JP6546147B2 - Method for quantitative analysis of neocotalanol - Google Patents
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Description
本発明は、ネオコタラノールの定量分析方法、及びその定量分析用内部標準物質としてのマルトース等の化合物の使用に関する。 The present invention relates to a method for the quantitative analysis of neocotalanol and the use of compounds such as maltose as internal standard substances for the quantitative analysis.
チオ糖スルホニウム塩化合物は、糖尿病、腎症等に対する治療効果を有することが知られている（特許文献１及び２参照）。中でも、チオ糖スルホニウム塩化合物の一種であるネオコタラノールは、治療効果が高いため、近年注目を浴びている。 Thiosugar sulfonium salt compounds are known to have a therapeutic effect on diabetes, nephropathy and the like (see Patent Documents 1 and 2). Among them, neocotalanol, which is a kind of thiosugar sulfonium salt compound, has attracted attention in recent years because of its high therapeutic effect.
現状、ネオコタラノールを含むチオ糖スルホニウム塩化合物を定量する分析方法としては、LC-MSを用いた絶対検量線法（特許文献３参照）及びキャピラリー電気泳動法（非特許文献１参照）が知られている。 At present, as an analysis method for quantifying a thiosugar sulfonium salt compound containing neocotalanol, an absolute calibration curve method (see Patent Document 3) and a capillary electrophoresis method (see Non-patent Document 1) using LC-MS are known. It is done.
LC-MSは高感度ではあるが、HPLC等と比較して定量精度が低いことや煩雑性（機種毎のスペックによって異なるイオン化効率を考慮する必要がある、マトリックス効果の排除に適切な希釈率や前処理法の設定が必要である等）といった課題があることに加えて、高額機器でもあり、容易に利用できる方法ではない。
キャピラリー電気泳動を用いた方法については、食品を用いた定量が報告されているが、各対象物質を完全分離ピークとして検出されておらず、その定量精度に課題がある。
Although LC-MS has high sensitivity, it has low quantitative accuracy and complexity compared to HPLC etc. (It is necessary to consider ionization efficiency that differs depending on the specifications of each model, and appropriate dilution ratio to eliminate matrix effect In addition to the problem that the setting of the pretreatment method is required, etc., it is also an expensive apparatus and not an easy-to-use method.
Regarding methods using capillary electrophoresis, quantification using food has been reported, but each target substance is not detected as a completely separated peak, and there is a problem in the accuracy of the quantification.
よって、本発明が解決しようとする課題は、ネオコタラノールを精度よく、かつ、簡便に定量することができる分析法を提供することである。 Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide an analysis method capable of quantifying neocotalanol accurately and easily.
本発明の要旨は以下のとおりである。 The gist of the present invention is as follows.
（１）マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物を内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法である。 (1) Quantitative analysis of neocotalanol in a sample by liquid chromatography using a compound selected from the group consisting of maltitol, sucrose, maltose, lactose, trehalose, laminaribiose, cellobiose and gentiobiose as an internal standard substance It is a method.
（２）液体クロマトグラフィーにおけるカラムとして陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いる、（１）記載の方法である。 (2) The method according to (1), wherein a column packed with an anion exchange resin is used as a column in liquid chromatography.
（３）液体クロマトグラフィーにおける移動相として水酸化ナトリウムを用いる、（１）又は（２）記載の方法である。 (3) The method according to (1) or (2), wherein sodium hydroxide is used as a mobile phase in liquid chromatography.
（４）試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としてのマルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物の使用である。 (4) The use of a compound selected from the group consisting of maltitol, sucrose, maltose, lactose, trehalose, laminaribiose, cellobiose and gentiobiose as an internal standard substance for quantitative analysis of neocotalanol in a sample.
本発明によれば、試料溶液中のネオコタラノールを精度よく、かつ、簡便に定量することができる。 According to the present invention, neocotalanol in a sample solution can be quantified accurately and easily.
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、具体的には、以下の構成を有する。
マルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物、好ましくはマルトースを内部標準物質として用いる液体クロマトフラフィーにより、試料中のネオコタラノールを定量分析する方法。
The present invention was made in order to solve the above-mentioned subject, and, specifically, has the following composition.
Quantitative analysis of neocotalanol in the sample by liquid chromatography using a compound selected from the group consisting of maltitol, sucrose, maltose, lactose, trehalose, laminaribiose, cellobiose and gentiobiose, preferably maltose as internal standard substance how to.
