JP6539212B2 - Process for producing optically active cyclic imino acid - Google Patents
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Description
本発明は、医薬品中間体として有用なヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造するための方法に関するものである。 The present invention relates to a process for producing hydroxy-L-pipecolic acid useful as a pharmaceutical intermediate.
ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法として、例えば、以下の方法が知られている：
１） Ｌ−ピペコリン酸にＬ−プロリン水酸化酵素を作用させて、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸およびトランス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を取得する方法（非特許文献１）；
２） ３−ヒドロキシピコリン酸を高圧条件下で水素化することでシス−３−ヒドロキシ−ＤＬ−ピペコリン酸を取得する方法（非特許文献２，非特許文献３）；
３） （Ｓ）−１−（ベンジルオキシカルボニル）−５−オキソピロリジン−２−カルボン酸を原料とし、イリジウム触媒を用いてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のｔ−ブチルエステルを取得する方法（特許文献１）。As a method of producing hydroxy-L-pipecolic acid, for example, the following method is known:
1) L-Pipecolic acid is reacted with L-proline hydroxylase to give cis-3-hydroxy-L-pipecolic acid, cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid and trans-5-hydroxy-L-pipecolic acid To obtain (non-patent document 1);
2) A method for obtaining cis-3-hydroxy-DL-pipecolic acid by hydrogenating 3-hydroxypicolinic acid under high pressure conditions (Non-patent document 2, Non-patent document 3);
3) Using (S) -1- (benzyloxycarbonyl) -5-oxopyrrolidine-2-carboxylic acid as a raw material and using an iridium catalyst to obtain t-butyl ester of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid Method (Patent Document 1).
しかしながら、上記１）の方法は高価なＬ−ピペコリン酸を原料とする必要がある。上記２）の方法は高圧条件が必要である上に、高価な金属触媒を必要とし、製造コストが高いという問題がある。また、上記３）の方法は高圧条件と多段階反応を要し、さらに、高価な金属触媒を必要とする。このように、上記のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、コスト面や反応条件の面で工業的生産に有利な方法とは言い難い。 However, the method of the above 1) needs to use expensive L-pipecolic acid as a raw material. The above method 2) requires high pressure conditions, requires an expensive metal catalyst, and has the problem of high production cost. Moreover, the method of said 3) requires a high pressure condition and multistep reaction, and also requires an expensive metal catalyst. Thus, the method for producing hydroxy-L-pipecolic acid described above can not be said to be an advantageous method for industrial production in terms of cost and reaction conditions.
一方、特許文献２には、Ｌ−リジンを出発原料とし、酵素を用いてｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法が記載されている。また、特許文献３には、ピペコリン酸に水酸基を導入する反応を触媒する酵素が開示されている。 On the other hand, Patent Document 2 describes a method of producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-lysine as a starting material and using an enzyme. Patent Document 3 discloses an enzyme that catalyzes a reaction for introducing a hydroxyl group into pipecolic acid.
上述したように、特許文献２には、Ｌ−リジンを出発原料とし、酵素を用いてｃｉｓ−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法が記載されている。 As described above, Patent Document 2 describes a method of producing cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid using L-lysine as a starting material and using an enzyme.
しかし特許文献２に記載の製造方法では、最初にＬ−リジン ６−アミノトランスフェラーゼによりＬ−リジンのε−アミノ基をα−ケトグルタル酸に転移させてＬ−アミノアジピン酸−δ−セミアルデヒドとしている。かかるα−ケトグルタル酸や、アミノ基の転移により生成するグルタミン酸を除去して目的化合物を精製するには、非常に手間がかかる。また、当該製造方法では、得られたＬ−アミノアジピン酸−δ−セミアルデヒドを平衡反応により環状シッフ塩基に変換しているが、溶媒としては酵素反応のために水を使用しているため、シッフ塩基は非常に不安定であるといえる。さらに、当該製造方法では４つもの酵素を使用しており、製造コストは高くならざるを得ない。 However, in the production method described in Patent Document 2, first, the ε-amino group of L-lysine is transferred to α-ketoglutaric acid by L-lysine 6-aminotransferase to form L-aminoadipic acid-δ-semialdehyde . It is very laborious to remove the .alpha.-ketoglutaric acid and glutamic acid produced by the transfer of the amino group to purify the target compound. Moreover, in the said manufacturing method, although L- amino adipic acid-delta-semialdehyde obtained is converted into cyclic Schiff base by equilibrium reaction, since water is used for an enzyme reaction as a solvent, Schiff bases can be said to be very unstable. Furthermore, as many as four enzymes are used in the production method, and the production cost must be high.
そこで本発明は、医薬品中間体として有用なヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を、温和な条件下、低コストで効率的に製造する方法を提供することを目的とする。 Then, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing hydroxy-L-pipecolic acid useful as a pharmaceutical intermediate at low cost under a mild condition.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、発酵生産により安価に製造されているＬ−リジンを原料とし、環化酵素と水酸化酵素を用いることで上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, it has been found that the above-mentioned problems can be solved by using cyclase and hydroxylase using L-lysine which is inexpensively produced by fermentation production as a raw material, and the present invention has been completed.
本発明を以下に示す。 The present invention is described below.
［１］ ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法であって、
Ｌ−リジンを出発物質として、環化酵素を作用させる工程および水酸化酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする製造方法。[1] A method for producing hydroxy-L-pipecolic acid,
A production method comprising the steps of: reacting L-lysine as a starting material with cyclizing enzyme; and reacting with hydroxylase.
［２］ ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法であって、
Ｌ−リジンに環化酵素および水酸化酵素の両方を作用させることにより、中間体を単離することなくヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させる工程を含むことを特徴とする製造方法。[2] A method for producing hydroxy-L-pipecolic acid,
A process comprising producing a hydroxy-L-pipecolic acid without isolation of an intermediate by causing L-lysine to act on both a cyclase and a hydroxylase.
［３］ 上記ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、トランス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一つである上記［１］または［２］に記載の製造方法。 [3] The above hydroxy-L-pipecolic acid is cis-3-hydroxy-L-pipecolic acid, trans-3-hydroxy-L-pipecolic acid, cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid, trans-5-hydroxy acid -The manufacturing method as described in said [1] or [2] which is at least one chosen from the group which consists of-L- pipecolic acid.
［４］ 前記環化酵素が、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選択されるものである上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法：
（Ａ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列を有する環化酵素；
（Ｂ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列の１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素；
（Ｃ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素。[4] The process according to any one of the above-mentioned [1] to [3], wherein the cyclization enzyme is selected from the group consisting of the following (A), (B) and (C):
(A) a cyclase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141;
(B) has an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141 is substituted, deleted and / or added, and L-lysine or hydroxy-L-lysine A cyclization enzyme having an activity of acting on L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid;
(C) has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141, and acts on L-lysine or hydroxy-L-lysine to effect L- A cyclization enzyme having an activity of producing pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid.
