JP6539729B2

JP6539729B2 - Peptide-drug complex

Info

Publication number: JP6539729B2
Application number: JP2017516251A
Authority: JP
Inventors: チュウ・シャオソン
Original assignee: Jiaray Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Jiaray Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2019-07-03
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: MA40030A; CN106456799A; ES2857192T3; EP3152223B1; CA2951049A1; AU2015270924A1; JP2017521486A; US20150343083A1; WO2015187540A1; AU2015270924B2; US9579317B2; CN106456799B; JP2019189623A; EP3152223A4; EP3152223A1; US20170232023A1; CA2951049C

Description

本発明は、腫瘍特異的ペプチド−薬物複合体及びこの複合体を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、このような複合体及び組成物の、哺乳動物、特にヒトの癌の治療のための抗腫瘍薬としての使用に関する。
The present invention, tumor-specific peptide - a pharmaceutical composition comprising a drug matrix composite and this composite. The invention further relates to the use of such complexes and compositions as antineoplastic agents for the treatment of cancer in mammals, in particular in humans.

癌性細胞は、多くの場合、正常細胞と比較して、ある特定のプロテアーゼを過発現する。このことは、細胞障害性治療薬を、腫瘍プロテアーゼが切断するペプチドに結合させて、正常な細胞に危害を与えずまたは及ぼす影響を実質的に少なくしながら、細胞胞障害性薬を癌性細胞近くで、または癌性細胞内で放出させることによって、癌性細胞を標的化する努力を促した。 Cancerous cells often overexpress certain proteases as compared to normal cells. This combines a cytotoxic therapeutic agent with a peptide that is cleaved by a tumor protease to substantially reduce or not harm normal cells while causing a cytopathic agent to be a cancerous cell. The effort to target cancerous cells was encouraged by releasing it in the vicinity or in cancerous cells.

特許文献１では、自壊性リンカーを含み、腫瘍の部位において選択的に活性化される腫瘍特異的ペプチド−薬物複合体を開示し、この薬物は、マイトマイシンまたはドキソルビシンであり、自壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルアルコールである。
アスパラギナーゼを発現する細胞は、多くの腫瘍がこれらのプロテアーゼを過発現するために、ペプチド−薬物複合体アプローチのための魅力的な標的となっている。このようなアスパラギナーゼの１つであるレグマインは、これに関して特に注目を集めている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
マイトマイシン、ドキソルビシン及びカンプトテシンは、ペプチド−薬物複合体療法で使用される薬物として注目を集めている。特許文献２、特許文献３、特許文献４、及び特許文献５では、ドキソルビシンを含む薬物でレグマインを標的とするペプチド−薬物複合体の例を開示している。 Patent Document 1 discloses a tumor-specific peptide-drug complex that contains a self-destructing linker and is selectively activated at the site of a tumor, the drug is mitomycin or doxorubicin, and the self-destructing linker is p -Aminobenzyl alcohol.
Asparaginase-expressing cells are attractive targets for peptide-drug complex approaches because many tumors overexpress these proteases. One such asparaginase, legumain, has drawn particular attention in this regard (Non-Patent Document 1; Non-Patent Document 2; Non-Patent Document 3; Non-Patent Document 4).
Mitomycin, doxorubicin and camptothecin attract attention as drugs used in peptide-drug complex therapy. Patent documents 2, patent documents 3, patent documents 4 and patent documents 5 disclose examples of peptide-drug conjugates that target legumain with a drug containing doxorubicin.

上記参考文献のそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれている。 Each of the above references is incorporated herein by reference in its entirety.

これらの以前のアプローチは、一般的に、薬物部分の化学修飾を伴い、これは薬物の効力に悪影響を及ぼす可能性がある。ペプチドがマイトマイシンのアジリジンＮ原子へ直接結合することによって、二級アミド、すなわち、通常、プロテアーゼによる攻撃を受けない官能基がもたらされる。さらに、マイトマイシンに関する研究によって、生物活性に対するアジリジン環中のＮＨ基の役割が示唆されている。したがって、レグマイン及び他のアスパラギナーゼを発現する腫瘍細胞に対するマイトマイシンなどの抗腫瘍薬を標的とする複合体を改善する必要がある。 These previous approaches generally involve chemical modification of the drug moiety, which can adversely affect the efficacy of the drug. Direct attachment of the peptide to the aziridine N atom of mitomycin results in a secondary amide, ie a functional group which is usually not attacked by proteases. Furthermore, studies on mitomycin have suggested a role for the NH group in the aziridine ring on biological activity. Thus, there is a need to improve complexes targeting antineoplastic agents such as mitomycin to tumor cells expressing legumain and other asparaginases.

米国特許第６，２１４，３４５号明細書U.S. Patent No. 6,214,345 米国特許第７，６０８，５９１号明細書U.S. Patent No. 7,608,591 米国特許出願公開第２０１１０３００１４７号明細書US Patent Application Publication No. 20110300147 米国特許出願公開第２００９０１７５８７３号明細書U.S. Patent Application Publication 20090175873 米国特許第８，３１４，０６０号明細書U.S. Pat. No. 8,314,060

Ｗｕｅｔａｌ．，ＣｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００６；６６：９７０−９８０Wu et al. , Cncer Research 2006; 66: 970-980. Ｌｉｕｅｔａｌ．，ＶｍｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ２００３；６３：２９５７−２９６４Liu et al. , Vmcer Research 2003; 63: 2957-2964 Ｂａｊｊｕｒｉｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２０１１；６：．ｄｏｉ：１０：１００２／ｃｍｄｃ．２０１０００４７８Bajjuri et al. ChemMed Chem. 2011; 6:. doi: 10: 1002 / cmdc. 201000478 ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３５４９５９２／ｐｄｆ／ｎｉｈｍ５４−５９ｓ−３４０２６８．ｐｄｆ．http // www. ncbi. nlm. nih. gov / pmc / articles / PMC3549592 / pdf / nihm54-59s-340268. pdf.

ヒト血漿に曝されたときのＮ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[本明細書では複合体８]の減衰速度を時間の関数として示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the rate of decay of N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [herein complex 8] as a function of time when exposed to human plasma. Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシンの投与後のＢａｌｂ／マウスの体重を時間の関数として示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the body weight of Balb / mouse as a function of time after administration of N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin. Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン投与後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける皮下ＣＴ−２６同質遺伝子型結腸癌モデルの腫瘍成長曲線を示すグラフである。FIG. 16 is a graph showing a tumor growth curve of a subcutaneous CT-26 isogenic colon cancer model in Balb / c mice after administration of N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin.

本発明のある特定の実施形態は、ペプチド−薬物複合体である。このような複合体は、一般的に、１）細胞プロテアーゼによって切断され得るペプチド部分を含み、これが２）自壊性リンカー、特に、ｐ−アミノベンジルカルバモイルまたはｐ−アミノベンジルカルボネート部分に結合し、これが次に、３）細胞障害性薬部分に結合する。これらの実施形態では、リンカー部分は、アスパラギン残基に連結し、この部分でタンパク質分解切断が起こる。 One particular embodiment of the invention is a peptide-drug complex. Such complexes generally comprise: 1) a peptide moiety which can be cleaved by cellular proteases, 2) attached to a self-destructing linker, in particular to a p-aminobenzylcarbamoyl or p-aminobenzylcarbonate moiety, This then binds to 3) the cytotoxic drug moiety. In these embodiments, the linker moiety is linked to an asparagine residue at which proteolytic cleavage occurs.

特定の実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、以下の式Ｉ：
Ｒ−Ｙ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｄ（式Ｉ）
の構造を有し、
式中、
Ｒは、
ｉ）１〜約５個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、Ｃ_１〜約Ｃ_２０の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基、
ｉｉ）１〜約５０個のＬ−またはＤ−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
ｉｉｉ）４００〜約４０，０００の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Ｙは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ａｓｎは、アスパラギン残基であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、ｐ−アミノベンジルカルバモイル部分またはｐ−アミノベンジルカルボネート部分であり、
Ｄは、リンカー部分に結合した抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、マイトマイシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、９−アミノ−カンプトテシン、Ｎ^８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、ポドフィラトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルホリン−ドキソルビシン、ｎ−（５，５−ジアセトキシ−ペンチル）ドキソルビシン、及びこれらの誘導体からなる群から選択される。 In certain embodiments, the peptide-drug complex has the following Formula I:
R-Y-Z-Asn-Linker-D (Formula I)
Have the structure of
During the ceremony
R is
i) from a C ₁ to about C ₂₀ linear, branched or alicyclic carboxylic acid optionally substituted with 1 to about 5 hydroxyl, amine, carboxyl, sulfonic acid or phosphoryl groups Derived acyl, carbamoyl, sulfonyl, phosphoryl or alkyl groups,
ii) a substituent selected from the group consisting of: a peptide having 1 to about 50 L- or D-amino acid residues; and iii) a polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to about 40,000,
Y is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr, Phe,
Z is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Asn and Pro;
Asn is an asparagine residue,
Linker is a p-aminobenzylcarbamoyl moiety or a p-aminobenzylcarbonate moiety,
D is an antitumor drug moiety linked to a linker moiety, and the drug is mitomycin, doxorubicin, aminopterin, actinomycin, bleomycin, 9-amino-camptothecin, N ⁸ -acetylspermidine, 1- (2-chloroethyl) -1,2-dimethanesulfonylhydrazide, thalismomycin, cytarabine, etoposide, camptothecin, taxol, esperamicin, podophyllatoxin, anguidine, vincristine, vinblastine, morpholine-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl) doxorubicin, And derivatives thereof.

式Ｉの特定の実施形態では、
Ｒは、
ｉ）１〜約５個のヒドロキシル、アミン、カルボキシル、スルホン酸、またはホスホリル基で任意に置換された、Ｃ１〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、
ｉｉ）１〜約５０個のＬ−またはＤ−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
ｉｉｉ）４００〜約４０，０００の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Ｙは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ａｓｎは、アスパラギン残基であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、ｐ−アミノベンジルカルバモイル部分であり、
Ｄは、抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、マイトマイシン及びドキソルビシンから選択される。 In certain embodiments of Formula I
R is
i) Acyl groups derived from C1 to about C20 linear, branched or alicyclic carboxylic acids, optionally substituted with 1 to about 5 hydroxyl, amine, carboxyl, sulfonic acid or phosphoryl groups,
ii) a substituent selected from the group consisting of: a peptide having 1 to about 50 L- or D-amino acid residues; and iii) a polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to about 40,000,
Y is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr, Phe,
Z is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Asn and Pro;
Asn is an asparagine residue,
Linker is a p-aminobenzylcarbamoyl moiety,
D is an antitumor drug moiety, which is selected from mitomycin and doxorubicin.

式Ｉの他の特定の実施形態では、
Ｒは、
ｉ）１〜約５個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、Ｃ１〜約Ｃ２０の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基、
ｉｉ）１〜約５０個のＬ−またはＤ−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
ｉｉｉ）４００〜約４０，０００の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Ｙは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ｚは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ａｓｎは、アスパラギン残基であり、
Ｌｉｎｋｅｒは、ｐ−アミノベンジルカルボネート部分であり、
Ｄは、リンカー部分に結合した抗腫瘍薬部分であり、この薬物は、カンプトテシンである。 In other specific embodiments of Formula I
R is
i) derived from a C1 to about C20 linear, branched or alicyclic carboxylic acid optionally substituted with 1 to about 5 hydroxyl, amine, carboxyl, sulfonic acid or phosphoryl groups; Acyl group, carbamoyl group, sulfonyl group, phosphoryl group or alkyl group,
ii) a substituent selected from the group consisting of: a peptide having 1 to about 50 L- or D-amino acid residues; and iii) a polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to about 40,000,
Y is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr, Phe,
Z is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Asn and Pro;
Asn is an asparagine residue,
Linker is a p-aminobenzyl carbonate moiety,
D is an antineoplastic drug moiety linked to a linker moiety, which is a camptothecin.

