JP6540989B2 - Method for screening compounds that enhance taste and taste enhancer and food and drink containing taste enhancer - Google Patents
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Description
本発明は、呈味を増強する化合物をスクリーニングする方法および呈味増強剤並びに呈味増強剤を含む飲食品に関する。 The present invention relates to a method for screening a compound that enhances taste and a food and drink containing the taste enhancer and the taste enhancer.
味覚物質は、私たちの生活において様々な重要な役割を果たしている。食品加工においては、様々な味覚物質が、嗜好性向上、物性向上、保存性向上などに寄与している。 Taste substances play various important roles in our lives. In food processing, various taste substances contribute to the improvement of palatability, the improvement of physical properties, the improvement of storage stability and the like.
人体の必須栄養素であるナトリウムイオンを含む食塩は、調味料として不可欠であるが、食塩の過剰摂取は様々な疾病の原因になることが明らかとなっている。しかし、減塩すると味の物足りなさから食品の嗜好性が大きく低下するという問題があり、減塩してもおいしく食べられる食品に対する消費者の要求は著しく高まっている。 Salt containing sodium ion, which is an essential nutrient of the human body, is essential as a seasoning, but it has been revealed that excessive intake of salt causes various diseases. However, there is a problem that when the amount of salt is reduced, the taste of the food is reduced due to lack of taste, and the consumer's demand for foods that can be eaten deliciously even if the amount of salt is reduced is significantly increased.
このように、味覚物質を低減しながら風味を保つ技術の開発が求められているといえる。 Thus, it can be said that development of a technique for maintaining flavor while reducing taste substances is required.
呈味増強剤についてはこれまでに、上皮型ナトリウムチャネルの活性化剤を用いた塩味増強剤（特許文献１）、少量の添加で飲食品の香味を増強する香味増強剤（特許文献２）が提案されている。 As for taste enhancers, a salty taste enhancer using an activator of epithelial sodium channel (Patent Document 1), a flavor enhancer that enhances the flavor of food and drink with a small amount of addition (Patent Document 2) Proposed.
本発明は、呈味を増強する化合物をスクリーニングする方法および呈味増強剤並びに呈味増強剤を含む飲食品を提供する。 The present invention provides a method of screening a compound that enhances taste, and a food and drink containing the taste enhancer and the taste enhancer.
本発明者らは、ヒトの官能評価を代替できる客観的指標として、味覚物質存在時の鼓索神経もしくは味覚受容体を発現する細胞（味覚細胞）の生理学的応答を用いることができることを見出した。本発明者らはまた、単独では味覚を呈さない程度の濃度の化合物を共存させることにより、味覚物質に対する鼓索神経若しくは味覚細胞の生理学的応答が増強されることを明らかにした。本発明はこのような知見に基づいてなされたものである。 The present inventors have found that the physiological response of tympanic nerve or cells expressing taste receptors (taste cells) in the presence of a taste substance can be used as an objective index that can replace human sensory evaluation. . The present inventors have also revealed that coexistence of a compound at a concentration that does not exhibit taste alone can enhance the physiological response of the chorda tympani or taste cells to taste substances. The present invention has been made based on such findings.
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）非ヒト動物を用いた呈味を増強する化合物のインビボのスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｂ）得られた水溶液を非ヒト動物の舌に接触させることと、
（ｃ）上記接触により発生する鼓索神経の生理学的応答を検出することと、
（ｄ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと
を含む、スクリーニング方法。
（２）呈味を増強する化合物から、その化合物自体が味覚受容体に反応しないことを指標として化合物を選択することをさらに含む、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）鼓索神経に対して生理学的応答を生じさせない濃度で呈味を増強する化合物を選択する、上記（１）または（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）被検化合物存在時の鼓索神経の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の鼓索神経の生理学的応答の強度に対して１．１倍以上６．０倍以下である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）味覚物質が、塩味物質である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）味覚物質が、塩味物質であり、被検化合物が上皮型ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）発現細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、塩味物質による鼓索神経の生理学的応答を増強することを指標として、塩味を増強する化合物を選択する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）味覚細胞を用いた呈味を増強する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、
（ｉ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｉｉ）得られた水溶液を味覚細胞に接触させることと、
（ｉｉｉ）上記接触により発生する味覚細胞の生理学的応答を検出することと、
（ｉｖ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと
を含む、スクリーニング方法。
（８）生理学的応答が、味覚細胞内へのカルシウム流入であるか、または味覚細胞の膜電位の脱分極である、上記（７）に記載の方法。
（９）呈味を増強する化合物から、その化合物自体が味覚受容体に反応しないことを指標として化合物を選択することをさらに含む、上記（７）または（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１０）味覚細胞に対して生理学的応答を生じさせない濃度で呈味を増強する化合物を選択する、上記（７）〜（９）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１１）被検化合物存在時の味覚細胞の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の味覚細胞の生理学的応答の強度に対して１．１倍以上６．０倍以下である、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１２）味覚物質が、塩味物質である、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（１３）味覚物質が、塩味物質であり、被検化合物が上皮型ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）発現細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、塩味物質による味覚細胞の生理学的応答を増強することを指標として、塩味を増強する化合物を選択する、上記（７）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法により得られた、呈味を増強する化合物。
（１５）上記（１４）に記載の化合物を、味覚物質を含む組成物と混合することを含む、呈味の増強方法。
（１６）上記（１４）に記載の化合物を、味覚物質を含まない水溶液中では非ヒト動物の鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で、味覚物質を含む飲食品と混合することを含む、呈味の増強方法。
（１７）上記（１４）に記載の化合物を、味覚物質を含まない水溶液中では味覚細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、味覚物質を含む飲食品と混合することを含む、呈味の増強方法。
（１８）上記（１４）に記載の化合物を、味覚物質を含まない水溶液中では非ヒト動物の鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で含む、飲食品。
（１９）上記（１４）に記載の化合物を、味覚物質を含まない水溶液中では非ヒト動物の味覚細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で含む、飲食品。
（２０）スピラントールを、０．０３ｍＭ〜９００ｍＭの濃度で含む、呈味増強剤。
（２１）上記（２０）に記載の呈味増強剤を飲食品と混合することを含み、これにより呈味増強剤を飲食品の総重量に対して０．０１〜１重量％となるように調節する、飲食品の呈味増強方法。
（２２）上記（２０）に記載の呈味増強剤を０．０１〜１重量％含むことを特徴とする飲食品。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A method for in vivo screening of compounds that enhance taste using non-human animals, comprising:
(A) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(B) bringing the obtained aqueous solution into contact with the non-human animal's tongue;
(C) detecting the physiological response of the chorda tympani nerve generated by the contact;
(D) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound Method.
(2) The screening method according to (1) above, which further comprises selecting a compound that enhances taste based on the fact that the compound itself does not respond to a taste receptor as an indicator.
(3) The screening method according to (1) or (2) above, which selects a compound that enhances taste at a concentration that does not produce a physiological response to the tympanic nerve.
(4) The physiological response of the chorda tympani nerve in the presence of the test compound is 1.1 to 6.0 times the strength of the physiological response of the chorda tympani nerve in the absence of the test compound The screening method according to any one of the above (1) to (3).
(5) The screening method according to any one of (1) to (4) above, wherein the taste substance is a salty substance.
(6) To enhance the physiological response of the chorda tympani nerve by a salty taste substance at a concentration at which the taste substance is a salty taste substance and the test compound does not produce a physiological response to epithelial sodium channel (ENaC) expressing cells The method in any one of said (1)-(5) which selects the compound which enhances saltiness as a parameter | index.
(7) A method for screening a compound that enhances taste using taste cells in vitro, comprising:
(I) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(Ii) bringing the obtained aqueous solution into contact with taste cells;
(Iii) detecting the physiological response of taste cells generated by the contact;
(Iv) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound Method.
(8) The method according to (7) above, wherein the physiological response is calcium influx into taste cells or depolarization of membrane potential of taste cells.
(9) The screening method according to any one of the above (7) or (8), further comprising selecting a compound that enhances taste based on the fact that the compound itself does not respond to taste receptors as an indicator .
(10) The screening method according to any one of (7) to (9) above, which selects a compound that enhances taste at a concentration that does not cause a physiological response to taste cells.