［５］ 前記水酸化酵素が、下記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選択されるものである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法：
（Ｄ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素；
（Ｅ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列の１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素；
（Ｆ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。[5] The production method according to any one of the above [1] to [4], wherein the hydroxylase is selected from the group consisting of the following (D), (E) and (F):
(D) a hydroxylase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(E) has an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 is substituted, deleted and / or added, and L-lysine or L-pipecolic acid A hydroxylase having the activity of acting to produce hydroxy-L-lysine or hydroxy-L-pipecolic acid;
(F) has at least 80% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 and acts on L-lysine or L-pipecolic acid to produce hydroxy-L-lysine or hydroxy-L -A hydroxylase having the activity of producing pipecolic acid.
［６］ 前記環化酵素が配列番号１のアミノ酸配列を有し、且つ、前記水酸化酵素が配列番号３のアミノ酸配列を有する上記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。 [6] The method according to any one of the above [1] to [5], wherein the cyclization enzyme has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the hydroxylation enzyme has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
［７］ 前記環化酵素が、下記（Ａ１）、（Ｂ１）および（Ｃ１）からなる群から選択されるＤＮＡにコードされるポリペプチドである上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法：
（Ａ１） 配列番号２に記載のＤＮＡ；
（Ｂ１） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ１） 配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンを環化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。[7] The cyclization enzyme according to any one of the above-mentioned [1] to [6], which is a polypeptide encoded by a DNA selected from the group consisting of the following (A1), (B1) and (C1) Production method of:
(A1) DNA described in SEQ ID NO: 2;
(B1) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141;
(C1) A polypeptide which hybridizes under stringent conditions with a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has an activity of cyclizing L-lysine or hydroxy-L-lysine DNA to be
［８］ 前記水酸化酵素が、下記（Ｄ１）、（Ｅ１）および（Ｆ１）からなる群から選択されるＤＮＡにコードされるポリペプチドである上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法：
（Ｄ１） 配列番号４、６または８に記載のＤＮＡ；
（Ｅ１） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ１） 配列番号４、６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。[8] The hydroxylase is a polypeptide encoded by a DNA selected from the group consisting of the following (D1), (E1) and (F1): Production method of:
(D1) the DNA of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(E1) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(F1) A poly that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6 or 8 and has an activity of hydroxylating L-lysine or L-pipecolic acid DNA encoding a peptide.
［９］ 上記［７］に記載の前記（Ａ１）、（Ｂ１）および（Ｃ１）からなる群から選択されるＤＮＡと、上記［８］に記載の前記（Ｄ１）、（Ｅ１）および（Ｆ１）からなる群から選択されるＤＮＡとを宿主細胞に導入し、得られた形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いる上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。 [9] A DNA selected from the group consisting of (A1), (B1) and (C1) described in the above [7], and the above (D1), (E1) and (F1) described in the above [8] The method according to any one of the above [1] to [3], wherein a DNA selected from the group consisting of the above is introduced into a host cell, and the obtained transformant and / or the culture thereof is used as an enzyme source .
［１０］ 上記［７］に記載の前記（Ａ１）、（Ｂ１）および（Ｃ１）からなる群から選択されるＤＮＡと、上記［８］に記載の前記（Ｄ１）、（Ｅ１）および（Ｆ１）からなる群から選択されるＤＮＡを、別々に含有する複数の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いる上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。 [10] A DNA selected from the group consisting of (A1), (B1) and (C1) described in the above [7], and the above (D1), (E1) and (F1) described in the above [8] The host cell is transformed with a plurality of recombinant vectors separately containing a DNA selected from the group consisting of the above-mentioned [1], and the obtained transformant and / or its culture is used as an enzyme source [1] ]-The manufacturing method in any one of [3].
［１１］ 上記［７］に記載の前記（Ａ１）、（Ｂ１）および（Ｃ１）からなる群から選択されるＤＮＡと、上記［８］に記載の前記（Ｄ１）、（Ｅ１）および（Ｆ１）からなる群から選択されるＤＮＡとを両方含有する１つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いる上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。 [11] A DNA selected from the group consisting of the above (A1), (B1) and (C1) according to the above [7], and the above (D1), (E1) and (F1) according to the above [8] The host cell is transformed with one recombinant vector containing both of the DNAs selected from the group consisting of and the above transformants and / or the culture thereof obtained as the enzyme source [1] The manufacturing method in any one of-[3].
［１２］ 前記宿主細胞が微生物である上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。 [12] The method according to any one of the above [9] to [11], wherein the host cell is a microorganism.
［１３］ さらに、生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のアミノ基および／またはカルボキシ基を保護した後、目的のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を精製する工程を含む上記［１］〜［１２］に記載の製造方法。 [13] The method according to the above [1] to [12], further comprising the step of purifying the desired hydroxy-L-pipecolic acid after protecting the amino group and / or carboxy group of the produced hydroxy-L-pipecolic acid Manufacturing method.
本発明方法によれば、発酵生産により安価に製造可能なＬ−リジンを原料とすることができる。また、本発明方法では水溶媒が使用可能であり、高圧条件や高価な触媒を用いる必要がなく、穏和な条件で反応可能な酵素反応を用いる。さらに本発明方法では、必要な酵素は２つのみであり、また、水中で加水分解を受け易く不安定なシッフ塩基を経由する必要もない。よって本発明方法は、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を、温和な条件下、低コストで効率的に製造可能な技術として、産業上非常に有用である。 According to the method of the present invention, L-lysine which can be produced inexpensively by fermentation production can be used as a raw material. In the method of the present invention, an aqueous solvent can be used, and it is not necessary to use a high pressure condition or an expensive catalyst, and an enzyme reaction which can be reacted under mild conditions is used. Furthermore, in the method of the present invention, only two enzymes are required, and it is not necessary to go through hydrolysis in water and via unstable Schiff bases. Thus, the method of the present invention is very useful industrially as a technology capable of efficiently producing hydroxy-L-pipecolic acid under mild conditions at low cost.
以下、本発明について実施形態を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of embodiments, but the present invention is not limited thereto.
［目的化合物］
本発明方法で製造すべき目的化合物は、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸である。本発明の目的化合物であるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は水酸基の位置や、結合の方向、即ちカルボキシ基に対するシス位またはトランス位を問わないが、好ましくは下記式（１）：[Target compound]
The target compound to be prepared in the process of the present invention is hydroxy-L-pipecolic acid. The hydroxy-L-pipecolic acid, which is the object compound of the present invention, does not matter at the position of the hydroxyl group or the direction of bonding, ie, the cis position or the trans position relative to the carboxy group.
