease progression was calculated.
パーキンソン病の疾病マーカを見出すためにパーキンソン病疾患を有する被験者の血中アミノ酸測定例を図１及び図２に示した。図１及び図２に認められるように、液体クロマトグラフィーにより血中アミノ酸の分離が詳しく表示されている。サンプル数１０２人の疾病群（治療していない人と治療中の人）と健常人について測定を実施した。 In order to find a disease marker for Parkinson's disease, examples of blood amino acid measurement in subjects having Parkinson's disease are shown in FIGS. As can be seen in FIGS. 1 and 2, the separation of amino acids in the blood is shown in detail by liquid chromatography. Measurements were performed on a disease group (non-treated and on-treatment) of 102 samples and healthy individuals.
サンプル数１０２人の疾病群（治療していない人と治療中の人）と健常人の差が明らかにできた。この方法をより明確にするために、チロシンとフェニルアラニンの比を用いると、図２に示すように健常人と疾病群の分け方が、良好な確率で達成できた。上記比率が２以上であることで判別できる。 The difference between the disease group of 102 samples (the person who was not treated and the person who was being treated) and the healthy person was clarified. In order to make this method clearer, when the ratio of tyrosine and phenylalanine was used, as shown in FIG. 2, how to divide a healthy person from a disease group could be achieved with a good probability. It can be determined that the ratio is 2 or more.
この図よりパーキンソン病患者群と健常者群の区別が明確にできた。これを被験者に実施したところ、それぞれの妥当な群への区分が出来た。血液中の上記比率が２.２以上であることで判別できる。 From this figure, the Parkinson's disease patient group and the healthy group could be clearly distinguished. When this was performed on subjects, they were divided into appropriate groups. It can be determined that the ratio in the blood is 2.2 or more.
チロシンとはタンパク質を構成する芳香族アミノ酸の一つであり、絹糸・カゼインに特に多く含まれる。生体内でフェニルアラニンから生成されるもので生成前のフェニルアラニンに占める生成後のチロシンの比率が指標となることをつきとめたものである。 Tyrosine is one of the aromatic amino acids that constitute proteins, and is particularly abundant in silk and casein. It was generated from phenylalanine in vivo, and it was found that the ratio of tyrosine after generation to phenylalanine before generation becomes an index.
パーキンソン病を早期診断するためのものであり、血液を採血し、該血液中のアミノ酸を液体クロマトグラフあるいは液体クロマトグラフ/質量分析計により分離分析し、アミノ酸類の濃度を計測し図１を得たのち、各種アミノ酸と疾病の重度との間の関係を求めて統計処理を加え、パーキンソン病の早期診断あるいは疾病の進行度合いを算定する手段とする方法を得た。 For early diagnosis of Parkinson's disease, blood is collected, amino acids in the blood are separated and analyzed with a liquid chromatograph or liquid chromatograph / mass spectrometer, and the concentration of amino acids is measured to obtain FIG. After that, a relationship between various amino acids and the severity of the disease was obtained and statistical processing was added to obtain a method for early diagnosis of Parkinson's disease or for calculating the degree of progression of the disease .
血液のクロマトグラフによる測定から得られた各種アミノ酸の濃度データーに、あらかじめパーキンソン病疾患から得られた重度との関連について、統計処理を加えてパーキンソン病重度の指標を算出した。これにより早期発見を行った。パーキンソン病疾病群を分けて、一つの群により統計処理（多変量解析法のうちのPLS 回帰Partial Least Squares Regressionの使用)を実施し、得られた処理方法を用いて、もう一つの群に適用したところ良い相関係数０．９が得られた。この実施例により、パーキンソン病の重度を示す指標（ＵＰＤＲＳ、パーキンソン病統一スケール、カウント数で表示される）が個々の患者さんに得られた。
上記により得られた式は
Y=a1x1+a2x2+a3x3+----------+anxn
でＹはＵＰＤＲＳのカウント数であり、aは係数、ｘは各種アミノ酸の濃度カウント数を用いる。
この得られた式を用いて上記方法を一般の被験者に適用した。すなわち一般の被験者の血液を採集し、クロマトグラフ分析計による血中アミノ酸濃度測定を実施し、次いで前記式を適用して、ＵＰＤＲＳのカウント数を得る。得られたなＵＰＤＲＳのカウント数により病気になっていないかを診断する。
An index of the severity of Parkinson's disease was calculated by adding statistical processing to the concentration data of various amino acids obtained from the blood chromatographic measurement and the relationship with the severity obtained from Parkinson's disease in advance. This made early detection. Divide the Parkinson's disease group and perform statistical processing (use of PLS regression Partial Least Squares Regression in multivariate analysis method) by one group, and apply to another group using the obtained processing method As a result, a good correlation coefficient of 0.9 was obtained. This example provided an individual patient with an indicator of the severity of Parkinson's disease (UPDRS, Parkinson's disease unified scale, expressed in counts ).
