JP6552960B2 - Methods for producing recombinant peptides and resulting peptides - Google Patents
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Description
関連出願への相互参照Cross-reference to related applications
この出願は、2012年3月28日に出願されたロシア連邦特許出願第2012111965号の優先権を主張する、2013年5月28日に出願された国際特許出願第PCT/RU2013/000433号の米国特許法第371条に基づく米国国内段階出願である。国際出願は、特許協力条約第21条(2)に基づく国際公報第WO2013/151467号として、2013年10月10日に公開された。これらの出願の内容全体が、参照により本明細書中に援用される。This application claims priority to Russian Federation Patent Application No. 2012111965, filed March 28, 2012, the United States of International Patent Application No. PCT / RU2013 / 000433 filed May 28, 2013 It is a US domestic phased application under 351 Patent Act. The international application was published on October 10, 2013 as International Publication No. WO2013 / 151467 based on Article 21 (2) of the Patent Cooperation Treaty. The entire contents of these applications are incorporated herein by reference.
配列表Sequence listing
本出願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書中に援用される。2014年10月31日に作成された上記ASCIIの写しは、246273.000002_SL.txtと称され、サイズは503,566バイトである。This application contains a Sequence Listing submitted electronically in ASCII format, which is incorporated herein by reference in its entirety. The above ASCII copy created on October 31, 2014 is called 246273.000002_SL.txt and has a size of 503,566 bytes.
発明の分野
本発明は生化学の分野に関し、ペプチドの生産のための組換え方法および得られるペプチドに関する。特に、本発明は、次の一般式:
A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X
(式中、
A - 0, Met, Met (O), Thr, Ala, His, Phe, Lys, Gly
B - 0, Gly, Asp, Trp, Gln, Asn, Tyr, Pro, Arg
C - 0, Arg, Phe, Tyr, Gly, His, Pro, Lys
D - 0, Val, Gly, Tyr, Trp, Phe, His
X - OH, OCH3, NH2
であり、式中、0はアミノ酸残基が存在しない。但し、A≠0の場合、Bおよび/またはCおよび/またはD≠0であり、B≠0の場合、Cおよび/またはD≠0であり、Phe-Thr-Lys-Pro-Gly、Thr-Lys-Pro-Pro-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg-Glyのペプチドを除く。)
を有するペプチドに関する。
FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the field of biochemistry, to recombinant methods for the production of peptides and to the resulting peptides. In particular, the present invention provides the following general formula:
A-Thr-Lys-Pro-BCDX
(In the formula,
A-0, Met, Met (O), Thr, Ala, His, Phe, Lys, Gly
B-0, Gly, Asp, Trp, Gln, Asn, Tyr, Pro, Arg
C-0, Arg, Phe, Tyr, Gly, His, Pro, Lys
D-0, Val, Gly, Tyr, Trp, Phe, His
X-OH, OCH 3 , NH 2
Where 0 is no amino acid residue. However, when A ≠ 0, B and / or C and / or D ≠ 0, and when B ≠ 0, C and / or D ≠ 0, and Phe-Thr-Lys-Pro-Gly, Thr- Excludes Lys-Pro-Pro-Arg and Thr-Lys-Pro-Arg-Gly peptides. )
It relates to a peptide having
発明の背景
低分子ペプチドは、非常に高い活性を示し、障害が生じた器官において自然治癒を促すことが知られている。一般に知られるように、より低分子のペプチドは、初めは動物組織に由来し、後に実験室条件下で生産されるようになる。ペプチドを含有する医薬品は、損傷した体細胞を修復し、影響を受けた器官に失われた機能を戻し、若返らせることが可能である。ペプチドを含有する医薬品は30年以上前に開発されており、その時から、何百もの実験が行われ、さまざまな全身の疾患の処置および予防、ならびに個々の器官および体全体の若返りにおけるペプチドの有効性が証明されてきた。
Background of the Invention Small peptides are known to exhibit very high activity and promote spontaneous healing in damaged organs. As is generally known, smaller peptides are initially derived from animal tissue and later produced under laboratory conditions. Drugs containing peptides are capable of repairing damaged somatic cells and restoring and restoring lost function to affected organs. Drugs containing peptides have been developed over 30 years ago, and since then hundreds of experiments have been conducted to treat and prevent various systemic diseases, and the effectiveness of peptides in rejuvenation of individual organs and whole bodies Sex has been proven.
体内では、ペプチドは情報メッセンジャーを務めている。ペプチドは、すべてがうまく時間通りに行われ得るように、ある細胞から別の細胞へ情報を伝達する。1つの細胞が適切に機能すれば、対応する器官はうまく働く。機能不全が生じると、それは器官全体に影響を及ぼし、疾患を引起す。体内に欠損している物質を導入することにより、疾患を処置することが可能であるのは明らかであるが、このアプローチは、細胞を完全に「損なって」しまい、適切な機能の働きを止めてしまうおそれがある。したがって、体が自然治癒するように細胞を機能させるペプチドメッセンジャーを細胞に送達する必要がある。各器官は、貯蔵幹細胞の供給を有する。この供給が均等に消費されれば、人は100〜110歳まで生きる。ペプチドは、すべての哺乳類について同じである。したがって、仔ウシペプチドがヒトに導入されれば、ヒトの体は生来の分子としてそれを取入れる。主な課題は、動物器官からペプチドを単離する方法を見つけることであった。この技術は、早くも1971年に、軍病院のVladimir Morozov教授およびVyacheslav Havinson教授によって発明
された。医薬品が開発され、その後これらに基づいて、栄養補助食品が使用し易いため作られた。老化過程および老化に影響を及ぼす方法の研究において、サンクトペテルブルク老年医学研究所の研究員らは、ペプチドをマウスの実験群の飼料に導入すると、平均寿命が30〜38%延びたことを結論づけた。その後、キエフ老年医学研究所およびサンクトペテルブルクにおいて、高齢者に対してペプチドの研究が行われた。これは、死亡率のほぼ2倍の低下を示し、ペプチドの高い老化保護的活性が示唆された。ペプチド医薬品の長期的な研究および使用は、異なる年齢群の患者においてこれらの高い有効性を示したものの、高齢者(50歳以上)において特別な有効性が観察された。ペプチド生体調節剤の絶対的利点は、副作用が一切無いことである。26年以内に、さまざまな病状をかかえる1
500万人を超える人々が、このような製品を受け入れた。これらの有効性は、平均75〜95%にまでなった。年齢および病状変化とともに発生するペプチド不足は、組織消耗および体老化を顕著に加速させる。実際、細胞および組織が適当に機能するには適量のペプチドが必要であり、適量のペプチドはまた、最適な遺伝子の働きをサポートする。ペプチドに特異的な細胞において機能するペプチドは、その細胞において合成される。したがって、病状変化において、さらに年齢とともに、細胞機能は破壊されるため、ペプチド複製も影響を受ける。その結果、細胞機能は二次的に影響を受ける。したがって、組織の退化が進行し、結局は臨床的に表れる。そのため、低分子ペプチドの適用は、医学における主要な革新のひとつであり、細胞増殖および組織再生を刺激するとともに、細胞寿命を向上させることにより、老化の速度を顕著に遅めることができる。ペプチドの別の重要な利点は、抗腫瘍作用である。現在、ペプチドの使用は、活性化 (体の若返り)および癌予防
において最善な妥協のない解決策である。なぜなら、それは、すべての循環過程の調節および同期によってのみでなく、非定型性(非定型性は、誤った細胞構造、または異常である)なしに細胞分裂能を増大させることにより、細胞および組織を若返らせることができるためである。
In the body, peptides serve as information messengers. The peptide transmits information from one cell to another so that everything can be done on time and on time. If one cell functions properly, the corresponding organ works well. When dysfunction occurs, it affects the entire organ and causes disease. Obviously, it is possible to treat the disease by introducing a deficient substance into the body, but this approach completely “damages” the cells and stops the proper functioning. There is a risk that. Thus, there is a need to deliver to the cells peptide messengers that cause the cells to function in a way that the body heals spontaneously. Each organ has a supply of storage stem cells. If this supply is consumed evenly, one can live to 100-110 years old. The peptide is the same for all mammals. Thus, when a calf peptide is introduced into humans, the human body incorporates it as a native molecule. The main task was to find a way to isolate the peptide from animal organs. This technology was invented as early as 1971 by professors Vladimir Morozov and Vyacheslav Havinson of the military hospital. Medicaments were developed and based on them, nutraceuticals were made for ease of use. In a study of the aging process and how it affects aging, researchers at the St. Petersburg Geriatric Institute concluded that the average life span was increased by 30-38% when peptides were introduced into the experimental group of mice. Later, peptides were studied for the elderly in the Kiev Geriatric Institute and St. Petersburg. This showed almost a two-fold reduction in mortality, suggesting a high senile protective activity of the peptide. Although long-term studies and use of peptide drugs have shown these high efficacy in patients of different age groups, special efficacy has been observed in the elderly (over 50 years). The absolute advantage of peptide biomodulators is that there are no side effects. Have various medical conditions within 26
More than 5 million people have accepted such products. Their effectiveness averaged up to 75-95%. The peptide deficiency that occurs with age and disease changes significantly accelerates tissue wasting and body aging. In fact, the proper amount of peptide is required for proper functioning of cells and tissues, and the proper amount of peptide also supports optimal gene function. Peptides that are functional in cells specific for the peptide are synthesized in the cells. Thus, in disease state changes, and with age, cellular function is destroyed, so peptide replication is also affected. As a result, cell function is affected secondarily. Thus, tissue degeneration progresses and eventually appears clinically. Therefore, the application of low molecular weight peptides is one of the major innovations in medicine, which can significantly slow the rate of aging by stimulating cell proliferation and tissue regeneration and improving cell life. Another important advantage of peptides is their anti-tumor activity. Currently, the use of peptides is the best uncompromising solution in activation (rejuvenation of the body) and cancer prevention. Because it is not only by the regulation and synchronization of all circulation processes, but also by increasing cell division capacity without atypical (atypical is the wrong cell structure, or abnormal), cells and tissues To rejuvenate the
当然のことながら、技術の現段階では、動物組織からの低分子ペプチドの生産は非実用的である。なぜなら、この方法は、生産プロセスの人道性は言うまでもないが、非常に高額なためである。 Of course, at the current stage of the technology, production of low molecular weight peptides from animal tissue is impractical. The reason is that this method is very expensive although it is needless to say that the humanity of the production process is not.
現代的で高度な生産方法は、組換え微生物の使用を含む。最も便利な微生物は大腸菌である。大腸菌K12、大腸菌O104など、実験室条件下での使用に好適な大腸菌の商用菌株が先行技術において知られている。これらおよび同様の既知の大腸菌を使用して、請求の範囲の低分子ペプチドを産生する菌株を得ることができる。対応する標的低分子ペプチドをエンコードする核酸は、実験室条件下での使用に好適な任意の既知の菌株に組込まれることができる。細菌性プラスミド、ウィルス、ビリオン、ファージDNAを含有するハイブリッドベクター、およびプラスミドなどのベクターは、宿主細胞にDNAを挿入するために使用される。これらのベクターとしては、たとえば、コスミドおよびファスミドが含まれる。 Modern and advanced methods of production involve the use of recombinant microorganisms. The most convenient microorganism is E. coli. Commercial strains of E. coli suitable for use under laboratory conditions, such as E. coli K12, E. coli O104, are known in the prior art. These and similar known E. coli strains can be used to obtain strains that produce the claimed low molecular weight peptides. The nucleic acid encoding the corresponding target small molecule peptide can be incorporated into any known strain suitable for use under laboratory conditions. Vectors such as bacterial plasmids, viruses, virions, hybrid vectors containing phage DNA, and plasmids are used to insert DNA into host cells. These vectors include, for example, cosmid and phasmid.
さらに、従来の化学合成によりペプチドを生産することが可能である。
提案されるペプチドは、生殖および性的機能の刺激ならびに生殖および性的機能障害の処置のための手法の範囲を拡大するという、現在も未だ重要な課題を解決する。現在、このような病状の病原的処置は、精神療法、抗うつ剤、抗不安剤、アダプトゲン、ならびにビタミン剤、一般の工場系刺激剤、およびダイエット栄養補助食品を用いて行われている。このような処置は長く、非能率的で、多くの副作用を伴う。
Furthermore, it is possible to produce peptides by conventional chemical synthesis.
The proposed peptide solves the still important issue of expanding the range of approaches for stimulating reproduction and sexual function and treating reproductive and sexual dysfunction. Currently, pathogenic treatments for such conditions are performed using psychotherapy, antidepressants, anti-anxiety agents, adaptogens, and vitamins, general factory stimulants, and diet supplements. Such treatment is long, inefficient and has many side effects.
生殖および性的機能の刺激剤の生産に好適な、最も有効的なクラスの生理活性物質のひとつはペプチドであり、ペプチドは内在性物質として、マイナスの副作用を事実上有さない。 One of the most effective class of physiologically active substances suitable for the production of stimulants of reproductive and sexual function is peptides, which as endogenous substances have virtually no negative side effects.