［式中、水酸基の立体配置は、カルボキシ基に対してシス位またはトランス位を示す］
で表される５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、および／または下記式（２）：[Wherein, the configuration of the hydroxyl group indicates a cis or trans position relative to the carboxy group]
5-hydroxy-L-pipecolic acid represented by and / or the following formula (2):
［式中、水酸基の立体配置は、カルボキシ基に対してシス位またはトランス位を示す］
で表される３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸である。具体的には、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、トランス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、トランス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。[Wherein, the configuration of the hydroxyl group indicates a cis or trans position relative to the carboxy group]
It is 3-hydroxy-L- pipecolic acid represented by Specifically, it consists of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid, trans-5-hydroxy-L-pipecolic acid, cis-3-hydroxy-L-pipecolic acid, trans-3-hydroxy-L-pipecolic acid At least one selected from the group is mentioned.
本発明では、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（以下、「ＨＰＡ」と略記する場合がある）の異性体について、水酸基が導入される位置の違いと、水酸基の空間的配置（カルボキシ基に対してシス位であるかトランス位であるか）の違いにより、シス−３−ＨＰＡ、シス−５−ＨＰＡ、トランス−５−ＨＰＡなどとそれぞれ表す場合がある。 In the present invention, with respect to the isomer of hydroxy-L-pipecolic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “HPA”), the difference in the position at which the hydroxyl group is introduced and the spatial arrangement of the hydroxyl group (cis relative to the carboxy group Depending on the difference in position or trans position), it may be represented as cis-3-HPA, cis-5-HPA, trans-5-HPA, etc.
シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（シス−５−ＨＰＡ）の構造は、下記式（３）で表される。 The structure of cis-5-hydroxy-L-pipecolic acid (cis-5-HPA) is represented by the following formula (3).
シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（シス−３−ＨＰＡ）の構造は、下記式（４）で表される。 The structure of cis-3-hydroxy-L-pipecolic acid (cis-3-HPA) is represented by the following formula (4).
本発明方法では、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は上記異性体の混合物として得られる場合があるが、目的化合物として実質的に特定の異性体のみが生成するか、特定の異性体が主生成物として生成することが好ましい。本発明において、目的のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸異性体が主生成物として生成するとは、環化酵素と水酸化酵素の反応によって生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のうち、６０モル％以上が目的の異性体であることを意味する。当該割合としては、７０モル％以上が好ましく、８０モル％以上がより好ましく、９０モル％以上が特に好ましい。 In the method of the present invention, hydroxy-L-pipecolic acid may be obtained as a mixture of the above isomers, but substantially only a specific isomer is produced as a target compound, or a specific isomer is a main product. It is preferred to generate. In the present invention, the purpose of producing the objective hydroxy-L-pipecolic acid isomer as the main product is that at least 60 mol% of the hydroxy-L-pipecolic acid produced by the reaction of the cyclizing enzyme with the hydroxylating enzyme Is meant to be an isomer of As the said ratio, 70 mol% or more is preferable, 80 mol% or more is more preferable, 90 mol% or more is especially preferable.
得られたヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に占める目的異性体の割合は、反応後溶液をＨＰＬＣで分析し、各異性体ピークの面積から算出することができる。なお、各異性体のＨＰＬＣピークの特定は、各異性体の標品のＨＰＬＣピークから特定することができる。一般的に、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の異性体の標品は市販されている。例えば、シス−５−ＨＰＡの標品はＡｕｒｕｍ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ社から、シス−３−ＨＰＡの標品はＮｅｔＣｈｅｍ社から、トランス−５−ＨＰＡの標品はＪ＆Ｗ ＰｈａｒｍＬａｂ社から購入することができる。 The ratio of the target isomer to the obtained hydroxy-L-pipecolic acid can be calculated from the area of each isomer peak by analyzing the solution after the reaction by HPLC. In addition, specification of the HPLC peak of each isomer can be specified from the HPLC peak of the standard of each isomer. In general, preparations of isomers of hydroxy-L-pipecolic acid are commercially available. For example, the preparation of cis-5-HPA can be purchased from Aurum Pharmatech, the preparation of cis-3-HPA from NetChem, and the preparation of trans-5-HPA from J & W PharmLab.
［反応工程］
本発明に係るヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、Ｌ−リジンを出発物質として、環化酵素を作用させる工程および水酸化酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする。本発明においては、上記両工程は何れを先に行ってもよい。[Reaction process]
The method for producing hydroxy-L-pipecolic acid according to the present invention is characterized in that it comprises a step of causing cyclization enzyme to act on L-lysine as a starting material and a step of causing hydroxylase to act. In the present invention, either of the above steps may be performed first.
例えば、（Ｉ）先ずＬ−リジンに環化酵素を作用させることによりＬ−ピペコリン酸を生成させ、次に水酸化酵素を作用させることによりＬ−ピペコリン酸からヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させてもよい。この場合、各反応は以下のとおりになる。 For example, (I) First, L-pipecolic acid is produced by reacting L-lysine with a cyclase, and then hydroxy-L-pipecolic acid is produced from L-pipecolic acid by acting a hydroxylase. May be In this case, each reaction is as follows.
或いは、（ＩＩ）先ずＬ−リジンに水酸化酵素を作用させることによりヒドロキシ−Ｌ−リジンを生成させ、次に環化酵素を作用させることによりヒドロキシ−Ｌ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させてもよい。この場合、各反応は以下のとおりになる。 Alternatively, (II) hydroxy-L-lysine is first generated by reacting L-lysine with hydroxylase, and then hydroxy-L-pipecolic acid is generated from hydroxy-L-lysine by reacting cyclase. It may be generated. In this case, each reaction is as follows.
本発明方法により得られるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸における水酸基の置換位置や立体配置は、主に水酸化酵素により制御される。よって、特定のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が必要である場合には、所望の異性体が得られるように水酸基を導入できる水酸化酵素を選択することが好ましい。 The substitution position and configuration of the hydroxyl group in hydroxy-L-pipecolic acid obtained by the method of the present invention are mainly controlled by the hydroxylase. Therefore, when a specific hydroxy-L-pipecolic acid is required, it is preferable to select a hydroxylase capable of introducing a hydroxyl group so as to obtain a desired isomer.
また、本発明においては、一方の工程を行い、生成した中間体を単離精製した後に他方の工程を行ってもよいし、一方の工程を行った後、生成した中間体を単離精製することなく他方の工程を行うための酵素を反応溶液へ添加することにより他方の工程を連続的に行ってもよい。 In the present invention, one of the steps may be carried out, and the produced intermediate may be isolated and purified before the other step may be carried out, or after the one step is carried out, the produced intermediate is isolated and purified. Alternatively, the other step may be performed continuously by adding an enzyme for performing the other step to the reaction solution.