さらなる実施形態では、本発明は、式ＩＩ：
Ｄ’−Ｌｉｎｋｅｒ−Ａｓｎ−Ｚ−Ｙ−Ｒ’−Ｙ−Ｚ−Ａｓｎ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｄ（式ＩＩ）
に示される式の二量体ペプチド−薬物複合体を含み、
式中、Ｄ及びＤ’は、互いに同一または異なる細胞障害性薬部分であり、マイトマイシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、９−アミノ−カンプトテシン、Ｎ^８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、ポドフィラトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルホリン−ドキソルビシン、ｎ−（５，５−ジアセトキシ−ペンチル）ドキソルビシン、及びこれらの誘導体からなる群から独立して選択され、
Ｌｉｎｋｅｒは、ｐ−アミノベンジルカルバメート部分またはｐ−アミノベンジルカルボネート部分であり、これらのリンカーは、同一であっても異なってもよく、
Ｒ’は、
ｉ）１〜約５個のヒドロキシル基、アミン基、カルボキシル基、スルホン酸基、またはホスホリル基で任意に置換された、Ｃ_１〜約Ｃ_２０の直鎖、分岐鎖または脂環式カルボン酸から誘導されたアシル基、カルバモイル基、スルホニル基、ホスホリル基またはアルキル基から選択されるビス−官能基、
ｉｉ）１〜約５０個のＬ−またはＤ−アミノ酸残基を有するペプチド、及び
ｉｉｉ）４００〜約４０，０００の分子量を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される置換基を含み、
Ｙは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基であり、
Ａｓｎは、アスパラギン残基であり、
Ｚは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基であ
る。 In a further embodiment, the present invention provides compounds of formula II:
D'-Linker-Asn-Z-Y-R'-Y-Z-Asn-Linker-D (Formula II)
A dimeric peptide-drug complex of the formula shown in
In the formula, D and D ′ are the same or different cytotoxic drug moieties, and mitomycin, doxorubicin, aminopterin, actinomycin, bleomycin, 9-amino-camptothecin, N ⁸ -acetylspermidine, 1- (2- (2-) Chloroethyl) -1,2-dimethanesulfonylhydrazide, talisomycin, cytarabine, etoposide, camptothecin, taxol, espelamicin, podophyllatoxin, anguidine, vincristine, vinblastine, morpholine-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl) Independently selected from the group consisting of doxorubicin, and derivatives thereof,
Linker is p-aminobenzyl carbamate moiety or p-amino benzyl carbonate moiety, and these linkers may be the same or different.
R 'is
i) from a C ₁ to about C ₂₀ linear, branched or alicyclic carboxylic acid optionally substituted with 1 to about 5 hydroxyl, amine, carboxyl, sulfonic acid or phosphoryl groups Bis-functional groups selected from derived acyl, carbamoyl, sulfonyl, phosphoryl or alkyl groups,
ii) a substituent selected from the group consisting of: a peptide having 1 to about 50 L- or D-amino acid residues; and iii) a polyethylene glycol having a molecular weight of 400 to about 40,000,
Y is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Ser, Leu, Arg, Pro, Val, Tyr, Phe,
Asn is an asparagine residue,
Z is an amino acid residue selected from the group consisting of Ala, Thr, Asn and Pro.

当然のことながら、式ＩＩの複合体は、本質的に式Ｉの複合体の二量体型であり、標的とされた細胞または組織に対する複合体当たり細胞障害性薬の２つの分子を標的とすることができる。 It will be appreciated that the complex of formula II is essentially a dimeric form of the complex of formula I and targets two molecules of cytotoxic drug per complex to the targeted cell or tissue be able to.

さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体中に、式Ｉまたは式ＩＩの少なくとも１つのペプチド−薬物複合体を含む医薬組成物を含む。 In a further embodiment, the invention comprises a pharmaceutical composition comprising at least one peptide-drug conjugate of Formula I or Formula II in at least one pharmaceutically acceptable carrier.

さらなる実施形態では、本発明は、ヒトであり得る哺乳動物において癌を治療する方法を含み、本方法は、抗腫瘍有効量の本発明の複合体または医薬組成物を投与することを含む。 In a further embodiment, the invention comprises a method of treating cancer in a mammal, which may be human, the method comprising administering an anti-tumor effective amount of a complex or pharmaceutical composition of the invention.

本明細書で使用される「マイトマイシン」は、ストレプトマイセス・カエスピトサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）またはストレプトマイセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）から単離されたアジリジン含有薬物のファミリーのメンバーを指し、具体的には、マイトマイシンＣ及びマイトマイシンＡを含む。 As used herein, "mitomycin" refers to a member of the family of aziridine-containing drugs isolated from Streptomyces caespitoss or Streptomyces lavendulae, specifically , Mitomycin C and mitomycin A.

本明細書で使用される「ドキソルビシン」は、ストレストマイセス属細菌のストレストマイセスペウセチウス変種カエシウス（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｅｕｃｅｔｉｕｓｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）から誘導されたアントラサイクリンのファミリーのメンバーを指し、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン及びイダルビシンを含む。 As used herein, "doxorubicin" refers to a member of the family of anthracyclines derived from the stress tomyces spp. Strain Streptomyces bacteria Streptomyces peucetius var. Caesius. Including doxorubicin, daunorubicin, epirubicin and idarubicin.

本明細書で使用される「カンプトテシン」は、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａａｃｕｍｉｎａｔａ）から単離されたアルカロイドのファミリーのメンバー及びその化学的誘導体を指し、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン及びルビテカンを含む。 "Camptothecin" as used herein refers to members of the alkaloid family isolated from Camptotheca acuminata and chemical derivatives thereof, including camptothecin, irinotecan, topotecan and rubitecan.

本発明は、ペプチド部分と、ｐ−アミノベンジル−カルバモイルまたはｐ−アミノベンジルカルボネートである（自壊性リンカーに結合する薬物中に含まれる官能基のタイプに応じる）自壊性リンカーと、細胞障害性薬部分とを含む腫瘍特異的ペプチド−薬物複合体を提供する。この複合体は、実質的に不活性かつ非毒性であるという意味では、プロドラッグとして作用する。ペプチド部分は、インビボでプロテアーゼ酵素によって選択的に切断され、自壊性リンカー／細胞障害性薬部分を遊離することができる。このような酵素的切断時に、自壊性リンカーは、同時に加水分化して遊離薬物をその活性形態でもたらすが、より多くがヒト患者の腫瘍の部位などの標的化された環境を標的とする。このように、細胞障害性薬は、治療の必要がある特定部位を標的とし、標的部位以外の部位における細胞及び組織の損傷は低減される。 The present invention comprises a peptide moiety and a self-destructing linker which is p-aminobenzyl-carbamoyl or p-aminobenzyl carbonate (depending on the type of functional group contained in the drug attached to the self-destructing linker) and cytotoxic Provided is a tumor-specific peptide-drug complex comprising a drug moiety. This complex acts as a prodrug in the sense that it is substantially inactive and nontoxic. The peptide moiety can be selectively cleaved by protease enzymes in vivo to release the autogenous linker / cytotoxic drug moiety. During such enzymatic cleavage, the self-destructing linker simultaneously hydrolyzes to yield the free drug in its active form, but more targets the targeted environment, such as the site of a human patient's tumor. In this way, cytotoxic agents target specific sites in need of treatment and cell and tissue damage at sites other than the target site is reduced.

細胞障害性薬部分は、化学的反応性官能基を有し、これによって、薬物骨格が自壊性リンカーに共有結合する。細胞障害性薬を自壊性リンカーに結合させる官能基は、自壊性リンカーの加水分解時に、細胞障害性薬を、細胞障害活性化形態で放出させる。このような官能基としては、例えば、一級アミン、二級アミンまたはヒドロキシルが含まれてもよい。細胞障害性薬としては、マイトマイシン、ドキソルビシン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、９−アミノ−カンプトテシン、Ｎ^８−アセチルスペルミジン、１−（２−クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、タリソマイシン、シタラビン、エトポシド、カンプトテシン、タキソール、エスペラミシン、ポドフィラトキシン、アングイジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、モルホリン−ドキソルビシン、ｎ−（５，５−ジアセトキシ−ペンチル）ドキソルビシン、及びこれらの誘導体が含まれる。好ましい実施形態は、マイトマイシン、ドキソルビシン及び／またはカンプトテシンに基づいている。 The cytotoxic drug moiety has a chemically reactive functional group, which covalently links the drug backbone to the autogenous linker. The functional group linking the cytotoxic drug to the autogenous linker releases the cytotoxic drug in a cytotoxic activated form upon hydrolysis of the autogenous linker. Such functional groups may include, for example, primary amines, secondary amines or hydroxyls. As cytotoxic agents, mitomycin, doxorubicin, aminopterin, actinomycin, bleomycin, 9-amino-camptothecin, N ⁸ -acetylspermidine, 1- (2-chloroethyl) -1,2-dimethanesulfonyl hydrazide, thalismomycin, Cytarabine, etoposide, camptothecin, taxol, esperamicin, podophyllatoxin, angiodine, vincristine, vinblastine, morpholine-doxorubicin, n- (5,5-diacetoxy-pentyl) doxorubicin, and derivatives thereof. Preferred embodiments are based on mitomycin, doxorubicin and / or camptothecin.

薬物（Ｄ）がマイトマイシンである具体的な実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、式ＩＩＩ：
に示される構造を有する（式中Ｒは、上記で定義された通りであり、Ａｌａは、アラニン残基である）。 In a specific embodiment where drug (D) is a mitomycin, the peptide-drug complex is a compound of formula III:
(Wherein R is as defined above and Ala is an alanine residue).

薬物（Ｄ）がドキソルビシンである具体的な実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、式ＩＶ：
に示される構造を有する（式中Ｒは、上記で定義された通りであり、Ａｌａは、アラニン残基である）。 In a specific embodiment where drug (D) is doxorubicin, the peptide-drug complex is a compound of formula IV:
(Wherein R is as defined above and Ala is an alanine residue).

薬物（Ｄ）がカンプトテシンである具体的な実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、式Ｖ：
に示される構造を有する（式中Ｒは、上記で定義された通りであり、Ａｌａは、アラニン残基である）。 In a specific embodiment where drug (D) is camptothecin, the peptide-drug complex is of formula V:
(Wherein R is as defined above and Ala is an alanine residue).

薬物（Ｄ）がマイトマイシンであり、かつ薬物（Ｄ’）がドキソルビシンである二量体複合体の具体的な実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、式ＶＩ：
に示される構造を有する（式中Ｒ’は、上記で定義された通りであり、Ａｌａは、アラニン残基である）。 In a specific embodiment of the dimer complex wherein drug (D) is mitomycin and drug (D ') is doxorubicin, the peptide-drug complex is a compound of formula VI:
(Wherein R ′ is as defined above and Ala is an alanine residue).

薬物（Ｄ）がマイトマイシンであり、かつ薬物（Ｄ’）がカンプトテシンである二量体複合体の具体的な実施形態では、ペプチド−薬物複合体は、式ＶＩＩ：
に示される構造を有する（式中Ｒ’は、上記で定義された通りであり、Ａｌａは、アラニン残基である）。 In a specific embodiment of the dimeric complex wherein drug (D) is mitomycin and drug (D ') is camptothecin, the peptide-drug complex is a compound of formula VII:
(Wherein R ′ is as defined above and Ala is an alanine residue).

本発明の好ましい複合体としては、
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ｎ^α−アセトアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ｎ^α−ブチルアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ｎ^α−ヘキサンアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、及び
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン、
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン、
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン、
Ｎ^α−アセトアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン、
Ｎ^α−ブチルアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン、及び
Ｎ^α−ヘキサンアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシンン、
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン、ならびに
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシンが含まれ、式中、ＰＡＢＣは、ｐ−アミノベンジルカルバモイルリンカー部分である。 Preferred complexes of the invention are:
Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
N ^α -acetamido-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
N ^α -butylamido-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
N ^α -hexanamide-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, and N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) aminoacetic acid ] -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin,
Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin,
N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin,
N ^α -acetamido-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin,
N ^α -butyl amido-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin, and N ^α -hexanamide-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin,
N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin, as well as N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) aminoacetic acid ] -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin, wherein PABC is a p-aminobenzylcarbamoyl linker moiety.