我々自身の調査は、内在的に産生されるペプチドであるタフトシンの合成類似体である、一般式Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-ProのヘプタペプチドであるSelankが、生殖および性
的機能障害の処置および予防のための手法として使用可能であることを示した(ロシア連邦特許第2404793号)。しかしながら、ヘプタペプチドであるSelankの合成は多段であり、これに基づく医薬品のコストは大幅に増加してしまう。さらに、体内で強い蛋白質分解に晒されるため、生殖および性的機能障害の予防および処置に対するその刺激効果が低減する。
Our own research has shown that Selank, a heptapeptide of the general formula Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, which is a synthetic analogue of taftsin which is an endogenously produced peptide, is reproductive and sexual. It has been shown that it can be used as an approach for the treatment and prevention of dysfunction (Russian Federal Patent No. 2404793). However, the synthesis of Selank, which is a heptapeptide, is multi-step, and the cost of pharmaceuticals based on this is greatly increased. Furthermore, exposure to strong proteolysis in the body reduces its stimulatory effect on the prevention and treatment of reproductive and sexual dysfunction.
発明の開示
発明の目的は、生殖および性的機能刺激活性を有する手法の範囲を拡大することである。
DISCLOSURE OF THE INVENTION The object of the invention is to expand the scope of approaches having reproductive and sexual function stimulating activity.
本発明を実施すると達成される技術的成果は、生殖および性的機能障害の予防および処置の有効性の増大、治療の経過の期間の短縮、ならびに薬剤のコスト低下である。ここで、次の一般式を有するペプチドが医薬品として提案される。 The technical outcome achieved when practicing the present invention is increased effectiveness of prevention and treatment of reproductive and sexual dysfunction, shortening the duration of the course of therapy, and reducing the cost of the drug. Here, a peptide having the following general formula is proposed as a pharmaceutical.
A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X
(式中、
A - 0, Met, Met (O), Thr, Ala, His, Phe, Lys, Gly
B - 0, Gly, Asp, Trp, Gln, Asn, Tyr, Pro, Arg
C - 0, Arg, Phe, Tyr, Gly, His, Pro, Lys
D - 0, Val, Gly, Tyr, Trp, Phe, His
X - OH, OCH3, NH2
であり、式中、0はアミノ酸残基が存在しない。
但し、A≠0の場合、Bおよび/またはCおよび/またはD≠0であり、B≠0の場合、Cおよび/またはD≠0であり、Phe-Thr-Lys-Pro-Gly、Thr-Lys-Pro-Pro-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg-Glyのペプチドを除く。)
A-Thr-Lys-Pro-BCDX
(In the formula,
A-0, Met, Met (O), Thr, Ala, His, Phe, Lys, Gly
B-0, Gly, Asp, Trp, Gln, Asn, Tyr, Pro, Arg
C-0, Arg, Phe, Tyr, Gly, His, Pro, Lys
D-0, Val, Gly, Tyr, Trp, Phe, His
X-OH, OCH 3 , NH 2
Where 0 is no amino acid residue.
However, when A ≠ 0, B and / or C and / or D ≠ 0, and when B ≠ 0, C and / or D ≠ 0, and Phe-Thr-Lys-Pro-Gly, Thr- Excludes Lys-Pro-Pro-Arg and Thr-Lys-Pro-Arg-Gly peptides. )
A、B、C、D、およびX位のアミノ酸残基の選択は、データベース[EROP-Moscow (http://erop.inbi.ras.ru/) Zamyatin A.A.]中のN末端およびC末端アミノ酸残基の対応する位置でのアミノ酸残基頻度の生物情報学的分析に基づく。これらのアミノ酸残基の選択は、その位置のアミノ酸残基の50%を超える出現率の基準に基づいて行われた。このアミノ酸残基のサンプルは、個々のペプチドを合成し、生体内モデルにおける生殖および性的機能活性の刺激についてこれらを試験することにより、実験により確認された。ペプチド中のファルマコフォア位置は、実験により決定される。すべてのペプチドは、ペプチダーゼに晒され、特定のフラグメントに分解することが知られている。この目的のために、Thr-Lys, Thr-Lys-Pro, Pro-Gly-Pro, Arg-Pro-Gly-Pro, Pro-Arg-Pro-Gly-ProのSelank
ヘプタペプチドフラグメントを合成し、これらの活性を研究した。結果を表4に示す。この分析では、ファルマコフォアがThr-Lys-Proであると決定された。実験により特定され
た個々のアミノ酸残基のC末端への結合は、(生殖および性的機能を刺激して)ペプチドの活性を維持することが示された。但し、研究により示されるように(表5、実施例10)、ペプチド中のアミノ酸残基の数は、3であるまたは4を超える。テトラペプチドは、生殖および性的機能刺激活性を有さない。
The selection of amino acid residues at positions A, B, C, D, and X is based on the N-terminal and C-terminal amino acid residues in the database [EROP-Moscow (http://erop.inbi.ras.ru/) Zamyatin AA]. Based on bioinformatic analysis of amino acid residue frequency at corresponding positions of groups. The selection of these amino acid residues was based on a criterion for the appearance rate exceeding 50% of the amino acid residues at that position. Samples of this amino acid residue were confirmed experimentally by synthesizing individual peptides and testing them for stimulation of reproductive and sexual function activity in in vivo models. The pharmacophore position in the peptide is determined by experiment. All peptides are known to be exposed to peptidases and break down into specific fragments. For this purpose, Selank of Thr-Lys, Thr-Lys-Pro, Pro-Gly-Pro, Arg-Pro-Gly-Pro, Pro-Arg-Pro-Gly-Pro
Heptapeptide fragments were synthesized and their activities were studied. The results are shown in Table 4. In this analysis, the pharmacophore was determined to be Thr-Lys-Pro. The binding of the experimentally identified individual amino acid residues to the C-terminus has been shown to maintain the activity of the peptide (stimulating reproductive and sexual function). However, as shown by studies (Table 5, Example 10), the number of amino acid residues in the peptide is 3 or greater than 4. Tetrapeptides have no reproductive and sexual function stimulating activity.
上述の技術的成果は、一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X(テトラペプチドを除く)を有す
るさまざまなペプチドを直接的に合成し、これらのペプチドを生殖および性的機能障害の予防および処置のための生殖および性的機能の刺激剤として用いることにより達成される。我々自身の調査は、生殖および性的機能の刺激剤として、一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-Xに対応する、合成されたペプチド、すなわち、Thr-Lys-Proトリペプチド、Thr-Lys-Pro-Arg-Proペンタペプチド、およびThr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheヘキサペプチドが推奨され得ることを示した。
The above technical result directly synthesizes various peptides having the general formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX (except tetrapeptides), and prevents and treats these peptides for reproductive and sexual dysfunction. Achieved by using it as a reproductive and sexual function stimulant. Our own research shows that as a stimulator of reproductive and sexual function, a synthesized peptide corresponding to the general formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX, namely Thr-Lys-Pro tripeptide, Thr-Lys- It was shown that Pro-Arg-Pro pentapeptide and Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe hexapeptide can be recommended.
生殖および性的機能の刺激剤として推奨されるA-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X(テトラペプチ
ドを除く)を有するすべてのペプチドは、共通のパターンを有する。すなわち、それらの分子構造中にThr-Lys-Proトリペプチド分子が存在する。
All peptides with A-Thr-Lys-Pro-BCDX (except tetrapeptides) recommended as stimulators of reproduction and sexual function have a common pattern. That is, there are Thr-Lys-Pro tripeptide molecules in their molecular structure.
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Proヘプタペプチド(Selank)がコントロールとして用いら
れた。
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro heptapeptide (Selank) was used as a control.
行われた研究の成果は、一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X(テトラペプチドを除く)を有
するペプチドが生殖および性的機能刺激活性を有し、生殖および性的機能障害の予防および処置のための医薬品として使用され得ることを示した。一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-X
のペプチドの一部を表1に示す。
The outcome of the studies carried out is that peptides having the general formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX (except for tetrapeptides) have reproductive and sexual function stimulating activity and prevent and treat reproductive and sexual dysfunction It can be used as a medicine for General Formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX
Table 1 shows some of the peptides.
発明の最良の形態
以下は、発明を例示する実施例である。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The following are examples illustrating the invention.
Lアミノ酸を用いた溶液中ペプチド化学法により、一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-Xを
有するペプチドの合成が行われた。ペプチド鎖の逐次延長、ならびに、混合無水物法、補助求核分子として1−ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加するカルボジイミド法、活性化エステル法、および混合無水物法を用いたフラグメント縮合により、ペプチド合成を実施した。中間生成物および最終生成物は、すべて単離され、特徴化された。溶液の蒸発は、40℃で真空蒸発器を用いて行われた。Boethius装置で求められた融点は、較正なしで示される。得られた化合物の同一性を、Silufolシリカゲル被覆プレート(チェコ共和国)
上でTLCにより試験した。塩素環境下、ニンヒドリン、バートン試薬、Pauly試薬、Reindel-Hoppe試薬、およびo−トリジンを用いてUV光により物質を検出した。比旋光度は
、AI−EPO旋光計により求めた。ペプチド均質性は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により試験し、ペプチド構造は、質量分析法により確認した。溶媒はすべて対応して無水化された。融点は較正されていない。
A peptide having the general formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX was synthesized by peptide chemistry in solution using L amino acids. Perform peptide synthesis by sequential extension of the peptide chain and fragment condensation using mixed anhydride method, carbodiimide method with 1-hydroxybenzotriazole added as conucleophile, activated ester method, and mixed anhydride method did. All intermediate and final products were isolated and characterized. Evaporation of the solution was carried out at 40 ° C. using a vacuum evaporator. The melting point determined with the Boethius apparatus is shown without calibration. Silufol silica gel coated plate (Czech Republic)
Tested by TLC above. Under a chlorine environment, substances were detected by UV light using ninhydrin, Burton reagent, Pauly reagent, Reindel-Hoppe reagent, and o-tolidine. The specific rotation was obtained by an AI-EPO polarimeter. Peptide homogeneity was examined by high performance liquid chromatography (HPLC) and peptide structure was confirmed by mass spectrometry. All solvents were correspondingly dehydrated. Melting points are not calibrated.
さらに、大腸菌の既知の実験室菌株により設計された宿主細胞を用いた遺伝子工学手法
により、ペプチドを得た。これらの大腸菌株は、標的ペプチドをエンコードする核酸を含有する既知の市販のプラスミドで形質転換された。
Furthermore, peptides were obtained by genetic engineering techniques using host cells designed with known laboratory strains of E. coli. These E. coli strains were transformed with a known commercial plasmid containing a nucleic acid encoding the target peptide.
実施例においてペプチド合成を説明する。 In the examples, peptide synthesis is described.
Arg-Pro-Gly-Proテトラペプチドの合成
図1に示す図に従ってテトラペプチドの合成を行った。
Synthesis of Arg-Pro-Gly-Pro tetrapeptide The tetrapeptide was synthesized according to the diagram shown in FIG.
合成には、混合無水物法、アジド法、およびカルボジイミド法が用いられた。Lアミノ酸の誘導体が合成のために用いられた。溶液の蒸発は、40℃で回転式蒸発器を用いて行われた。Boethius装置で求められた融点は、較正なしで示される。得られた化合物の同一性を、Silufolシリカゲル被覆プレート(チェコ共和国)上でTLCにより試験した。物質
は、ニンヒドリンおよび(または)o−トリジンの溶液をプレートに噴霧することにより
検出された。次の溶媒系中でのクロマトグラフィーの移動率(Rf)値が示される。アセトン:ベンゼン:酢酸(50:100:1)−(1);クロロホルム:メタノール(9:1)−(2);ヘキサン:アセトン(3:2)−(3);ブタノール:酢酸:水(4:1:1)−(4);ブタノール:酢酸:ピリジン:水(30:6:20:24)−(5);クロロホルム:メタノール:アンモニア(6:4:1)−(6);ベンゼン:エタノール(8:2)−(7);酢酸エチル:アセトン:50%酢酸:水(2:1:1)−(8);クロロホルム:メタノール(14:1)−(9);クロロホルム:メタノール:アンモニア(8:1.75:0.25)−(10);クロロホルム:メタノール:アンモニア(6.5:3.0:0.5)−(11)。
The mixed anhydride method, azide method, and carbodiimide method were used for the synthesis. Derivatives of L amino acids were used for the synthesis. Evaporation of the solution was carried out at 40 ° C. using a rotary evaporator. The melting point determined on the Boethius device is shown without calibration. The identity of the resulting compounds was tested by TLC on Silufol silica gel coated plates (Czech Republic). Substances were detected by spraying a solution of ninhydrin and / or o-tolidine onto the plate. Chromatographic transfer rate (Rf) values in the following solvent systems are shown. Acetone: benzene: acetic acid (50: 100: 1)-(1); chloroform: methanol (9: 1)-(2); hexane: acetone (3: 2)-(3); butanol: acetic acid: water (4 Butanol: acetic acid: pyridine: water (30: 6: 20: 24)-(5); chloroform: methanol: ammonia (6: 4: 1)-(6); benzene: Ethyl acetate: acetone: 50% acetic acid: water (2: 1: 1)-(8); chloroform: methanol (14: 1)-(9); chloroform: methanol: Ammonia (8: 1.75: 0.25)-(10); chloroform: methanol: ammonia (6.5: 3.0: 0.5)-(11).