さらに、Ｌ−リジンに環化酵素および水酸化酵素の両方を作用させることにより、中間体を単離することなくヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させてもよい。即ち、Ｌ−リジンに環化酵素および水酸化酵素を連続的に作用させることにより、中間体を単離することなく環化工程および水酸化工程をワンポットで行ってもよい。この場合の中間体は、Ｌ−リジンに環化酵素が先に作用する場合にはＬ−ピペコリン酸であり、水酸化酵素が先に作用する場合にはヒドロキシ−Ｌ−リジンである。かかる態様は、最も製造効率が高いことから好ましい。中間体を単離精製することなく反応を進めるいわゆるワンポット合成の場合、環化酵素と水酸化酵素は、同時に反応系へ添加してもよいし、時間を空けて逐次的に添加してもよいし、連続的に添加してもよい。環化酵素と水酸化酵素を同時に用いる場合には、上記の何れの工程が先に進行して何れの工程が次に進行しているかは、使用する酵素などによると考えられ不明であるが、上記（Ｉ）と（ＩＩ）のスキームが同時に進行していることも考えられる。 Furthermore, L-lysine may be reacted with both a cyclase and a hydroxylase to produce hydroxy-L-pipecolic acid without isolation of an intermediate. That is, the cyclization step and the hydroxylation step may be carried out in one pot without isolation of the intermediate, by continuously acting L-lysine on the cyclase and the hydroxylase. The intermediate in this case is L-pipecolic acid if the cyclization enzyme acts first on L-lysine, and is hydroxy-L-lysine if the hydroxylation enzyme acts first. Such an embodiment is preferable because it has the highest production efficiency. In the case of so-called one-pot synthesis in which the reaction proceeds without isolation and purification of the intermediate, the cyclase and the hydroxylase may be simultaneously added to the reaction system or may be added sequentially at intervals. May be added continuously. When cyclase and hydroxylase are used at the same time, it is unclear which step of the above steps have been made and which step has proceeded, although this is believed to be due to the enzyme used, etc. It is also conceivable that the schemes of (I) and (II) above proceed simultaneously.
反応条件は適宜調整することができ、例えば、反応の進行状態に応じて調整したり、或いは予備実験により決定することができる。具体的には、例えば、溶媒としては水を用い、原料化合物であるＬ−リジンの濃度は０．１質量％以上、９９質量％以下、好ましくは１質量％以上、６０質量％以下にすることができる。各酵素の濃度は、使用した酵素が精製酵素であるか粗酵素であるか、酵素を産生する微生物自体を用いるか、或いは酵素を含む微生物の菌体破砕液や培養液など酵素を産生する微生物の処理物を用いるかなどにより異なるので、適宜調整する。Ｌ−リジンは一括して添加してもよいし、連続的に添加してもよい。 The reaction conditions can be appropriately adjusted, and can be adjusted, for example, according to the progress of the reaction, or can be determined by preliminary experiments. Specifically, for example, water is used as the solvent, and the concentration of L-lysine as the raw material compound is 0.1% by mass or more and 99% by mass or less, preferably 1% by mass or more and 60% by mass or less Can. The concentration of each enzyme is determined whether the enzyme used is a purified enzyme or a crude enzyme, or the microorganism itself that produces the enzyme is used, or a microorganism that produces the enzyme, such as a disrupted cell solution or culture solution of a microorganism containing the enzyme Because it differs depending on whether or not the processed material is used, adjust as appropriate. L-lysine may be added all at once or may be added continuously.
その他、反応液には、各酵素の活性発現に必要な補酵素や金属塩などを適量添加してもよい。例えば、環化酵素の反応効率を上げるために０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下、好ましくは０．１ｍＭ以上、３０ｍＭ以下のＮＡＤを添加したり、水酸化酵素の反応効率を上げるために０．１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下、好ましくは１ｍＭ以上、５０ｍＭ以下の二価鉄を添加することもできる。 In addition, an appropriate amount of coenzyme, metal salt or the like necessary for expression of the activity of each enzyme may be added to the reaction solution. For example, 0.1 mM or more and 100 mM or less, preferably 0.1 mM or more and 30 mM or less of NAD is added to increase the reaction efficiency of the cyclization enzyme, or 0.1 mM or more to increase the reaction efficiency of the hydroxylase It is also possible to add 100 mM or less, preferably 1 mM or more and 50 mM or less of divalent iron.
反応温度は酵素が十分に発揮できるよう調整する。例えば、１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下とすることができる。反応液のｐＨは各酵素の至適ｐＨを考慮して適宜調整すればよいが、例えば、４以上、１１以下とすることができ、好ましくは６以上、９以下とする。反応時間は、原料であるＬ−リジンが十分に消費されるまでとすればよいが、例えば、１時間以上、１２０時間以下とすることができ、好ましくは１時間以上、７２時間以下とすることができる。 The reaction temperature is adjusted so that the enzyme can fully exhibit. For example, the temperature can be 10 ° C. or more and 60 ° C. or less, preferably 20 ° C. or more and 50 ° C. or less. The pH of the reaction solution may be appropriately adjusted in consideration of the optimum pH of each enzyme, but may be, for example, 4 or more and 11 or less, preferably 6 or more and 9 or less. The reaction time may be up to sufficient consumption of the raw material L-lysine, but can be, for example, 1 hour or more and 120 hours or less, preferably 1 hour or more and 72 hours or less Can.
［環化酵素］
本発明で用いる「環化酵素」には、Ｌ−リジンを環化してＬ−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素か、或いはヒドロキシ−Ｌ−リジンを環化してヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素のうちいずれか１つが含まれる。より具体的には、本発明で用いる環化酵素としては、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選択されるものを挙げることができる：
（Ａ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列を有する環化酵素；
（Ｂ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列の１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素；
（Ｃ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素。[Cyclizing enzyme]
As the "cyclizing enzyme" used in the present invention, an enzyme having an activity of cyclizing L-lysine to generate L-pipecolic acid, or cyclization of hydroxy-L-lysine to generate hydroxy-L-pipecolic acid Any one of the enzymes having the following activity. More specifically, as the cyclization enzyme used in the present invention, one selected from the group consisting of the following (A), (B) and (C) can be mentioned:
(A) a cyclase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141;
(B) has an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141 is substituted, deleted and / or added, and L-lysine or hydroxy-L-lysine A cyclization enzyme having an activity of acting on L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid;
(C) has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141, and acts on L-lysine or hydroxy-L-lysine to effect L- A cyclization enzyme having an activity of producing pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid.