The formula obtained by the above is
Y = a 1 x 1 + a 2 x 2 + a 3 x 3 + ---------- + a n x n
Where Y is the UPDRS count number , a is a coefficient, and x is the concentration count number of various amino acids.
Using the obtained formula, the above method was applied to general subjects. That is, blood of a general subject is collected, blood amino acid concentration is measured by a chromatographic analyzer, and then the above formula is applied to obtain the UPDR S count . It diagnoses or not has become more ill count of the obtained Do UPDR S.
パーキンソン病を早期診断するためのものであり、ヒトの血液を採集するサンプリングを行い、採血した血液を液体クロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計で分離分析し、あらかじめ測定されているＵＰＤＲＳのカウント数を用いて統計処理を実施して相関を得た。この相関をパーキンソン病患者群へ適用したところ、妥当なＵＰＤＲＳのカウント数が得られこれによりパーキンソン病を診断をするための方法が得られた。 For early diagnosis of Parkinson's disease, sampling is performed to collect human blood, and the collected blood is separated and analyzed with a liquid chromatograph or a liquid chromatograph / mass spectrometer . Statistical processing was performed using the count number to obtain a correlation. We applied this correlation to Parkinson's disease patients, the counted number of reasonable UPDR S is thereby to order a method diagnosing Parkinson's disease obtained was obtained.
パーキンソン病の有用な臨床的疾病マーカはこれまで見出されていない。本発明は血液中のアミノ酸の一つであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸であり、絹糸・カゼインに特に多く含まれ、生体内でフェニルアラニンから生成されるチロシンとの比率が指標となることを発明したものである。
本発明によりこれまでパーキンソン病の疾患は５０％進行して医学的に見出される現状であったが、これが改善され早期発見が出来るようになる。すなわち本発明によりパーキンソン病の診断をするための手段とする方法の発見が可能になり、したがって早期に治療の開始ができるので、人々の健康維持に貢献できる。
To date, useful clinical disease markers for Parkinson's disease have not been found. The present invention is one of the amino acids in the blood, is an aromatic amino acid that constitutes a protein, and is particularly abundant in silk and casein, and its ratio to tyrosine produced from phenylalanine in vivo is an index. Invented.
According to the present invention, the disease of Parkinson's disease has been progressed 50% so far as it is found medically, but this has been improved and early detection can be performed. That the present invention enables the discovered ways to a means for the diagnosis of Parkinson's disease, hence it is the start of treatment at an early stage, it can contribute to health of the people.
本発明は人の血液をサンプリングして、次いで分離分析を実施して、疾病マーカの濃度を検知し、これを用いて被検者のパーキンソン病に罹病しているか否かを診断する。非常に医療現場に受け入れやすい方法で、パーキンソン病の早期発見に寄与する。 The present invention samples the human blood, then carrying out separation analysis, to detect the concentration of disease markers, diagnose whether diseased the subject of Parkinson's disease using the same. It contributes to early detection of Parkinson's disease in a way that is very easy to accept in the medical field.
本発明は被験者の血液をサンプリングして、分離手段に供し、用いた液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフ/質量分析計により血液中の各種アミノ酸の濃度を得、ついであらかじめパーキンソン病疾患のＵＰＤＲＳとの統計処理を実施して得た数式に代入して、新たに被検者のＵＰＤＲＳが求められる。この方法により得られたＵＰＤＲＳはパーキンソン病疾患の進行度を示しており、治療の参考に用いることが出来る。 In the present invention, the blood of a subject is sampled, provided to a separation means, the concentration of various amino acids in the blood is obtained by the used liquid chromatograph and liquid chromatograph / mass spectrometer, and then statistically calculated with UPDRS of Parkinson's disease in advance. The UPDRS of the subject is newly obtained by substituting into the mathematical formula obtained by executing the processing. UPDRS obtained by this method shows the degree of progression of Parkinson's disease, and can be used as a reference for treatment.