比旋光度は、AI−EPO旋光計により求めた。
元素分析は、Carlo−Erbaモデル1106分析器を用いて行った。
The specific rotation was obtained by an AI-EPO polarimeter.
Elemental analysis was performed using a Carlo-Erba model 1106 analyzer.
I.Boc-Pro-Gly-OEt. 8.3g(3.45mmol)のBoc−Pro−OHを50mlのCH2Cl2に溶解し、5℃に冷却した。その後、38.45mmol(5.38ml)のTEAを添加した。反応混合物を−25〜−30℃に冷却した。この温度で、38.45mmol(4.84ml)のクロロぎ酸イソブチルをピペットを用いて添加した。反応混合物温度を−18〜−20℃の範囲内に20分間維持した。同時に、5.92mlのTEAを含有する、75mlのクロロホルム中の5.9g(42.3mmol)の1.1倍過剰のHCl・H-Gly-OEtの溶液。この溶液を−25℃に冷却し、第1のフラスコにおける混合無水物の形成後、内容物を即座にエーテル溶液に注いだ。反応混合物を−10℃で1時間インキュベートし、その後、マグネチックスターラーで4℃で12時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、その後250mlの酢酸エチルを添加した。その後、酢酸エチル溶液を25mlの0.1N HClで3回、25mlのH2Oで3回、NaClの飽和溶液で1回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過して蒸発させた。残渣をP2O5/KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させた。
収率:10.2g(30.3mmol) 78.83%
Rf 0.5(7);0.862(8)
融点 68〜70℃
I. Boc-Pro-Gly-OEt. 8.3 g (3.45 mmol) of Boc-Pro-OH was dissolved in 50 ml of CH 2 Cl 2 and cooled to 5 ° C. After that, 38.45 mmol (5.38 ml) of TEA was added. The reaction mixture was cooled to -25 to -30.degree. At this temperature, 38.45 mmol (4.84 ml) isobutyl chloroformate was added using a pipette. The reaction mixture temperature was maintained in the range of -18 to -20.degree. C. for 20 minutes. At the same time, a solution of 5.9 g (42.3 mmol) 1.1-fold excess of HCl.H-Gly-OEt in 75 ml chloroform containing 5.92 ml TEA. The solution was cooled to -25.degree. C. and after formation of the mixed anhydride in the first flask, the contents were poured immediately into ether solution. The reaction mixture was incubated at -10.degree. C. for 1 hour and then stirred with a magnetic stirrer at 4.degree. C. for 12 hours. The reaction mixture is evaporated and then 250 ml of ethyl acetate are added. The ethyl acetate solution was then washed three times with 25 ml of 0.1 N HCl, three times with 25 ml of H 2 O and once with a saturated solution of NaCl. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. The residue was dried under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Yield: 10.2 g (30.3 mmol) 78.83%
Rf 0.5 (7); 0.862 (8)
Melting point 68-70 ° C
II. Boc-Pro-Gly-N 2 H 3 . 10.2gのBoc-Pro-Gly-OEt(30.3mmol)を80mlの無水メタノールに溶解し、4倍過剰、すなわち、5.88ml(121.2mmol)のヒドラジン水化物を添加した。この溶液を室温でマグネチックスターラーで12時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、その後エーテルで2回蒸発させた。その後、残渣にエーテル(〜5ml)を注ぎ、冷蔵庫に一晩放置した(より良い結晶化のために、シーディング剤を添加した)。析出した結晶をろ過し、フィルタを用いてエーテルで洗浄し、デシ
ケーターで乾燥させた。
収率:6.9g(20.79mmol) 68.62%
Rf 0.284(7);0.474(8);0.189(9)
融点 98〜100℃
II. Boc-Pro-Gly- N 2
Yield: 6.9 g (20.79 mmol) 68.62%
Rf 0.284 (7); 0.474 (8); 0.189 (9)
Melting point 98-100 ° C
III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. 40mlのDMF中に4.7g(14.6mmol)を含有するBoc-Pro-Gly-N2H3の溶液に、酢酸エチル中の58.4mmol(4倍過剰)の塩化水素を添加し、−20℃に冷却し、1.73mL(14.6mmol)の新しく蒸留した亜硝酸tert−ブチルを即座に添加した。その後、反応混合物を−5℃で30分間撹拌した。反応混合物を−40℃に冷却し、−10℃に冷却した4mLのDMF中の8.2mL(58.4mmol)のTEAの溶液を添加した。反応混合物の温度が−20℃に上昇したとき、20mlのDMFおよび2.14mlのTEAに、3.7g(15.3mmol)の1.05倍過剰のHCl・H-Pro-OBzlを添加した。その後、マグネチックスターラー
で24時間4℃で撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣を200mLの酢酸エチルに溶解し、20mlのH2Oで2回、20mlの10%ナトリウムKHSO4で3回、20mlのH2Oで3回、20mlの5%NaHCO3で3回、20mlのH2Oで3回洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。その後、蒸発させて、少量のエーテル(〜10mL)を残渣に添加した。その後、冷蔵庫に放置して結晶化させた。より良い生成物結晶化のために、シーディング剤を添加した。析出した結晶をろ過し、フィルタを用いて少量のエーテルで洗浄した。その後、デシケーターで乾燥させた。
収率:5.358g(11.65mmol) 79.92%
Rf 0.326(7);0.947(8);0.390(9)
融点 125〜126℃
[α]D 22=−101.18°(c=0.85;CH3OH)
元素分析:С62.89(62.73);N9.21(9.14);H7.52(7.24)
III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. A solution of Boc-Pro-Gly-N 2 H 3 containing 4.7 g (14.6 mmol) in 40 ml of DMF was added to 58.4 mmol of ethyl acetate ( (4-fold excess) of hydrogen chloride was added, cooled to -20 ° C, and 1.73 mL (14.6 mmol) of freshly distilled tert-butyl nitrite was added immediately. The reaction mixture was then stirred at -5 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was cooled to −40 ° C. and a solution of 8.2 mL (58.4 mmol) of TEA in 4 mL of DMF cooled to −10 ° C. was added. When the temperature of the reaction mixture rose to −20 ° C., 3.7 g (15.3 mmol) of 1.05 fold excess of HCl.H-Pro-OBzl was added to 20 ml of DMF and 2.14 ml of TEA. Thereafter, it was stirred at 4 ° C. for 24 hours with a magnetic stirrer. The reaction mixture was evaporated and the residue dissolved in ethyl acetate 200 mL, 2 times with H 2 O in 20ml, 3 times with 10% sodium KHSO 4 of 20ml, 3 times with H 2 O in 20ml, 5% NaHCO of 20ml Washed 3 times with 3 and 3 times with 20 ml of H 2 O. The ethyl acetate solution was dried by MgSO 4 and. Then it was evaporated and a small amount of ether (-10 mL) was added to the residue. Then, it was left to stand in a refrigerator for crystallization. A seeding agent was added for better product crystallization. The precipitated crystals were filtered and washed with a small amount of ether using a filter. It was then dried in a desiccator.
Yield: 5.358 g (11.65 mmol) 79.92%
Rf 0.326 (7); 0.947 (8); 0.390 (9)
Melting point 125-126 ° C
[Α] D 22 = −101.18 ° (c = 0.85; CH 3 OH)
Elemental analysis: С62.89 (62.73); N9.21 (9.14); H7.52 (7.24)
IV. TFA・H-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5.358g(11.65mmol)のBoc-Pro-Gly-Pro-OBzlを29.13mlの塩化メチレンに溶解した。その後、29.13mLのTFAを添加し、室温で45分間インキュベートし、無水エタノールで2回、ベンゼンで2回、エーテルで2回蒸発させ、ベンゼンに溶解した。その後、ヘキサンを上に注いだ。ヘキサンを傾瀉し、得られた物質をKOH、P2O5およびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:4.63g(9.7mmol) 98%
Rf 0.043(7);0.247(8);0.018(9)
IV. TFA.H -Pro-Gly-Pro-OBzl. 5.358 g (11.65 mmol) of Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl was dissolved in 29.13 ml of methylene chloride. Then 29.13 mL of TFA was added, incubated at room temperature for 45 minutes, evaporated twice with absolute ethanol, twice with benzene and twice with ether and dissolved in benzene. Then hexane was poured on. Hexane was decanted and the resulting material was dried under vacuum in a desiccator with KOH, P 2 O 5 and paraffin while the desiccant was changed several times.
Yield: 4.63 g (9.7 mmol) 98%
Rf 0.043 (7); 0.247 (8); 0.018 (9)
V. Boc-Arg(NO 2 )-Pro-Gly-Pro-OBzl.
3.09gのBoc-Arg (NO2)-OH(9.7mmol)を50mLのTHFおよび10ml
DMFに溶解し、2.07g(10.67mmol)のDCCを添加し、0℃に冷却し、40分間攪拌した。その後、TFA・H-Pro-Gly-Pro-OBzlの溶液を50mlのTHFおよ
び4.46ml(9.7mmol)のTEAに添加した。反応混合物を3日間攪拌した。DCM析出物をろ去し、溶液を真空下蒸発させ、その後、200mlのヘキサンを残渣に添加した。これを用いて、所望の生成物を油として分離し、油を500mLの酢酸エチルに溶解し、25mlの0.1N HClで3回、25mlのH2Oで3回、NaClの飽和溶液で1回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過して蒸発させた。残渣を酢酸エチルに溶解し、乾燥エーテルで析出させた。析出物をろ過し、P2O5/KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:4.76g(7.9mmol) 85%
Rf 0.44(1);0.8(11)
融点 108〜110℃
[α]D 22=−77.8°(c=0.5;CH3COOH)
V. Boc-Arg (NO 2 ) -Pro-Gly-Pro-OBzl.
3.09 g of Boc-Arg (NO 2 ) —OH (9.7 mmol) in 50 mL THF and 10 ml
Dissolved in DMF, added 2.07 g (10.67 mmol) of DCC, cooled to 0 ° C. and stirred for 40 minutes. Then, a solution of TFA · H-Pro-Gly-Pro-OBzl was added to 50 ml of THF and 4.46 ml (9.7 mmol) of TEA. The reaction mixture was stirred for 3 days. The DCM precipitate was filtered off and the solution was evaporated under vacuum, after which 200 ml of hexane was added to the residue. This is used to separate the desired product as an oil, which is dissolved in 500 mL of ethyl acetate, 3 times with 25 ml 0.1 N HCl, 3 times with 25 ml H 2 O, 1 with a saturated solution of NaCl. Washed twice. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. The residue was dissolved in ethyl acetate and precipitated with dry ether. The precipitate was filtered off and dried under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin, while changing the desiccant several times.
Yield: 4.76 g (7.9 mmol) 85%
Rf 0.44 (1); 0.8 (11)
Melting point 108 to 110 ° C
[Α] D 22 = -77.8 ° (c = 0.5; CH 3 COOH)
VI. Boc-Arg-Pro-Gly-Pro. 4.76g(6.5mmol)のBoc-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzlを100mlのメタノールに溶解し、その後、1ml 1N塩酸および4.67
gの触媒、すなわち、中性酸化アルミニウム上の10%酸化パラジウムを添加し、1at
m下室温で乾燥水素を流しつつ、水素付加を6時間行った。その後、触媒をろ去し、メタノールによりフィルタ上で洗浄した。プールされたろ液を蒸発乾固した。残渣を無水メタノールからエーテルにより析出した。その後、真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:4.23g(5.8mmol) 89%
Rf 0.125(4);0.57(6);0.37(5)
融点 123〜125℃
VI. Was dissolved Boc-Arg-Pro-Gly- Pro. Boc-Arg (NO 2) of 4.76g (6.5mmol) -Pro-Gly- Pro-OBzl in methanol 100 ml, then, 1 ml 1N hydrochloric acid and 4.67
g catalyst, ie 10% palladium oxide on neutral aluminum oxide,
Hydrogenation was carried out for 6 hours while flowing dry hydrogen at room temperature under m. The catalyst was then filtered off and washed on the filter with methanol. The pooled filtrate was evaporated to dryness. The residue was precipitated from anhydrous methanol with ether. Then, it was made to dry under vacuum and during that time, the desiccant was changed several times.