本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、タンパク質の可溶化を促進するためのタグなどが挙げられる。 In the present invention, "having an (specific) amino acid sequence" for an enzyme means that the amino acid sequence of the enzyme includes the specified amino acid sequence, and that the function of the enzyme is maintained. Do. As a sequence other than the amino acid sequence specified in the enzyme, in addition to a histidine tag and a linker sequence for immobilization, a tag for promoting protein solubilization and the like can be mentioned.
環化酵素（Ｂ）において、「１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列」における「１または複数個」の範囲は、欠失等を有する環化酵素がＬ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有するものであれば特に限定されるものではない。「１または複数個」、即ち「１以上」の範囲は、例えば、１個以上、５０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、３０個以下、より好ましくは１個以上、２０個以下、さらに好ましくは１個以上、１５個以下、特に好ましくは１個以上、１０個以下とすることができる。当該範囲の上限としては、さらに、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個とすることができる。当該数は１個であってもよい。 In the cyclizing enzyme (B), the range of “one or more” in “an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and / or added” is a cyclizing enzyme having a deletion etc. It is not particularly limited as long as it has an activity of producing L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid by acting on -lysine or hydroxy-L-lysine. The range of "one or more", that is, "one or more" can be, for example, 1 or more and 50 or less, preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 20 Hereinafter, more preferably, it is 1 or more and 15 or less, and particularly preferably 1 or more and 10 or less. The upper limit of the range may be 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 3 or 2. The number may be one.
アミノ酸が置換、欠失および／または付加される位置は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで「高度保存領域」とは、由来の異なる複数の酵素についてアミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している領域を表す。高度保存領域は、比較すべきポリペプチドのアミノ酸配列を、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。 The position at which the amino acid is substituted, deleted and / or added is not particularly limited, but it is preferable to avoid highly conserved regions. Here, the “highly conserved region” refers to a region in which amino acids are identical among a plurality of sequences when the amino acid sequences are optimally aligned and compared for a plurality of enzymes derived from different origins. Highly conserved regions can be identified by comparing the amino acid sequences of the polypeptides to be compared using tools such as GENETYX.
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。 The amino acid sequence modified by substitution, insertion, deletion and / or addition may contain only one type of (for example, substitution) modification, or two or more types of modification (for example, substitution and Insertion) may be included.
「置換」の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。 In the case of "substitution", the amino acid to be substituted is preferably an amino acid (homologous amino acid) having similar properties to the amino acid before substitution. Here, amino acids in the same group of each group listed below are considered as homologous amino acids.
第１群：中性非極性アミノ酸 − Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ
第２群：中性極性アミノ酸 − Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
第３群：酸性アミノ酸 − Ｇｌｕ，Ａｓｐ
第４群：塩基性アミノ酸 − Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ
本発明において「Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する」とは、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンを基質とした場合に、その少なくとも一部からそれぞれＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成できる活性を有することをいう。Ｌ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が生成しているか否かは、例えば、反応液をＨＰＬＣで分析してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のピークが確認できるか否かにより決定することができる。Group 1: Neutral nonpolar amino acids-Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe
Group 2: neutral polar amino acids-Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
Third group: acidic amino acid-Glu, Asp
Group 4: basic amino acids-His, Lys, Arg
In the present invention, "having the activity of producing L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid by acting on L-lysine or hydroxy-L-lysine" means L-lysine or hydroxy-L-lysine as a substrate In this case, it means that it has an activity capable of producing L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid from at least a part thereof. Whether or not L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid is generated depends, for example, on whether or not the peak of L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid can be confirmed by analyzing the reaction solution by HPLC. It can be decided.
環化酵素（Ｃ）において、「配列同一性」とは、２以上のアミノ酸配列の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の類似性は高い。２以上のアミノ酸配列の同一性は、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができ、パーセンテージとして表すことができる。当該同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。 In the cyclization enzyme (C), "sequence identity" refers to the degree of identity of two or more amino acid sequences. Thus, the higher the identity of a given two amino acid sequences, the higher the similarity of those sequences. The identity of two or more amino acid sequences can be analyzed by direct comparison of the sequences, and specifically, it can be analyzed using commercially available sequence analysis software etc., and can be expressed as a percentage. . The identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % Or more, 99% or more, 99.5% or more.
環化酵素（Ｂ）および環化酵素（Ｃ）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９８９）等に記載の公知の方法に準じて調製することができる。 The cyclization enzyme (B) and the cyclization enzyme (C) can be prepared according to known methods described in Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., 1989) and the like.
本発明で用いる環化酵素としては、特に限定されないが、例えば、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｏｒｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来の環化酵素が挙げられ、好ましくはオクロバクトラム・アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｏｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）種、ストレプトマイセス・プリスチネスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）種、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）種、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）種由来の環化酵素が挙げられ、より好ましくは表１に記載の酵素である。 The cyclization enzyme used in the present invention is not particularly limited, and includes, for example, cyclization enzymes derived from Ochrobactorum, Streptomyces, Agrobacterium, preferably Oclobactrum.・ Anthropi (Ochrobactorum anthropi) species, Streptomyces pristine spiralis (Streptomyces pristinae spiralis) species, Streptomyces hygroscopicus species, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) species-derived cyclization enzyme More preferably Table 1 Is an enzyme described.
本発明で用いる「水酸化酵素」には、Ｌ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する酵素か、或いはＬ−リジンに作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンを生成する活性を有する酵素のうちいずれか１つが含まれる。より具体的には、本発明で用いる水酸化酵素としては、下記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選択されるものを挙げることができる：
（Ｄ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素；
（Ｅ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列の１または複数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素；
（Ｆ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。
The “hydroxylase” used in the present invention is an enzyme having an activity of producing L-pipecolic acid to produce hydroxy-L-pipecolic acid, or L-lysine to produce hydroxy-L-lysine Any one of the enzymes having the following activity. More specifically, as the hydroxylase used in the present invention, those selected from the group consisting of the following (D), (E) and (F) can be mentioned:
(D) a hydroxylase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(E) has an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 is substituted, deleted and / or added, and L-lysine or L-pipecolic acid A hydroxylase having the activity of acting to produce hydroxy-L-lysine or hydroxy-L-pipecolic acid;
(F) has at least 80% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 and acts on L-lysine or L-pipecolic acid to produce hydroxy-L-lysine or hydroxy-L -A hydroxylase having the activity of producing pipecolic acid.
水酸化酵素（Ｄ）〜（Ｆ）における語の定義や好適範囲などは、環化酵素における上記定義などを準用する。 The definitions and preferred ranges of the terms in the hydroxylases (D) to (F) apply mutatis mutandis to the above definitions in the cyclization enzymes.