(11) The physiological response of the taste cell in the presence of the test compound is 1.1 times or more and 6.0 times or less the strength of the physiological response of the taste cell in the absence of the test compound. The screening method in any one of said (7)-(10).
(12) The screening method according to any one of the above (7) to (11), wherein the taste substance is a salty substance.
(13) The indicator is that the taste substance is a salty substance, and the test compound enhances the physiological response of the taste cell by the salt taste substance at a concentration at which the epithelial type sodium channel (ENaC) expressing cell does not produce a physiological response. The method according to any one of (7) to (12) above, wherein a compound that enhances saltiness is selected.
(14) A compound which enhances taste, obtained by the method according to any one of the above (1) to (13).
(15) A method of enhancing taste comprising mixing the compound according to (14) above with a composition containing a taste substance.
(16) mixing the compound according to the above (14) with a food or drink containing a taste substance at a concentration which does not produce a physiological response to the chorda tympani nerve of a non-human animal in an aqueous solution containing no taste substance , How to enhance the taste.
(17) Taste enhancement, which comprises mixing the compound according to (14) with a food or beverage containing a taste substance at a concentration at which the taste cells do not produce a physiological response in an aqueous solution containing no taste substance Method.
(18) A food or drink comprising the compound according to the above (14) at a concentration which does not produce a physiological response to the chorda tympani nerve of a non-human animal in an aqueous solution containing no taste substance.
(19) A food or drink comprising the compound according to the above (14) at a concentration which does not cause a physiological response to taste cells of non-human animals in an aqueous solution containing no taste substance.
(20) A taste enhancer comprising spilanthol at a concentration of 0.03 mM to 900 mM.
(21) Including mixing the taste enhancer described in the above (20) with food and drink, whereby the taste enhancer is 0.01 to 1% by weight based on the total weight of the food and drink A method of enhancing the taste of food and drink to be adjusted.
(22) A food or drink containing 0.01 to 1% by weight of the taste enhancer described in the above (20).
本明細書では、「鼓索神経」は、顔面神経の垂直部から分岐して三叉神経の舌神経に加わって、舌の前部分２／３の味蕾をカバーし、味覚を伝達する神経を意味する。 As used herein, "tympanic nerve" means a nerve that branches from the vertical part of the facial nerve and joins the tongue nerve of the trigeminal nerve to cover the taste buds of the front part 2/3 of the tongue and transmit the taste. Do.
本明細書では、「三叉神経」とは、脳神経の一つであり、第五脳神経を意味する。三叉神経は、香辛料により刺激されることが知られている。 As used herein, "trigeminal nerve" is one of the cranial nerves and means the fifth cranial nerve. The trigeminal nerve is known to be stimulated by spices.
本明細書では、「味覚」は、食べ物に対して認識される感覚であり、甘味、酸味、塩味、苦みおよび旨味の５つの味が挙げられる。味覚は、味覚細胞（または味覚受容体細胞）に存在する味覚受容体を介して認識されると考えられている。味覚細胞は、発現する受容体の性質やシグナル伝達の機構によってI型、II型またはIII型に大別される。例えば、III型の味覚受容体細胞には、神経がシナプス接合しており、受容体細胞においてカルシウムイオンの流入による膜電位の脱分極が生じると、セロトニンがシナプス間隙に放出され、神経に刺激が伝達されると考えられている。 As used herein, "taste" is the perceived perception of food and includes five tastes: sweet, sour, salty, bitter and umami. Taste is thought to be recognized via taste receptors present in taste cells (or taste receptor cells). Taste cells are roughly classified into type I, type II or type III depending on the nature of the receptor to be expressed and the mechanism of signal transduction. For example, in type III taste receptor cells, nerves are synaptic junctions, and when depolarization of membrane potential occurs by influx of calcium ions in the receptor cells, serotonin is released into the synaptic cleft and stimulation to nerves It is believed to be transmitted.
本明細書では、「味覚物質」とは、味を感じさせる物質をいい、呈味物質ともいわれる。甘味、酸味、塩味および旨味を感じさせる物質はそれぞれ周知であり、当業者であれば、適宜これらを選択してスクリーニングに用いることができる。 As used herein, "taste substance" refers to a substance that causes taste, and is also referred to as a taste substance. Substances that impart sweetness, acidity, saltiness and umami taste are well known, and those skilled in the art can appropriately select and use these for screening.
本明細書では、「呈味」とは、広く飲食物の味を意味する。呈味としては、甘味、酸味、塩味および旨味が挙げられる。 As used herein, "taste" broadly refers to the taste of food and drink. The taste includes sweetness, sourness, saltiness and umami taste.
本明細書では、「被検化合物」とは、スクリーニングに供される化合物を意味する。被検化合物は、特に限定されないが、例えば、香辛料抽出物であり、例えば、さらにその有効成分である刺激物質とすることができる。 As used herein, “test compound” means a compound to be subjected to screening. Although a test compound is not specifically limited, For example, it is a spice extract, For example, it can be made into the stimulant which is the active ingredient further.
刺激物質としては、特に限定されないが、例えば、オランダセンニチ、カプシカム（トウガラシ）、ペッパー（コショウ）、ジンジャー（ショウガ）、オニオン（タマネギ）、ガーリック（ニンニク）、マスタード（カラシ）、ワサビ、ダイコンおよびサンショウなどに含まれる刺激物質を挙げることができる。具体的には、スピラントール、カプサイシン、ピペリン、ジンゲロール、ショーガオール、アリルイソチオシアネートおよびα−サンショオール並びにこれらの類縁体などが挙げられる。 Examples of the stimulant include, but are not limited to, for example, sorghum, capsicum (capsicum), pepper (pepper), ginger (singer), onion (onion), garlic (garlic), mustard (scallop), horseradish, radish and Stimulants included in Sansho etc. can be mentioned. Specific examples thereof include spiranthol, capsaicin, piperine, gingerol, shogaol, allyl isothiocyanate and α-sanshool and analogs thereof.
刺激物質は合成により得られたものでも、天然物から精製された化合物でもよく、これらを刺激物質として使用することができるが、香辛料から抽出または蒸留により得られた、いわゆる香辛料抽出物を使用することが好ましい。香辛料抽出物は常法に従って得ることができ、有効成分の回収率や費用を考慮し適宜選択すればよい。抽出方法は、特に限定されないが例えば、溶剤抽出、超臨界二酸化炭素抽出および水蒸気蒸留などがあげられ、さらに目的に応じてシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどで分画したものを用いることもできる。 The stimulant may be synthetically obtained or a compound purified from a natural product, and these can be used as stimulants, but use so-called spice extracts obtained by extraction or distillation from spices. Is preferred. The spice extract can be obtained according to a conventional method, and may be selected appropriately in consideration of the recovery rate and cost of the active ingredient. The extraction method is not particularly limited, and examples thereof include solvent extraction, supercritical carbon dioxide extraction, steam distillation and the like, and further, those fractionated by silica gel column chromatography and the like can be used according to the purpose.
溶剤抽出による採取法を例示すると、香辛料を乾燥・粉砕した後、有機溶媒で抽出して刺激物質を含有する抽出液を得ることができる。抽出に使用する有機溶媒は特に制限はないが、メタノール、エタノール、プロパノールおよびプロピレングリコール等のアルコール類；アセトン等のケトン類；酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル等のエーテル類；並びに、ヘキサンおよびヘプタン等の炭化水素類を適宜単独で、又は混合して使用することができる。これらのうち、抽出液を濃縮せずに使用する場合は、アルコール類のような極性有機溶媒が好ましく、さらに安全性の観点から特にエタノールが好ましい。また、濃縮して溶媒を留去し、いわゆるオレオレジンやオイルなどとして使用する場合は低極性または無極性の溶媒を使用することもでき、この場合は残留溶媒を十分除去する必要がある。 As an example of the extraction method by solvent extraction, after the spice is dried and ground, it can be extracted with an organic solvent to obtain an extract containing a stimulant. The organic solvent used for the extraction is not particularly limited, but alcohols such as methanol, ethanol, propanol and propylene glycol; ketones such as acetone; esters such as ethyl acetate; ethers such as diethyl ether; Hydrocarbons such as heptane can be used alone or in combination as appropriate. Among these, when the extract is used without concentration, polar organic solvents such as alcohols are preferable, and ethanol is particularly preferable from the viewpoint of safety. When the solvent is removed by concentration and used as a so-called oleoresin or oil, a low polar or nonpolar solvent can be used. In this case, it is necessary to sufficiently remove the residual solvent.