Yield: 4.23 g (5.8 mmol) 89%
Rf 0.125 (4); 0.57 (6); 0.37 (5)
Melting point 123-125 ° C
VII. Arg-Pro-Gly-Pro. 4.23g(5.8mmol)のBoc-Arg-Pro-Gly-Pro-OHを
ジオキサン中の10mlの2N塩酸に懸濁し、45分間室温でインキュベートした。その後、乾燥エーテルを添加し、析出物を乾燥エーテルによる傾潟により洗浄した。無水メタノールからエーテルにより再析出した。得られた析出物を7.5mlの30%エタノールに溶解し、酢酸/塩酸塩塩交換のためにAmberlyst A-21 (AcO-形態)カラムに適用した。
ペプチドを200mlの30%エタノールで溶出させ、真空下蒸発乾固させ、メタノールから無水エーテルにより析出した。
収率:3.69g(4.93mmol) 85%
Rf 0.287(4);0.145(5);0.338(14)
融点 120〜122℃
HPLC結果:カラム:Supercosil ABZ Plus、サイズ 4.6x250mm、流速
1mL/分、溶剤A:NH4H2PO4+H3PO4(50mM,pH2.8)、溶剤B:MeOH
勾配:0〜20分(0〜40%B)、保持時間 21.21分
Rf 0.24(6)
融点 151℃
[α]D 22=−65.0°(c=0.5 CH3COOH)
HPLC結果:カラム:Zorbax ODS d=4.6mm;t=35℃
流速 1mL/分;A=50mM NH4H2PO4(pH 2.5);B=A+MeOH(1:1);10〜60%B(25分以内)
保持時間 16.5分
VII. Arg-Pro-Gly-Pro. 4.23 g (5.8 mmol) of Boc-Arg-Pro-Gly-Pro-OH were suspended in 10 ml of 2N hydrochloric acid in dioxane and incubated for 45 minutes at room temperature. Thereafter, dry ether was added and the precipitate was washed by dry ether. It was reprecipitated from anhydrous methanol with ether. The resulting precipitate was dissolved in 30% ethanol 7.5ml, Amberlyst A-21 for the acetic acid / hydrochloride salt exchange (AcO - form) was applied to the column.
The peptide was eluted with 200 ml of 30% ethanol, evaporated to dryness under vacuum and precipitated from methanol with anhydrous ether.
Yield: 3.69 g (4.93 mmol) 85%
Rf 0.287 (4); 0.145 (5); 0.338 (14)
Melting point 120-122 ° C
HPLC result: Column: Supercosil ABZ Plus, size 4.6 × 250 mm, flow rate
1 mL / min, solvent A: NH 4 H 2 PO 4 + H 3 PO 4 (50 mM, pH 2.8), solvent B: MeOH
Gradient: 0 to 20 minutes (0 to 40% B), retention time 21.21 minutes Rf 0.24 (6)
Melting point 151 ° C
[Α] D 22 = -65.0 ° (c = 0.5 CH 3 COOH)
HPLC result: Column: Zorbax ODS d = 4.6 mm; t = 35 ° C.
Retention time 16.5 minutes
Pro-Arg-Pro-Gly-Proペンタペプチドの合成
図2に示す図に従った天然Lアミノ酸を用いたペプチド化学の古典的方法によりペプチド合成を行った。
Synthesis of Pro-Arg-Pro-Gly-Pro Pentapeptide Peptide synthesis was carried out by the classical method of peptide chemistry using native L amino acids according to the diagram shown in FIG.
初めに、Pro-Gly-Proトリペプチドを生産し、その後、N末端からのペプチド鎖の段階
的堆積によりペンタペプチドが得られた。合成では、混合無水物法、アジド法およびカルボジイミド法が用いられた。
Initially, Pro-Gly-Pro tripeptide was produced, and then pentapeptide was obtained by stepwise deposition of peptide chains from the N-terminus. In the synthesis, a mixed anhydride method, an azide method and a carbodiimide method were used.
次の溶媒系中でのクロマトグラフィーの移動率(Rl)値が示される。ブタノール:酢酸:水(4:1:1)−(1);クロロホルム:メタノール:アンモニア(6:4:1)−(2);アセトン:ベンゼン:酢酸(50:100:1)−(3);クロロホルム:メタノール(9:1)−(4);ヘキサン:アセトン(3:2)−(5);ブタノール:酢酸:ピリジン:水(30:6:20:24)−(6);クロロホルム:メタノール(14:1)−(7)。 The chromatographic transfer rate (Rl) values in the following solvent systems are indicated. Butanol: acetic acid: water (4: 1: 1)-(1); chloroform: methanol: ammonia (6: 4: 1)-(2); acetone: benzene: acetic acid (50: 100: 1)-(3) Chloroform: methanol (9: 1)-(4); hexane: acetone (3: 2)-(5); butanol: acetic acid: pyridine: water (30: 6: 20: 24)-(6); chloroform: Methanol (14: 1)-(7).
I. Boc-Pro-Gly-OEt. 8.3gのBoc-Pro(38.45mmol)を50mlのCH2Cl2に溶解し、+5℃に冷却し、38.45mmol(5.38ml)のTEAを添加した。反応混合物を−25〜−30℃に冷却した。この温度で、38.45mmol(4.84ml)のクロロぎ酸イソブチルをピペットを用いて添加した。反応混合物温度を−18〜−20℃の範囲内に20分間維持した。同時に、5.92mlのTEAを含有する、75mlのクロロホルム中の5.9g(42.3mmol)の1.1倍過剰のHCl・H-Gly-OEtの溶液。溶液を−25℃に冷却し、第1のフラスコ中での混合無水物の形成後、内容物を直ちにエーテル溶液に注いだ。反応混合物を−10℃で1時間インキュベートし、その後、マグネチックスターラーで4℃で12時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、250mlの酢酸エチルを添加した。酢酸エチル溶液を25mlの0.1N HClで3回、25ml H2Oで3回、NaClの飽和溶液で1回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過して蒸発させた。残渣をP2O5/KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させた。
収率:10.2g(30.3mmol) 78.83%
Rf 0.5(3);0.862(4)
I. Boc-Pro-Gly-OEt. 8.3 g Boc-Pro (38.45 mmol) was dissolved in 50 ml CH 2 Cl 2 , cooled to + 5 ° C. and 38.45 mmol (5.38 ml) TEA was added. Added. The reaction mixture was cooled to -25 to -30.degree. At this temperature, 38.45 mmol (4.84 ml) isobutyl chloroformate was added using a pipette. The reaction mixture temperature was maintained in the range of −18 to −20 ° C. for 20 minutes. At the same time, a solution of 5.9 g (42.3 mmol) 1.1-fold excess of HCl.H-Gly-OEt in 75 ml chloroform containing 5.92 ml TEA. The solution was cooled to -25.degree. C. and after formation of the mixed anhydride in the first flask, the contents were immediately poured into ether solution. The reaction mixture was incubated at −10 ° C. for 1 hour and then stirred with a magnetic stirrer at 4 ° C. for 12 hours. The reaction mixture was evaporated and 250 ml of ethyl acetate was added. The ethyl acetate solution was washed 3 times with 25 ml 0.1 N HCl, 3 times with 25 ml H 2 O and once with a saturated solution of NaCl. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. The residue was dried under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Yield: 10.2 g (30.3 mmol) 78.83%
Rf 0.5 (3); 0.862 (4)
II. Boc-Pro-Gly-N 2 H 3 . 10.2gのBoc-Pro-Gly-OEt(30.3mmol)を80mlの無水メタノールに溶解し、4倍過剰のヒドラジン水化物、すなわち、5.88ml(121.2mmol)を添加した。溶液を室温でマグネチックスターラーで12時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、その後、エーテルで2回蒸発させ、その後、エーテル(〜5ml)を残渣に注ぎ、冷蔵庫に一晩放置した(より良い結晶化のために、シーディング剤を添加した)。析出した結晶をろ過し、フィルタを用いてエーテルで洗浄し、デシケーターで乾燥させた。
収率:6.9g(20.79mmol) 68.62%
融点 98〜100℃
Rf 0.284(3);0.474(4);0.189(5)
II. Boc-Pro-Gly- N 2
Yield: 6.9 g (20.79 mmol) 68.62%
Melting point 98-100 ° C
Rf 0.284 (3); 0.474 (4); 0.189 (5)
III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.
酢酸エチル中の58.4mmol(4倍過剰)の塩化水素を、−20℃に冷却させた、40mlのDMF中に4.7g(14.6mmol)を含有するBoc-Pro-Gly-N2H3の溶液に添加し、1.73mL(14.6mmol)の新しく蒸留した亜硝酸tert−ブチルを即座に添加した。その後、反応混合物を−5℃で30分間攪拌した。反応混合物を−40℃に冷却し、−10℃に冷却した4mLのDMF中の8.2mL(58.4mmol)のTEAの溶液を添加した。反応混合物の温度が−20℃に上昇したとき、20mlのDMFおよび2.14mlのTEAに、3.7g(15.3mmol)の1.05倍過剰のHCl・H-Pro-OBzlを添加した。その後、マグネチックスターラーで4℃で24時間攪拌した
。反応混合物を蒸発させ、残渣を200mLの酢酸エチルに溶解し、20mlのH2Oで2回、20mlの10%ナトリウムKHSO4で3回、20mlのH2Oで3回、20mlの5%NAHCO3で3回、3mlのH2Oで3回洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。その後、蒸発させ、少量のエーテル(〜10mL)を残渣に添加した。その後、冷蔵庫に放置した。より良い生成物結晶化のために、シーディング剤を添加した。析出した結晶をろ過し、フィルタを用いて少量のエーテルで洗浄した。その後、デシケーターで乾燥させた。
収率:5.358g(11.65mmol) 79.92%
Rf 0.326(3);0.947(4);0.390(5)
融点 125〜126℃
[α]D 22=−101.2°(c=0.85;CH3OH)
元素分析:C62.89(62.73);N9.21(9.14);H7.52 (7.24)
III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.
Boc-Pro-Gly-N 2 H containing 4.7 g (14.6 mmol) in 40 ml DMF, cooled to −20 ° C., 58.4 mmol (4-fold excess) hydrogen chloride in ethyl acetate. To the solution of 3 , 1.73 mL (14.6 mmol) freshly distilled tert-butyl nitrite was added immediately. The reaction mixture was then stirred at -5 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was cooled to −40 ° C. and a solution of 8.2 mL (58.4 mmol) of TEA in 4 mL of DMF cooled to −10 ° C. was added. When the temperature of the reaction mixture rose to −20 ° C., 3.7 g (15.3 mmol) of 1.05 fold excess of HCl.H-Pro-OBzl was added to 20 ml of DMF and 2.14 ml of TEA. Then, it stirred at 4 degreeC with a magnetic stirrer for 24 hours. The reaction mixture is evaporated, the residue dissolved in ethyl acetate 200 mL, 2 times with H 2 O in 20 ml, 3 times with a 10% sodium KHSO 4 of 20 ml, 3 times with H 2 O in 20 ml, 5% of 20 ml NaHCO Washed 3 times with 3 and 3 times with 3 ml of H 2 O. The ethyl acetate solution was dried by MgSO 4 and. It was then evaporated and a small amount of ether (-10 mL) was added to the residue. Then it was left in the refrigerator. A seeding agent was added for better product crystallization. The precipitated crystals were filtered off and washed with a small amount of ether using a filter. It was then dried in a desiccator.
Yield: 5.358 g (11.65 mmol) 79.92%
Rf 0.326 (3); 0.947 (4); 0.390 (5)
Melting point 125-126 ° C
[Α] D 22 = -101.2 ° (c = 0.85; CH 3 OH)
Elemental analysis: C62.89 (62.73); N9.21 (9.14); H7.52 (7.24)
IV. TFA・H-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5.358g(11.65mmol)のBoc-Pro-Gly-Pro-OBzlを29.13mlの塩化メチレンに溶解し、29.13mLのTFAを添加し、室温で45分間インキュベートし、無水エタノールで2回、ベンゼンで2回、エーテルで2回蒸発させ、ベンゼンに溶解した。その後、ヘキサンを上に注いだ。ヘキサンを傾潟させ、得られた物質をP2O5/KOHおよびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させた。
収率:4.63g(9.7mmol) 98%
Rf 0.043(3);0.247(4);0.018(5)
IV. TFA H-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5.358 g (11.65 mmol) of Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl is dissolved in 29.13 ml of methylene chloride and 29.13 mL of TFA is added It was incubated at room temperature for 45 minutes, evaporated twice with absolute ethanol, twice with benzene, twice with ether and dissolved in benzene. Then hexane was poured on. Hexane was decanted and the resulting material was dried in a desiccator under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Yield: 4.63 g (9.7 mmol) 98%
Rf 0.043 (3); 0.247 (4); 0.018 (5)
V. Boc-Arg(NO 2 )-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3.09g(9.7mmol)のBoc-Arg (NO2)を50mlのTHFおよび10ml DMFに溶解し、その後、2.07g(10.67mmol)のDCCを添加し、0℃に冷却し、40分間攪拌した。TFA・H-Pro-Gly-Pro-OBzlの溶液を50mlのTHFおよび4.46ml(9.7mmol)のTEAに添加し
た。反応混合物を3日間攪拌した。DCM析出物をろ去し、溶液を真空下で蒸発させ、その後、200mlのヘキサンを残渣に添加した。これを用いて、所望の生成物を油として分離し、油を500mLの酢酸エチルに溶解し、25mlの0.1N HClで3回、mlのH2Oで3回、NaClの飽和溶液で1回洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させ、ろ過して蒸発させた。残渣をP2O5/KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させた。
収率:4.76g(7.9mmol) 85%
Rf 0.44(1);0.8(6)
融点 108〜110℃
V. Boc-Arg (NO 2) -Pro-Gly-Pro-OBzl. Boc-Arg of 3.09 g (9.7 mmol) of (NO 2) was dissolved in THF and 10 ml DMF in 50 ml, then, 2.07 g (10.67 mmol) of DCC was added, cooled to 0 ° C. and stirred for 40 minutes. A solution of TFA.H-Pro-Gly-Pro-OBzl was added to 50 ml of THF and 4.46 ml (9.7 mmol) of TEA. The reaction mixture was stirred for 3 days. The DCM precipitate was filtered off and the solution was evaporated under vacuum, after which 200 ml of hexane was added to the residue. This is used to separate the desired product as an oil, which is dissolved in 500 mL of ethyl acetate, 3 times with 25 ml 0.1 N HCl, 3 times with ml H 2 O and 1 with a saturated solution of NaCl. Washed twice. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated. The residue was dried under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Yield: 4.76 g (7.9 mmol) 85%
Rf 0.44 (1); 0.8 (6)
Melting point 108-110 ° C
VI. TFA-Arg(NO 2 )-Pro-Gly-Pro-OBzl. 4.76g(7.9mmol)のBoc-Arg (NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzlを20mlの塩化メチレンに溶解し、20mLのTFAを添加し、室温で45分間インキュベートし、無水エタノールで2回、ベンゼンで2回、エーテルで2回蒸発させ、その後ベンゼンに溶解した。その後、ヘキサンを上に注いだ。ヘキサンを傾潟させ、得られた物質をP2O5/KOHおよびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させた。
収率は定量的である。
Rf 0.16(1);0.27(6)
VI. The TFA-Arg (NO 2) -Pro -Gly-Pro-OBzl. Boc-Arg (NO 2) of 4.76g (7.9mmol) -Pro-Gly- Pro-OBzl was dissolved in 20ml of methylene chloride 20 mL of TFA was added, incubated at room temperature for 45 minutes, evaporated twice with absolute ethanol, twice with benzene, twice with ether and then dissolved in benzene. Hexane was then poured on top. Hexane was decanted and the resulting material was dried in a desiccator under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Yield is quantitative.