本発明の他の好ましい複合体としては、
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン、
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン、
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン、及び
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシンが含まれ、
式中、ＰＡＢＣは、ｐ−アミノベンジルカルボネートリンカー部分である。 Other preferred complexes of the invention are:
Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin,
N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin,
N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin, and N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) aminoacetic acid ] -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin.
In the formula, PABC is a p-aminobenzyl carbonate linker moiety.

好ましい二量体複合体としては、
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^４−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−スクシンアミド、
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−ビス（Ｏ^α）−アセトアミド、
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−ビス（Ｎ^α−メチル）−アセトアミド、
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^４−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−スクシンアミド、
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−ビス（Ｏ^α）−アセトアミド、及び
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−ビス（Ｎ^α−メチル）−アセトアミドが含まれ、
式中、ＰＡＢＣは、ｐ−アミノベンジルカルバモイルまたはｐ−アミノベンジルカルボネートリンカー部分である。 As preferred dimeric complexes,
N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁴ -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-succinamide,
N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁵ -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-bis (O ^α ) -acetamide,
N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁵ -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-bis (N ^α -methyl) -acetamide,
N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁴ -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin-succinamide,
N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁵ -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin-bis (O ^α ) -acetamide, and N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁵ -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin-bis (N ^α -methyl) -acetamide is included,
In the formula, PABC is p-aminobenzylcarbamoyl or p-aminobenzylcarbonate linker moiety.

ペプチド−薬物複合体の調製
一般に、式Ｉ及び式ＩＩのペプチド−薬物複合体は、入手可能な材料及び従来の有機合成技術を用いて調製されてもよい。例えば、記載されるタイプの細胞障害性薬は、市販されているものであり、これらの合成は、科学文献に記載されている。一般的に、本発明のペプチド−薬物複合体は、薬物部分を、自壊性リンカーを介してペプチド配列に共有結合させることによって構築され得る。以下に示される調製物の具体的な合成経路は、利用され得るものを例示するものである。 Preparation of Peptide-Drug Conjugates In general, peptide-drug conjugates of Formula I and Formula II may be prepared using available materials and conventional organic synthesis techniques. For example, cytotoxic agents of the type described are commercially available and their synthesis is described in the scientific literature. In general, the peptide-drug conjugates of the invention can be constructed by covalently attaching the drug moiety to the peptide sequence via a self-destructing linker. The specific synthetic routes to the preparations shown below are illustrative of those that may be utilized.

合成スキームＩは、ペプチド−マイトマイシン複合体を生成するための合成経路を示す。
Synthetic Scheme I shows a synthetic route to generate peptide-mitomycin complexes.

合成スキーム２は、ペプチド−ドキソルビシン複合体を生成するための合成経路を示す。
Synthetic scheme 2 shows a synthetic route to generate peptide-doxorubicin complex.

合成スキーム３は、ペプチド−カンプトテシン複合体を生成するための合成経路を示す。
Synthetic scheme 3 shows a synthetic route to generate a peptide-camptothecin complex.

合成スキーム４は、ドキソルビシン−ペプチド−マイトマイシン複合体（二量体複合体）を生成するための合成経路を示す。
Synthetic scheme 4 shows a synthetic route to generate doxorubicin-peptide-mitomycin complex (dimeric complex).

合成スキーム５は、カンプトテシン−ペプチド−マイトマイシン複合体（二量体複合体）を生成するための合成経路を示す。
Synthetic scheme 5 shows a synthetic route to generate camptothecin-peptide-mitomycin complex (dimeric complex).

一般に、記載された合成反応については、下記のように行われた。
ａ）Ｆｍｏｃ及びトリチル除去、ならびにペプチドカップリングに対しては、標準ペプチド合成法が使用された。
ｂ）自壊性リンカーは、有機／水性溶媒混合物中で、ＥＥＤＱをカップリング試薬として用いて、Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎまたはトリチル保護Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎとｐ−アミノベンジルアルコールとを反応させることによって、アミノ酸に結合された。
ｃ）ｐ−アミノベンジルアルコールの活性化炭酸塩は、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメートとＮ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＯＨまたはＮ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｎ−トリチル−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＯＨとを反応させることによって得ることができた。
ｄ）マイトマイシン及びドキソルビシンのペプチド薬物複合体は、ＤＭＦ中、ＨＯＢＴの存在下で、Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＰＮＰまたはＮ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰの対応する活性化炭酸塩と反応させることによって得られた。
ｅ）カンプトテシン複合体の合成については、カンプトテシンをトリホスゲンと反応させて、インサイチュでカンプトテシンクロロホルメートを得て、次いで、これを、Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＯＨとカップリングさせて、対応するＮ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシンを得た。
ｆ）ペプチドカップリング法によって、種々の無水物、塩化アシルまたはカルボン酸によるアシル化によって、最終ペプチド−薬物複合体を得た。 In general, the described synthesis reactions were performed as follows.
a) Standard peptide synthesis methods were used for Fmoc and trityl removal, and for peptide coupling.
b) A self-destructing linker is to react N ^α -Fmoc-Asn or trityl protected N ^α -Fmoc-Asn with p-aminobenzyl alcohol in organic / aqueous solvent mixture using EEDQ as a coupling reagent Was attached to the amino acid.
c) p-aminobenzyl activation carbonate of alcohol, p- nitrophenyl chloroformate and ^{N α -Fmoc-Asn-PAB-} OH or ^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} N- trityl -Asn-PAB- It could be obtained by reacting with OH.
d) mitomycin and peptide drug conjugates of doxorubicin, in DMF, in the presence of ^{HOBT, N α -Fmoc-Asn-} PAB-PNP or ^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn-PABC-PNP the corresponding active It was obtained by reacting with carbonates.
e) For the synthesis of the camptothecin complex, camptothecin is reacted with triphosgene to obtain camptothecin chloroformate in situ, which is then coupled with N ^α -Fmoc-Asn-PAB-OH to The obtained N ^α -Fmoc-Asn-PABC-camptothecin was obtained.
f) The final peptide-drug complex was obtained by peptide coupling method and by acylation with various anhydrides, acyl chlorides or carboxylic acids.

合成された最終複合体は、シリカカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、酸／塩基沈降及び結晶化を含む種々の方法によって精製することができる。 The final complex synthesized can be purified by a variety of methods including silica column chromatography, HPLC, ion exchange chromatography, acid / base precipitation and crystallization.

最終複合体は、^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＮＭＲ、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ、ＵＶ／ＶＩＳ、及び／またはＩＲによって特徴付けることができる。 The final complex can be characterized by ¹ H-NMR, ¹³ C-NMR, MS, LC / MS, UV / VIS and / or IR.

開示された複合体の多くは、塩酸塩または他の塩として存在することができる。医薬品化学の熟練者であれば、塩の選択は重要ではないこと、他の薬学的に許容される塩を周知の方法で調製することができ、かつ医薬組成物の調製に利用することができることを理解するであろう。例えば、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ：Ｐｒｅｐｅｒｔｉｅｓ，ＳｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＵｓｅ．（Ｐ．ＨｅｉｎｒｉｃｈＳｔａｈｌ及びＣａｍｉｌｌｅＧ．Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄｓ．）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＰｕｒｅａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ２００２及びｌ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ，ｉｎ“ＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’．Ｅｄｓ．Ｊ．ＳｗａｒｂｒｉｃｋａｎｄＪ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｖｏｌ１３，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，ＨｏｎｇＫｏｎｇ１９９５，ｐｐ.４５３−４９９を参照されたい。 Many of the disclosed complexes can exist as hydrochlorides or other salts. The choice of salt is not critical to those skilled in medicinal chemistry, and other pharmaceutically acceptable salts can be prepared by known methods and can be used to prepare pharmaceutical compositions. Will understand. For example, Handbook of Pharmaceutical Salts: Preperties, Selection and Use. (P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, eds.) International Union of Pure and Applied Chemistry, Wiley-VCH 2002 and l. D. Bighley, S. M. Berge, D .; C. See Monkhouse, in "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology". Eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, Vol 13, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, pp. 453-499.

加えて、当業者であれば、様々な塩が生成されかつ使用され得ることのみならず、水和物、溶媒和物、及び多形体が、本明細書に開示される複合体から生成され得ることも理解するであろう。また、種々の同位体置換変型（例えば、重水素を水素で置換すること、^１３Ｃを炭素で置換すること、^１５Ｎを窒素で置換することにより）も容易に生成することも可能である。このような誘導体は、本開示の範囲内のものと見なされる。 In addition, one skilled in the art can not only produce and use various salts, but also hydrates, solvates, and polymorphs can be produced from the complexes disclosed herein. You will understand that. It is also possible to readily generate various isotopic variations (eg, by substituting deuterium with hydrogen, replacing ¹³ C with carbon, replacing ¹⁵ N with nitrogen). Such derivatives are considered to be within the scope of the present disclosure.

本発明の医薬組成物を調製するために、複合体の１つまたは複数が、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と組み合される。「薬学的に許容される担体」とは、薬理学的に有効な物質を投与する特定の経路に好適である生体適合性化合物を指す。これらには、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、モル浸透圧濃度を変更するための塩、封入剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透促進剤が含まれる。薬学的に許容される担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＡｌｆｏｎｓｏＲ．Ｇｅｎｎａｒｏ．ｅｄ．，１８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０）に記載されている。担体（複数可）の特定の選択は、意図される具体的な療法によって決定する。医薬組成物及びその成分のための種々の製剤が、米国特許出願公開第２０１４／００５７８４４号に記載されており、この開示は、参照により組み込まれるものとする。 To prepare a pharmaceutical composition of the invention, one or more of the conjugates are combined with at least one pharmaceutically acceptable carrier. "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to a biocompatible compound that is suitable for the particular route of administering the pharmacologically active substance. These include stabilizers, wetting agents and emulsifiers, salts for altering the osmolarity, mounting agents, buffers, and skin penetration enhancers. Examples of pharmaceutically acceptable carriers are described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro. Ed., 18 th edition, 1990). The particular choice of carrier (s) will be determined by the particular therapy intended. Pharmaceutical formulations and various formulations for the components thereof are described in US Patent Application Publication No. 2014/0057844, the disclosure of which is incorporated by reference.

複合体中の細胞障害性薬部分の選択は、治療される癌のタイプに従う。特定のタイプの癌または腫瘍の治療については、細胞障害性薬部分は、このようなタイプの癌を治療するために有効な細胞障害性薬に基づくべきである。例えば、マイトマイシンに基づく薬物複合体は、現在知られており、当該技術分野において既知であるマイトマイシン投与プロトコルに従って癌を治療するために使用されるか、またはそれに誘導されてもよい。 The choice of cytotoxic drug moiety in the complex depends on the type of cancer being treated. For the treatment of certain types of cancer or tumor, the cytotoxic drug moiety should be based on cytotoxic drugs effective to treat such type of cancer. For example, mitomycin-based drug conjugates are currently known and may be used or induced to treat cancer according to mitomycin administration protocols known in the art.

本発明の複合体、組成物、及び方法は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、食道癌、大腸癌、皮膚癌、及び前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない、様々なタイプの癌を治療するために使用されてもよい。
The complexes, compositions, and methods of the present invention include bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, colon cancer, skin cancer, and prostate cancer. May be used to treat various types of cancer, not limited to these.

投与の経路としては、注射、経口投与、口腔投与、非経口投与、吸入、及び直腸投与が含まれる。 Routes of administration include injection, oral administration, buccal administration, parenteral administration, inhalation, and rectal administration.