抽出処理条件は、特に限定されず、常法に従って行うことができ、室温ないし還流加熱下において任意の装置を使用することができる。例えば、上記抽出溶媒を満たした容器に、抽出原料を投入し、ときどき撹拌しながら可溶性成分を溶出させることができる。この際、抽出条件は、抽出原料の種類や部位等に応じて適宜調整し得るが、抽出溶媒量は、通常、抽出原料の８〜５０倍量（重量比）とすることができ、抽出時間は、通常、熱水の場合は７０℃〜１００℃で５分〜２時間程度とすることができ、室温抽出の場合は１〜２４時間程度とすることができ、低級脂肪族アルコールおよび含水低級脂肪族アルコール等の有機溶媒の場合は室温〜８０℃で１０分〜２時間程度とすることができる。抽出処理により香辛料成分を溶出させた後、該抽出処理で得られた抽出液を濾過あるいは遠心分離して抽出残渣を除去することによって、抽出液を調製することができる。得られた抽出液から溶媒を留去し、刺激物質含有抽出物を得ることができる。 The extraction treatment conditions are not particularly limited, and can be performed according to a conventional method, and any apparatus can be used at room temperature to reflux heating. For example, the extraction raw material can be charged into a container filled with the above-mentioned extraction solvent, and the soluble component can be eluted while stirring occasionally. Under the present circumstances, extraction conditions can be suitably adjusted according to the kind, site | part, etc. of extraction raw material, but the amount of extraction solvents can usually be made into 8 to 50 times quantity (weight ratio) of extraction raw material, and extraction time In general, in the case of hot water, it can be about 5 minutes to 2 hours at 70.degree. C. to 100.degree. C., and in the case of room temperature extraction, it can be about 1 to 24 hours. In the case of an organic solvent such as aliphatic alcohol, it may be about 10 minutes to 2 hours at room temperature to 80 ° C. After the spice component is eluted by the extraction treatment, the extract obtained by the extraction treatment is filtered or centrifuged to remove the extraction residue, whereby the extract can be prepared. The solvent can be distilled off from the obtained extract to obtain a stimulant-containing extract.
飲食品に刺激物質を添加する場合、刺激物質は単独で使用しても良く、また、組み合わせて使用しても良い。また香辛料のエキス、オレオレジン、オイルなどの抽出物を使用しても良い。飲食品に対して刺激物質を感知される濃度で添加することが許容される場合もあり得る。 When a stimulant is added to food and drink, the stimulant may be used alone or in combination. Also, extracts of spices, oleoresins, oils and the like may be used. In some cases it may be acceptable to add a stimulant to the food or beverage at a sensed concentration.
スピラントール（Ｎ−イソブチル−２，６，８−デカトリエンアミド）は、キク科オランダセンニチ（Spilanthes acmella）またはキバナオランダセンニチ（Spilanthes acmella var. oleracea）などに含まれる刺激成分として知られる。スピラントールは、植物から精製することにより得られる他、化学的に合成することも可能であり、いずれも本発明で用いることができる。 Spilanthol (N-isobutyl-2,6,8-decatrienamide) is known as a stimulant component contained in the Asteraceae Dutch Sennith ( Spilanthes acmella ) or in Scutellaria syllandensis ( Spilanthes acmella var. Oleracea ). Spilanthol can be obtained by purifying it from plants or chemically synthesized, and any of them can be used in the present invention.
ヒドロキシ α―サンショオール（Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）ドデカ−２，６，８，１０−テトラエンアミド）は、ミカン科の山椒（Zanthoxylum piperitum）または花椒（Zanthoxylum bungeanum）などに含まれる刺激成分として知られる。ヒドロキシ α―サンショオールは、植物から精製することにより得られる他、化学的に合成することも可能であり、いずれも本発明で用いることができる。 Hydroxy α-sanshool (N- (2-hydroxy-2-methylpropyl) dodeca-2,6,8,10-tetraenamide) is used as a phlegm ( Zanthoxylum piperitum ) or floret ( Zanthoxylum bungeanum ) of the Rutaceae family It is known as a stimulus component to be contained. Hydroxy α-sanshool can be obtained by purification from plants or chemically synthesized, and any of them can be used in the present invention.
本発明によれば、
非ヒト動物を用いた呈味を増強する化合物のインビボのスクリーニング方法であって、
（ａ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｂ）得られた水溶液を非ヒト動物の舌に接触させることと、
（ｃ）上記接触により発生する鼓索神経の生理学的応答を検出することと、
（ｄ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと
を含む、スクリーニング方法が提供される。
According to the invention
A method for in vivo screening of compounds that enhance taste using non-human animals, comprising:
(A) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(B) bringing the obtained aqueous solution into contact with the non-human animal's tongue;
(C) detecting the physiological response of the chorda tympani nerve generated by the contact;
(D) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound A method is provided.
本発明で用いることができる非ヒト動物は、例えば、非ヒト霊長類、偶蹄類、奇蹄類、またはげっ歯類などの非ヒト哺乳動物とすることができ、例えば、ブタ、イヌ、ウシ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、イノシシ、ヤギ、またはラクダとすることができる。本発明で用いることができる非ヒト動物は、鳥類、両生類および爬虫類などの非ヒト動物であってもよい。本発明では、ペットフードの呈味を増強する化合物をスクリーニングすることも可能であり、その場合には、工程（ｂ）において、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギおよびトリなどのペットを非ヒト動物として用いて、その動物が感じる呈味を増強する化合物をスクリーニングすることができる。 The non-human animals that can be used in the present invention can be, for example, non-human mammals such as non-human primates, rodents, etc., for example, pigs, dogs, cattle, It can be a cat, mouse, rat, rabbit, boar, goat or camel. Non-human animals which can be used in the present invention may be non-human animals such as birds, amphibians and reptiles. In the present invention, it is also possible to screen for compounds that enhance the taste of pet food, in which case in step (b), pets such as dogs, cats, mice, rats, rabbits and birds are nonhuman. It can be used as an animal to screen for compounds that enhance the taste that the animal feels.
本発明では、スクリーニングできる呈味を増強する化合物は、例えば、甘味、酸味、塩味、苦味および旨味から選択される１以上またはすべてを増強する化合物である。好ましい態様では、呈味は塩味である。塩味としては、塩味物質、特に限定されないが例えば、塩化ナトリウム（食塩）および塩化カリウムからもたらされる味覚が挙げられる。 In the present invention, the compound that enhances the taste that can be screened is, for example, a compound that enhances one or more or all selected from sweetness, acidity, saltiness, bitterness and umami. In a preferred embodiment, the taste is salty. Saltiness includes salty substances, such as, but not limited to, the taste resulting from sodium chloride (sodium chloride) and potassium chloride.
以下、工程ごとに詳細に説明する。 Each step will be described in detail below.
（ａ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合すること
味覚物質としては、増強させたい味覚を生じる味覚物質を用いることができる。例えば、特に限定されないが、塩味物質、甘味物質、酸味物質または旨味物質を用いることができる。
(A) Mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance As the taste substance, a taste substance that produces a taste to be enhanced can be used. For example, although not particularly limited, salty substances, sweet substances, sour substances or umami substances can be used.
被検化合物としては、人体に毒性を有しない限り様々な化合物を用いることができる。被検化合物としては、特に限定されないが、例えば、刺激物質を用いることができる。刺激物質としては、オランダセンニチ、カプシカム（トウガラシ）、ペッパー（コショウ）、ジンジャー（ショウガ）、オニオン（タマネギ）、ガーリック（ニンニク）、マスタード（カラシ）、ワサビ、ダイコン、サンショウなどに含まれる刺激物質を用いることができる。具体的には、スピラントール、カプサイシン、ピペリン、ジンゲロール、ショーガオール、アリルイソチオシアネートおよびα−サンショオール並びにこれらの類縁体などが挙げられる。 As the test compound, various compounds can be used as long as they have no toxicity to the human body. The test compound is not particularly limited, and for example, a stimulant can be used. Stimulants included in Dutch sennin, Capsicum (capsicum), pepper (pepper), ginger (ginger), onion (onion), garlic (garlic), mustard (wasabi), wasabi, radish, salamander, etc. Substances can be used. Specific examples thereof include spiranthol, capsaicin, piperine, gingerol, shogaol, allyl isothiocyanate and α-sanshool and analogs thereof.