Rf 0.16 (1); 0.27 (6)
VII. Boc-Pro-Arg(NO 2 )-Pro-Gly-Pro-OBzl. 1.7g(7.9mmol)のBoc-Proを20mLのTHFに溶解し、1.07g(7.9mmol)のBTを添加し、0℃に冷却し、50mlのTHF中の1.8gのDCCを添加した。40分以内に、50mLのTHF中のTFA-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzl(7.9mmol)の溶液および1.1mL(7
.9mmol)のTEAを反応混合物に添加した。0℃で2時間攪拌し、さらに室温で2日間攪拌した。その後、DCMをろ去し、真空下で蒸発させて、500mLの酢酸エチルに溶解し、Boc-Pro-Arg(NO2)-Pro-Gly-Pro-OBzlと同様に処理した。
収率:4.07g(67.8%)
Rf 0.42(1);0.72(6);0.31(7)
融点 147〜148℃
VII. Boc-Pro-Arg ( NO 2) -Pro-Gly-Pro-OBzl. Was dissolved Boc-Pro of 1.7 g (7.9 mmol) in THF of 20 mL, BT of 1.07 g (7.9 mmol) Was cooled to 0 ° C. and 1.8 g DCC in 50 ml THF was added. Within 40 minutes, a solution of TFA-Arg (NO 2 ) -Pro-Gly-Pro-OBzl (7.9 mmol) in 50 mL THF and 1.1 mL (7
. 9 mmol) of TEA was added to the reaction mixture. The mixture was stirred at 0 ° C. for 2 hours and further at room temperature for 2 days. The DCM was then filtered off, evaporated in vacuo, dissolved in 500 mL of ethyl acetate and treated in the same way as Boc-Pro-Arg (NO 2 ) -Pro-Gly-Pro-OBzl.
Yield: 4.07 g (67.8%)
Rf 0.42 (1); 0.72 (6); 0.31 (7)
Melting point: 147-148 ° C
VIII. Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 4.07g(6.5mmol)を100mlのメタノールに溶解し、1mlの1N塩酸および0.85gの触媒、すなわち、中性酸化アルミニウム上の10%酸化パラジウムを添加し、1atm下室温で乾燥水素を流しつつ、水素
付加を6時間行った。その後、触媒をろ去し、メタノールによりフィルタ上で洗浄した。プールされたろ液を蒸発乾固させた。残渣を無水メタノールからエーテルにより析出した。
収率:3.02g(5.8mmol) 89%
Rf 0.125(1),0.57(2),0.37(6)
VIII. Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 4.07 g (6.5 mmol) is dissolved in 100 ml of methanol and 1 ml of 1 N hydrochloric acid and 0.85 g of catalyst, ie 10 on neutral aluminum oxide % Palladium oxide was added, and hydrogenation was performed for 6 hours while flowing dry hydrogen at room temperature under 1 atm. The catalyst was then filtered off and washed on the filter with methanol. The pooled filtrate was evaporated to dryness. The residue was precipitated from anhydrous methanol with ether.
Yield: 3.02 g (5.8 mmol) 89%
Rf 0.125 (1), 0.57 (2), 0.37 (6)
IX. Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 3.02g(5.8mmol)のBoc-Pro-Arg-Pro-Gly-Proをジオキサン中の10mlの2N塩酸に懸濁し、45分間室温でインキュベートした。
その後、乾燥エーテルを添加し、析出物を乾燥エーテルによる傾潟により洗浄した。無水メタノールからエーテルにより再析出した。得られた析出物を7.5mlの30%エタノールに溶解し、酢酸/塩酸塩塩交換のためにAmberlyst A-21 (AcO-形態)に適用した。ペ
プチドを200mlの30%エタノールで溶出させ、真空下蒸発乾固させ、メタノールから無水エーテルにより析出した。
収率:2.27g(75%)
Rf 0.2(2);0.1(6)
融点 180〜185℃
[α]D 20=−105°(c=0.4;CH3COOH)
アミノ酸組成対アルギニン:Pro 2.78(3);Gly 1.1(1)
HPLC結果:カラム:Supercosil ABZ Plus、サイズ 4.6x250mm、流速
1mL/分、溶離剤A:NH4H2PO4+H3PO4(50mM,pH2.8)、溶離剤B:MeOH
勾配:0〜20分(0〜40%B)、保持時間 10.13分
IX. Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 3.02 g (5.8 mmol) of Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro were suspended in 10 ml of 2 N hydrochloric acid in dioxane and incubated for 45 minutes at room temperature .
Thereafter, dry ether was added, and the precipitate was washed by tidal lagoon with dry ether. It was reprecipitated from anhydrous methanol with ether. The resulting precipitate was dissolved in 30% ethanol 7.5ml, Amberlyst A-21 for the acetic acid / hydrochloride salt exchange - is applied to (AcO form). The peptide was eluted with 200 ml of 30% ethanol, evaporated to dryness under vacuum and precipitated from methanol with anhydrous ether.
Yield: 2.27 g (75%)
Rf 0.2 (2); 0.1 (6)
Melting point 180-185 ° C
[Α] D 20 = −105 ° (c = 0.4; CH 3 COOH)
Amino acid composition versus arginine: Pro 2.78 (3); Gly 1.1 (1)
HPLC result: Column: Supercosil ABZ Plus, size 4.6 × 250 mm, flow rate
1 mL / min, eluent A: NH 4 H 2 PO 4 + H 3 PO 4 (50 mM, pH 2.8), eluent B: MeOH
Gradient: 0 to 20 minutes (0 to 40% B), retention time 10.13 minutes
Pro-Gly-Proトリペプチドの合成
Pro-Gly-Proトリペプチドの合成を、図3に示す図に従って実施した。Pro-Gly-Proトリペプチドの合成は、現代の保護基および溶液中ペプチド結合形成の方法を用いて実施した。ペプチド結合形成のために、PivClを用いた混合無水物法を使用した。tert−ブチルオキシカルボニル保護(Boc)をアミノ基の保護のために用い、ベンジルエステル(OBzl)をカルボキシル基の保護のために補充した。ペプチド鎖伸長に対しては段階的なアプローチが用いられた。
Synthesis of Pro-Gly-Pro tripeptide
The synthesis of Pro-Gly-Pro tripeptide was performed according to the diagram shown in FIG. The synthesis of Pro-Gly-Pro tripeptide was performed using modern protecting groups and methods of peptide bond formation in solution. A mixed anhydride method with PivCl was used for peptide bond formation. Tert-butyloxycarbonyl protection (Boc) was used for protection of the amino group and benzyl ester (OBzl) was supplemented for protection of the carboxyl group. A stepwise approach was used for peptide chain elongation.
Lアミノ酸の誘導体を合成に用いた。溶液の蒸発は、40℃で真空蒸発器を用いて行った。Boethius装置で求められた融点は、較正なしで示される。 L amino acid derivatives were used in the synthesis. Evaporation of the solution was carried out at 40 ° C. using a vacuum evaporator. The melting point determined on the Boethius device is shown without calibration.
得られた化合物の同一性を、Silufolシリカゲル被覆プレート(チェコ共和国)上でTL
Cにより試験した。物質は、ニンヒドリンおよび(または)o−トリジンの溶液をプレー
トに噴霧することにより検出された。次の溶媒系中でのクロマトグラフィーの移動率(Rf)値が示される。(酢酸エチル:アセトン:50%酢酸:水(2:1:1);ベンゼン:エタノール(8:2);クロロホルム:メタノール:アンモニア(6:4:1);クロロホルム:メタノール:酢酸(42:7:1);アセトン:ベンゼン:酢酸(50:100:1);クロロホルム:メタノール(9:1);ヘキサン:アセトン(3:2);ブタノール:酢酸:水(4:1:1);ブタノール:酢酸:ピリジン:水(30:6:20:24);ヘキサン:酢酸エチル(4:1);クロロホルム:メタノール:アンモニア(8:1.75:0.25);(イソプロパノール:ぎ酸:水)(20:5:1);(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(7:2.5:0.5);メタノール。比旋光度は、AI−EPO旋光計により求めた。)元素分析は、Carlo−Erbaモデル1106分析器を用いて行った。
The identity of the compound obtained was determined on TL on Silufol silica gel coated plates (Czech Republic).
Tested by C. Substances were detected by spraying a solution of ninhydrin and / or o-tolidine onto the plate. Chromatographic transfer rate (Rf) values in the following solvent systems are shown. (Ethyl acetate: acetone: 50% acetic acid: water (2: 1: 1); benzene: ethanol (8: 2); chloroform: methanol: ammonia (6: 4: 1); chloroform: methanol: acetic acid (42: 7 Acetone: benzene: acetic acid (50: 100: 1); chloroform: methanol (9: 1); hexane: acetone (3: 2); butanol: acetic acid: water (4: 1: 1); butanol: Acetic acid: pyridine: water (30: 6: 20: 24); hexane: ethyl acetate (4: 1); chloroform: methanol: ammonia (8: 1.75: 0.25); (isopropanol: formic acid: water) (20: 5: 1); (chloroform: methanol: ammonia) (7: 2.5: 0.5); methanol. Specific rotation was determined by AI-EPO polarimeter. It was carried out using a Carlo-Erba model 1106 analyzer.
I. Boc-Pro-Gly-OHの生産
1. 10.75g(50mmol)のBoc-Proを150mlのアセトニトリルに溶解
し、−5℃に冷却し、その後、7.7ml(50mmol)のトリエチルアミン(TEA)を溶液に添加した。マグネチックスターラーで攪拌しつつ、−20℃に冷却した。6.
8ml(55mmol)の塩化ピバロイル(PivCl)を冷却された溶液に添加し、−10℃で20分間マグネチックスターラーで攪拌し、その後、−30℃に冷却し、その後、予め冷却されたGlyの溶液を添加した。同時に、Gly溶液を調製した。
I. Production of Boc-Pro-Gly-OH 10.75 g (50 mmol) of Boc-Pro was dissolved in 150 ml of acetonitrile and cooled to −5 ° C., after which 7.7 ml (50 mmol) of triethylamine (TEA) was added to the solution. It cooled to -20 degreeC, stirring with a magnetic stirrer. 6.
Add 8 ml (55 mmol) of pivaloyl chloride (PivCl) to the cooled solution and stir with a magnetic stirrer at -10 ° C for 20 minutes, then cool to -30 ° C and then pre-chilled solution of Gly Was added. At the same time, a Gly solution was prepared.