液体クロマトグラフィーにおけるカラムには陰イオン交換樹脂を充填したカラムを用いることが好ましい。陰イオン交換樹脂の官能基としては、４級アルキルアミン、４級アルカノールアミン、４級アンモニウム塩、４級アルカノールアンモニウム塩等が挙げられる。 It is preferable to use a column packed with anion exchange resin as the column in liquid chromatography. Examples of functional groups of the anion exchange resin include quaternary alkylamines, quaternary alkanolamines, quaternary ammonium salts, quaternary alkanol ammonium salts and the like.
液体クロマトグラフィーにおける移動相としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いることができる。これらの中でも水酸化ナトリウムを用いることが好ましい。また、移動相は、上記塩基性物質以外に公知の各種添加剤を含有していてもよい。 As a mobile phase in liquid chromatography, an aqueous solution of a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or sodium acetate can be used. Among these, it is preferable to use sodium hydroxide. The mobile phase may also contain various known additives in addition to the basic substance.
更に、本発明は、試料中のネオコタラノールの定量分析用内部標準物質としてのマルチトール、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースからなる群より選択される化合物、好ましくはマルトースの使用に関する。 Furthermore, the present invention provides a compound selected from the group consisting of maltitol, sucrose, maltose, lactose, trehalose, laminaribiose, cellobiose and gentiobiose as an internal standard substance for quantitative analysis of neocotalanol in a sample, preferably For the use of maltose.
以下、具体的態様を参照して、本発明を説明する。部、％は、他に断りのない限り、質量部、質量％を表す。本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではない。 The invention will now be described with reference to specific embodiments. Parts and% represent parts by mass and% by mass unless otherwise noted. The present invention is not limited to the following specific embodiments.
例１．内部標準物質としてマルトースを用いたネオコタラノールの定量分析結果
１．使用試薬及び装置
１−１．試薬
以下の試薬を用いた。
・標準物質：ネオコタラノール（純度96.3％）
・内部標準物質：マルトース一水和物（99.9+%HPLC、生化学用, 和光純薬工業株式会社製)
・超純水（0.22 μmフィルターろ過した比抵抗値18MΩ以上のもの）
・1 M塩酸（容量分析用、和光純薬工業株式会社製）
・50%NaOH水溶液（d=1.525、精密分析用、和光純薬工業株式会社製）
・陽イオン交換カラム担体：TOYOPEARL（登録商標） SP-650M （東ソー株式会社製）
・Heガス（移動相内への炭酸ガス混入防止）
Example 1. Results of quantitative analysis of neocotalanol using maltose as internal standard substance Use reagent and device 1-1. Reagents The following reagents were used.
・ Standard substance: Neocotalanol (purity 96.3%)
Internal standard substance: maltose monohydrate (99.9 +% HPLC, for biochemistry, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ Ultrapure water (0.22 μm filter-filtered with a resistivity of 18 MΩ or more)
・ 1 M hydrochloric acid (for volumetric analysis, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ 50% NaOH aqueous solution (d = 1.525, for precision analysis, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
-Cation exchange column carrier: TOYOPEARL (registered trademark) SP-650M (manufactured by Tosoh Corporation)
・ He gas (preventing carbon dioxide mixture in mobile phase)
１−２．装置
使用した装置は、以下のとおりである。
・電子天秤AB204-S（メトラー・トレド株式会社製）
・圧力調整器（Heガス用）
・ボルテックスミキサー
・遠心分離機：KUBOTA 7780II（久保田商事株式会社製）
・分析装置 ：Dionex（商標） ICS-3000（Thermo Scientific社製）
分析カラム ：Dionex（商標） CarboPac（商標） PA1（4.0×250mm）
（Thermo Scientific社製）
ガードカラム ：Dionex（商標） CarboPac（商標） PA1G（4.0×50mm）
（Thermo Scientific社製）
カラム恒温槽 ：TC
ポンプ ：シングルポンプモジュールSP-グラジエント
オートサンプラー：Dionex（商標） AS-AP（Thermo Scientific社製）
検出器 ：電気化学検出器（作用電極;Au、参照電極;AgCl）
1-2. Equipment The equipment used is as follows.
Electronic balance AB204-S (manufactured by METTLER TOLEDO Co., Ltd.)
・ Pressure regulator (for He gas)
Vortex mixer Centrifuge: KUBOTA 7780 II (made by Kubota Shoji Co., Ltd.)