（ｂ）得られた水溶液を非ヒト動物の舌に接触させること
工程（ｂ）は、通常は、非ヒト動物を麻酔し、鼓索神経を露出させた上で鼓索神経の生理学的応答を測定しながら非ヒト動物の舌に水溶液を接触させることにより行うことができる。これにより、水溶液は舌に存在する味覚細胞に接触することとなる。
(B) bringing the obtained aqueous solution into contact with the tongue of a non-human animal (b) usually involves anesthetizing the non-human animal and exposing the chorda tympani nerve, and then applying the physiological response of the chorda tympani nerve It can be carried out by contacting the non-human animal tongue with an aqueous solution while measuring. This causes the aqueous solution to contact taste cells present in the tongue.
対照として、被検化合物を含み、味覚物質を含まない水溶液と非ヒト動物の舌とを接触させてもよい。また、対照として、味覚物質を含み、被検化合物を含まない水と非ヒト動物の舌とを接触させてもよい。 As a control, an aqueous solution containing a test compound and containing no taste substance may be brought into contact with the tongue of a non-human animal. In addition, as a control, water containing a taste substance and not containing a test compound may be brought into contact with the tongue of a non-human animal.
（ｃ）上記接触により発生する鼓索神経の生理学的応答を検出すること
鼓索神経は、味覚受容体細胞とシナプスを介して連結しており、呈味刺激による生理学的応答を伝達する。従って、工程（ｃ）では、呈味刺激に応じて生じる鼓索神経の生理学的応答を検出する。生理学的応答は、神経細胞の活動電位とすることができる。
(C) Detecting the physiological response of the chorda tympani nerve generated by the contact The chorda tympani nerve is synaptically connected to taste receptor cells to transmit the physiological response due to taste stimulation. Thus, in step (c), the physiological response of the chorda tympani nerve generated in response to the taste stimulus is detected. The physiological response can be the action potential of a neuronal cell.
活動電位は、当業者に周知の方法により測定することができる。すなわち、顔面側部より鼓索神経を一部露出させ鼓索神経にその神経応答を検出できるように電極を接触させ、電極はアンプ、オシロスコープおよび応答記録装置に接続し、鼓索神経の神経応答を経時的に記録することができる。神経応答の大きさは、測定されたピークの高さや、応答曲線の曲線下面積で表すことができる。これらの値は標準刺激に対する応答値で割るなどして標準化することもできる。標準刺激としては、任意の濃度の味覚物質を含む溶液および冷刺激を用いることができる。一般的に、ヒトおよび非ヒト動物は、鼓索神経の生理学的応答値が高まるほど、味覚を強く感じると考えられている。 The action potential can be measured by methods known to those skilled in the art. That is, a part of the chordal nerve is exposed from the side of the face and the chordal nerve is contacted with an electrode so that the nerve response can be detected, and the electrode is connected to an amplifier, an oscilloscope and a response recording device. Can be recorded over time. The magnitude of the neural response can be represented by the height of the measured peak and the area under the curve of the response curve. These values can also be standardized by dividing by the response value to the standard stimulus. As standard stimuli, solutions containing taste substances of any concentration and cold stimuli can be used. In general, humans and non-human animals are considered to have a stronger taste as the physiological response value of the chorda tympani increases.
（ｄ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択すること
工程（ｄ）では、被検化合物を混入させた味覚物質溶液に対する鼓索神経の生理学的応答（すなわち、被検化合物存在時の生理学的応答）と、被検化合物を含まない味覚物質溶液に対する鼓索神経の生理学的応答（すなわち、被検化合物非存在時の生理学的応答）とを比較して、生理学的強度が高まったか否かを評価することができる。
(D) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound in step (d) The physiological response of the chorda tympani nerve to the taste substance solution mixed with the test compound (ie, the physiological response in the presence of the test compound), and the physiology of the chorda tympani nerve to the taste substance solution not containing the test compound The response (ie, the physiological response in the absence of the test compound) can be compared to assess whether the physiological strength has increased.
工程（ｄ）では、被検化合物そのものが、鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で、呈味を増強することを指標として化合物を選択してもよい。ここで、「被検化合物そのもの」とは、味覚物質非存在下で被検化合物を用いることを意味し、被検化合物自体に備わる生理学的特性を検出することを意図して用いられる。また、例えば、工程（ｄ）では、被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度に対して１．１倍以上、好ましくは１．３倍以上６．０倍以下であり、特に好ましくは、１．３倍以上２．０倍以下である被検化合物を、呈味を増強する化合物として選択することができる。この態様では、生理学的応答は、鼓索神経（例えば、ラットなどの非ヒト哺乳動物の鼓索神経）の活動電位とすることができる。 In the step (d), the compound to be tested may be selected on the basis of enhancing the taste at a concentration at which the tympanic nerve does not cause a physiological response. Here, "the test compound itself" means using the test compound in the absence of a taste substance, and is used with the intention of detecting the physiological characteristic of the test compound itself. Also, for example, in step (d), the strength of the physiological response in the presence of the test compound is at least 1.1 times, preferably 1.3 times the strength of the physiological response in the absence of the test compound A test compound which is not less than 6.0 times and particularly preferably not less than 1.3 times and not more than 2.0 times can be selected as a compound that enhances the taste. In this aspect, the physiological response can be the action potential of the chorda tympani nerve (eg, chorda tympani nerve of a non-human mammal such as a rat).
本発明は、工程（ｅ）呈味を増強する化合物から、味覚受容体に反応しない化合物を選択することをさらに含んでいてもよい。 The present invention may further comprise selecting a compound that does not react to taste receptors from the compound that enhances taste in step (e).
（ｅ）呈味を増強する化合物から、味覚受容体に反応しない化合物を選択すること
呈味を増強する化合物の中には、味覚受容体に反応しない化合物が存在する。例えば、本明細書では、被検化合物が味覚受容体に反応するか否かは、特定の味覚受容体を発現する味覚細胞を単離して該化合物と接触させた場合に、その細胞に対して生理学的応答を示さないことを指標として判断することができる。あるいは、被検化合物が味覚受容体に反応するか否かは、インビボで被検化合物を単独で非ヒト動物の舌に接触させたときに非ヒト動物の鼓索神経応答を生じさせないことを指標として判断してもよい。工程（ｅ）は、呈味を増強する濃度で化合物が味覚受容体に反応しない化合物を選択することができる。工程（ｅ）は、呈味を増強する濃度域において、味覚受容体に反応しない濃度域を決定することもできる。
(E) Selecting Compounds That Do Not Respond to Taste Receptors from Compounds that Enhance Taste Among compounds that enhance taste, there are compounds that do not respond to taste receptors. For example, in the present specification, whether or not a test compound responds to a taste receptor depends on the taste cell expressing a particular taste receptor when it is isolated and brought into contact with the compound. It can be judged that no physiological response is shown as an indicator. Alternatively, whether or not the test compound responds to the taste receptor is an index that the test compound alone does not generate the chorda tympani response of the nonhuman animal when the test compound alone is brought into contact with the tongue of the nonhuman animal. It may be judged as Step (e) can select compounds in which the compounds do not respond to taste receptors at concentrations that enhance taste. Step (e) can also determine a concentration range which does not respond to taste receptors in a concentration range which enhances taste.
工程（ｅ）により選択された化合物は、味覚物質を含まない水溶液中では非ヒト動物の鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で、味覚物質を含む飲食品と混合することにより、飲食品の呈味を増強することに用いることができる。 The compound selected in step (e) is mixed with a food or drink containing a taste substance at a concentration that does not cause a physiological response to the chorda tympani nerve of a non-human animal in an aqueous solution containing no taste substance Can be used to enhance the taste of
味覚細胞は、舌上皮から単離した味蕾を酵素処理してマイクロピペットの水流で味蕾の細胞を解離させて得ることができる。味覚細胞の生理的応答は、例えば、膜電位の脱分極または細胞へのカルシウムイオンの流入を指標として検出することができる。一般的に細胞へのカルシウムイオンの流入の度合いが大きいほど、強い味覚を生じると考えられている。 Taste cells can be obtained by enzymatically treating miso isolated from the tongue epithelium and dissociating the miso cells with a water flow of a micropipette. The physiological response of taste cells can be detected, for example, by depolarization of membrane potential or influx of calcium ions into cells. Generally, it is believed that the greater the influx of calcium ions into cells, the stronger the taste.