2. 4.5gのGly(60mmol、1.2倍過剰)を35mlの水および60mlのアセトニトリルに溶解し、8.4ml(60mmol)のトリエチルアミンを添加した。混合物を−10℃に冷却し、20分後に第1のフラスコ中の溶液に添加した。反応混合物を−10℃で1時間インキュベートし、マグネチックスターラーで18〜20℃で2時間攪拌した。反応混合物を回転式蒸発器で蒸発させた。約50mLの水を残渣に添加した。水溶液を3倍過剰のNaHSO4(24.84g)でpH=3に酸性化し、100mlの酢酸エチルで5倍に抽出した。プールされた酢酸エチル溶液をH2O(50mL)、KHSO4(50mL)の10%溶液、H2O(50mL)、および飽和NaCl(50mL)で洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。乾燥させた酢酸エチルをろ過し、蒸発させた。乾燥エーテルを残渣に添加した。エーテルをフラスコに添加すると、生成物が析出され、これをろ過し、フィルタを用いて乾燥エーテルで洗浄した。得られた物質をKOH、P2O5およびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させ、その間、デシケーターを数回交換した。
生成物 M.W.272.3
収率:5.97g(21.74mmol);(43.5%)
融点 70℃
Rf 0.863(アセトン−ベンゼン−酢酸)(50:100:1);
0.746(ベンゼン−エタノール)(8:2);0.903(クロロホルム:メタノール)(9:1);
0.847(酢酸エチル:アセトン:50%酢酸:水)(2:1:1)
2. 4.5 g Gly (60 mmol, 1.2-fold excess) was dissolved in 35 ml water and 60 ml acetonitrile and 8.4 ml (60 mmol) triethylamine was added. The mixture was cooled to −10 ° C. and added to the solution in the first flask after 20 minutes. The reaction mixture was incubated at −10 ° C. for 1 hour and stirred with a magnetic stirrer at 18-20 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was evaporated on a rotary evaporator. Approximately 50 mL of water was added to the residue. The aqueous solution was acidified to pH = 3 with a 3-fold excess of NaHSO 4 (24.84 g) and extracted 5-fold with 100 ml of ethyl acetate. The pooled ethyl acetate solution H 2 O (50mL), 10 % solution of
Product M.I. W. 272.3
Yield: 5.97 g (21.74 mmol); (43.5%)
Melting point 70 ° C
Rf 0.863 (acetone-benzene-acetic acid) (50: 100: 1);
0.746 (benzene-ethanol) (8: 2); 0.903 (chloroform: methanol) (9: 1);
0.847 (ethyl acetate: acetone: 50% acetic acid: water) (2: 1: 1)
II. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzlの生産
1. 5.97g(21.74mmol)のBoc-Pro-Gly-OHを100mlのアセトニトリルに溶解し、−5℃に冷却した。その後、1.1倍過剰(3.35ml、23.9mmol)のトリエチルアミン(TEA)を溶液に添加し、マグネチックスターラーで攪拌しつつ−20℃に冷却した。1.1倍過剰(2.34ml、23.9mmol)の塩化ピバロイル(PivCl)を冷却させた溶液に添加し、−10℃で20分間マグネチックスターラーで攪拌し、その後、−30℃に冷却し、その後、予め冷却されたHCl・Pro-OBzlの
溶液を添加した。同時に、HCl・Pro-OBzlを調製した。
II. Production of Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl 5.97 g (21.74 mmol) of Boc-Pro-Gly-OH were dissolved in 100 ml of acetonitrile and cooled to -5.degree. Thereafter, a 1.1-fold excess (3.35 ml, 23.9 mmol) of triethylamine (TEA) was added to the solution and cooled to −20 ° C. with magnetic stirring. Add a 1.1-fold excess (2.34 ml, 23.9 mmol) of pivaloyl chloride (PivCl) to the cooled solution and stir with a magnetic stirrer at -10 ° C for 20 minutes, then cool to -30 ° C. Thereafter, a pre-cooled solution of HCl.Pro-OBzl was added. At the same time, HCl.Pro-OBzl was prepared.
2. 6.3gのHCl・Pro-OBzl(26.1mmol、1.2倍過剰)を50mlのア
セトニトリルに溶解し、4.0ml(28.71mmol、1.1倍過剰)のトリエチルアミンを添加した。混合物を−10℃に冷却し、20分後第1のフラスコ中の溶液に添加した。反応混合物を−10℃で1時間インキュベートし、マグネチックスターラーで18〜20℃で2時間攪拌した。反応混合物を蒸発させた。蒸発させた残渣に300mlの酢酸エチルを添加した。酢酸エチル溶液をH2O(25mLで3回)、10%溶液KHSO4(25mlで3回)、H2O(25mlで3回)、5%NaHCO3(25mlで3回)、H2O(25mLで3回)、およびNaClの飽和溶液(25mLで1回)で洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。乾燥させた酢酸エチルをろ過し、蒸発させた。約100μmの乾燥エーテルを残渣に添加した。フラスコにエーテルを添加すると、生成物が析出され、これをろ過し、フィルタを用いて乾燥エーテルで洗浄した。得られた物質をKOH、P2O5およびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
生成物 M.W.459.82
収率:8.12g(17.66mmol);(81.23%)
融点 125〜126℃
Rf 0.326(アセトン:ベンゼン:酢酸)(50:100:1)
0.390(ヘキサン:アセトン)(3:2)
0.947(クロロホルム:メタノール)(9:1)
0.716(メタノール)
0.620(ベンゼン:エタノール)(8:2)
2. 6.3 g of HCl Pro-OBzl (26.1 mmol, 1.2 fold excess) was dissolved in 50 ml of acetonitrile and 4.0 ml (28.71 mmol, 1.1 fold excess) of triethylamine was added. The mixture was cooled to −10 ° C. and added to the solution in the first flask after 20 minutes. The reaction mixture was incubated at −10 ° C. for 1 hour and stirred with a magnetic stirrer at 18-20 ° C. for 2 hours. The reaction mixture was evaporated. To the evaporated residue was added 300 ml of ethyl acetate. Ethyl acetate solution: H 2 O (3 × 25 mL), 10% solution KHSO 4 (3 × 25 ml), H 2 O (3 × 25 ml), 5% NaHCO 3 (3 × 25 ml), H 2 O (3 × 25 mL) and washed with a saturated solution of NaCl (1 × 25 mL). The ethyl acetate solution was dried by MgSO 4 and. The dried ethyl acetate was filtered and evaporated. About 100 μm of dry ether was added to the residue. When ether was added to the flask, the product precipitated and was filtered and washed with dry ether using a filter. The resulting material was dried under vacuum in a desiccator with KOH, P 2 O 5 and paraffin while changing the desiccant several times.
Product M.I. W. 459.82
Yield: 8.12 g (17.66 mmol); (81.23%)
Melting point 125-126 ° C
Rf 0.326 (acetone: benzene: acetic acid) (50: 100: 1)
0.390 (hexane: acetone) (3: 2)
0.947 (chloroform: methanol) (9: 1)
0.716 (methanol)
0.620 (benzene: ethanol) (8: 2)
III. Boc-Pro-Gly-Pro-OHの生産
8g(17.4mmol)のBoc-Pro-Gly-Pro-OBzlを100mlのメタノールに溶解し、マグネチックスターラーで攪拌しつつ、0.5mlのCH3COOHおよびパラジウムブラッ
クを添加し、水素を2時間流した。溶液をろ過し、蒸発させ、ベンゼンで3回、酢酸エチルで2回蒸発させた。その後、アセトンからエーテルヘキサンにより析出し、フラスコに形成された析出物をP2O5/KOHおよびパラフィンによりデシケーターで乾燥させた。
生成物 M.W.369.39
収率:6.3g(17.05mmol) 98%
融点 99〜100℃
Rf 0.560(クロロホルム−メタノール)(9:1)
0.812(クロロホルム−メタノール−酢酸)(42:7:1)
0.187(アセトン:ベンゼン:酢酸)(50:100:1)
0.164(ヘキサン:アセトン)(3:2)
III. Production of Boc-Pro-Gly-Pro-OH 8 g (17.4 mmol) of Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl was dissolved in 100 ml of methanol and stirred with a magnetic stirrer while adding 0.5 ml of CH. 3 COOH and palladium black were added and hydrogen was flowed for 2 hours. The solution was filtered and evaporated, evaporated three times with benzene and twice with ethyl acetate. Thereafter, precipitated with ether hexane from acetone, the precipitate formed in the flask was dried in a desiccator with P 2 O 5 / KOH and paraffin.
Product M.I. W. 369.39
Yield: 6.3 g (17.05 mmol) 98%
Melting point 99-100 ° C
Rf 0.560 (chloroform-methanol) (9: 1)
0.812 (chloroform-methanol-acetic acid) (42: 7: 1)
0.187 (acetone: benzene: acetic acid) (50: 100: 1)
0.164 (hexane: acetone) (3: 2)
IV. Pro-Gly-Proの生産
40.6mlの塩化メチレンおよび40.6mlのTFAを6.0g(16.24mmol)のBoc-Pro-Gly-Pro-OHに添加し、室温で45分間インキュベートした。保護基の除去後、溶液を無水メタノールで2回、ベンゼンで2回、エーテルで2回蒸発させた。アセトンからエーテルにより析出した。残渣をP2O5、KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させた。乾燥させた生成物を無水MeOHから乾燥ジエチルエーテルにより再析出した。
生成物 M.W.381.39
収率:5.6g(14.72mmol)(90.62%)
IV. Production of Pro-Gly-Pro 40.6 ml of methylene chloride and 40.6 ml of TFA were added to 6.0 g (16.24 mmol) of Boc-Pro-Gly-Pro-OH and incubated for 45 minutes at room temperature. . After removal of the protecting group, the solution was evaporated twice with anhydrous methanol, twice with benzene and twice with ether. Precipitated from acetone with ether. The residue was dried under vacuum with P 2 O 5 , KOH and paraffin. The dried product was reprecipitated from anhydrous MeOH with dry diethyl ether.
Product M.I. W. 381.39
Yield: 5.6 g (14.72 mmol) (90.62%)
TFA・Pro-Gly-Pro-OHの得られた析出物を10mlの30%エタノールに溶解し、その
後、トリフルオロアセテートの酢酸塩への交換のために、25mLのAmberlyst A-21 (CH3COO-)イオン−交換樹脂を添加し、マグネチックスターラーで45分間攪拌した。その後、150mlの30%エタノールで洗浄し、真空下蒸発乾固させ、無水メタノールから乾燥ジエチルエーテルにより析出した。得られた析出物をろ去し、P2O5、KOHおよびパラフィンにより真空下デシケーターで乾燥させ、その間、乾燥材を数回交換した。
生成物 M.W.328.34
収率:4.54g(13.84mmol)(94%)
融点 143〜145℃
[α]D 22 −31.5°(cl,MeOH)
Rf 0.59(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(6:4:1)
0.52(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(4:4.5:1.5)
0.524(エタノール:アンモニア)(7:3)
The resulting precipitate of TFA-Pro-Gly-Pro-OH is dissolved in 10 ml of 30% ethanol and then 25 ml of Amberlyst A-21 (CH 3 COO) for the exchange of trifluoroacetate to acetate. - ) Ion-exchange resin was added and stirred for 45 minutes with a magnetic stirrer. Thereafter, it was washed with 150 ml of 30% ethanol, evaporated to dryness under vacuum, and precipitated from anhydrous methanol with dry diethyl ether. The resulting precipitate was filtered off and dried in a desiccator under vacuum with P 2 O 5 , KOH and paraffin, while the desiccant was changed several times.
Product M.I. W. 328.34
Yield: 4.54 g (13.84 mmol) (94%)
Melting point: 143-145 ° C
[Α] D 22 -31.5 ° (cl, MeOH)
Rf 0.59 (chloroform: methanol: ammonia) (6: 4: 1)
0.52 (chloroform: methanol: ammonia) (4: 4.5: 1.5)
0.524 (ethanol: ammonia) (7: 3)
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheヘキサペプチドの合成
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheヘキサペプチドの合成を図4に示す図に従って行った。
Synthesis of Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe hexapeptide
The synthesis of Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe hexapeptide was performed according to the diagram shown in FIG.
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheヘキサペプチドの合成は、現代の保護基および溶液中ペプチ
ド結合形成の方法を用いて実施した。ペプチド結合形成のために、TBA塩法、活性化エステル法、カルボジイミド法および混合無水物法を用いた。段階的およびブロック的アプローチの両方が用いられた。
The synthesis of Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe hexapeptide was performed using modern protecting groups and methods of peptide bond formation in solution. A TBA salt method, an activated ester method, a carbodiimide method and a mixed anhydride method were used for peptide bond formation. Both staged and block approaches were used.
Thr-Lys-Pro-Arg-Proペンタペプチドの合成
Thr-Lys-Pro-Arg-Proペンタペプチドの合成を図5に示す図に従って行った。
Synthesis of Thr-Lys-Pro-Arg-Pro pentapeptide
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro pentapeptide was synthesized according to the diagram shown in FIG.
Thr-Lys-Pro-Arg-Proペンタペプチドの合成は、現代の保護基および溶液中ペプチド結
合形成の方法を用いて実施した。ペプチド結合形成のために、TBA塩法、活性化エステル法およびカルボジイミド法を用いた。段階的およびブロック的アプローチの両方が用いられた。
The synthesis of Thr-Lys-Pro-Arg-Pro pentapeptide was performed using modern protecting groups and methods of peptide bond formation in solution. TBA salt method, activated ester method and carbodiimide method were used for peptide bond formation. Both staged and block approaches were used.