本発明で用いる水酸化酵素としては、特に限定されないが、例えば、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ダクチロスポランジウム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属、ストレプトスポランジウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セグニリパラス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｉｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくは、表２に記載の酵素およびその改変酵素である。 The hydroxylase used in the present invention is not particularly limited. For example, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Dactylosporangium, Streptosporangium, Rhizobium Genus, Segniliparus, Streptomyces, Amycolatopsis, Acinetobacter, Bacillus, Corynebacterium, Catenulispora, Molite (Moritella), Nocardia, Burkholderia, and Frankia, and enzymes from microorganisms selected from the group consisting of Frankia (Frankia) can be mentioned, and preferably, enzymes described in Table 2 and It is the modified enzyme.
本発明に係る環化酵素と水酸化酵素は、常法により得ることができる。例えば、これら酵素を生産する天然微生物や、これら酵素を生産するように遺伝子操作された微生物を培養する。酵素が菌体外へ分泌される場合には、液体培地などの培養物自体を使ったり、培養物から酵素を精製または粗精製すればよい。酵素が菌体内に存在する場合には、菌体自体またはその乾燥物を使ったり、菌体破砕液を用いたり、菌体破砕液から酵素を精製または粗精製すればよい。より具体的には、上記酵素を得るための方法は、例えば、ＷＯ９８／３５０２５を参照することができる。
The cyclase and the hydroxylase according to the present invention can be obtained by a conventional method. For example, natural microorganisms that produce these enzymes and microorganisms engineered to produce these enzymes are cultured. When the enzyme is secreted out of the cell, the culture itself such as a liquid medium may be used, or the enzyme may be purified or roughly purified from the culture. When the enzyme is present in the cells, the cells themselves or a dried product thereof may be used, or a disrupted cell solution may be used, or the enzyme may be purified or roughly purified from the disrupted cell solution. More specifically, the method for obtaining the above enzyme can be referred to, for example, WO 98/35025.
本発明に係る酵素を産生する生物体は、天然に存在する生物でもよく、遺伝子組換え生物でもよい。また、酵素活性を示すものであれば、当該生物体の処理物を用いてもよい。生物体の処理物としては、例えば、菌体破砕物、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物を挙げることができ、各酵素の触媒活性が残存している物を意味する。 The organism producing the enzyme according to the present invention may be a naturally occurring organism or a genetically modified organism. In addition, processed products of the organism may be used as long as they exhibit enzyme activity. Examples of treated products of organisms include: disrupted cells, crude extract, cultured cells, freeze-dried organisms, acetone-dried organisms, or ground products thereof, and mixtures thereof. It means the one where the catalytic activity of
例えば、本発明の環化酵素および水酸化酵素は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、発現ベクターと宿主生物を使用する発現系かで発現させることにより産生することができる。前記宿主生物には、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とが含まれる。本発明に係る発現ベクターと宿主生物を使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素は、それぞれＬ−リジンサイクラーゼ活性またはヒドロキシ−Ｌ−リジンサイクラーゼ活性、および、Ｌ−ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性またはＬ−リジンヒドロキシラーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系または発現ベクターおよび宿主生物を使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法に使用される場合がある。本発明の酵素を前記発現ベクターと宿主生物を使用する発現系で発現させる場合には、前記酵素を発現する宿主生物、例えば本発明で利用する形質転換体が生きた状態で本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。或いは、前記酵素は、精製された状態で本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法に使用されてもよい。 For example, the cyclase and the hydroxylase of the present invention are produced by expressing DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence in an inanimate expression system or an expression system using an expression vector and a host organism. be able to. The host organisms include prokaryotes such as E. coli and Bacillus subtilis, and eukaryotes such as yeast, fungi, plants, animals and the like. An expression system using the expression vector and host organism according to the present invention may be a part of an organism such as a cell or a tissue or a whole individual organism. The enzyme of the present invention is an in vivo expression system or system, provided that it has L-lysine cyclase activity or hydroxy-L-lysine cyclase activity and L-pipecolic acid hydroxylase activity or L-lysine hydroxylase activity, respectively. It may be used in the method for producing the hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention in the state where the expression vector and other components of the expression system using a host organism are mixed. When the enzyme of the present invention is expressed in an expression system using the expression vector and a host organism, a host organism expressing the enzyme, for example, a transformant of the present invention which is used in the present invention can It may be used for the production of L-pipecolic acid. At this time, the hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention can be produced by a resting cell reaction system or a fermentation method. Alternatively, the enzyme may be used in a purified state in the method for producing hydroxy-L-pipecolic acid of the present invention.
本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明酵素発現ベクターを作製できる。 The enzyme expression vector of the present invention can be prepared by inserting a polynucleotide encoding the enzyme of the present invention into an expression vector.
形質転換に使用するポリヌクレオチドは、前記環化酵素または前記水酸化酵素をコードするものであれば特に制限されないが、例えば、前記環化酵素をコードする下記（Ａ１）、（Ｂ１）、（Ｃ１）、および、前記水酸化酵素をコードする（Ｄ１）、（Ｅ１）、（Ｆ１）を挙げることができる。 The polynucleotide used for transformation is not particularly limited as long as it encodes the cyclizing enzyme or the hydroxylating enzyme. For example, the following (A1), (B1), (C1) encoding the cyclizing enzyme may be used. And (D1), (E1) and (F1) encoding the above-mentioned hydroxylase.
（Ａ１） 配列番号２に記載のＤＮＡ
（Ｂ１） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｃ１） 配列表の配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンを環化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｄ１） 配列番号４、６または８に記載のＤＮＡ；
（Ｅ１） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ１） 配列番号４、６または８に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸を水酸化する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。(A1) DNA described in SEQ ID NO: 2
(B1) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141
(C1) A poly that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing under stringent conditions and has an activity of cyclizing L-lysine or hydroxy-L-lysine. DNA encoding a peptide
(D1) the DNA of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(E1) DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(F1) A poly that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, 6 or 8 and has an activity of hydroxylating L-lysine or L-pipecolic acid DNA encoding a peptide.
上記ＤＮＡ（Ｃ１）における「ストリンジェントな条件」としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．１１×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄することをいう。ＳＳＣ溶液の濃度としては、０．０８倍が好ましく、０．０５倍がより好ましく、０．０４倍が最も好ましい。 As “stringent conditions” in the above DNA (C1), for example, after hybridization at 65 ° C. in 0.11 × SSC containing 0.1% SDS, 0.1 × SSC-0.1% Washing twice with SDS. The concentration of the SSC solution is preferably 0.08 times, more preferably 0.05 times, and most preferably 0.04 times.