投与される複合体の投与量、及び投与の特定の経路ならびに投与計画は、治療される癌のタイプ及び特定の癌状態の状況によって決定するが、当業者によって決定することができる。 The dose of conjugate to be administered, and the particular route of administration as well as the dosage regimen will be determined by the type of cancer being treated and the circumstances of the particular cancer condition, but can be determined by one skilled in the art.

本発明の複合体は、互いに併用されても、他の化学療法剤または治療と併用されてもよい。例えば、本発明の複合体を使用する療法は、放射線療法と併用されてもよい。 The conjugates of the invention may be used in combination with one another or with other chemotherapeutic agents or treatments. For example, therapy using the complexes of the invention may be combined with radiation therapy.

以下に続く実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、例示するものと見なされるべきである。 The following examples are given to illustrate certain embodiments of the present invention and should not be considered as limiting the scope of the invention, but as being illustrative.

生物学的活性
本発明の代表的なペプチド−薬物複合体を、インビトロ及びインビボ系の両方で試験して、それらの生物学的活性を決定した。これらの試験において、細胞障害薬の複合体の効力を、ヒトの癌原発部位の細胞に対する複合体の細胞毒性を測定することによって決定した。当業者であれば、所望の腫瘍関連プロテアーゼ（本発明の複合体を切断して、薬物を活性形態で放出するプロテアーゼ）を発現する任意の腫瘍細胞株が、以下の分析で使用される特定の腫瘍細胞株の代わりに使用することができることを認識するであろう。以下では、使用された代表的な試験及び得られた結果について説明する。 Biological Activity Representative peptide-drug conjugates of the invention were tested in both in vitro and in vivo systems to determine their biological activity. In these tests, the potency of the cytotoxic drug complex was determined by measuring the cytotoxicity of the complex to cells of human cancer primary site. Those skilled in the art will appreciate that any tumor cell line that expresses the desired tumor associated protease (a protease that cleaves the complex of the present invention to release the drug in active form) will be used in the following analysis. It will be appreciated that it can be used in place of tumor cell lines. The following describes the representative tests used and the results obtained.

試験I
ヒト血漿安定性
５００μＭのペプチド−薬物複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[本明細書では化合物８]の２０μＬのＤＭＳＯ保存溶液を、ヒト血漿で１ｍＬに希釈し（最終濃度：１０μＭ、２％ＤＭＳＯ）、混合物を３７℃でインキュベートした。１００μＬのアリコートを、０、０．２５、０．５、１、２、４、６時間の時点で取り出し、内部標準としてトルブタミド（２００ｎｇ／ｍＬ）を含有する冷アセトニトリル４００μＬで希釈した。試料を１４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上記上清１００μＬを、０．１％ギ酸のＨＰＬＣ水３００μＬで希釈し、１０μＬをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用に採取した（カラム：Ｃ−１８；移動相：水中０．１％ギ酸／アセトニトリル中０．１％ギ酸；イオン遷移：Ｑ１イオン（ｍ／ｚ）＝８４０．５、Ｑ２イオン（ｍ／ｚ）＝４６２．２）。図１に示すように、ペプチド−薬物複合体は、ヒト血漿中で比較的安定しており、１５時間超（Ｔ１／２＞１５時間）の半減期を有する。２％未満の遊離薬物マイトマイシンを検出した。 Examination I
Human plasma stability 500 μM of peptide-drug complex N ^α -succinamic acid -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [herein compound 8] in 20 μL DMSO stock solution of DMSO is diluted to 1 mL with human plasma ( Final concentration: 10 μM, 2% DMSO), the mixture was incubated at 37 ° C. Aliquots of 100 μL were removed at 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 hours and diluted with 400 μL of cold acetonitrile containing tolbutamide (200 ng / mL) as an internal standard. The samples were centrifuged at 14,000 rpm for 4 minutes. 100 μL of the above supernatant was diluted with 300 μL of 0.1% formic acid in HPLC water, and 10 μL was collected for LC / MS / MS analysis (column: C-18; mobile phase: in water 0.1% formic acid / acetonitrile in water) 0.1% formic acid; ion transition: Q1 ion (m / z) = 840.5, Q2 ion (m / z) = 462.2). As shown in FIG. 1, the peptide-drug complex is relatively stable in human plasma and has a half life of more than 15 hours (T1 / 2> 15 hours). Less than 2% of free drug mitomycin was detected.

試験ＩＩ
インビトロ細胞毒性アッセイ
ヒト癌腫細胞の単層培養物を、トリプシンーＥＤＴＡを用いて採取し、細胞を計数し、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭ１×１０^５／ｍＬに再懸濁させた。細胞（０．１ｍＬ／ウェル）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２の加湿空気中で、３７℃にて一晩インキュベートした。培地をプレートから除去し、培地中のマイトマイシンまたは複合体の連続希釈液（最終ＤＭＳＯ濃度＜０．１％）を、ウェルに添加した。全ての希釈は、三通り行った。薬物で処理された細胞を、５％ＣＯ_２の加湿空気中で、３７℃にてさらに７２時間インキュベートした。冷ＴＣＡ（５０％、重量／体積）５０μＬを、各ウェルに添加し、プレートを４℃で１時間インキュベートした。プレートをゆっくりと流れる水道水で３回洗浄し、室温で乾燥させた。スルホローダミンＢ溶液（０．４％、重量／体積）５０μＬを各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間放置した。プレートを酢酸溶液（１％、体積／体積）で濯ぎ、未結合の染料を除去し、室温で乾燥させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基溶液２００μＬを各ウェルに添加し、プレートを旋回シェーカー上で１５分間振動させ、タンパク質結合染料を可溶化した。マイクロプレートリーダで、５１０ｎｍにおけるウェルの光学密度を測定し、ＩＣ_５０を、各実験で三通り行われた３つの別個の実験からのＧｒａｐｈＰａｄにより計算し、平均値として表した（表１）。
Examination II
In Vitro Cytotoxicity Assay Monolayer cultures of human carcinoma cells were harvested using trypsin-EDTA, cells were counted and resuspended in RPMI-1640 or DMEM 1 × 10 ⁵ / mL containing 10% FBS . Cells (0.1 mL / well) were added to each well of a 96 well microtiter plate and incubated overnight at 37 ° C. in humidified air with 5% CO ₂ . Media was removed from the plate and serial dilutions of mitomycin or complex in media (final DMSO concentration <0.1%) were added to the wells. All dilutions were done in triplicate. Drug-treated cells were incubated for an additional 72 hours at 37 ° C. in humidified air with 5% CO ₂ . Fifty microliters of cold TCA (50%, w / v) was added to each well and the plates were incubated at 4 ° C for 1 hour. The plate was washed 3 times with slow flowing tap water and allowed to dry at room temperature. 50 μl of sulforhodamine B solution (0.4%, w / v) was added to each well and the plate was left at room temperature for 1 hour. The plates were rinsed with acetic acid solution (1%, v / v) to remove unbound dye and allowed to dry at room temperature. 200 μl of 10 mM Tris base solution was added to each well and the plate was shaken on a shaker for 15 minutes to solubilize the protein-bound dye. In a microplate reader, the optical density of the wells at 510 nm was measured, and the IC ₅₀ was calculated by GraphPad from three separate experiments performed in triplicate in each experiment and expressed as mean values (Table 1).

ＨＣＴ１１６及びＨｅｐＧ２ヒト癌腫細胞株アッセイでは、ペプチド−薬物複合体の細胞毒性が、様々な腫瘍細胞株に応じて、親薬物マイトマイシンと比較して７６〜１７倍低減したことを明らかにしている。腫瘍関連プロテアーゼのレグマインは、低酸素かつ酸性条件下で、固形腫瘍の腫瘍微小環境中で過発現される。しかしながら、細胞培養中のＨＣＴ１１６及びＨｅｐＧ２細胞株双方のあるレベルのレグマイン発現が以前に報告されており、これは、このアッセイで観察されたペプチド−薬物複合体の残存活性をもたらす場合がある。 HCT116 and HepG2 human carcinoma cell line assays reveal that the cytotoxicity of the peptide-drug complex is reduced 76- to 17-fold relative to the parent drug mitomycin, depending on the various tumor cell lines. The tumor associated protease legumain is overexpressed in the tumor microenvironment of solid tumors under hypoxic and acidic conditions. However, certain levels of legumain expression in both HCT116 and HepG2 cell lines in cell culture have been previously reported, which may result in the residual activity of the peptide-drug complex observed in this assay.

試験ＩＩＩ
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるインビボ最大耐用量（ＭＴＤ）
マイトマイシン及び単剤としてのそのペプチド−薬物複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [化合物８]の忍容性を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて別個に評価した。処置後の異なる時点での異なる群における体重の結果を図２に示す。 Examination III
In vivo maximum tolerated dose (MTD) in Balb / c mice
The tolerability of mitomycin and its peptide-drug complex N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [compound 8] as single agent was evaluated separately in Balb / c mice. The results of weight in different groups at different time points after treatment are shown in FIG.

マイトマイシン１０ｍｇ／ｋｇを週１回投与した群では、動物の死亡が観察された。５ｍｇ／ｋｇの群では、マウスは、立毛及び発育遅延の挙動を表した。体重減少（＞１５％）は、５ｍｇ／ｋｇのマイトマイシン群で観察された。一方、異常な外観及び体重（＜１０％）は、ペプチド−薬物複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [８]、２５、５０及び１００ｍｇ／ｋｇを週１回、２４時間で合計３回の注射で投与した群においては観察されなかった。ネズミ毒性試験では、ペプチド−薬物複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [８]は、インビボで親薬物よりも毒性がかなり低いことが明らかになった。ペプチド−薬物複合体のマウス最大耐用量（ＭＴＤ）は、親薬物マイトマイシンと比べて、少なくとも２０倍増加する。 Animal death was observed in the group receiving 10 mg / kg of mitomycin once a week. In the 5 mg / kg group, mice exhibited napped and growth retarded behavior. Weight loss (> 15%) was observed with the 5 mg / kg mitomycin group. On the other hand, abnormal appearance and body weight (<10%), peptide-drug complex N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [8], 25, 50 and 100 mg / kg once a week, It was not observed in the group given a total of 3 injections for 24 hours. The murine toxicity test peptide - drug complex N ^alpha - succinamic acid -Ala-Ala-Asn-PABC- mitomycin [8], it became clear that much lower toxic than the parent drug in vivo. The mouse maximum tolerated dose (MTD) of the peptide-drug complex is increased by at least 20 fold compared to the parent drug mitomycin.

試験ＩＶ
インビボ抗腫瘍活性
ペプチド−薬物複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [８]の殺腫瘍効果を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける皮下ＣＴ−２６同一遺伝子型結腸癌モデルで評価した。各マウスを、ＰＢＳ０．１ｍＬ中、ＣＴ−２６腫瘍細胞（５×１０^５）で、右わき腹領域に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約１８０ｍｍ^３に達したとき（１０日後近辺）、ＣＴ−２６腫瘍マウスを、ビヒクル（２％ＤＭＡ及び９８％の４０％２ＨＰ−β−ＣＤ）、マイトマイシン（２ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ）及び複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [８]（２５ｍｇ／ｋｇ；５０ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ）を、３週間にわたって、マウス毎に合計３回の注射で、静脈内投与することによって処置した。ＣＴ−２６モデルの腫瘍成長曲線を図３に示す。 Examination IV
In vivo anti-tumor active peptide - drug complex N ^alpha - tumoricidal effect of succinamic acid -Ala-Ala-Asn-PABC- mitomycin [8], evaluated in subcutaneous CT-26 syngeneic colon cancer model in Balb / c mice did. Each mouse was inoculated subcutaneously in the right flank area with CT-26 tumor cells (5 × 10 ⁵ ) in 0.1 mL PBS. When the average tumor size reaches about 180 mm ³ (around 10 days), CT-26 tumor mice are treated with vehicle (2% DMA and 98% 40% 2HP-β-CD), mitomycin (2 mg / kg; 5 mg / kg) kg, QW) and complex N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [8] (25 mg / kg; 50 mg / kg, QW), for a total of 3 injections per mouse over 3 weeks Treated by intravenous administration. The tumor growth curve of the CT-26 model is shown in FIG.