・ Analyzer: DionexTM ICS-3000 (made by Thermo Scientific)
Analytical column: Dionex (TM) CarboPac (TM) PA1 (4.0 x 250 mm)
(Made by Thermo Scientific)
Guard column: Dionex (TM) CarboPac (TM) PA1G (4.0 x 50 mm)
(Made by Thermo Scientific)
Column thermostat: TC
Pump: Single pump module SP-Gradient Autosampler: DionexTM AS-AP (manufactured by Thermo Scientific)
Detector: Electrochemical detector (working electrode; Au, reference electrode; AgCl)
２．前処理法
２−１．前処理用試料調製
試料として、ネオコタラノール含有食品（0.239 mg/g）を用いた。
（１）スパチュラを用いて、15 mL容遠沈管に食品200 mg を電子天秤にて量りとった。
（２）超純水（8 mL）を添加し、ボルテックスミキサーにて撹拌・分散させ、均一溶液とした。
（３）均一溶液を遠心分離（15,000 rpm/5分間/20℃）後、予め準備した15 mL容遠沈管に上清を回収した。
上記操作にて得られた上清を「前処理用試料」とした。
2. Pretreatment method 2-1. Sample Preparation for Pretreatment Neocotalanol-containing food (0.239 mg / g) was used as a sample.
(1) Using a spatula, 200 mg of food was weighed into a 15 mL centrifuge tube with an electronic balance.
(2) Ultrapure water (8 mL) was added, and the mixture was stirred and dispersed by a vortex mixer to obtain a uniform solution.
(3) The homogeneous solution was centrifuged (15,000 rpm / 5 minutes / 20 ° C.), and the supernatant was collected in a 15 mL centrifuge tube prepared in advance.
The supernatant obtained by the above-mentioned operation is referred to as "pretreatment sample".
２−２．前処理カラム調整
２−２−１．カラム担体微粒子除去
（１）担体（TOYOPEARL（登録商標） SP-650M（東ソー株式会社製）、250 mL、使用時までは20％エタノールにて保存）に超純水を適宜加えながら撹拌し2 L容ビーカーに全て移した。
（２）全体が2 Lになるまで加水した後、撹拌均一化した。
（３）90分程度静置後、上澄み（微粒子を含む部分）を除去した。
（４）操作（２）〜（３）を3回繰り返した。
上記操作にて得られた担体を以下の処理に使用した。
2-2. Preparation column adjustment 2-2-1. Column carrier fine particle removal (1) Carrier (TOYOPEARL (registered trademark) SP-650M (made by Tosoh Corp.), 250 mL, store in 20% ethanol until use) while stirring, while adding ultrapure water appropriately The whole was transferred to a volume beaker.
(2) After water was added until the whole became 2 L, stirring and homogenization were carried out.
(3) After standing for about 90 minutes, the supernatant (portion containing fine particles) was removed.
(4) Operations (2) to (3) were repeated three times.
The carrier obtained by the above operation was used for the following treatment.
２−２−２．カラム充填
（１）エコノカラム（商標）（バイオラッド社製、1×10cm）を設置した。
（２）カラムに超純水（3 mL）を添加した。
（３）２−２−１の担体に超純水を適量加え、均一に分散した後、パスツールピペットを用いてカラムに添加した。
（４）高さ2cmになるよう充填した。
2-2-2. Column packing (1) Econo column (trademark) (manufactured by Bio-Rad, 1 × 10 cm) was installed.
(2) Ultrapure water (3 mL) was added to the column.
(3) An appropriate amount of ultrapure water was added to the carrier 2-2-1, dispersed uniformly, and then added to the column using a Pasteur pipette.
(4) It filled so that it might become height 2 cm.
２−２−３．洗浄
２−２−２で得られたカラムに超純水（20 mL）を通液し、移動相を水に置換した。
2-2-3. Washing Ultrapure water (20 mL) was passed through the column obtained in 2-2-2, and the mobile phase was replaced with water.
２−２−４．平衡化
（１）10 mL容メスシリンダーを用いて、1 M塩酸（5 mL）及び超純水（5 mL）を50 mL容ビーカーに分注した。均一に撹拌し、0.5M塩酸を調製した。
（２）２−２−３後のカラムに0.5M 塩酸（8 mL）を通液した。
（３）次いで、超純水（8 mL）を通液し、移動相を水に置換した。
上記操作を実施したものを「前処理カラム」として使用した。
2-2-4. Equilibration (1) Using a 10 mL measuring cylinder, 1 M hydrochloric acid (5 mL) and ultrapure water (5 mL) were dispensed into a 50 mL beaker. The mixture was uniformly stirred to prepare 0.5 M hydrochloric acid.