Thr-Lysジペプチドの合成
Thr-Lysジペプチドの合成は、図6に示す図に従って行われた。
Synthesis of Thr-Lys dipeptide
The synthesis of Thr-Lys dipeptide was performed according to the diagram shown in FIG.
Thr-Lysジペプチドの合成は、現代の保護基および溶液中ペプチド結合形成の方法を用
いて実施した。ペプチド結合形成のために、TBA塩法が用いられた。
The synthesis of Thr-Lys dipeptide was performed using modern protecting groups and methods of peptide bond formation in solution. The TBA salt method was used for peptide bond formation.
実施例7〜9に記載されるペプチドの合成のために、保護および遊離のLアミノ酸の両方の誘導体が用いられた。ペプチド合成に用いられた溶媒は、対応して無水化された。Milichrome-A02マイクロカラム液体クロマトグラフィーシステムを用いた高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によりペプチド均質性を試験した。合成されたペプチドは、ブルカー質量分光計((登録商標)ブルカー・ダルトニクス社)を用いた質量分析法により特徴化された。 For the synthesis of the peptides described in Examples 7-9, both protected and free L amino acid derivatives were used. The solvent used for peptide synthesis was correspondingly dehydrated. Peptide homogeneity was tested by high performance liquid chromatography (HPLC) using a Milichrome-A02 microcolumn liquid chromatography system. The synthesized peptides were characterized by mass spectrometry using a Bruker Mass Spectrometer (® Bruker Daltonics).
Thr-Lys-Pro-Pheテトラペプチドの合成
Thr-Lys-Pro-Pheテトラペプチドの合成を図7に示す図に従って実施した。
Synthesis of Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptide
The Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptide was synthesized according to the diagram shown in FIG.
Thr-Lys-Pro-Pheテトラペプチドの合成は、現代の保護基および溶液中ペプチド結合形
成の方法を用いて実施した。ペプチド結合形成のために、TBA塩法および活性化エステル法を用いた。ペプチド鎖伸長に対する段階的アプローチが用いられた。
The synthesis of the Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptide was carried out using modern protecting groups and methods of peptide bond formation in solution. The TBA salt method and the activated ester method were used for peptide bond formation. A stepwise approach to peptide chain elongation was used.
保護および遊離の両方のLアミノ酸の誘導体が合成のために用いられた。40℃で真空蒸発器を用いて、溶液の蒸発を行った。Boethius装置で求められた融点は、較正なしで示される。得られた化合物の同一性を、Silufolシリカゲル被覆プレート(チェコ共和国)上
でTLCにより試験した。物質は、ニンヒドリンおよび(または)o−トリジンの溶液を
プレートに噴霧することにより検出された。次の溶媒系中でのクロマトグラフィーの移動率(Rf)値が示される。(ブタノール:酢酸:水)(4:1:1);(ベンゼン−エタノール)(8:2);(クロロホルム:メタノール)(9:1);(イソプロパノール:ぎ酸:水)(20:5:1);(クロロホルム−メタノール−酢酸)(42:7:1);(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(8:1.75:0.25);(アセトン−ベンゼン−酢酸)(50:100:1);(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(6:4:1);(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(44.5:1.5);(ブタノール: 酢酸:ピリジン:水)(30:6:20:24)。
Both protected and free derivatives of L-amino acids were used for the synthesis. The solution was evaporated using a vacuum evaporator at 40 ° C. The melting point determined on the Boethius device is shown without calibration. The identity of the resulting compounds was tested by TLC on Silufol silica gel coated plates (Czech Republic). Substances were detected by spraying a solution of ninhydrin and / or o-tolidine onto the plate. Chromatographic transfer rate (Rf) values in the following solvent systems are shown. (Butanol: acetic acid: water) (4: 1: 1); (benzene-ethanol) (8: 2); (chloroform: methanol) (9: 1); (isopropanol: formic acid: water) (20: 5: 1); (Chloroform-methanol-acetic acid) (42: 7: 1); (Chloroform: methanol: ammonia) (8: 1. 75: 0.25); (Acetone-benzene-acetic acid) (50: 100: 1) (Chloroform: methanol: ammonia) (6: 4: 1); (chloroform: methanol: ammonia) (44.5: 1.5); (butanol: acetic acid: pyridine: water) (30: 6: 20) 24).
I. Z-Lys(Boc)-Pro-OHの生産
TBA(98ml)の13%溶液を46.32mmol(5.34g)のProに添加し
、エタノールで2回、エタノール/ベンゼン混合物で2回、ベンゼンで2回蒸発させた。300mlの無水酢酸エチルを添加した。反応混合物を0℃に冷却し、23.16mmol(12.66g)の先に合成したZ-Lys (Boc)-OPfpを添加し、1時間マグネチックスターラーで攪拌した。反応物質を蒸発させ、40mlの水を蒸発残渣に添加した。水溶液を80mlのエーテルで3回洗浄した。エーテルで洗浄後、水溶液をクエン酸でpH3に酸性化した。酸性化後、水溶液を40mlアリコートの酢酸エチルで3回抽出した。抽出後のプールされた酢酸エチルを20mlの水で3回、20mlのKHSO4の10%溶液で3回、20mlの水で3回洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。その後、ろ過し、回転式蒸発器で蒸発させた。得られた物質を酢酸エチルからヘキサンにより析出した。ヘキサンを傾潟させ、得られた物質をKOH、P2O5およびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を繰返し交換した。
収率:9.68g(20.26mmol);(87.51%)
融点 76〜77℃
Rf 0.705(ブタノール:酢酸:水)(4:1:1);
0.560(ベンゼン−エタノール)(8:2);
0.476(クロロホルム:メタノール)(9:1);
0.813(イソプロパノール:ぎ酸:水)(20:5:1);
0.297(アセトン−ベンゼン−酢酸)(50:100:1)
I. Production of Z-Lys (Boc) -Pro-OH A 13% solution of TBA (98 ml) was added to 46.32 mmol (5.34 g) of Pro, twice with ethanol, twice with an ethanol / benzene mixture, with benzene. Evaporated twice. 300 ml of anhydrous ethyl acetate was added. The reaction mixture was cooled to 0 ° C., 23.16 mmol (12.66 g) of the previously synthesized Z-Lys (Boc) -OPfp was added, and the mixture was stirred for 1 hour with a magnetic stirrer. The reaction mass was evaporated and 40 ml water was added to the evaporation residue. The aqueous solution was washed three times with 80 ml of ether. After washing with ether, the aqueous solution was acidified to
Yield: 9.68 g (20.26 mmol); (87.51%)
Melting point 76-77 ° C
Rf 0.705 (butanol: acetic acid: water) (4: 1: 1);
0.560 (benzene-ethanol) (8: 2);
0.476 (chloroform: methanol) (9: 1);
0.813 (isopropanol: formic acid: water) (20: 5: 1);
0.297 (acetone-benzene-acetic acid) (50: 100: 1)
I. H-Lys(Boc)-Pro-OHの製造
9.68g(20.26mmol)のZ-Lys(Boc)-Pro-OHに300mlの無水メタノー
ル、2mlの酢酸、およびパラジウムブラックを添加し、1atm下室温で乾燥水素を流しつつ、水素付加を8時間行った。その後、触媒をろ去し、メタノールによりフィルタ上で洗浄した。プールされたろ液を蒸発乾固した。残渣を無水メタノールからエーテルにより析出した。その後、真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:6.38g(18.58mmol);(91.87%)
融点 98〜99℃
Rf 0.110(クロロホルム−メタノール−酢酸)(42:7:1);
0.166(ブタノール:酢酸:水)(4:1:1);
0.235(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(8:1.75:0.25);
0.494(イソプロパノール:ぎ酸:水)(20:5:1)(2:1:1)
I. Preparation of H-Lys (Boc) -Pro-OH To 9.68 g (20.26 mmol) of Z-Lys (Boc) -Pro-OH was added 300 ml of anhydrous methanol, 2 ml of acetic acid, and palladium black, under 1 atm. Hydrogenation was carried out for 8 hours while flowing dry hydrogen at room temperature. The catalyst was then filtered off and washed on the filter with methanol. The pooled filtrate was evaporated to dryness. The residue was precipitated from anhydrous methanol with ether. Then, it was made to dry under vacuum and during that time, the desiccant was changed several times.
Yield: 6.38 g (18.58 mmol); (91.87%)
Melting point 98-99 ° C
Rf 0.110 (chloroform-methanol-acetic acid) (42: 7: 1);
0.166 (butanol: acetic acid: water) (4: 1: 1);
0.235 (chloroform: methanol: ammonia) (8: 1.75: 0.25);
0.494 (isopropanol: formic acid: water) (20: 5: 1) (2: 1: 1)
III. Boc-Thr-Lys-(Boc)-Pro-OHの製造
TBA(39.4ml)の13%溶液を18.58mmol(6.38g)のLys (Boc)-Pro-OHに添加し、エタノールで2回、エタノール/ベンゼン混合物で2回、ベンゼンで2回蒸発させた。250mlの無水酢酸エチルを添加し、反応混合物を0℃に冷却し、9.2mmol(3.74g)の先に合成したBoc-Thr-OPfpを添加し、1時間マグネチックスターラーで攪拌した。反応物質を蒸発させ、蒸発残渣に40mlの水を添加した。水溶液を80mlのエーテルで3回洗浄した。エーテルで洗浄後、水溶液を18.58mmol(3.95g)のクエン酸でpH3に酸性化した。酸性化後、水溶液を40mlアリコートの酢酸エチルで3回抽出した。抽出後のプールされた酢酸エチルを20mlの水で3回、20mlのKHSO4の10%溶液で3回、20mlの水で3回洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。
III. Preparation of Boc-Thr- Lys- (Boc) -Pro-OH A 13% solution of TBA (39.4 ml) is added to 18.58 mmol (6.38 g) of Lys (Boc) -Pro-OH and
その後、ろ過し、回転式蒸発器で蒸発させた。得られた物質を酢酸エチルからヘキサンにより析出した。ヘキサンを傾潟させ、得られた物質をKOH、P2O5およびパラフィンによりデシケーターで真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:3.32g(6.1mmol);(66.26%)
融点 105〜107℃
Rf 0.297(アセトン−ベンゼン−酢酸)(50:100:1);
0.234(クロロホルム:メタノール)(9:1);
0.560(ベンゼン−エタノール)(8:2)
It was then filtered and evaporated on a rotary evaporator. The resulting material was precipitated from ethyl acetate with hexane. Hexane was decanted and the resulting material was dried under vacuum in a desiccator with KOH, P 2 O 5 and paraffin while the desiccant was changed several times.
Yield: 3.32 g (6.1 mmol); (66.26%)
Melting point 105-107 ° C
Rf 0.297 (acetone-benzene-acetic acid) (50: 100: 1);
0.234 (chloroform: methanol) (9: 1);
0.560 (benzene-ethanol) (8: 2)
IV. Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-Phe-OHの生産
1. Boc-Thr-Lys(Boc)-Pro-OSuの生産
3.53mmol(0.38g)のヒドロキシスクシンイミドを50mlの無水酢酸エチル中の1.66g(3.05mmol)のBoc-Thr-Lys(Boc)-Proに添加し、マグネチックスターラーで攪拌しつつ、得られた溶液を0℃に冷却した。その後、0.76g(3.53mmol)DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)を添加し、室温でマグネチックスターラーで2時間攪拌した。反応の停止後、得られた反応混合物をろ去し、析出物を廃棄した。得られた溶液に200mlの無水酢酸エチルを添加した。プールされた酢酸エチルを20mlのNaClの飽和溶液で2回、20mlの10%ナトリウムKHSO4で2回、20mlのNaClの飽和溶液で2回、20mlの5%MaHCO3で2回、20mlのNaClの飽和溶液で2回洗浄した。酢酸エチル溶液をMgSO4により乾燥させた。その後、ろ過し、回転式蒸発器で蒸発させた。得られた物質を酢酸エチルからエーテルおよびヘキサンで析出した。析出物をろ過し、KOH、P2O5およびパラフィンにより真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:1.52g(2.37mmol) 77.74%
Rf 0.560(ベンゼン−エタノール)(8:2);0.457(クロロホルム:メタノール)(9:1)
IV. Production of Boc-Thr-Lys (Boc) -Pro-Phe-OH Production of Boc-Thr-Lys (Boc) -Pro-OSu 3.53 mmol (0.38 g) of hydroxysuccinimide in 1.66 g (3.05 mmol) of Boc-Thr-Lys (Boc) in 50 ml of anhydrous ethyl acetate The resulting solution was cooled to 0 ° C. while adding to -Pro and stirring with a magnetic stirrer. Then, 0.76 g (3.53 mmol) DCC (dicyclohexyl carbodiimide) was added, and it stirred by magnetic stirrer for 2 hours at room temperature. After termination of the reaction, the resulting reaction mixture was filtered off and the precipitate was discarded. To the resulting solution was added 200 ml of anhydrous ethyl acetate. Twice pooled ethyl acetate with a saturated solution of NaCl in 20ml, 2 times with 10% sodium KHSO 4 of 20ml, 2 times with a saturated solution of NaCl in 20ml, 2 times with 5% MaHCO 3 of 20ml, NaCl in 20ml Washed twice with a saturated solution of. The ethyl acetate solution was dried by MgSO 4 and. It was then filtered and evaporated on a rotary evaporator. The resulting material was precipitated from ethyl acetate with ether and hexane. The precipitate was filtered and dried under vacuum with KOH, P 2 O 5 and paraffin, while changing the desiccant several times.