上記ＤＮＡ（Ｆ１）における各配列番号に対応する「ストリンジェントな条件」としては、例えば、配列番号４の塩基配列では０．１％ＳＤＳを含む０．１８×ＳＳＣ中、配列番号６の塩基配列では０．１％ＳＤＳを含む０．１５×ＳＳＣ中、配列番号８の塩基配列では０．１％ＳＤＳを含む０．０４×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄することをいう。ＳＳＣ溶液の濃度としては、配列番号４の塩基配列の場合、０．１２倍が好ましく、０．０８倍がより好ましく、０．０６倍が最も好ましく、配列番号６の塩基配列の場合、０．１倍が好ましく、０．０７倍がより好ましく、０．０５倍が最も好ましく、配列番号８の塩基配列の場合、０．０２８倍が好ましく、０．０２倍がより好ましく、０．０１４倍が最も好ましい。 As the “stringent conditions” corresponding to the respective SEQ ID NOs in the above DNA (F1), for example, the base sequence of SEQ ID NO: 4 is a base sequence of SEQ ID NO: 6 in 0.18 × SSC containing 0.1% SDS. After hybridization at 65 ° C. in 0.15 × SSC containing 0.1% SDS and at base sequence of SEQ ID NO: 8 in 0.04 × SSC containing 0.1% SDS, 0.1 × SSC -Washing twice with 0.1% SDS. The concentration of the SSC solution is preferably 0.12 times, more preferably 0.08 times, and most preferably 0.06 times in the case of the base sequence of SEQ ID NO: 4, and 0.1% in the case of the base sequence of SEQ ID NO: 6. 1 times is preferable, 0.07 times is more preferable, 0.05 times is most preferable, and in the case of the base sequence of SEQ ID NO: 8, 0.028 times is preferable, 0.02 times is more preferable, and 0.014 times is Most preferred.
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。 The expression vector used above is not particularly limited as long as it can express the polypeptide encoded by the polynucleotide in a suitable host organism. Such vectors include, for example, plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, etc. Furthermore, shuttle vectors capable of gene exchange with other host strains can also be used.
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明酵素をコードするＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３）などが挙げられる。 Such a vector usually contains regulatory elements such as lac promoter, lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter etc. in the case of E. coli, for example. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit operably linked to a DNA encoding For example, pUCN18 (see Example 2), pSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUCNT (WO 94/03613) and the like can be mentioned.
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーターと、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。 As used herein, the term "regulatory element" refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプと種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。 As used herein, the term "operably linked" refers to various regulatory elements, such as promoters, enhancers and the like, which regulate expression of a gene, and a gene, which are operably linked in a host cell. It is well known to those skilled in the art that the type and type of regulatory factor may vary depending on the host.
各種生物において利用可能なベクターやプロモーターなどに関しては、安藤忠彦「微生物学基礎講座 ８」共立出版（１９８７）などに詳細に記述されている。 Vectors and promoters that can be used in various organisms are described in detail in Tadahiko Ando “Basic course of microbiology 8” Kyoritsu Publishing (1987).
ベクターは、環化酵素と水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを両方とも含んでいてもよい。 The vector may contain both polynucleotides encoding a cyclase and a hydroxylase.
ベクターにより宿主細胞を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。或いは、形質転換体として、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入して得られる形質転換体も挙げられる。 Transformants can be obtained by transforming host cells with a vector. Alternatively, a transformant can also be a transformant obtained by introducing a polynucleotide encoding the enzyme of the present invention into a chromosome.
ベクターにより形質転換するための宿主細胞としては、各酵素をコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現することができる細胞であれば、特に制限されない。宿主細胞として利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ；などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入効率や発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。 As a host cell for transformation with a vector, any cell transformed with a polypeptide expression vector containing a polynucleotide encoding each enzyme and capable of expressing a polypeptide encoded by the introduced polynucleotide can be used. It is not particularly limited. Examples of microorganisms usable as host cells include, for example, Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium. B) bacteria whose host vector systems have been developed, such as the genera Streptococcus, Lactobacillus, etc .; radiations which have been developed host vector systems such as the genus Rhodococcus and Streptomyces. Fungus; Saccharomyces (Saccharomyces) genus, Kluyveromyces (Klu The genus veromyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Zygosaccharomyces, the genus Yarrowia, the genus Trichosporon, the genus Rhodosporidium, the genus Pichia and the candyda Yeasts for which host vector systems such as Genus have been developed; molds for which host vector systems such as Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium and Trichoderma have been developed; Etc. In addition to microorganisms, various host-vector systems have been developed in plants and animals, and in particular insects (Nature, 315, 592-594 (1985)) using potatoes, and plants such as rapeseed, corn and potatoes. A system for expressing heterologous proteins in large amounts has been developed and can be suitably used. Among these, bacteria are preferable from the introduction efficiency and expression efficiency, and E. coli is particularly preferable.
上記のような組換え微生物としては、表１または表２で挙げる酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換微生物が挙げられる。また、宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましく、また、Ｌ−リジン生成能が強化されたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）とコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。宿主微生物としてＬ−リジン生成能が強化されたものを用いることにより、Ｌ−リジンを原料化合物として添加しなくても、或いは原料化合物としてのＬ−リジンの量を低減しても、同様の反応を行える可能性がある。 As such a recombinant microorganism, a transformed microorganism transformed with a plasmid having a DNA encoding an enzyme listed in Table 1 or Table 2 can be mentioned. As host microorganisms, Escherichia coli (Escherichia coli) and Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) are preferable, and Escherichia coli (C. coli) and Corynebacterium glutamicum having enhanced ability to produce L-lysine are preferable. (Corynebacterium glutamicum) is preferred. The same reaction can be performed even if L-lysine is not added as a raw material compound or the amount of L-lysine as a raw material compound is reduced by using a host microorganism having an enhanced L-lysine generation ability, or even if the amount of L-lysine as a raw material compound is reduced. There is a possibility of
本発明のベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、ポリペプチド発現ベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に環化酵素をコードするポリヌクレオチドまたは水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドまたは上記２つのポリヌクレオチドを共に導入した本発明のプラスミド（実施例２，５，９）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体（例えば、実施例３に示すＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ））が得られる。 The vector of the present invention can be introduced into a host microorganism by known methods. For example, a polynucleotide encoding a cyclization enzyme or a polynucleotide encoding a hydroxylase or a plasmid according to the present invention in which the two polynucleotides described above are introduced together as the polypeptide expression vector into the above expression vector pUCN18 (Examples 2, 5 , 9) in the case of using E. coli as a host microorganism, commercially available E. coli. A transformant (for example, E. coli HB101 (pNOA) shown in Example 3) in which the vector is introduced into a host cell by operating according to the protocol using E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) or the like. ) Is obtained.