以上説明したように本発明は、血液を採血して、分離手段を用いて血液中に含まれる各種アミノ酸の濃度を定量し,それらの相対比および各種アミノ酸の統計処理からパーキンソン病疾患と健常者との区分を見出す手段を提供することが出来る。 As described above, the present invention collects blood, quantifies the concentration of various amino acids contained in the blood using a separation means, and determines the relative ratios and statistical processing of the various amino acids, so that Parkinson's disease and healthy subjects and the child provides a Heading to means the division of the can.
発明を実施する一つの形態として、次の測定手順を用いてパーキンソンマーカの濃度を測定する。
測定手順は、まず人の血液を採血する。次にタンパク質成分を除去し、アミノ酸を誘導化し、次いで液体ケロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計により各種アミノ酸濃度を測定する。詳しくは、被験者の血液２０マイクロリットルに有機溶媒アセトニトリルおよびメタノールを加え、次いで１００００ｇで遠心分離を行い、上澄み液を２０マイクロリットル取り出し、蛍光誘導化試薬ＮＢＤ−Ｆを加えて反応させて、次いで液体クロマトグラフィーを行い、血液中のアミノ酸分析を行ない、各種アミノ酸の濃度が得られた。図１及び図２に示した。
測定された各種アミノ酸の内チロシンとフェニルアラニンの相対比を求め、アミノ酸のパーキンソン病疾病マーカとした。パーキンソン病疾患の被験者１０２人と健常者の典型的なチロシンとフェニルアラニンの相対比を図３に示した。
また各種アミノ酸の濃度とパーキンソン病の重度との統計処理による関連を求め関係式を得て、パーキンソン病の疾患の診断を行った。統計処理の方法は本特許出願者らによる特許文献4の手法に従った。
As one mode for carrying out the invention, the concentration of the Parkinson marker is measured using the following measurement procedure.
In the measurement procedure, first, blood of a person is collected. Then remove protein components, amino acids were derivatized and then you measure the various amino acid concentration by liquid Keromatogurafu or liquid chromatograph / mass spectrometer. Specifically, the organic solvent acetonitrile and methanol are added to 20 microliters of the subject's blood, followed by centrifugation at 10000 g, the supernatant is removed by 20 microliters, the fluorescence derivatization reagent NBD-F is added and reacted, and then the liquid Chromatography was performed to analyze amino acids in blood, and various amino acid concentrations were obtained. It showed in FIG.1 and FIG.2.
The relative ratio of tyrosine and phenylalanine among the various amino acids measured was determined and used as the Parkinson's disease disease marker for amino acids. The relative ratio of typical tyrosine and phenylalanine of 102 subjects with Parkinson's disease and healthy subjects is shown in FIG.
In addition, the relation between various amino acid concentrations and the severity of Parkinson's disease was obtained by statistical processing, and a relational expression was obtained to diagnose Parkinson's disease. The statistical processing method followed the method of Patent Document 4 by the applicants of the present patent.
ここで、パーキンソン病についての実験結果を説明すると、図１乃至図３により説明すると、図１および図２はパーキンソン患者の血中から得られたアミノ酸のクロマトグラムである。患者によりピークの強度がそれぞれ異なっていることが分かる。図３ではＤＯＰＡ薬を服用中の患者とＤＯＰＡ薬を服用していない患者と、健常人の血液中のアミノ酸化合物であるフェニルアラニンを分母としてフェニルアラニンから生成されるチロシンを分子とした比率を縦軸に、横軸には上記対象患者と健常者とを示している。図３からわかるようにチロシン／フェニルアラニンが２．２以上である場合には、パーキンソン病患者はＤＯＰＡ薬服用および非服用ともパーキンソン病と診断できるので、服用条件にかかわらずパーキンソン病患者であることのマーカとなることを示している。 Here, the experimental results for Parkinson's disease will be described. FIG. 1 to FIG. 3 are chromatograms of amino acids obtained from the blood of Parkinson patients. It can be seen that the intensity of the peak varies depending on the patient. In FIG. 3, the vertical axis represents the ratio of tyrosine produced from phenylalanine as the denominator of phenylalanine, which is an amino acid compound in the blood of a healthy person and a patient who is not taking DOPA drug and a patient who is not taking DOPA drug. The horizontal axis shows the target patient and healthy subjects. If 3 or Rawakaru so on is tyrosine / phenylalanine 2.2 or more, since the Parkinson's disease patient can be diagnosed that DOPA agent taken and nonusers with Parkinson's disease, it is Parkinson's disease patients regardless of dose condition It becomes that it becomes a marker of.