以前報告されたように、ＣＴ−２６細胞がインビトロにおいて腫瘍関連プロテアーゼのレグマインの弱い発現を有するにもかかわらず、レグマイン発現が低酸素かつストレス条件下で誘発されるために、レグマインは、ＣＴ−２６固形腫瘍微小環境内の生内皮細胞上の表面のＴＭＥ及び腫瘍随伴マクロファージ中で、インビボで多量に発現される。レグマイン特異的活性化複合体Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン [８]は、図３に示すように、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける皮下ＣＴ−２６同一遺伝子型結腸癌モデルに及ぼす強い抗腫瘍効力を立証した。そのＭＴＤよりも非常に低い５０ｍｇ／ｋｇの用量において、この複合体は、未処置対照と対比して腫瘍成長を有意に阻害する（Ｔ／Ｃ＝３６．４％、ｐ＜０．０１）。一方、そのＭＴＤ用量（５ｍｇ／ｋｇ）では、親薬物のマイトマイシンは、非常に弱い腫瘍成長効果を示した（Ｔ／Ｃ＝５０．４％）。したがって、インビボの実験は、本発明のペプチド−マイトマイシン複合体が、宿主に対して親薬物よりも大きな効力及び低い毒性で抗腫瘍活性を生じさせることを示している。 As previously reported, even though CT-26 cells have weak expression of legumain as a tumor-associated protease in vitro, legumain is expressed as CT-, because legumain expression is induced under hypoxic and stress conditions. It is abundantly expressed in vivo in TME and paraneoplastic macrophages on surfaces on live endothelial cells in a 26 solid tumor microenvironment. The legumain-specific activation complex N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [8], as shown in FIG. 3, is a subcutaneous CT-26 isogenic genotype colon cancer model in Balb / c mice It has demonstrated strong anti-tumor efficacy. At a dose of 50 mg / kg, which is much lower than its MTD, this complex significantly inhibits tumor growth relative to untreated controls (T / C = 36.4%, p <0.01). On the other hand, at its MTD dose (5 mg / kg), the parent drug mitomycin showed a very weak tumor growth effect (T / C = 50.4%). Thus, in vivo experiments show that the peptide-mitomycin conjugates of the invention produce antitumor activity with greater potency and lower toxicity to the host than the parent drug.

合成実施例
実施例１
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ[１]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（１．５８ｇ、５．０ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（０．６３ｇ、５．５ミリモル）及びＤＣＣ（１．０３ｇ、５．０ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（５０ｍＬ）を、５℃で６時間撹拌した。ＤＣＵを濾過して取り除き、濾液を濃縮した。残渣をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、冷蔵庫（４℃）で一晩保管した。より多量のＤＣＵを濾過して取り除き、ＴＨＦ溶液を、アラニン（０．９９ｇ、７．５ミリモル）及びＮａＨＣＯ_３（１．６８ｇ、２０ミリモル）の２５％ＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ溶液（８０ｍＬ）に添加した。反応混合物を、２５℃で５時間にわたり激しく撹拌した。ＴＨＦを濃縮によって除去し、水性懸濁液を、濃ＨＣｌでｐＨ４に調節した。水性懸濁液を、２５℃でさらに３時間撹拌し、濾過により沈殿物を集め、脱塩水で十分に濯ぎ、ＫＯＨで真空にて乾燥させて、白色固体生成物（１．７７ｇ、８３．７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝３８３ Synthesis Example Example 1
Preparation of N ^α -Fmoc-Ala-Ala [1] N ^α -Fmoc-Ala (1.58 g, 5.0 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.63 g, 5.5 mmol) and DCC (1.03 g) A solution of 5.0 mmol) in CH ₂ Cl ₂ (50 mL) was stirred at 5 ° C. for 6 hours. The DCU was filtered off and the filtrate was concentrated. The residue was redissolved in THF (50 mL) and stored in the refrigerator (4 ° C.) overnight. Filter out more DCU and add THF solution to a solution of alanine (0.99 g, 7.5 mmol) and NaHCO ₃ (1.68 g, 20 mmol) in 25% THF / H ₂ O solution (80 mL) did. The reaction mixture was vigorously stirred at 25 ° C. for 5 hours. The THF was removed by concentration and the aqueous suspension was adjusted to pH 4 with concentrated HCl. The aqueous suspension is stirred at 25 ° C. for a further 3 hours, the precipitate is collected by filtration, rinsed thoroughly with demineralised water and dried over KOH in vacuo to give a white solid product (1.77 g, 83.7) % Yield was obtained.
LC / MS: (MH) ⁺ = 383

実施例２
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＯＨ[２]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（１．７７ｇ、５．０ミリモル）、ｐ−アミノベンジルアルコール（０．８６ｇ、７．０ミリモル）及びＥＥＤＱ（１．４８ｇ、６ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ溶液（１００／２０ｍＬ）を、室温で一晩撹拌した。ＥＥＤＱの追加量（０．６１ｇ、２．５ミリモル）を添加し、さらに２４時間撹拌した。ＴＨＦを濃縮によって除去し、残った懸濁液を、ＮａＯＨ／ＮａＨＣＯ_３水性溶液（２／８ｇ、２００ｍＬ）で希釈し、３時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、水で濯ぎ、１０％クエン酸（１５０ｍＬ）中に再懸濁させた。沈殿物を濾過によって集め、１０％クエン酸、続いて脱塩水で濯ぎ、真空中で乾燥させた。上記固体を、酢酸エチル（１００ｍＬ）中で摩砕した。濾過により固体を集め、真空中で乾燥させて、灰白色生成物（０．９５ｇ、４０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝４６０ Example 2
Preparation of N ^α -Fmoc-Asn-PAB-OH [2] N ^α -Fmoc-Asn (1.77 g, 5.0 mmol), p-aminobenzyl alcohol (0.86 g, 7.0 mmol) and EEDQ A 1.48 g (6 mmol) solution in THF / H 2 O (100/20 mL) was stirred at room temperature overnight. An additional amount of EEDQ (0.61 g, 2.5 mmol) was added and stirred for a further 24 hours. The THF was removed by concentration and the remaining suspension was diluted with aqueous NaOH / NaHCO ₃ solution (2/8 g, 200 mL) and stirred for 3 hours. The precipitate was collected by filtration, rinsed with water and resuspended in 10% citric acid (150 mL). The precipitate was collected by filtration, rinsed with 10% citric acid followed by demineralised water and dried in vacuo. The solid was triturated in ethyl acetate (100 mL). The solid was collected by filtration and dried in vacuo to give an off-white product (0.95 g, 40% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 460

実施例３
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[３]の調製
乾燥ＴＨＦ／ＤＭＦ（５０／５ｍＬ）中、Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ−ＯＨ[２]（０．７５ｇ、１．６ミリモル）を室温で、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．４ｇ、２．０ミリモル）及びピリジン（０．１５ｇ、２．０ミリモル）で処理した。１６時間後に、追加量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．２ｇ、１．０ミリモル）を添加し、反応溶液をさらに６時間撹拌した。上記溶液を、酢酸エチル（２５０ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸（２×１００ｍＬ）、続いて塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を５０％ＥＡ／ヘキサン中で摩砕し、固体を濾過により集め、灰黄色生成物（０．８ｇ、８１％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝６２５ Example 3
Preparation of N ^α -Fmoc-Asn-PABC-PNP [3] N ^α -Fmoc-Asn-PAB-OH [2] (0.75 g, 1.6 mmol) in dry THF / DMF (50/5 mL) Treatment with p-nitrophenyl chloroformate (0.4 g, 2.0 mmol) and pyridine (0.15 g, 2.0 mmol) at room temperature. After 16 hours, an additional amount of p-nitrophenyl chloroformate (0.2 g, 1.0 mmol) was added and the reaction solution was stirred for another 6 hours. The solution was diluted with ethyl acetate (250 mL), washed with 5% citric acid (2 × 100 mL) followed by brine, dried over Na ₂ SO ₄ and evaporated to dryness. The residue was triturated in 50% EA / hexane and the solid was collected by filtration to give an off-yellow product (0.8 g, 81% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 625

実施例４
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[４]の調製
乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[３]（６２４ｍｇ、１．０ミリモル）及びマイトマイシン（４００ｍｇ、１．２ミリモル）を、室温でＨＯＢＴ（６７５ｍｇ、５．０ミリモル）及びＤＩＥＡ（６５０ｍｇ、５．０ミリモル）で４時間処理した。反応混合物を、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈し、ＮａＯＨ／ＮａＨＣＯ_３（１／４ｇ、２００ｍＬ）で３回洗浄し、続いて塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮乾固させた。残渣を５０％酢酸エチル／ヘキサン（５０ｍＬ）中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチル／ヘキサンで濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（６３５ｍｇ、７６．３％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８２０ Example 4
Preparation of N ^α -Fmoc-Asn-PABC-Mitomycin [4] N ^α -Fmoc-Asn-PABC-PNP [3] (624 mg, 1.0 mmol) and Mitomycin (400 mg, 2 mmol) was treated with HOBT (675 mg, 5.0 mmol) and DIEA (650 mg, 5.0 mmol) at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate (150 mL) and washed three times with NaOH / NaHCO ₃ (1/4 g, 200 mL) followed by brine. The organic layer was dried over Na ₂ SO ₄ and concentrated to dryness under reduced pressure. The residue is triturated in 50% ethyl acetate / hexane (50 mL) and the solid is collected by filtration, rinsed with ethyl acetate / hexane and dried in vacuo to give a purple product (635 mg, 76.3% yield) I got
LC / MS: (MH) ⁺ = 820

実施例５
Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[５]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[４]（６２４ｍｇ、０．７６ミリモル）を、２０％モルホリン／ＮＭＰ（１５ｍＬ）で室温にて処理した。３０分後に、５０％酢酸エチル／ヘキサン（１００ｍＬ）を添加し、上清を除去した。上記工程を２回繰り返した。残渣をメタノール（２５ｍＬ）中に再溶解させ、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。残渣を、５０％酢酸エチル／ヘキサン（１００ｍＬ）中で摩砕し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過により集め、酢酸エチル／ヘキサンで濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（４４０ｍｇ、９５．６％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝５９８ Example 5
Asn-PABC- mitomycin [5] Preparation of N α ^{-Fmoc-Asn-PABC-} mitomycin [4] (624 mg, 0.76 mmol) was treated at room temperature with 20% morpholine / NMP (15 mL). After 30 minutes, 50% ethyl acetate / hexane (100 mL) was added and the supernatant was removed. The above process was repeated twice. The residue was redissolved in methanol (25 mL) and the solvent was evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was triturated in 50% ethyl acetate / hexane (100 mL) and stirred at room temperature overnight. The solid was collected by filtration, rinsed with ethyl acetate / hexane and dried in vacuo to give a purple product (440 mg, 95.6% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 598

実施例６
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[６]の調製
Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[５]（４４０ｍｇ、０．７３ミリモル）及びＮ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ[１]（２８６ｍｇ、０．７５ミリモル）を、ＮＭＰ（１５ｍL）中ＰｙＢｏｐ(３９０ｍｇ、０．７５ミリモル)及びＤＩＥＡ（５８５ｍｇ、４．５ミリモル）で室温にて処理した。１時間後に、反応混合物を、酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した。有機溶液を、５％クエン酸（３×１００ｍＬ）、塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を５０％酢酸エチル／ヘキサン（１００ｍＬ）中で摩砕し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過により集め、酢酸エチル（５０ｍＬ）中に再懸濁させ、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（５３０ｍｇ、７５．４％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝９６２ Example 6
Preparation of N ^α -Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [6] Asn-PABC-Mitomycin [5] (440 mg, 0.73 mmol) and N ^α -Fmoc-Ala-Ala [1] (286 mg, 0.75 mmol) was treated with PyBop (390 mg, 0.75 mmol) and DIEA (585 mg, 4.5 mmol) in NMP (15 mL) at room temperature. After 1 hour, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate (200 mL). The organic solution was washed with 5% citric acid (3 × 100 mL), brine and dried over Na ₂ SO ₄ . The solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was triturated in 50% ethyl acetate / hexane (100 mL) and stirred at room temperature overnight. The solid was collected by filtration, resuspended in ethyl acetate (50 mL) and sonicated. The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a purple product (530 mg, 75.4% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 962