ある態様では、味覚物質は塩味物質（例えば、ＮａＣｌ）であり、工程（ｅ）において、インビトロでは単離したＥＮａＣ発現細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、インビボでは塩味を増強することを指標として化合物を選択してもよい。更なる特定の態様では、被検化合物はスピラントールである。 In one embodiment, the taste substance is a salty substance (e.g., NaCl), and in step (e), an index to enhance saltiness in vivo at a concentration that does not produce a physiological response to isolated ENaC-expressing cells in vitro The compound may be selected as In a further particular aspect, the test compound is spiranthol.
本発明では、
味覚細胞を用いた呈味を増強する化合物のインビトロのスクリーニング方法であって、
（ｉ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｉｉ）得られた水溶液を味覚細胞に接触させることと、
（ｉｉｉ）上記接触により発生する味覚細胞の生理学的応答を検出することと、
（ｉｖ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと
を含む、スクリーニング方法が提供される。
In the present invention,
A method for in vitro screening of compounds that enhance taste using taste cells, comprising:
(I) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(Ii) bringing the obtained aqueous solution into contact with taste cells;
(Iii) detecting the physiological response of taste cells generated by the contact;
(Iv) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound A method is provided.
味覚細胞の生理学的応答は、例えば、細胞へのカルシウムイオンの流入やそれに伴う膜電位の脱分極（すなわち、活動電位）であり、それぞれカルシウムイメージング法やパッチクランプ法などの周知の方法により測定することができる。 Physiological responses of taste cells are, for example, the influx of calcium ions into cells and the corresponding depolarization of membrane potential (that is, action potential), which are respectively measured by known methods such as calcium imaging and patch clamp methods. be able to.
細胞内へのカルシウムイオンの流入は、例えば、カルシウム蛍光プローブを用いて検出することができる。カルシウム蛍光プローブとしては、１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸，ペンタアセトキシメチルエステル（Fura 2-AM）など様々なプローブが知られ、本発明で用いることができる。 The influx of calcium ions into cells can be detected, for example, using a calcium fluorescent probe. As a calcium fluorescent probe, 1- [6-amino-2- (5-carboxy-2-oxazolyl) -5-benzofuranyloxy] -2- (2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N, N , N ', N'-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester (Fura 2-AM), etc. Various probes are known and can be used in the present invention.
また、膜電位は、例えば、微小電極法などの神経レコーディング法やパッチクランプ法により測定することができ、または膜電位測定用蛍光プローブを用いて計測してもよい。膜電位測定用蛍光プローブとしては、特に限定されないが、４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムイオダイド（４−Ｄｉ−１０−ＡＳＰ）、ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸トリメチンオキソノール（ＤｉＳＢＡＣ２（３））、３，３’−ジプロピルチアジカルボシアニンイオダイド（ＤｉＳＣ３（５））、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’、−テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンイオダイド（ＪＣ−１）およびローダミン１２３が挙げられる。 The membrane potential can be measured by, for example, a nerve recording method such as a microelectrode method or a patch clamp method, or may be measured using a membrane potential measurement fluorescent probe. The fluorescent probe for measuring the membrane potential is not particularly limited, but 4- (4- (didecylamino) styryl) -N-methyl pyridinium iodide (4-Di-10-ASP), bis- (1,3-dibutylbarbi) Tool acid trimethine oxonol (DiSBAC2 (3)), 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide (DiSC3 (5)), 5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1' And 3,3,3'-tetraethyl benzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) and rhodamine 123 can be mentioned.
工程（ｉｖ）では、被検化合物が、味覚物質を含まない水溶液中では味覚細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として化合物を選択してもよい。例えば、工程（ｉｖ）では、被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度に対して１．１倍以上６．０倍以下、好ましくは２．０倍以上６．０倍以下であり、特に好ましくは、２．０倍以上３．３倍以下である被検化合物を、呈味を増強する化合物として選択することができる。この態様では、生理学的応答は、味覚細胞へのカルシウムの流入または味覚細胞の活動電位とすることができる。 In the step (iv), at a concentration at which the test compound does not produce a physiological response to the taste cells in an aqueous solution containing no taste substance, the strength of the physiological response in the presence of the test compound is as high as that in the absence of the test compound. The compound may be selected on the basis of an increase in the strength of the physiological response of For example, in step (iv), the strength of the physiological response in the presence of the test compound is 1.1 times or more and 6.0 times or less, preferably 2 times the strength of the physiological response in the absence of the test compound. Test compounds that are not less than 0 times and not more than 6.0 times, and particularly preferably not less than 2.0 times and not more than 3.3 times can be selected as compounds that enhance the taste. In this aspect, the physiological response can be the influx of calcium to the taste cells or the action potential of the taste cells.
工程（ｉｖ）により選択された化合物は、味覚物質を含まない水溶液中では非ヒト動物の鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で、味覚物質を含む飲食品と混合することにより、飲食品の呈味を増強することに用いることができる。 The compound selected in step (iv) is a food or drink by mixing it with a food or drink containing a taste substance at a concentration which does not cause a physiological response to the chorda tympani nerve of a non-human animal in an aqueous solution containing no taste substance Can be used to enhance the taste of
工程（ｉｖ）は、特に限定されないが、例えば、以下のように行うことができる。工程（ｉｖ）では、被検化合物そのものが、上皮型ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）発現細胞に生理学的応答を生じさせない濃度で、塩味物質による細胞の生理学的応答を増強することを指標として化合物を選択してもよい。 Although a process (iv) is not specifically limited, For example, it can carry out as follows. In step (iv), the compound to be tested is selected based on the fact that the physiological response of the salty taste substance is enhanced at a concentration that does not cause a physiological response to epithelial type sodium channel (ENaC) -expressing cells. May be
本発明では、本発明の方法により得られる化合物が提供される。 The invention provides a compound obtainable by the process of the invention.
本発明では、スピラントールを、鼓索神経に生理学的応答を生じさせない濃度で含む、呈味増強剤が提供される。このような呈味増強剤は、本来の味を損なうことなく所望の呈味を増強できる点で有利である。本発明では、スピラントールを０．０３ｍＭ〜９００ｍＭの濃度で含む呈味増強剤が提供される。ある態様では、飲食品には、上記呈味増強剤が０．０１〜１重量％含まれる。 In the present invention, a taste enhancer is provided, which comprises spiranthol at a concentration that does not produce a physiological response to the tympanic nerve. Such taste enhancers are advantageous in that they can enhance the desired taste without impairing the original taste. The present invention provides a taste enhancer comprising spilanthol at a concentration of 0.03 mM to 900 mM. In one aspect, the food and drink contains 0.01 to 1% by weight of the taste enhancer.
本発明の呈味増強剤は、飲食品に添加することにより、その呈味の増強を図ることができる。飲食品としては、特に限定されないが例えば、スープ類およびポテトチップスなどの菓子類、水産および畜産加工品、野菜類を使用した惣菜並びに調味料が挙げられ、本発明の呈味増強剤を添加することができる。従って、本発明によれば、本発明の呈味増強剤を含む飲食品が提供される。 The taste enhancer of the present invention can be enhanced in taste by adding it to food and drink. Examples of food and drink include, but are not limited to, confectionery such as soups and potato chips, processed fish and fish products, prepared vegetables using vegetables and seasonings, and the taste enhancer of the present invention is added. be able to. Therefore, according to the present invention, there is provided a food and drink containing the taste enhancer of the present invention.
実施例１：鼓索神経の神経レコーディング
本実施例では、鼓索神経の神経レコーディング法（Journal of Neurophysiology, 108：3221-3232, 2012を参照）を用いて味覚刺激の検出を試みた。
Example 1: Neural recording of chorda tympani nerve In this example, detection of taste stimulation was attempted using the chorda tympani nerve recording method (see Journal of Neurophysiology, 108: 3221-3232, 2012).