(2) 0.5 M hydrochloric acid (8 mL) was passed through the column after 2-2-3.
(3) Next, ultrapure water (8 mL) was passed to replace the mobile phase with water.
What carried out the above operation was used as a "pretreatment column".
２−３．前処理操作
（１）「前処理カラム」に「前処理用試料」全量を供した。
（２）全量通液後、超純水（8 mL）通液により不要部分を溶出させた。
（３）1 M塩酸（3.5 mL）及び超純水（46.5 mL）を100 mL容ビーカーに分注した。均一に撹拌し、0.07M 塩酸を調製した。
（４）その後、0.07M 塩酸（8 mL）を通液し、ネオコタラノールを回収した。この時、10 mL容メスフラスコに回収した。
（５）加水し、10 mL溶液とした後、よく撹拌して均一溶液とした。
（６）これを0.20 μmフィルター処理し、ろ液を得た。
上記操作にて得られたろ液を「試験溶液」として用いた。
2-3. Pretreatment Procedure (1) The entire amount of "pretreatment sample" was applied to the "pretreatment column".
(2) After passing all of the solution, unnecessary portions were eluted by passing of ultra pure water (8 mL).
(3) 1 M hydrochloric acid (3.5 mL) and ultrapure water (46.5 mL) were dispensed into a 100 mL beaker. Stirring uniformly, 0.07 M hydrochloric acid was prepared.
(4) Then, 0.07 M hydrochloric acid (8 mL) was passed to recover neocotalanol. At this time, it was collected in a 10 mL volumetric flask.
(5) After adding water to make a 10 mL solution, the solution was well stirred to obtain a uniform solution.
(6) This was treated with a 0.20 μm filter to obtain a filtrate.
The filtrate obtained by the above operation was used as a "test solution".
３．分析前準備
３−１．標準溶液の調製
（１）ネオコタラノール（10 mg）を10 mL容メスフラスコに正確に量りとった。
（２）超純水を用い10 mLまでメスアップした後、均一に撹拌し、1,000 μg/mL標準溶液を作製した。
（３）1,000 μg/mL標準溶液を基準液とし、希釈系列（1、2、5、10及び20 μg/mL）を作製した。
上記操作にて得られた溶液（1、2、5、10及び20 μg/mL）を「標準溶液」として用いた。
3. Preparation before analysis 3-1. Preparation of Standard Solution (1) Neocotalanol (10 mg) was accurately weighed in a 10 mL volumetric flask.
(2) After measuring up to 10 mL using ultrapure water, the solution was uniformly stirred to prepare a 1,000 μg / mL standard solution.
(3) A 1,000 μg / mL standard solution was used as a standard solution to prepare dilution series (1, 2, 5, 10 and 20 μg / mL).
The solutions (1, 2, 5, 10 and 20 μg / mL) obtained by the above operation were used as “standard solutions”.
３−２．内部標準溶液の調製
（１）マルトース1水和物（10 mg）を10 mL容メスフラスコに正確に量りとった。
（２）超純水を用い10 mLまでメスアップした後、均一に撹拌し、1,000 μg/mL内部標準溶液を作製した。
（３）1,000 μg/mL内部標準溶液を基準液とし、1及び10 μg/mLを作製した。
上記操作にて得られた溶液（1及び10 μg/mL）を「内部標準溶液」として用いた。
3-2. Preparation of internal standard solution (1) Maltose monohydrate (10 mg) was accurately weighed in a 10 mL volumetric flask.
(2) After measuring up to 10 mL using ultrapure water, the solution was uniformly stirred to prepare a 1,000 μg / mL internal standard solution.
(3) A 1,000 μg / mL internal standard solution was used as a reference solution to prepare 1 and 10 μg / mL.
The solutions (1 and 10 μg / mL) obtained by the above operation were used as “internal standard solutions”.
３−３．検量線作成用試料の調製
（１）2 mL容エッペンチューブに各標準溶液（1、2、5、10及び20 μg/mL）を0.5 mLずつ分注した。
（２）これに内部標準溶液（1 μg/mL）を0.5 mLずつ添加した。
（３）ボルテックスミキサーにて均一に撹拌した。
上記操作にて得られた5サンプルを「検量線作成用試料」として用いた。
3-3. Preparation of sample for preparation of calibration curve (1) 0.5 mL of each standard solution (1, 2, 5, 10 and 20 μg / mL) was dispensed into a 2 mL Eppendorf tube.