実施例７
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[６]（４８１ｍｇ、０．５ミリモル）を、２０％モルホリン／ＮＭＰ（１０ｍＬ）中で室温にて処理した。３０分後に、５０％酢酸エチル／ヘキサン（１５０ｍＬ）を添加し、１時間撹拌した。上清を除去し、残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）中で摩砕した。固体を濾過により集め、メタノール（２０ｍＬ）中に再溶解させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（２７７ｍｇ、７５％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝７４０ Example 7
Preparation of Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [7] N ^α- Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [6] (481 mg, 0.5 mmol) in 20% morpholine / NMP (10 mL) At room temperature. After 30 minutes, 50% ethyl acetate / hexane (150 mL) was added and stirred for 1 hour. The supernatant was removed and the residue was triturated in CH ₂ Cl ₂ (50 mL). The solid was collected by filtration and redissolved in methanol (20 mL). The solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was triturated in ethyl acetate. The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a purple product (277 mg, 75% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 740

実施例８
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[８]の調製
ＤＭＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（２／６ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（２６０ｍｇ、０．３５ミリモル）を、室温において、無水コハク酸（５０ｍｇ、０．５ミリモル）及びＤＩＥＡ（１３０ｍｇ、１．０ミリモル）で処理した。反応混合物を一晩撹拌した。上記反応混合物に、エチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌した。上清を除去し、この工程を２回繰り返した。残渣を２％ＨＯＡｃ／酢酸エチル（５０ｍＬ）中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（２６５ｍｇ、９０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^-＝８３８ Example 8
Preparation of N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [8] Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [7] (260 mg, 0. 1) in DMA / CH ₂ Cl ₂ (2/6 mL). 35 mmol) was treated at room temperature with succinic anhydride (50 mg, 0.5 mmol) and DIEA (130 mg, 1.0 mmol). The reaction mixture was stirred overnight. To the above reaction mixture, ethyl ether (100 mL) was added and stirred for 30 minutes. The supernatant was removed and this process was repeated twice. The residue is triturated in 2% HOAc / ethyl acetate (50 mL) and the solid is collected by filtration, rinsed thoroughly with ethyl acetate and dried in vacuo to give a purple product (265 mg, 90% yield) The
LC / MS: (MH) ^- = 838

実施例９
Ｎ^α−アセトアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[９]の調製
ＤＭＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１／３ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（３７ｍｇ、０．０５ミリモル）を、室温において、無水酢酸（１０ｍｇ、０．１ミリモル）及びＤＩＥＡ（１３ｍｇ、０．１ミリモル）で処理した。３０分後、エチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、６０分間撹拌した。軟質固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール（５ｍＬ）中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を５０％酢酸エチル／ヘキサン（１０ｍＬ）中で摩砕し、固体を濾過により集め、酢酸エチル／ヘキサンで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（３５ｍｇ、９０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８０５ Example 9
Preparation of N ^α -Acetamide-Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [9] Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [7] (37 mg, 0.05) in DMA / CH ₂ Cl ₂ (1/3 mL) The mmol) was treated at room temperature with acetic anhydride (10 mg, 0.1 mmol) and DIEA (13 mg, 0.1 mmol). After 30 minutes, ethyl ether (50 mL) was added and stirred for 60 minutes. The soft solid was collected by filtration, rinsed with ethyl ether and redissolved in methanol (5 mL). The solvent is removed under reduced pressure, the residue is triturated in 50% ethyl acetate / hexane (10 mL), the solid is collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate / hexane and dried in vacuo to give a purple product (35 mg, 90% yield) were obtained.
LC / MS: (MH) ⁺ = 805

実施例１０
Ｎ^α−ブチルアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[１０]の調製
ＤＭＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１／３ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（３７ｍｇ、０．０５ミリモル）を、室温において、塩化ブチリル（６．３ｍｇ、０．０６ミリモル）及びＤＩＥＡ（１３ｍｇ、０．１ミリモル）で処理した。３０分後、エチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、６０分間撹拌した。固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール（５ｍＬ）中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（２７ｍｇ、６７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＣ：（ＭＨ）^＋＝８０８；（Ｍ＋Ｎａ）^＋＝８３３ Example 10
Preparation of N ^α -Butylamido-Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [10] Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin [7] (37 mg, 0.05) in DMA / CH ₂ Cl ₂ (1/3 mL) The mmol) was treated at room temperature with butyryl chloride (6.3 mg, 0.06 mmol) and DIEA (13 mg, 0.1 mmol). After 30 minutes, ethyl ether (50 mL) was added and stirred for 60 minutes. The solid was collected by filtration, rinsed with ethyl ether and redissolved in methanol (5 mL). The solvent was removed under reduced pressure and the residue was triturated in ethyl acetate (10 mL). The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a purple product (27 mg, 67% yield).
LC / MC: (MH) ⁺ = 808; (M + Na) ⁺ = 833

実施例１１
Ｎ^α−ヘキサンアミド−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[１１]の調製
ＤＭＡ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１／３ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（３７ｍｇ、０．０５ミリモル）を、室温において、塩化ヘキサノイル（９．０ｍｇ、０．０６ミリモル）及びＤＩＥＡ（１３ｍｇ、０．１ミリモル）で処理した。３０分後、エチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、６０分間撹拌した。固体を濾過により集め、エチルエーテルで濯ぎ、メタノール（５ｍＬ）中に再溶解させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣を５０％酢酸エチル／ヘキサン（１０ｍＬ）中で摩砕した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、紫色生成物（２７ｍｇ、６７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＣ：（ＭＨ）^＋＝８３６；（Ｍ＋Ｎａ）^＋＝８６０ Example 11
Preparation of N ^α -Hexanamido-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [11] Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [7] (37 mg, 0. 1) in DMA / CH ₂ Cl ₂ (1/3 mL). 05 mmol) was treated with hexanoyl chloride (9.0 mg, 0.06 mmol) and DIEA (13 mg, 0.1 mmol) at room temperature. After 30 minutes, ethyl ether (50 mL) was added and stirred for 60 minutes. The solid was collected by filtration, rinsed with ethyl ether and redissolved in methanol (5 mL). The solvent was removed under reduced pressure and the residue was triturated in 50% ethyl acetate / hexane (10 mL). The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a purple product (27 mg, 67% yield).
LC / MC: (MH) ⁺ = 836; (M + Na) ⁺ = 860

実施例１２
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[１２]の調製
ＴＨＦ／ＤＭＦ（４／０．５ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（２９５ｍｇ、０．４ミリモル）を、室温において１，４−ジオキサン−２，６−ジオン（７０ｍｇ、０．６ミリモル）及びＤＩＥＡ（６０ｍｇ、０．５ミリモル）で２時間処理した。エチルエーテル（１０ｍＬ）をゆっくりと添加し、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル中１％酢酸中で摩砕し、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、暗色生成物（２７６ｍｇ、８０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＣ：（ＭＨ）^＋＝８５４ Example 12
Preparation of N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [12] Ala-Ala-Asn- in THF / DMF (4 / 0.5 mL) PABC-mitomycin [7] (295 mg, 0.4 mmol) at room temperature with 1,4-dioxane-2,6-dione (70 mg, 0.6 mmol) and DIEA (60 mg, 0.5 mmol) for 2 hours It was processed. Ethyl ether (10 mL) was added slowly and the mixture was stirred for 30 minutes. The solvent was removed under reduced pressure and the residue was triturated in 1% acetic acid in ethyl acetate and sonicated. The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a dark product (276 mg, 80% yield).
LC / MC: (MH) ⁺ = 854

実施例１３
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[１３]の調製
ＴＨＦ／ＤＭＦ（４／０．５ｍＬ）中、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[７]（２９５ｍｇ、０．４ミリモル）を、室温において４−メチルモルホリン−２，６−ジオン（７７ｍｇ、０．６ミリモル）及びＤＩＥＡ（１３０ｍｇ、１．０ミリモル）で２時間処理した。エチルエーテル（１０ｍＬ）をゆっくりと添加し、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル中１％酢酸中で摩砕し、超音波処理した。固体を濾過により集め、酢酸エチルで十分に濯ぎ、真空中で乾燥させて、暗色生成物（３３９ｍｇ、９７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（Ｍ-Ｈ）^＋＝８６７ Example 13
Preparation of N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) amino) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [13] in THF / DMF (4 / 0.5 mL), Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [7] (295 mg, 0.4 mmol) at room temperature 4-methylmorpholine-2,6-dione (77 mg, 0.6 mmol) and DIEA (130 mg, 1.0) Treated with mmol) for 2 hours. Ethyl ether (10 mL) was added slowly and the mixture was stirred for 30 minutes. The solvent was removed under reduced pressure and the residue was triturated in 1% acetic acid in ethyl acetate and sonicated. The solid was collected by filtration, rinsed well with ethyl acetate and dried in vacuo to give a dark product (339 mg, 97% yield).
LC / MS: (M-H) ⁺ = 867

実施例１４
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１４]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｎ−トリチル）（１．４９ｇ、２．５ミリモル）、ｐ−アミノベンジルアルコール（０．３７ｇ、３．０ミリモル）及びＥＥＤＱ（０．７４ｇ、３ミリモル）のＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）を、室温で一晩撹拌した。ＥＥＤＱの追加量（０．２５ｇ、１．０ミリモル）を添加し、さらに６時間撹拌した。反応溶液を、酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、０．１ＮのＨＣｌで３回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。酢酸塩溶液を短いシリカプラグを介して濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、濃縮乾固させた。残渣を酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、真空中で乾燥させて、白色固体を得た（１．６５ｇ、９３％収率）。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝７０２ Example 14
N α ^-Fmoc-Asn- (N- trityl) -PAB-OH [14] Preparation of N α ^-Fmoc-Asn (N- trityl) (1.49 g, 2.5 mmol), p-aminobenzyl alcohol (0 A solution of .37 g (3.0 mmol) and EEDQ (0.74 g, 3 mmol) in THF (50 mL) was stirred at room temperature overnight. An additional amount of EEDQ (0.25 g, 1.0 mmol) was added and stirred for an additional 6 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate (300 mL), washed three times with 0.1 N HCl, and dried over Na ₂ SO ₄ . The acetate solution was filtered through a short plug of silica, rinsed with ethyl acetate and concentrated to dryness. The residue was triturated in ethyl acetate, filtered, rinsed with ethyl acetate and dried in vacuo to give a white solid (1.65 g, 93% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 702

実施例１５
Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１５]の調製
Ｎ^α―Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１４]（１．６ｇ、２．２８ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（５０ｍＬ）に、ＤＢＵ（１ｍＬ）を添加した。反応溶液を１５分間撹拌した。反応溶液を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）で希釈し、塩水で２回洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。残渣を、ヘキサン／エチルエーテル（１／１）中で摩砕した。固体を濾過により集めて、エチルエーテルで濯ぎ、真空中で乾燥させて白色固体を得た（１．１ｇ、１００％収率）。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝４８０ Example 15
Preparation of Asn- (N-trityl) -PAB-OH [15] N ^α -Fmoc-Asn- (N-trityl) -PAB-OH [14] (1.6 g, 2.28 mmol) of CH ₂ Cl ₂ To the solution (50 mL) was added DBU (1 mL). The reaction solution was stirred for 15 minutes. The reaction solution was diluted with CH ₂ Cl ₂ (200 mL), washed twice with brine, dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated to dryness. The residue was triturated in hexane / ethyl ether (1/1). The solid was collected by filtration, rinsed with ethyl ether and dried in vacuo to give a white solid (1.1 g, 100% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 480