８〜１０週齢の雄性ラットをネンブタールで麻酔し、顔面側部より鼓索神経を一部露出させた。鼓索神経にその神経応答を検出できるように電極を接触させた。電極はアンプ、オシロスコープおよび応答記録装置に接続し、鼓索神経の神経応答を経時的に記録した。この麻酔下のラットの舌に味覚物質を含む２８℃の溶液を接触させて味覚物質による鼓索神経の神経応答を測定した。なお、本実施例ではSD系ラットを使用した。 Male rats of 8 to 10 weeks of age were anesthetized with Nembutal to partially expose the chorda nerve from the side of the face. The chorda tympani nerve was contacted with an electrode so as to detect the nerve response. The electrodes were connected to an amplifier, an oscilloscope and a response recording device, and the nerve response of the chorda tympani nerve was recorded over time. The tongue of this anesthetized rat was contacted with a solution at 28 ° C. containing a taste substance, and the nerve response of the chorda tympani nerve by the taste substance was measured. In the present example, SD rat was used.
上記において用いた実験装置の概要は図１に記載される通りである。また、塩化ナトリウム刺激（０．０３Ｍ）に対する神経応答の様子を図２に示す。 The outline of the experimental apparatus used above is as described in FIG. Moreover, the appearance of the neural response to sodium chloride stimulation (0.03 M) is shown in FIG.
図２に示されるように、神経応答は、塩化ナトリウムなどの味覚物質の刺激の直後に生じる電位変化として測定された。 As shown in FIG. 2, neural responses were measured as potential changes that occurred immediately after stimulation of taste substances such as sodium chloride.
このように味覚刺激は、鼓索神経の神経レコーディングにより検出可能であった。 Thus, taste stimuli were detectable by neural recordings of the chorda tympani nerve.
実施例２：スピラントールによる塩味物質に対する鼓索神経の応答の増強
本実施例では、塩味物質に対する被検化合物の呈味増強効果を鼓索神経の神経応答により検出することを試みた。
Example 2 Enhancement of Response of Chorda tympani to Salt Taste Substance by Spilantool In this example, it was attempted to detect the taste-enhancing effect of a test compound on salt taste substance by the nerve response of chorda tympani.
実施例１に記載された方法で、麻酔下のラットの舌に味覚物質として０．０１Ｍから０．３Ｍの塩化ナトリウム溶液を接触させ、塩化ナトリウムによる鼓索神経の生理学的応答を測定し、刺激から２分後に舌を水洗し、その後、４０μＭのスピラントールを添加した上記と同じ濃度の塩化ナトリウム水溶液を舌に接触させて鼓索神経の生理学的応答を測定した。０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液における測定結果を図３Ａに示す。図３Ａに示されるように、スピラントールを添加した溶液では、鼓索神経の神経応答が増強されることが分かった。 The tongue of a rat under anesthesia is brought into contact with a sodium chloride solution of 0.01 M to 0.3 M as a taste substance by the method described in Example 1, and the physiological response of the chorda tympani nerve with sodium chloride is measured and stimulated. Two minutes after, the tongue was washed with water, and then the physiological response of the chorda tympani nerve was measured by bringing the tongue into contact with an aqueous solution of sodium chloride of the same concentration as above added with 40 μM spirantol. The measurement results in 0.1 M sodium chloride solution are shown in FIG. 3A. As shown in FIG. 3A, it was found that the solution to which spilanthol was added enhanced the nerve response of the chorda tympani nerve.
本実施例では、生理学的応答値は、各刺激に対する神経電位の変化を経時的にモニタリングした応答曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）として算出した。なお、ＡＵＣは、刺激から２分間にわたり測定した神経電位の曲線下面積とした。また、得られた生理学的応答値は、測定毎に発生する誤差を是正するため４℃の冷水刺激に対する応答値で除することで標準化した。その結果、図３Ｂに示されるように、０．０１Ｍおよび０．０４Ｍの塩化ナトリウム水溶液ではスピラントールによる塩味の増強効果に有意差が見られた。 In the present example, the physiological response value was calculated as the area under the curve (AUC) of a response curve in which changes in nerve potential for each stimulus were monitored over time. In addition, AUC was made into the area under the curve of the nerve potential measured over 2 minutes from stimulation. Moreover, the physiological response value obtained was standardized by dividing by the response value to cold water stimulation at 4 ° C. in order to correct an error generated for each measurement. As a result, as shown in FIG. 3B, significant differences were observed in the saltiness enhancing effect of spilanthol in 0.01 M and 0.04 M sodium chloride aqueous solutions.
スピラントールは、三叉神経を刺激する刺激物質として知られ、鼓索神経を刺激するものではない。にもかかわらず、鼓索神経の神経増強がスピラントールにより引き起こされたことは驚くべき発見であった。 Spiranthol is known as a stimulator that stimulates the trigeminal nerve, and does not stimulate the chorda tympani nerve. Nevertheless, it was a surprising finding that Spilantol caused the tyropodal nerve enhancement.
実施例３：スピラントールによる塩味物質に対する鼓索神経応答の増強と官能評価への影響
本実施例では、スピラントールの官能特性に及ぼす影響と、実施例２で示された鼓索神経応答との関連を調べた。
Example 3: Enhancement of chorda tympani nerve response to salty substances by spiranthol and influence on sensory evaluation In this example, the relationship between the effect on pilanthol sensory characteristics and the chorda tympani nerve response shown in Example 2 is shown. Examined.
鼓索神経の神経応答は、実施例１および２に記載の通り測定した。 The nerve response of the chorda tympani nerve was measured as described in Examples 1 and 2.
用いた塩化ナトリウム溶液において、塩化ナトリウム濃度は、０．２重量％とし、スピラントール濃度は、０、５、２０、４０、６０または９０μＭとした。０．２重量％塩化ナトリウム刺激による生理学的応答のスピラントールによる増強度合いは、スピラントールを含む塩化ナトリウム水溶液に対するＡＵＣの平均値を、スピラントールを含まない塩化ナトリウム水溶液に対するＡＵＣの平均値で除すことで算出した。 In the sodium chloride solution used, the sodium chloride concentration was 0.2% by weight, and the spilanthol concentration was 0, 5, 20, 40, 60 or 90 μM. The degree of enhancement by Spirantol of the physiological response by 0.2% by weight sodium chloride stimulation is calculated by dividing the average value of AUC for sodium chloride solution containing spilanthol by the average value of AUC for sodium chloride solution without spilantol. did.
また、本実施例では、神経レコーディングに加えて、１８人のパネリストによる官能評価を実施した。官能評価は、舌半分試験（Half-tongue test）により下記の通り行った。まず、各パネリストの舌を縦に２つの領域に区分けし、片側にのみスピラントールを上記の濃度で混合した水溶液を塗布し、他方の片側にはスピラントールを含まない水溶液を塗布した。次いで、舌全体を０．２重量％の塩化ナトリウム溶液に浸して塩味の強い方を各パネリストに選択させた。そして、スピラントールを含む水溶液を塗布した側を正確に選択できたパネリスト（正解者）数を求めた。 Moreover, in this example, in addition to the nerve recording, sensory evaluation by 18 panelists was performed. Sensory evaluation was performed as follows by the tongue half test (Half-tongue test). First, the tongue of each panelist was divided vertically into two regions, an aqueous solution in which spiranthol was mixed at the above concentration was applied only to one side, and an aqueous solution containing no spirantol was applied to the other side. Then, the whole tongue was immersed in a 0.2% by weight sodium chloride solution to allow each panelist to select the more salty one. Then, the number of panelists (correct persons) who correctly selected the side coated with the aqueous solution containing spiranthol was determined.