(2) To this was added an internal standard solution (1 μg / mL) in 0.5 mL portions.
(3) The mixture was uniformly stirred by a vortex mixer.
Five samples obtained by the above operation were used as "samples for preparing a calibration curve".
３−４．分析試料の調製
（１）2 mL容エッペンチューブに２−３で調製した試験溶液（0.5 mL）を分注した。
（２）（１）で得た溶液に３−２で調製した10 μg/mL内部標準溶液（0.5 mL）を添加した。
（３）ボルテックスミキサーにて均一に撹拌した。
上記操作にて得られた均一溶液を「分析試料」として用いた。
3-4. Preparation of Analysis Sample (1) The test solution (0.5 mL) prepared in 2-3 was dispensed into a 2 mL Eppendorf tube.
(2) To the solution obtained in (1) was added the 10 μg / mL internal standard solution (0.5 mL) prepared in 3-2.
(3) The mixture was uniformly stirred by a vortex mixer.
The homogeneous solution obtained by the above operation was used as an "analytical sample".
３−５．移動相（120mM NaOH水溶液）の調製
（１）2 mL容メスピペット（PP製）を用い、50%NaOH水溶液（6.3 mL）を1 L容メスシリンダー（PFA製）に分注した。
（２）1,000 mLまで加水し、1L容ボトル（PFA製）に移した。
（３）撹拌混合し、均一溶液とした。
上記操作にて得られた均一溶液を「移動相」として用いた。
3-5. Preparation of mobile phase (120 mM aqueous solution of NaOH) (1) A 50% aqueous solution of NaOH (6.3 mL) was dispensed into a 1 L measuring cylinder (manufactured by PFA) using a 2 mL measuring pipette (manufactured by PP).
(2) Water was added to 1,000 mL and transferred to a 1 L bottle (manufactured by PFA).
(3) Stir and mix to obtain a uniform solution.
The homogeneous solution obtained by the above operation was used as a "mobile phase".
３−６．カラム接続及び平衡化
（１）パージを行い、ポンプ内を「移動相」で置換した。
（２）流速を0.3 mL/minに設定後、通液しながら分析カラム及びガードカラムを接続した。
（３）接続後、所定流速1 mL/minまでは、5分間かけて段階的に上げていった。具体的には、約2分後には0.6 mL/min、約5分後には1 mL/minのごとくである。
（４）所定流速に到達後、1時間以上の通液により平衡化させた。平衡化後、分析を開始した。
3-6. Column connection and equilibration (1) purge were performed, and the inside of the pump was replaced with the “mobile phase”.
(2) After setting the flow rate to 0.3 mL / min, the analytical column and the guard column were connected while passing through.
(3) After connection, the flow rate was gradually increased over 5 minutes until the predetermined flow rate was 1 mL / min. Specifically, it is 0.6 mL / min after about 2 minutes, and 1 mL / min after about 5 minutes.
(4) After reaching a predetermined flow rate, it was equilibrated by passing for 1 hour or more. After equilibration, analysis was started.
４．HPAEC-PAD定量分析（内部標準法）
４−１．分析条件
陰イオン交換樹脂を充填したカラムとパルスドアンペロメトリ検出器を組み合わせた方法（High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection：HPAEC-PAD法）により、表１の条件にて分析を実施した。
4-1. Analysis conditions The analysis was carried out under the conditions of Table 1 by a method (High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection: HPAEC-PAD method) in which a column filled with anion exchange resin and a pulsed amperometry detector were combined.
４−２．検量線作成
（１）３−３で調製した「検量線作成用試料」を分析した。
（２）標準物質のピーク面積（Ax）と内部標準物質のピーク面積（As）の比を縦軸、標準物質の濃度（Mx）と内部標準物質の濃度（Ms）の比を横軸にプロットし、図１に示す検量線を作成した。
4-2. Preparation of Calibration Curve (1) The “sample for calibration curve preparation” prepared in 3-3 was analyzed.
(2) The ratio of peak area (Ax) of standard substance to peak area (As) of internal standard substance is plotted on the vertical axis, and the ratio of standard substance concentration (Mx) to internal standard substance concentration (Ms) is plotted on the horizontal axis Then, a calibration curve shown in FIG. 1 was prepared.