実施例１６
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１６]の調製
Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１５]（０．７２ｇ、１．５ミリモル）、Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ[１]（０．５７ｇ、１．５ミリモル）、ＰｙＢｏｐ（０．９４ｇ、１．８ミリモル）及びＤＩＥＡ（１．１７ｇ、９．０ミリモル）のＮＭＰ溶液（２０ｍＬ）を、室温で１時間撹拌した。上記反応物に、５％クエン酸水溶液（１５０ｍＬ）を、氷水温度でゆっくりと添加し、２時間撹拌した。沈殿物を濾過により集めて、５％クエン酸溶液、続いて脱塩水で濯いだ。固体を、水性ＮａＨＣＯ_３溶液中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、脱塩水で濯ぎ、ＫＯＨで真空中にて乾燥させ、白色生成物を得た（１．１ｇ、８７％収率）。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８４５ Example 16
Preparation of N ^α -Fmoc-Ala-Ala-Asn- (N-trityl) -PAB-OH [16] Asn- (N-trityl) -PAB-OH [15] (0.72 g, 1.5 mmol), A solution of N ^α -Fmoc-Ala-Ala [1] (0.57 g, 1.5 mmol), PyBop (0.94 g, 1.8 mmol) and DIEA (1.17 g, 9.0 mmol) in NMP (20 mL) ) Was stirred at room temperature for 1 hour. To the above reaction, 5% aqueous citric acid (150 mL) was added slowly at ice water temperature and stirred for 2 hours. The precipitate was collected by filtration and rinsed with 5% citric acid solution followed by demineralised water. The solid was resuspended in aqueous NaHCO ₃ solution, triturated, filtered, rinsed with demineralised water and dried over KOH in vacuo to give a white product (1.1 g, 87% yield) ).
LC / MS: (MH) ⁺ = 845

実施例１７
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[１７]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢ−ＯＨ[１６]（１．１ｇ、１．３ミリモル）、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．３１ｇ、１．６ミリモル）及びピリジン（０．１３ｇ、１．６ミリモル）の乾燥ＴＨＦ反応溶液を、室温で一晩撹拌した。追加量のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（０．２ｇ、１．０ミリモル）及びピリジン（０．０８ｇ、１．０ミリモル）を添加し、さらに４時間撹拌した。上記溶液を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、５％クエン酸溶液（３×１００ｍＬ）、続いて塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、濾過し、濃縮乾固させた。残渣をエチルエーテル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空中で乾燥させて、灰白色生成物（１．１ｇ、８３％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１０１０ Example 17
^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn- (N- trityl) Preparation of ^{-PABC-PNP [17] N α} -Fmoc-Ala-Ala-Asn- (N- trityl) -PAB-OH [16] ( 1 Stir a dry THF reaction solution of .1 g, 1.3 mmol), p-nitrophenyl chloroformate (0.31 g, 1.6 mmol) and pyridine (0.13 g, 1.6 mmol) overnight at room temperature did. Additional amounts of p-nitrophenyl chloroformate (0.2 g, 1.0 mmol) and pyridine (0.08 g, 1.0 mmol) were added and stirred for a further 4 hours. The solution was diluted with ethyl acetate (300 mL), washed with 5% citric acid solution (3 × 100 mL) followed by brine, dried over Na ₂ SO ₄ , filtered and concentrated to dryness. The residue was triturated in ethyl ether, filtered, washed with ethyl acetate and dried in vacuo to give an off-white product (1.1 g, 83% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 1010

実施例１８
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[１８]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−（Ｎ−トリチル）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[１７]（１．０ｇ、１ミリモル）及びＴＩＰＳ（２．５ｍＬ）のＴＦＡ／ＣＨ_２ＣＬ_２溶液（６／２４ｍＬ）を、室温で２時間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル（１５０ｍＬ）をゆっくりと添加し、懸濁液を１時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、エチルエーテルで濯いだ。固体を酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、真空中で乾燥させて、灰白色生成物（０．７５ｇ、９７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝７６７ Example 18
^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn-PABC-PNP [18] Preparation of ^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn- (N- trityl) -PABC-PNP [17] ( 1.0g, 1 mmol) And TIPS (2.5 mL) in TFA / CH ₂ CL ₂ solution (6/24 mL) were stirred at room temperature for 2 hours. To the above reaction solution, ethyl ether (150 mL) was added slowly and the suspension was stirred for 1 hour. The precipitate was collected by filtration and rinsed with ethyl ether. The solid was triturated in ethyl acetate, filtered, rinsed with ethyl acetate and dried in vacuo to give an off-white product (0.75 g, 97% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 767

実施例１９
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[１９]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ[１８]（３８３ｍｇ、０．５ミリモル）、ドキソルビシン塩酸塩（３４８ｍｇ、０．６ミリモル）、ＨＯＢＴ（２０２ｍｇ、１．５ミリモル）及びＤＩＥＡ（３２５ｍｇ、２．５ミリモル）の乾燥ＤＭＦ反応溶液（５ｍＬ）を、暗所で一晩撹拌した。上記溶液に、氷水温度で５％クエン酸（１００ｍＬ）をゆっくりと添加し、１時間撹拌した。沈殿物を濾過により集め、５％クエン酸、続いて脱塩水で濯いだ。固体を水性ＮａＨＣＯ_３溶液中に再懸濁させ、３０分間撹拌した。固体を集め、ＮａＨＣＯ_３溶液、続いて脱塩水で十分に濯いだ。固体をイソプロパノール、１０％メタノール／酢酸エチル中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、真空中で乾燥させて、暗赤色生成物（５５０ｍｇ、９４％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１１７１ Example 19
^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn-PABC- doxorubicin [19] Preparation of ^{N α -Fmoc-Ala-Ala-} Asn-PABC-PNP [18] (383mg, 0.5 mmol), doxorubicin hydrochloride (348 mg A solution of 0.6 mmol), HOBT (202 mg, 1.5 mmol) and DIEA (325 mg, 2.5 mmol) in dry DMF (5 mL) was stirred overnight in the dark. To the above solution, 5% citric acid (100 mL) was slowly added at ice water temperature and stirred for 1 hour. The precipitate was collected by filtration and rinsed with 5% citric acid followed by demineralised water. The solid was resuspended in aqueous NaHCO ₃ solution and stirred for 30 minutes. The solid was collected and thoroughly rinsed with NaHCO ₃ solution followed by demineralised water. The solid was resuspended in isopropanol, 10% methanol / ethyl acetate, triturated, filtered and dried in vacuo to give a dark red product (550 mg, 94% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 1171

実施例２０
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[２０]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[１９]（５００ｍｇ、０．４２ミリモル）の２０％モルホリン／ＮＭＰ溶液（５ｍＬ）を、１時間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル（５０ｍＬ）をゆっくりと添加し、得られた懸濁液を３０分間撹拌した。エチルエーテルを、流出させた（３回繰り返した）。残渣を酢酸エチル、２０％メタノール／酢酸エチル中で摩砕した。固体を濾過により集め、真空中で乾燥させた、固体を水中に再懸濁させ、超音波処理し、濾過し、ＫＯＨで真空中にて乾燥させ、暗赤色生成物（３２０ｇ、８０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＣ：（ＭＨ）^＋＝９４９ Example 20
Preparation of Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [20] N ^α- Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [19] (500 mg, 0.42 mmol) in 20% morpholine / NMP solution (5 mL) Stir for 1 hour. To the above reaction solution, ethyl ether (50 mL) was slowly added, and the resulting suspension was stirred for 30 minutes. Ethyl ether was drained (repeated 3 times). The residue was triturated in ethyl acetate, 20% methanol / ethyl acetate. The solid was collected by filtration, dried in vacuo, the solid resuspended in water, sonicated, filtered, dried in vacuo over KOH, dark red product (320 g, 80% yield) Got).
LC / MC: (MH) ⁺ = 949

実施例８、１２及び１３の調製の同様の方法を、化合物[２０]から実施例２１、２２及び２３を調製するために用いた。 A similar method of preparation of Examples 8, 12 and 13 was used to prepare Examples 21, 22 and 23 from compound [20].

実施例２１
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[２１]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１０４９ Example 21
N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [21]
LC / MS: (MH) ⁺ = 1049

実施例２２
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[２２]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１０６５ Example 22
N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [22]
LC / MS: (MH) ⁺ = 1065

実施例２３
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[２３]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１０７８ Example 23
N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) amino) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [23]
LC / MS: (MH) ⁺ = 1078

実施例２４
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２４]の調製
カンプトテシン（３４８ｍｇ、１ミリモル）及びＤＡＭＰ（３６６ｍｇ、３ミリモル）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２懸濁液（２０ｍＬ）に、トリホスゲン（１００ｍｇ、０．３３ミリモル）を、撹拌しながら氷水温度で添加した。２０分後に、Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢ―ＯＨ[２]（４５９ｍｇ、１ミリモル）の乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２懸濁液（１０ｍＬ）を、上記反応混合物に添加し、室温で一晩撹拌した。得られた反応混合物に、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（１００ｍｇ、０．５ミリモル）、続いて追加量のＤＡＭＰ（６０ｍｇ、０．５ミリモル）を添加し、反応混合物をさらに４時間撹拌した。濃縮後に、得られた残渣を２５％ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル中で摩砕し、濾過し、２５％ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチルで濯いで、真空中で乾燥させた。固体を、水性ＮａＨＣＯ_３中に懸濁させ、超音波処理し、濾過し、水性ＮａＨＣＯ_３、続いて５％クエン酸、脱塩水で十分に濯いで、ＫＯＨ上で真空にて乾燥させ、灰黄色生成物（７６３ｍｇ、９１％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８３４ Example 24
Preparation of N ^α -Fmoc-Asn-PABC-Camptothecin [24] A suspension of camptothecin (348 mg, 1 mmol) and DAMP (366 mg, 3 mmol) in dry CH ₂ Cl ₂ (20 mL), triphosgene (100 mg, 0. 33 mmol) were added at ice water temperature with stirring. After 20 ^{minutes, N α -Fmoc-Asn-PAB} -OH [2] a (459 mg, 1 mmol) in dry _CH 2 Cl ₂ suspension (10 mL), was added to the reaction mixture was stirred overnight at room temperature . To the resulting reaction mixture was added p-nitrophenyl chloroformate (100 mg, 0.5 mmol) followed by an additional amount of DAMP (60 mg, 0.5 mmol) and the reaction mixture was stirred for another 4 hours. After concentration, the residue obtained was triturated in 25% CH ₂ Cl ₂ / ethyl acetate, filtered, rinsed with 25% CH ₂ Cl ₂ / ethyl acetate and dried in vacuo. The solid is suspended in aqueous NaHCO ₃ , sonicated, filtered, rinsed thoroughly with aqueous NaHCO ₃ followed by 5% citric acid, demineralised water, dried in vacuo over KOH, grayish yellow The product (763 mg, 91% yield) was obtained.
LC / MS: (MH) ⁺ = 834

実施例２５
Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２５]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２４]（５００ｍｇ、０．６ミリモル）の２％ＤＢＵ／ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（１５ｍＬ）を、２０分間撹拌した。エチルエーテル（８０ｍＬ）を、上記反応溶液にゆっくりと添加し、３０分間撹拌した。沈殿物を摩砕し、濾過により集め、エチルエーテルで十分に濯いだ。固体を２０％ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル中で再摩砕し、濾過し、乾燥させた。固体を水性ＮａＨＣＯ_３中に再懸濁させ、摩砕し、濾過し、脱塩水で濯ぎ、ＫＯＨで真空にて乾燥させて、灰黄色生成物（２９５ｍｇ、８０％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝６１２ Example 25
Preparation of Asn-PABC-camptothecin [25] N ^α- Fmoc-Asn-PABC-camptothecin [24] (500 mg, 0.6 mmol) in 2% DBU / CH ₂ Cl ₂ solution (15 mL) was stirred for 20 minutes . Ethyl ether (80 mL) was slowly added to the above reaction solution and stirred for 30 minutes. The precipitate was triturated and collected by filtration and rinsed thoroughly with ethyl ether. The solid was triturated again in 20% CH ₂ Cl ₂ / ethyl acetate, filtered and dried. The solid was re-suspended in aqueous NaHCO ₃ , triturated, filtered, rinsed with demineralized water and dried over KOH in vacuo to give an off-yellow product (295 mg, 80% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 612