以上の結果から血液中のアミノ酸の成分から見出したパーキンソン病疾病マーカによる効果を示す。血液中の成分としてフェニルアラニンとチロシンが有効な疾病マーカであることを見出した。チロシン／フェニルアラニンの相対比の値２．２のところで疾病群と健常者群とが明確に分かれている。これは非常に良い新規疾病マーカである。以上説明したように本発明は血液成分のフェニルアラニンとチロシンの比が２．２以上であることを特徴とするパーキンソン病の早期診断のための方法である。 The effect by the Parkinson's disease disease marker discovered from the above result from the component of the amino acid in blood is shown. We found that phenylalanine and tyrosine are effective disease markers as components in blood. The disease group and the healthy group are clearly separated when the relative ratio of tyrosine / phenylalanine is 2.2. This is a very good new disease marker. Above-described manner, the present invention is the way for the early diagnosis of Parkinson's disease, wherein the ratio of phenylalanine and tyrosine in the blood component is 2.2 or more.
パーキンソン病疾病患者と健常人の血中成分を比較すると、その化学成分の濃度の高さと相対的な比較を実施すると、プロリンについて患者は健常人に比べて濃度が低く、スレオニンについても患者は健常人に比べて濃度が低く、ロイシンについて患者は健常人より濃度が高く、イソロイシンについても患者は健常人より濃度が高いことが分かった。これらの化学物質が存在するか調べることによりパーキンソン病の診断が出来る。すなわちプロリン、スレオニンンの濃度が相対的に低く、ロイシン、イソロイシンの濃度が相対的に高いときはパーキンソン病が疑われると診断できた。 Comparing the blood components of patients with Parkinson's disease and healthy subjects, the relative concentration of the chemical component was compared with that of patients, and proline concentration was lower than that of healthy subjects, and threonine was also healthy. It was found that the concentration of leucine was lower than that of humans, and that the concentration of leucine was higher than that of healthy individuals, and that of isoleucine was higher than that of healthy individuals. Parkinson's disease can be diagnosed by examining the presence of these chemical substances. That is, it was diagnosed that Parkinson's disease was suspected when the concentrations of proline and threonine were relatively low and the concentrations of leucine and isoleucine were relatively high .
各種血液中にアミノ酸濃度の存在から、これとパーキンソン病統一スケール（UPDRS）との統計解析より、被験者のパーキンソン病の可能性を診断することの方法が出来た。 From the presence of the amino acid concentration in the various blood, from the statistical analysis of this and the Unified Parkinson's Disease Scale (UPDRS), could method to diagnose the likelihood of the subject's path Parkinson's disease.
血液試料の液体クロマトグラフまたはガスクロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計による測定から得られた各種アミノ酸濃度に、あらかじめパーキンソン病疾患の重度から得られた関係について統計処理を加えてパーキンソン病指標のカウント数を算出した。これにより発見を行った。
すなわち、パーキンソン疾病群を分けて、一つの群により統計処理（多変量解析法のうちのPLS 回帰Partial Least Squares Regressionの使用)を行ない、得られた処理方法を用いて、もう一つの群に適用したところ良い相関係数０．９が得られた。得られた関係式により、パーキンソン病の重度を示す指標（ＵＰＤＲＳ、パーキンソン病統一スケール）が個々の被験者について得られた。
上記に統計処理についてさらに詳しく説明する。得られた関係式は、
Y=a1x1+a2x2+a3x3+----------+anxn
でＹはＵＰＤＲＳのカウント数であり、aは係数、ｘは各種アミノ酸を示しそれらの個別濃度を示すカウント数を用いる。ここでカウント数とはその特定のアミノ酸の濃度強度を示す。
上記方法をある被験者に適用した。すなわち血液を採集し、液体クロマトグラフまたは液体クロマトグラフ/質量分析計による測定を実施し各種アミノ酸濃度を得て、次いでパーキンソン病疾患から得られた式を適用し、ＵＰＤＲＳのカウント数を求めたところ、5以下の小さな値を示しほぼ健常人と診断された。
The various amino acids concentrations obtained from the measurement by liquid chromatograph or gas chromatograph or a liquid chromatograph / mass spectrometer of the blood sample, Parkinson's disease indicators added statistical processing relationship obtained from severe pre-Parkinson's disease The count number of was calculated. More discovery went to this.