４−３．分析及び分析対象物濃度（Mx）算出
（１）分析試料を分析した(各分析試料につき、5回分析実施)。
（２）分析結果（Ax, As: 測定値を入力、Ms：添加濃度）と検量線（図１：Y=1.0849X、R2=0.9999）から、分析試料中のネオコタラノール濃度（Mx）を算出した。
4-3. Analysis and Analyte Concentration (Mx) Calculation (1) An analysis sample was analyzed (for each analysis sample, analysis was performed 5 times).
(2) analysis (Ax, As: enter a measurement, Ms: addition concentration) to a standard curve: (FIG. 1 Y = 1.0849X, R 2 = 0.9999), Neokotaranoru concentration analysis in the samples (Mx) Was calculated.
４−４．食品中におけるネオコタラノールの定量値算出
（１）４−３で求めた（Mx）を下式に代入し、定量値を算出した。5回分析により得られた平均値を「ネオコタラノールの定量値」とした。
（式中、A：標準物質の純度（％）、Mx：ネオコタラノール濃度である。）
4-4. Quantitative value calculation of neocotalanol in food (1) (Mx) determined by 4-3 was substituted into the following equation to calculate a quantitative value. The average value obtained by 5 times analysis was taken as "quantitative value of neocotalanol".
(Wherein, A: purity of standard substance (%), Mx: neocotalanol concentration)
４−５．食品中におけるネオコタラノールの定量値＜算出例＞
表２及び図２に、当該食品の分析例を示した。
図２に示すとおり、マルトースは、ネオコタラノールのピークのごく近傍に明確に区別されるピークを有し、内部標準物質として好適であることがわかる。
The analysis example of the said food was shown in Table 2 and FIG.
As shown in FIG. 2, maltose has a clearly distinguished peak in the immediate vicinity of the peak of neocotalanol, which proves to be suitable as an internal standard substance.
４−６．分析試料中のネオコタラノールの定量結果
４−６−１．各分析試料中のネオコタラノール濃度（Mx）
分析結果より、分析１〜５のネオコタラノール濃度（Mx）を算出した。結果を表３に示す。
4-6. Quantitative Results of Neocotalanol in Analysis Sample 4-6-1. Neocotalanol concentration (Mx) in each analytical sample
From the analysis results, neocotalanol concentrations (Mx) in analyzes 1 to 5 were calculated. The results are shown in Table 3.
検量線： Y=1.0849X（Y=Ax/As, X=Mx/Ms）
Ax:ネオコタラノールのピーク面積
As: 内部標準物質（マルトース）のピーク面積
Mx: ネオコタラノール濃度（μg/mL）
Ms: 内部標準物質（マルトース）濃度（μg/mL）
Ax: Peak area of neocotalanol
As: Peak area of internal standard substance (maltose)
Mx: Neocotalanol concentration (μg / mL)
Ms: Internal standard (maltose) concentration (μg / mL)
４−６−２．分析試料中のネオコタラノール含量
得られた分析１〜５のネオコタラノール濃度（Mx）を４−４で示した式に代入し、定量値を算出し、平均定量値0.241 mg/gを得た。
例２．各種内部標準物質の検討
以下に示す８つの物質についての検討をした。
Example 2. Examination of various internal standard substances The following eight substances were examined.
１．分析条件
以下の条件で分析を行った。
２．検討物質一覧
下表の８成分を用い検討を実施した（全て、1 μg/mL溶液を10 μL注入）。
３．結果
表７に分析結果を示した。
以上、具体的な態様を参照して本発明を説明したが、当業者であれば以上の開示により本発明を実施できよう。しかしながら、上記の具体的な一態様は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。 While the invention has been described with reference to specific embodiments, those skilled in the art will be able to practice the invention according to the foregoing disclosure. However, one specific embodiment described above should not be construed as limiting the scope of the present invention.
本発明の方法は、ネオコタラノールを植物等から分離後若しくは合成後に精製する場合、又は、糖尿病、腎症等の治療等を目的としたネオコタラノールが配合される医薬品、食品等の分野において、有用に使用することができる。 The method of the present invention is used in the fields of pharmaceuticals, foods, etc. to which neocotalanol is added for purification of neocotalanol after separation or synthesis from plants etc., or for treatment of diabetes, nephropathy etc. , Can be usefully used.
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