結果は、表１の通りであった。
表１に示されるように、非ヒト動物を用いた神経レコーディング法において、５μＭから４０μＭのスピラントール溶液単独では鼓索神経の生理学的応答を示さなかったが、０．２重量％の塩化ナトリウム溶液中では、塩化ナトリウムに対する鼓索神経の生理学的応答を増強した。これは表中の０．２重量％塩化ナトリウム刺激による生理学的応答におけるスピラントールによる増強度合いが１．０倍以上であることから確認できる。一方で、官能評価では、添加されたスピラントール濃度の上昇に伴い、スピラントールを添加した塩溶液を塩味が強いと回答するパネリストが増加し、２０μＭから９０μＭのスピラントール溶液では統計処理により有意差ありとの結果を得た。なお、統計処理は２項分布における等確率の両側検定を有意水準５％で行った。特に、２０μＭから４０μＭのスピラントール溶液は鼓索神経の生理学的応答を示さないが、官能評価においては、塩味の増強効果があることが示された。 As shown in Table 1, in the nerve recording method using non-human animals, 5 μM to 40 μM spirantole solution alone did not exhibit physiological responses to the chorda tympani nerve, but in 0.2% by weight sodium chloride solution , Enhanced the physiological response of the chorda tympani to sodium chloride. This can be confirmed from the fact that the enhancement by spirantole in the physiological response by 0.2 wt% sodium chloride stimulation in the table is 1.0 or more. On the other hand, in sensory evaluation, the panelists who answered that the salt solution added with spirantol is strongly salty increase with the increase of the added spilanthol concentration, and it is considered that there is a significant difference in statistical processing with 20 μM to 90 μM spirantol solution I got the result. For statistical processing, two-sided test of equal probability in binomial distribution was performed at a significance level of 5%. In particular, although 20 μM to 40 μM spirantole solution did not exhibit physiological responses to the chorda tympani nerve, it was shown that it has an enhancing effect on saltiness in sensory evaluation.
また、表１に示されるように、５μＭのスピラントール溶液は、非ヒト動物を用いた神経レコーディング法における生理学的応答のスピラントールによる増強度合いが１．１であり塩化ナトリウムに対する応答の増強効果を呈したが、官能評価では、同濃度においてスピラントールの増強効果は測定されなかった。一方、スピラントールを２０μＭ以上としたときには、非ヒト動物を用いた鼓索神経の生理学的応答と官能評価との両方で増強効果が見られた。スピラントールが２０μＭのときの生理学的応答の増強度合いは１．３であることから、ヒトが呈味増強効果を体感するには神経レコーディング法の生理学的応答値の増強度合いが１．３以上であることが必要と分かった。このように、非ヒト動物の鼓索神経を用いた神経レコーディング法における生理学的応答を測定することにより、ヒトの官能評価を代替可能であることが明らかとなった。 In addition, as shown in Table 1, the 5 μM spirantole solution exhibited a potentiating effect on the response to sodium chloride, with the degree of enhancement by spilanthol of physiological response in the nerve recording method using non-human animals being 1.1. However, the sensory evaluation did not measure the enhancement effect of spilanthol at the same concentration. On the other hand, when spiranthol was 20 μM or more, an enhancing effect was observed in both the physiological response and sensory evaluation of the chorda tympani nerve using non-human animals. Since the degree of enhancement of the physiological response when spiranthol is 20 μM is 1.3, the degree of enhancement of the physiological response value of the nerve recording method is 1.3 or more in order for the human to experience the taste enhancing effect It turned out that it was necessary. Thus, by measuring the physiological response in the nerve recording method using the chorda tympani nerve of non-human animals, it has become clear that it is possible to substitute human sensory evaluation.
これらの結果から、刺激物質による塩味の増強効果は、鼓索神経の生理学的応答を検出することにより決定することが可能であることが明らかとなり、鼓索神経の生理学的応答がヒトの官能評価を代替できることや、ヒトによる官能評価を経ずに塩味の増強効果を有する物質の探索が可能になることが示された。 From these results, it becomes clear that the enhancing effect of saltiness by the stimulant can be determined by detecting the physiological response of the chorda tympani nerve, and the physiological response of the chorda tympani nerve is human sensory evaluation It has been shown that it is possible to search for substances having an enhancing effect on saltiness without being subjected to sensory evaluation by humans.
また、一方で、スピラントールは、５〜４０μＭの濃度では鼓索神経に生理学的応答を生じさせることはなかった（表１）。 Also, on the other hand, Spilantol did not produce a physiological response to the chorda tympani nerve at a concentration of 5 to 40 μM (Table 1).
このことから、スピラントールの塩味増強効果は、鼓索神経を刺激しない濃度（例えば、２０μＭ〜４０μＭ）で用いても、塩味を増強させることができることが明らかとなった。 From this, it has become clear that the saltiness enhancing effect of spilanthol can be enhanced even when used at a concentration that does not stimulate the chorda tympani nerve (for example, 20 μM to 40 μM).
実施例４：塩味増強におけるアミロライドの影響
本実施例では、スピラントールによる塩味増強作用に、上皮型ナトリウムイオンチャネル（ＥＮａＣ）が関与するか否かを調べた。
Example 4: The effect of amiloride on saltiness enhancement In this embodiment, it was examined whether the epithelial sodium ion channel (ENaC) was involved in the saltiness enhancement by spiranthol.
本実施例では、ＥＮａＣのアンタゴニストであるアミロライドを用いてＥＮａＣの関与を確認した。具体的には、塩味に対する生理学的応答における４０μＭスピラントールによる増強効果をアミロライドが消失させるか否かを確認した。鼓索神経の生理学的応答の測定および塩味増強度合いの算出は、実施例３と同様に行った。結果は図４に示される通りであった。 In this example, participation of ENaC was confirmed using amiloride which is an antagonist of ENaC. Specifically, it was confirmed whether amiloride abolished the potentiating effect of 40 μM spirantol on the physiological response to saltiness. Measurement of the physiological response of the tympanic nerve and calculation of the degree of saltiness enhancement were performed in the same manner as in Example 3. The results were as shown in FIG.
図４に示されるように、スピラントールによる塩味増強度合いは、アミロライド存在下でも確認された。また、アミロライド存在下における塩味増強度合いと非存在下における塩味増強度合いには明確な差は確認されなかった。このことから、塩味の増強には、塩味の代表的な受容体であるＥＮａＣは関与していないことが示唆された。なお、本実施例では、アミロライド（シグマアルドリッチ社製、製品番号：Ａ７４１０）は、濃度１００μＭで用いた。 As shown in FIG. 4, the degree of saltiness enhancement by spilanthol was also confirmed in the presence of amiloride. Also, no clear difference was found between the saltiness enhancement degree in the presence of amiloride and the saltiness enhancement degree in the absence. This suggests that enhancement of saltiness does not involve ENaC, a typical receptor for saltiness. In the present example, amiloride (manufactured by Sigma Aldrich, product number: A7410) was used at a concentration of 100 μM.
上記実施例から、非ヒト動物の鼓索神経における生理学的応答を測定することにより、ヒトの呈味に関する官能評価を代替することができることが明らかとなった。これにより、呈味の増強の有無を客観的に判定することが可能となった。これは、判定の正確さを向上させる点で、あるいは、大量な被検化合物のスクリーニングが容易となる点で、重要な利点となる。 From the above examples, it has become clear that measuring the physiological response in the chorda tympani nerve of non-human animals can replace sensory evaluation on human taste. This makes it possible to objectively determine the presence or absence of taste enhancement. This is an important advantage in that it improves the accuracy of determination or facilitates screening of a large amount of test compounds.
実施例５：インビトロにおける塩味増強度合いの測定
本実施例では、単離した味覚受容体細胞を用いて塩味増強度合いの測定を試みた。
Example 5 Measurement of Saltiness Enhancement Degree in Vitro In this example, measurement of saltiness enhancement degree was attempted using isolated taste receptor cells.
まず、マウスより切除した舌を、酵素混合溶液（０．２％トリプシン(シグマアルドリッチ、T6522)、０．２％ディスパーゼII（Roche, 14052400、０．２％エラスターゼ(Worthington、32P13828)）にて直接処理し有郭乳頭を含むマウス舌上皮を剥離させた。これを２分間上記の酵素溶液で処理した後、カルシウム、マグネシウムフリーのＴｙｒｏｄｅ溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ グルコース、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ７．２〜７．４）、３１０〜３２０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌ）で５分間処理した。滅菌処理したマイクロピペットで味蕾を注意深く吸引した。単離した味蕾をトリプシン（０．２５％）溶液で１０分間処理したあとマイクロピペットで２０回ピペッティングして味覚細胞を解離させ、レコーディングチャンバーに移した。Ｆｕｒａ−２ＡＭ（５μＭ）を細胞に４５分間接触させて、細胞内に導入した。精製した味覚細胞を導入したチャンバーにＴｙｒｏｄｅ溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ グルコース、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ７．２〜７．４）、３１０〜３２０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌ）を潅流した。 First, the tongue excised from the mouse was directly treated with an enzyme mixture solution (0.2% trypsin (Sigma Aldrich, T6522), 0.2% dispase II (Roche, 14052400, 0.2% elastase (Worthington, 32P13828)) After treating the mouse tongue epithelium containing the lava papillae and exfoliating the mouse tongue, treated with the above enzyme solution for 2 minutes, calcium, magnesium free Tyrode solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 10 mM pyruvine Treated with sodium acid, 5 mM NaHCO 3 (pH 7.2-7.4), 310-320 mosmol / L) for 5 minutes, carefully aspirated the miso with a sterile micropipette, isolated the miso with trypsin (0.25 Treatment with solution for 10 minutes and then pipetting 20 times with a micropipette The phagocytes were dissociated and transferred to the recording chamber Fura-2AM (5 μM) was brought into contact with the cells for 45 minutes and introduced into the cells Tyrode solution (140 mM NaCl, 5 mM KCl) was introduced into the chamber into which the purified taste cells were introduced. , 2 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 10 mM sodium pyruvate, 5 mM NaHCO 3 (pH 7.2 to 7.4, 310 to 320 mosmol / L).