In other words, Parkinson's disease group is divided and statistical processing (use of PLS regression Partial Least Squares Regression of multivariate analysis method) is performed by one group and applied to another group using the obtained processing method As a result, a good correlation coefficient of 0.9 was obtained. From the obtained relational expression, an index (UPDRS, Parkinson's disease unified scale) indicating the severity of Parkinson's disease was obtained for each subject.
The statistical processing will be described in more detail above. The obtained relational expression is
Y = a 1 x 1 + a 2 x 2 + a 3 x 3 + ---------- + a n x n
Where Y is the UPDR S count number , a is a coefficient, x is various amino acids, and the count number indicating their individual concentration is used. Here, the count number indicates the concentration intensity of the specific amino acid.
The above method was applied to a subject. That is, blood was collected and measured with a liquid chromatograph or liquid chromatograph / mass spectrometer to obtain various amino acid concentrations, and then the formula obtained from Parkinson's disease was applied to determine the UPDR S count . However , the patient showed a small value of 5 or less and was almost diagnosed as a healthy person.
以上パーキンソン病疾病マーカとして血液中に存在するフェニルアラニンとチロシンが有効な疾病マーカであることを見出した。チロシン／フェニルアラニンの相対比を用いた診断するための方法を見出した。また各種アミノ酸濃度からパーキンソン病患者の重度の診断が出来ることを見出した。 As described above, the present inventors have found that phenylalanine and tyrosine present in blood are effective disease markers as Parkinson's disease disease markers. A method for diagnosing using the relative ratio of tyrosine / phenylalanine was found. It was also found that severe diagnosis of Parkinson's disease patients can be made from various amino acid concentrations.
血液中のアミノ酸濃度からパーキンソン病疾患マーカを見出し、また血中の各種アミノ酸の統計処理によりパーキンソン病疾患の重度に関するカウント数を得るための方法を見出したが、その運用には、好ましくは複数のマーカの併用が期待され、より正確にパーキンソン病の疾病判断をすることである。また、皮膚ガスや、身体からの汗についてのマーカとの併用が好ましい。 Found Parkinson's disease marker from the amino acid concentration in the blood, also it has been found a method for obtaining a count number for the heavy of the Parkinson's disease disease by statistical processing of various amino acids in the blood, into its operations, preferably a plurality It is expected that the marker will be used in combination, and more accurately determine the disease of Parkinson's disease. Moreover, combined use with the marker about skin gas and the sweat from a body is preferable.
あらたなパーキンソン病疾病マーカを用いることにより、早期判断が正確に実施でき治療の早期開始による人々の健康への回復が期待できるようになると想定できる。 By using a new marker for Parkinson's disease, it can be assumed that early judgment can be performed accurately and recovery of people's health can be expected by early treatment.
本発明は、医療現場での利用が出来れば、パーキンソン病の疾病の早期発見が可能となり、早期治療の開始により人々の健康の回復が期待できる大きな効果が期待できるので、本発明を実施する検査機関の確立などの医療産業に効果をもたらす。また早期治療用の薬剤の開発が進み医薬産業への貢献が可能となる。さらに脳科学の進歩にも貢献できる。またパーキンソン病の早期診断のための血液中のアミノ酸濃度のカウント数を測定するためにクロマトグラフ装置を使用していることより分析機器産業や医療産業に効果がある。
Since the present invention enables early detection of Parkinson's disease if it can be used in the medical field, it can be expected to have a great effect that recovery of people's health can be expected by starting early treatment. It has an effect on the medical industry such as establishment of institutions. In addition, the development of drugs for early treatment will advance and it will be possible to contribute to the pharmaceutical industry. It can also contribute to the advancement of brain science. In addition, the use of a chromatographic device to measure the count of amino acid concentration in blood for early diagnosis of Parkinson's disease is effective in the analytical instrument industry and the medical industry.
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