Yield: 1.52 g (2.37 mmol) 77.74%
Rf 0.560 (benzene-ethanol) (8: 2); 0.457 (chloroform: methanol) (9: 1)
2. 調製後、1.52g(2.37mmol)のBoc-Thr-Lys (Boc)-Pro-OSuを25
mlのジメチルホルムアミドに溶解し、25mlのジメチルホルムアミド中に0.392g(2.37mmol)のL−Pheを含有する、調製された溶液に添加した。溶液を室温でマグネチックスターラーで攪拌した。反応混合物を回転式蒸発器で蒸発させ、ベンゼンからエーテルにより析出した。析出物をろ過し、P2O5/KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:1.03g(1.64mmol) 69.0%
Rf 0.063(イソプロパノール:ぎ酸:水)(20:5:1)(2:1:1)
0.745(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(8:1.75:0.25)
2. After the preparation, 1.52 g (2.37 mmol) of Boc-Thr-Lys (Boc) -Pro-OSu was added to 25
Dissolved in ml dimethylformamide and added to the prepared solution containing 0.392 g (2.37 mmol) L-Phe in 25 ml dimethylformamide. The solution was stirred with a magnetic stirrer at room temperature. The reaction mixture was evaporated in a rotary evaporator and precipitated from benzene with ether. The precipitate was filtered off and dried under vacuum with P 2 O 5 / KOH and paraffin, while changing the desiccant several times.
Yield: 1.03 g (1.64 mmol) 69.0%
Rf 0.063 (isopropanol: formic acid: water) (20: 5: 1) (2: 1: 1)
0.745 (chloroform: methanol: ammonia) (8: 1.75: 0.25)
V. H-Thr-Lys-Pro-Phe-OHの生産
1.03g(1.64mmol)のBoc-Thr-Lys (Boc)-Pro-Phe-OHを8.2mLの塩化メチレンおよび8.2mlのTFAに添加し、その後、混合物を室温で45分間インキュベートし、保護基の除去後、溶液を無水メタノールで2回、ベンゼンで2回、エーテルで2回蒸発させた。メタノールからエーテルにより析出した。残渣をP2O5 KOHおよびパラフィンにより真空下乾燥させた。得られた析出物を5mlの30%エタノールに溶解し、酢酸/塩酸塩塩交換のためにAmberlyst A-21 (AcO-形態)カラムに適用した。ペプ
チドを100mlの30%エタノールで溶出し、真空下蒸発乾固させ、無水メタノールから無水エーテルにより析出した。得られた析出物をろ過し、P2O5、KOHおよびパラフィンにより真空下デシケーターで乾燥させ、その間、乾燥剤を数回交換した。
収率:0.7g(1.43mmol)(87%)
融点 129〜131℃
Rf 0.201(ブタノール:酢酸:ピリジン:水)(30:6:20:24);
0.156(クロロホルム:メタノール:アンモニア)(4:4.5:1.5)
V. Production of H-Thr-Lys-Pro-Phe-OH 1.03 g (1.64 mmol) of Boc-Thr-Lys (Boc) -Pro-Phe-OH into 8.2 mL of methylene chloride and 8.2 ml of TFA After that, the mixture was incubated at room temperature for 45 minutes and after removal of the protecting group, the solution was evaporated twice with anhydrous methanol, twice with benzene and twice with ether. Precipitation from methanol with ether. The residue was dried under vacuum with P 2 O 5 KOH and paraffin. The resulting precipitate was dissolved in 30% ethanol 5ml, Amberlyst A-21 for the acetic acid / hydrochloride salt exchange (AcO - form) was applied to the column. The peptide was eluted with 100
Yield: 0.7 g (1.43 mmol) (87%)
Melting point: 129-131 ° C
Rf 0.201 (butanol: acetic acid: pyridine: water) (30: 6: 20: 24);
0.156 (chloroform: methanol: ammonia) (4: 4.5: 1.5)
実施例1〜7に記載した、ペプチド配列のクロマトグラフィーおよび質量分析計による分析を表2に示す。 The chromatographic and mass spectrometric analysis of the peptide sequences described in Examples 1-7 is shown in Table 2.
表3は、合成ペプチドの分離についての勾配形状を示す。 Table 3 shows the gradient shape for the separation of synthetic peptides.
ファルマコフォア位置の同定
ファルマコフォアを同定するために、親ペプチドSelankのフラグメント、Thr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; Pro-Arg-Pro-Gly-Proを合成し、関連する前
臨床モデルを用いて有効性試験を生体内で行なった(ロードシス試験)。
Identification of Pharmacophore Position In order to identify the pharmacophore, a fragment of the parent peptide Selank, Thr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; Pro-Arg-Pro -Gly-Pro was synthesized and tested for efficacy in vivo using the relevant preclinical model (Lordosis test).
我々は、雌ラットの性行動に関連して、100μg/ラットの用量で、Thr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; Pro-Arg-Pro-Gly-Proからなるペプチドの群の
有効性を研究した。性的に活動的な雄と直接接触した、またはこのような接触が不可能であったときの、卵巣摘出され、ホルモンで刺激された雌において性行動を記録した。監視中、Thr-Lys-Proペプチドは、雌における交尾に好意的な行動(proceptive behavior)の強さを14±4から29±6の行為に増加させたことが認められた(p=0.028、ウィルコクソン検定)。雌におけるロードシス反応に対する効果も同様の傾向を有しており(p=0.09)、Thr-Lys-Proペプチドの作用下でのロードシスの数は、0.73±0
.12から0.97±0.12に増加した。これらの結果は、Thr-Lys-Proペプチド作用
を背景とした性的意欲の強化を示している。効果は特異的であり、適切な行動状況下で表される。ロードシスのモデルにおけるThr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; およびPro-Arg-Pro-Gly-Proのペプチドの有効性研究の結果を表4に示す。
We determined that, at a dose of 100 μg / rat, Thr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; Pro-Arg-Pro- at a dose of 100 μg / rat in relation to the female rat's sexual behavior. The effectiveness of the group of peptides consisting of Gly-Pro was studied. Sexual behavior was recorded in ovariectomized, hormone-stimulated females who were in direct contact with sexually active males or when such contact was not possible. During monitoring, it was observed that the Thr-Lys-Pro peptide increased the strength of the proceptive behavior in females from 14 ± 4 to 29 ± 6 (p = 0.0). 028, Wilcoxon test). The effect on lordosis response in females has a similar tendency (p = 0.09), and the number of lordosis under the action of Thr-Lys-Pro peptide is 0.73 ± 0.
. It increased from 12 to 0.97 ± 0.12. These results indicate an increase in sexual motivation behind the Thr-Lys-Pro peptide action. The effects are specific and are expressed under appropriate behavioral conditions. Table 4 shows the results of efficacy studies on peptides of Thr-Lys; Thr-Lys-Pro; Pro-Gly-Pro; Arg-Pro-Gly-Pro; and Pro-Arg-Pro-Gly-Pro in the Rhodes model Show.
ファルマコフォア試験
ファルマコフォアを試験するために、ファルマコフォアに基づくペプチド、すなわち、一般式A-Thr-Lys-Pro-B-C-D-Xに対応する、Thr-Lys-Proトリペプチド、Thr-Lys-Pro-Arg
およびThr-Lys-Pro-Pheテトラペプチド、Thr-Lys-Pro-Arg-Proペンタペプチド、ならびにThr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheヘキサペプチドを合成し、関連する前臨床モデルを用いて有効
性試験を生体内で行なった(ロードシス試験)。
Pharmacophore Test To test pharmacophores, Pharmacophore-based peptides, ie, Thr-Lys-Pro tripeptide, Thr-Lys-Pro, corresponding to the general formula A-Thr-Lys-Pro-BCDX. -Arg
And Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptide, Thr-Lys-Pro-Arg-Pro pentapeptide, and Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe hexapeptide synthesized and effective using relevant preclinical models Sex tests were performed in vivo (Lodesis test).
我々は、雌ラットの性行動に関連して、100μg/ラットの用量で、Thr-Lys-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro; およびThr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheからなるペプチドの群の有効性を研究した。性的に活動的な雄と直接接触した、またはこのような接触が不可能であったときの、卵巣摘出され、ホルモンで刺激された雌において性行動を記録した。監視中、Thr-Lys-Pro、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro、およびThr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheを含
む群からのペプチドは、雌における交尾に好意的な行動の強さを14±4から26±4〜36±6の行為に増加させたことが認められた(p=0.028、ウィルコクソン検定)。同時に、Thr-Lys-Pro-ArgおよびThr-Lys-Pro-Pheは、雌の交尾に好意的な行動(proceptive behavior)の強さに影響を及ぼさず、ロードシスの数を増加させず、Thr-Lys-Pro-ArgおよびThr-Lys-Pro-Pheテトラペプチドの基本的パラメータは、陰性コントロールのレ
ベルに留まっている。雌におけるロードシス反応に対する効果も同様の傾向を有していた(p=0.09)。パートナーの直接的な接触が無くても、ペプチド作用は表された。結果は、Thr-Lys-Pro、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro、Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheのペプチド作用を
背景とした性的意欲の強化と、Thr-Lys-Pro-ArgおよびThr-Lys-Pro-Pheテトラペプチドにおける性的意欲効果の欠如を示している。効果は特異的であり、適切な行動状況下で表される。ロードシスのモデルにおけるペプチドThr-Lys-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg; Thr-Lys-Pro-Phe; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Pheの有効性研究の結果を表5に示
す。
We found that, at a dose of 100 μg / rat, Thr-Lys-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro; and Thr-Lys-Pro in relation to the sexual behavior of female rats. The efficacy of the group of peptides consisting of -Arg-Pro-Phe was studied. Sexual behavior was recorded in ovariectomized and hormonally stimulated females when in direct contact with sexually active males or when such contact was not possible. During monitoring, peptides from the group containing Thr-Lys-Pro, Thr-Lys-Pro-Arg-Pro, and Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe have strong mating-favoring behavior in females Was observed to increase from 14 ± 4 to 26 ± 4 to 36 ± 6 (p = 0.028, Wilcoxon test). At the same time, Thr-Lys-Pro-Arg and Thr-Lys-Pro-Phe do not affect the strength of the proceptive behavior in female matings, and do not increase the number of lordosis, The basic parameters of the Lys-Pro-Arg and Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptide remain at the level of the negative control. The effect on the rhodocis reaction in females had a similar tendency (p = 0.09). The peptide action was manifested even without direct contact of the partners. The results show that sexual motivation is enhanced by the peptide action of Thr-Lys-Pro, Thr-Lys-Pro-Arg-Pro, and Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe, and Thr-Lys-Pro- FIG. 3 shows the lack of sexual motivation effects in Arg and Thr-Lys-Pro-Phe tetrapeptides. The effects are specific and are expressed under appropriate behavioral conditions. Efficacy of the peptide Thr-Lys-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg; Thr-Lys-Pro-Phe; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro; Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe in a model of Rhodosis The results of the sex study are shown in Table 5.
産業上の利用可能性
発明は、生化学の分野に関し、特に、非常に高い活性を示し、障害が生じた器官において自然治癒を刺激することの可能なペプチドを生産するための方法に関する。特に、発明は、治療の経過の期間を短縮し、薬剤のコストを低下しつつ、性的機能の刺激および性的機能障害の処置のための手法の範囲を拡大することを可能にする。
Industrial applicability
The invention relates to the field of biochemistry and in particular to a method for producing peptides that exhibit very high activity and are capable of stimulating natural healing in damaged organs. In particular, the invention makes it possible to expand the range of techniques for stimulating sexual function and treating sexual dysfunction while reducing the duration of the course of therapy and reducing the cost of the drug.
Claims (11)
Thr-Lys-Pro-X
(ここにおいて、XはC末端OH、OCH 3 、NH 2 である)
を有するペプチドを含む医薬組成物。 A pharmaceutical composition for stimulating sexual or reproductive functions in a mammal in need stimulation of sexual or reproductive function, one general formula:
Thr-Lys-Pro-X
(Wherein X is C-terminal OH, OCH 3 , NH 2 )
A pharmaceutical composition comprising a peptide having
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-X
(ここにおいて、XはC末端OH、OCH 3 、NH 2 である)
を有するペプチドを含む医薬組成物。 General formula:
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-X
(Wherein X is C-terminal OH, OCH 3 , NH 2 )
A pharmaceutical composition comprising a peptide having
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe-X
(ここにおいて、XはC末端OH、OCH 3 、NH 2 である)
を有するペプチドを含む医薬組成物。 General formula:
Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Phe-X
(Wherein X is C-terminal OH, OCH 3 , NH 2 )
A pharmaceutical composition comprising a peptide having
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