実施例２６
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２６]の調製
Ｈ_２Ｎ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２５]（２４４ｍｇ、０．４ミリモル）、Ｎ^α−Ａｌａ−Ａｌａ[１]（１９０ｍｇ、０．５ミリモル）、ＰｙＢｏｐ（２６０ｍｇ、０．５ミリモル）及びＤＩＥＡ（３２５ｍｇ、２．５ミリモル）のＮＭＰ溶液（５ｍＬ）を、１時間撹拌した。上記反応溶液に、５％クエン酸（５０ｍＬ）をゆっくりと添加して、得た混合物を３０分間撹拌した。沈殿物を濾過により集めて、５％クエン酸溶液、続いて脱塩水で濯ぎ、ＫＯＨ上、真空中で乾燥させた。固体を１５％ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル中で摩砕し、超音波処理し、濾過し、乾燥させて、灰色生成物（２７４ｍｇ、７０％収率）。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝９７６ Example 26
Preparation of N ^α -Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin [26] H ₂ N-Asn-PABC-Camptothecin [25] (244 mg, 0.4 mmol), N ^α -Ala-Ala [1] ( A solution of 190 mg, 0.5 mmol), PyBop (260 mg, 0.5 mmol) and DIEA (325 mg, 2.5 mmol) in NMP (5 mL) was stirred for 1 h. To the above reaction solution, 5% citric acid (50 mL) was slowly added and the resulting mixture was stirred for 30 minutes. The precipitate was collected by filtration, rinsed with 5% citric acid solution followed by demineralised water and dried in vacuo over KOH. The solid is triturated in 15% CH ₂ Cl ₂ / ethyl acetate, sonicated, filtered and dried to give a gray product (274 mg, 70% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 976

実施例２７
Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２７]の調製
Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２６]（４８７ｍｇ、０．５ミリモル）の２％ＤＢＵ／ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（１０ｍＬ）を、１０分間撹拌した。上記反応溶液に、エチルエーテル（５０ｍＬ）をゆっくりと添加し、３０分間撹拌した。沈殿物を集め、エーテルで濯いだ。固体を２０％ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル中に懸濁させ、摩砕し、濾過し、酢酸エチルで濯ぎ、乾燥させて、灰色生成物（２９０ｍｇ、７７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝７５４ Example 27
Preparation of Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin [27] N ^α- Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin [26] (487 mg, 0.5 mmol) in 2% DBU / CH ₂ Cl ₂ solution ( 10 mL) was stirred for 10 minutes. Ethyl ether (50 mL) was slowly added to the above reaction solution and stirred for 30 minutes. The precipitate was collected and rinsed with ether. The solid was suspended in 20% CH ₂ Cl ₂ / ethyl acetate, triturated, filtered, rinsed with ethyl acetate and dried to give a gray product (290 mg, 77% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 754

実施例８、１２及び１３の調製の同様の方法を、化合物[２７]から実施例２８、２９及び３０を調製するために用いた。 A similar method of preparation of Examples 8, 12 and 13 was used to prepare Examples 28, 29 and 30 from compound [27].

実施例２８
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２８]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８５４ Example 28
N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin [28]
LC / MS: (MH) ⁺ = 854

実施例２９
Ｎ^α−［−（２−アミド−２−オキソエトキシ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[２９]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８７０ Example 29
N ^α -[-(2-amido-2-oxoethoxy) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin [29]
LC / MS: (MH) ⁺ = 870

実施例３０
Ｎ^α−［−（（２−アミド−２−オキソエトキシ）（メチル）アミノ）酢酸］−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン[３０]
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝８８３ Example 30
N ^α -[-((2-amido-2-oxoethoxy) (methyl) amino) acetic acid] -Ala-Ala-Asn-PABC-camptothecin [30]
LC / MS: (MH) ⁺ = 883

実施例３１
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^４−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−スクシンアミド[３１]の調製
Ｎ^α−スクシンアミド酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン[８]（８５ｍｇ、０．１ミリモル）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン[２０]（１０４ｍｇ、０．１１ミリモル）、ＰｙＢｏｐ（６２ｍｇ、０．１２ミリモル）及びＤＩＥＡ（７８ｍｇ、０．６ミリモル）のＮＭＰ溶液（２ｍＬ）を、１時間撹拌した。エチルエーテル（２０ｍＬ）を添加し、得られた混合物を撹拌し、超音波処理した。エーテルを流出させ（２回繰り返した）、残渣をメタノール中で摩砕し、濾過し、乾燥させて、暗色生成物（１００ｍｇ、５７％収率）を得た。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１７７０ Example 31
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁴ -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-succinamide [31] N ^α -succinamic acid -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin [8] (85 mg, 0.1 mmol), Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin [20] (104 mg, 0.11 mmol), PyBop (62 mg, 0.12 mmol) and DIEA (78 mg, 0.6 mmol) The NMP solution (2 mL) was stirred for 1 hour. Ethyl ether (20 mL) was added and the resulting mixture was stirred and sonicated. The ether was drained (repeated twice) and the residue was triturated in methanol, filtered and dried to give a dark product (100 mg, 57% yield).
LC / MS: (MH) ⁺ = 1770

実施例３２
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−ビス（Ｏ^α）−アセトアミド[３２]の調製
実施例３１の調製の同様の方法を、化合物[２０]及び化合物[１２]から実施例３２を調製するために用いた。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１７８６ Example 32
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ⁵ -Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-bis (O ^α ) -acetamide [32] A method similar to the preparation of Example 31, compound Used to prepare Example 32 from [20] and Compound [12].
LC / MS: (MH) ⁺ = 1786

実施例３３
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−ドキソルビシン−ビス（Ｎ^α−メチル）−アセトアミド[３３]の調製
実施例３１の調製についての同様な方法を、化合物[２０]及び化合物[１３]から実施例３３を調製するために用いた。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１７９９ Example 33
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin, N ^5- Ala-Ala-Asn-PABC-doxorubicin-bis (N ^α -methyl) -acetamide [33] A similar method for the preparation of example 31 Was used to prepare Example 33 from Compound [20] and Compound [13].
LC / MS: (MH) ⁺ = 1799

実施例３４
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^４−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−スクシンアミド[３４]の調製
実施例３１の調製の同様の方法を、化合物[２７]及び化合物[８]から実施例３４を調製するために用いた。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１５７５ Example 34
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin, N ⁴ -Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin-Succinamide [34] A method similar to the preparation of Example 31, compound [27] and compound [A] 8] and was used to prepare Example 34.
LC / MS: (MH) ⁺ = 1575

実施例３５
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−ビス（Ｏ^α）−アセトアミド[３５]の調製
実施例３１の調製の同様の方法を、化合物[２７]及び化合物[１２]から実施例３４を調製するために用いた。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１５９１ Example 35
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin, N ^5- Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin-Bis (O ^α ) -Acetamido [35] Used to prepare Example 34 from [27] and Compound [12].
LC / MS: (MH) ⁺ = 1591

実施例３６
Ｎ^１−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−マイトマイシン，Ｎ^５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢＣ−カンプトテシン−ビス（Ｎ^α−メチル）−アセトアミド[３６]の調製
実施例３１の調製の同様の方法を、化合物[２７]及び化合物[１３]から実施例３４を調製するために用いた。
ＬＣ／ＭＳ：（ＭＨ）^＋＝１６０４ Example 36
Preparation of N ¹ -Ala-Ala-Asn-PABC-Mitomycin, N ^5- Ala-Ala-Asn-PABC-Camptothecin-Bis (N ^α -Methyl) -Acetamide [36] A similar method to the preparation of Example 31 Used to prepare Example 34 from Compound [27] and Compound [13].
LC / MS: (MH) ⁺ = 1604

本実施例で使用される略語は下記の通りである。
ＤＣＣ＝ジクロヘキシルカルビジイミド
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＣＵ＝ジシクロヘキシル尿素
ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ＝ジメチルアセトアミド
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ修飾イーグル培地
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴＡ＝Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’−エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルバモイル
ＨＡＴＵ＝１−[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ[４，５−ｂ]ピリミジニウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢＴ＝Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー
ＩＲ＝赤外分光法
ＬＣ／ＭＳ＝液体クロマトグラフィー／質量分析法
ＭＳ＝質量分析法
ＭＴＤ＝最大耐用量
ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジノン
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
ＰＡＢＣ＝ｐ−アミノベンジルカルバモイル
ＰＢＳ＝リン酸緩衝塩類溶液
Ｐｙ＝ピリジン
ＱＷ＝毎週
ＴＣＡ＝トリクロロ酢酸
Ｔｒ＝トリチル、トリフェニルメチル、
ＵＶ／ＶＩＳ＝紫外／可視分光法 The abbreviations used in this example are as follows.
DCC = dichlorohexylcarbidiimide DCM = dichloromethane DCU = dicyclohexylurea DIEA = diisopropylethylamine DMA = dimethylacetamide DMEM = Dulbecco's modified Eagle's medium DMF = N, N-dimethylformamide DMSO = dimethylsulfoxide EDC = 1-ethyl-3- (3- Dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA = N, N ', N'',N'',N'''',N''''-ethylenediaminetetraacetic acid FBS = fetal bovine serum Fmoc = fluorenyl methoxycarbamoyl HATU = 1-[bis (dimethyl) Amino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyrimidinium-3-oxide hexafluorophosphate HOBT = N-hydroxybenzotriazole HPLC = high pressure liquid chromatography IR = External spectroscopy LC / MS = liquid chromatography / mass spectrometric method MS = mass spectrometric method MTD = maximum usable amount NMP = N-methyl pyrrolidinone NMR = nuclear magnetic resonance PABC = p-aminobenzylcarbamoyl PBS = phosphate buffered saline solution Py = Pyridine QW = weekly TCA = trichloroacetic acid Tr = trityl, triphenylmethyl,
UV / VIS = Ultraviolet / Visible Spectroscopy

Claims

A peptide-drug complex which is N ^α -succinamic acid-Ala-Ala-Asn-PABC-mitomycin , or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the PABC has the formula:
A peptide-drug complex or a linker represented by the following, wherein the aziridine nitrogen of the mitomycin is bound to the carbonyl of the PABC, and the terminal carboxylic acid of the Asn forms an amide bond with the amino group of the PABC Its pharmaceutically acceptable salts .

Peptide of claim 1 - drug conjugate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a carrier that is at least one pharmaceutically acceptable, pharmaceutical composition.

The pharmaceutical composition according to claim 2 , packaged as one or more individual doses.

A pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer in a mammal, the peptide according to 請 Motomeko 1 - including drug matrix composite or a pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical compositions.

A pharmaceutical composition according to claim 2 or 3 for use in the treatment of cancer in a mammal .

The pharmaceutical composition according to claim 4 or 5, wherein the cancer is a solid tumor.

The cancer according to claim 4 or 5, wherein the cancer is colon cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, colon cancer, skin cancer, or prostate cancer. Pharmaceutical composition as described.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 4 to 7, wherein the peptide-drug complex is combined with another chemotherapeutic agent.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 4 to 7, wherein the peptide-drug complex is used in combination with radiation therapy.

Use of the peptide-drug complex according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the preparation of a cancer therapeutic agent.

The use according to claim 10, wherein the cancer is a solid tumor.

The cancer according to claim 10, wherein the cancer is colon cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, lung cancer, liver cancer, esophageal cancer, colon cancer, skin cancer or prostate cancer. use.