その後、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で刺激し、続いて１μＭ、３μＭまたは６μＭの被検化合物としてのスピラントール単独で刺激し、次いでスピラントールを含有する１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液で刺激した。各刺激を添加した時の細胞の応答強度は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで励起した場合の５１０ｎｍの蛍光強度をＣＣＤカメラで検出し、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ（Universal Imaging Corp., Downingtown, PA, USA）により自動計算される比率Ｆ３４０／Ｆ３８０として求めた。塩味増強の指標としては、スピラントールを含む場合の前記比率の平均値を、スピラントールを含まない場合の応答の平均値で除した値を用いた。 Thereafter, stimulation was carried out with 140 mM sodium chloride solution, followed by stimulation with 1 μM, 3 μM or 6 μM testant alone as spilanthol, and then stimulation with 140 mM sodium chloride solution containing spilanthol. Response intensities of cells upon addition of each stimulus are automatically calculated by Metafluor (Universal Imaging Corp., Downingtown, PA, USA), with the fluorescence intensity at 510 nm excited at 340 nm and 380 nm detected by a CCD camera. It calculated | required as ratio F340 / F380. As an index of saltiness enhancement, a value obtained by dividing the average value of the ratio in the case of containing spilanthol by the average value of the response in the case of not containing spilanthol was used.
結果は、図５に示される通りであった。スピラントールは、３μＭおよび６μＭで用いると、１４０ｍＭ塩化ナトリウム溶液の刺激による細胞内へのカルシウム流入を増大させた。また、スピラントールの官能特性に及ぼす影響と、実施例５で示された味覚細胞の生理学的応答との関連を、実施例３に記載した舌半分試験を実施して確認した。 The results were as shown in FIG. Spilanthol, when used at 3 μM and 6 μM, increased calcium influx into cells upon stimulation with 140 mM sodium chloride solution. Also, the relationship between the influence on the sensory characteristics of spiranthol and the physiological response of taste cells shown in Example 5 was confirmed by conducting the tongue half test described in Example 3.
結果は表２に示される通りであった。 The results are as shown in Table 2.
表２に示されるように、３〜６μＭのスピラントール溶液は、単独で用いても味覚細胞へのカルシウム流入を引き起こさなかったが、１４０ｍＭ塩化ナトリウムの存在下では味覚細胞へのカルシウム流入を増大させた。また、３〜６μＭのスピラントールによる塩味増強効果は、ヒトによる官能評価によっても確認された。 As shown in Table 2, 3-6 μM spirantole solution did not cause calcium influx to taste cells when used alone, but increased calcium influx to taste cells in the presence of 140 mM sodium chloride . In addition, the saltiness enhancing effect of 3 to 6 μM spilanthol was also confirmed by sensory evaluation by humans.
この結果から、インビトロでも、単独では呈味を奏さない呈味増強剤のスクリーニングが可能であることが明らかとなった。 From these results, it has become clear that screening of taste enhancers that do not taste alone can be performed even in vitro.
Claims (10)
（ａ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｂ）得られた水溶液を非ヒト動物の舌に接触させることと、
（ｃ）上記接触により発生する鼓索神経の生理学的応答を検出することと、
（ｄ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと、
（ｅ１）呈味を増強する化合物から、その化合物自体が味覚受容体に反応しないことを指標として化合物を選択すること、および／または（ｅ２）鼓索神経に対して生理学的応答を生じさせない濃度で呈味を増強する化合物を選択することと
を含み、前記被検化合物は、オランダセンニチ、カプシカム（トウガラシ）、ペッパー（コショウ）、ジンジャー（ショウガ）、オニオン（タマネギ）、ガーリック（ニンニク）、マスタード（カラシ）、ワサビ、ダイコン、及びサンショウからなる群から選択される香辛料に含まれる刺激物質若しくは当該刺激物質を含む香辛料抽出物であるか、または、スピラントール、ピペリン、ジンゲロール、ショーガオール、アリルイソチオシアネート及びα−サンショオール並びにこれらの類縁体からなる群から選択される刺激物質である、
を含む、スクリーニング方法。 A method for in vivo screening of compounds that enhance taste using non-human animals, comprising:
(A) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(B) bringing the obtained aqueous solution into contact with the non-human animal's tongue;
(C) detecting the physiological response of the chorda tympani nerve generated by the contact;
(D) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound ,
(E1) selecting a compound from compounds that enhance taste based on the fact that the compound itself does not respond to taste receptors, and / or (e2) a concentration that does not produce a physiological response to the chorda tympani nerve in viewing including the <br/> and selecting a compound that enhances the taste, the test compound, Netherlands Sen Nitinol, capsicum (pepper), pepper (black pepper), ginger (ginger), onion (onion), A stimulant contained in a spice selected from the group consisting of garlic (garlic), mustard (horseradish), wasabi, radish, and salamander or a spice extract containing the stimulant, or spilanthol, piperine, gingerol , Shogaol, allyl isothiocyanate and α-sanshool and their analogs A stimulator which is selected from that group,
Screening methods, including:
（ｉ）被検化合物と、味覚物質を含む水溶液とを混合することと、
（ｉｉ）得られた水溶液を味覚細胞に接触させることと、
（ｉｉｉ）上記接触により発生する味覚細胞の生理学的応答を検出することと、
（ｉｖ）被検化合物存在時の生理学的応答の強度が、被検化合物非存在時の生理学的応答の強度よりも高まることを指標として呈味を増強する化合物を選択することと、
（ｖ）呈味を増強する化合物から、その化合物自体が味覚受容体に反応しないことを指標として化合物を選択することと
を含み、前記被検化合物は、オランダセンニチ、カプシカム（トウガラシ）、ペッパー（コショウ）、ジンジャー（ショウガ）、オニオン（タマネギ）、ガーリック（ニンニク）、マスタード（カラシ）、ワサビ、ダイコン、及びサンショウからなる群から選択される香辛料に含まれる刺激物質若しくは当該刺激物質を含む香辛料抽出物であるか、または、スピラントール、ピペリン、ジンゲロール、ショーガオール、アリルイソチオシアネート及びα−サンショオール並びにこれらの類縁体からなる群から選択される刺激物質である、
スクリーニング方法。 A method for in vitro screening of compounds that enhance taste using taste cells, comprising:
(I) mixing a test compound with an aqueous solution containing a taste substance;
(Ii) bringing the obtained aqueous solution into contact with taste cells;
(Iii) detecting the physiological response of taste cells generated by the contact;
(Iv) selecting a compound that enhances taste based on the fact that the strength of the physiological response in the presence of the test compound is higher than the strength of the physiological response in the absence of the test compound ,
(V) a compound that enhances the taste, look including the <br/> and selecting a compound that the compound itself does not react to the taste receptors as an index, the test compound, Netherlands Sen Nitinol, capsicum (Pepper pepper), pepper (pepper), ginger (shoga), onion (onion), garlic (garlic), mustard (bastard), wasabi, radish, stimulant contained in a spice selected from the group consisting of salamanders A spice extract comprising the stimulant, or a stimulant selected from the group consisting of spiranthol, piperine, gingerol, shogaol, allyl isothiocyanate and α-sanshool and analogues thereof,
Screening method.
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