また、環化酵素と水酸化酵素の両酵素を同一菌体内で発現させた形質転換体も育種することができる。即ち、環化酵素をコードするポリヌクレオチドおよび水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。 In addition, transformants in which both cyclase and hydroxylase enzymes are expressed in the same cell can be bred. That is, a polynucleotide encoding a cyclization enzyme and a polynucleotide encoding a hydroxylase are incorporated into the same vector, and the vector is obtained by introducing the same into a host cell. It can also be obtained by respectively incorporating into two different vectors and introducing them into the same host cell.
このようにして得られる形質転換体としては、例えば、環化酵素をコードするポリヌクレオチドを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクター（例えば、実施例２に示したｐＮＯＡ）と水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体などが挙げられる。 As a transformant thus obtained, for example, a recombinant vector (for example, pNOA shown in Example 2) in which a polynucleotide encoding a cyclization enzyme is introduced into the above expression vector pUCN18 and a hydroxylase A vector containing the encoding polynucleotide is Examples include transformants introduced into E. coli HB101 competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.).
本発明では、前記環化酵素および／または前記水酸化酵素として、これら酵素を生産する天然微生物自体および／またはその培養物や、これら酵素を生産するように遺伝子操作された微生物自体および／またはその培養物を用いてもよい。原料化合物であるＬ−リジンと共に当該微生物を培養することにより、Ｌ−リジンが微生物変換されて目的化合物であるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が得られる可能性がある。また、当該微生物に産生される酵素が微生物細胞内に存在する場合には、当該微生物の乾燥物や細胞破砕液を用いてもよい。当該微生物が酵素を細胞外へ分泌する場合には、液体培地などその培養物、さらには当該培養物から微生物を除去した培養物を用いてもよい。 In the present invention, as said cyclization enzyme and / or said hydroxylase, a natural microorganism itself producing said enzyme and / or a culture thereof, or a microorganism engineered so as to produce these enzymes itself and / or its Cultures may be used. By culturing the microorganism with L-lysine which is a starting compound, L-lysine may be converted to a microorganism to obtain hydroxy-L-pipecolic acid which is a target compound. In addition, when an enzyme produced by the microorganism is present in a microbial cell, a dried product of the microorganism or a cell disruption solution may be used. When the microorganism secretes the enzyme extracellularly, a culture such as a liquid medium, or a culture obtained by removing the microorganism from the culture may be used.
前記酵素を産生する微生物を用いる場合には、前記環化酵素と前記水酸化酵素をそれぞれ産生する複数の微生物を用いてもよいし、両酵素の産生能を有する微生物を用いてもよい。 When using a microorganism that produces the enzyme, a plurality of microorganisms that respectively produce the cyclization enzyme and the hydroxylase may be used, or a microorganism that has the ability to produce both enzymes may be used.
酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類；オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸およびそのエステル類；菜種油、大豆油等の油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキス、環状アミノ酸など；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸鉄（ＩＩ）など；他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地を使用することができる。 The culture medium for the microorganism used as the enzyme source is not particularly limited as long as the microorganism can grow. For example, carbon sources such as sugars such as glucose and sucrose, alcohols such as ethanol and glycerol; fatty acids such as oleic acid and stearic acid and esters thereof; oils such as rapeseed oil and soybean oil; ammonium sulfate as nitrogen source Sodium nitrate, peptone, casamino acids, corn steep liquor, bran, yeast extract, cyclic amino acids, etc .; inorganic salts such as magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, potassium monohydrogenphosphate, potassium dihydrogenphosphate, iron (II) sulfate Etc. As other nutrient sources, a common liquid medium containing malt extract, meat extract and the like can be used.
［後処理工程］
本発明では、所望のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が主生成物として得られるよう環化酵素と水酸化酵素を選択すればよいが、特に使用する水酸化酵素によっては、導入される水酸基の位置や絶対構造に関する異性体が生じ得る。このような場合には、目的化合物である異性体を単離精製してもよい。また、所望のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が十分な選択性をもって生成する場合であっても、反応液から単離精製してもよい。[Post-processing process]
In the present invention, cyclase and hydroxylase may be selected so that the desired hydroxy-L-pipecolic acid can be obtained as the main product, but depending on the hydroxylase to be used in particular, the position of the introduced hydroxyl group or Isomers of the absolute structure may occur. In such a case, the isomer which is the target compound may be isolated and purified. Also, even if the desired hydroxy-L-pipecolic acid is produced with sufficient selectivity, it may be isolated and purified from the reaction solution.
反応で生じたヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、常法により、それぞれを単離精製できる。例えば、環化反応および水酸化反応で生じたヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を含む反応液を、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、クロマトグラフィーなどの処理を行うことにより単離精製できる。また、各酵素として微生物自体を用いたような場合には、反応液から微生物菌体を除去した濾液を、硫酸などを用いて中和晶析し、析出した目的物を濾別することによっても単離・精製できる。 Each hydroxy-L-pipecolic acid produced in the reaction can be isolated and purified by a conventional method. For example, the reaction solution containing hydroxy-L-pipecolic acid produced by the cyclization reaction and the hydroxylation reaction is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate or toluene, and the organic solvent is distilled off under reduced pressure and then distilled, re-used. It can be isolated and purified by performing treatments such as crystallization and chromatography. When microorganisms themselves are used as each enzyme, the filtrate obtained by removing the microbial cells from the reaction solution may be neutralized and crystallized using sulfuric acid or the like, and the precipitated target may be separated by filtration. It can be isolated and purified.
生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸はアミノ基とカルボキシ基を有する両性化合物であり、これら極性基の少なくとも一方を保護して全体の極性を下げることにより精製効率を向上することができる。例えば、極性基の保護により有機溶媒による抽出が可能になり、イオン交換カラムクロマトグラフィーや中和晶析を用いなくても水溶性化合物からの分離が可能になる。また、かかる抽出液に貧溶媒を添加することにより保護された目的化合物を容易に晶析精製することができるし、或いは、アミノ基のみ保護した場合には抽出液を塩基性にすることにより、カルボキシ基のみ保護した場合には抽出液を酸性にすることにより、晶析精製することができる。また、化合物の極性を下げることにより、カラムクロマトグラフィーによる精製が容易になる場合がある。なお、適切な保護基を選択することにより、脱保護反応やその後の目的化合物（ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸）の精製も容易に実施することができる。 The produced hydroxy-L-pipecolic acid is an amphoteric compound having an amino group and a carboxy group, and purification efficiency can be improved by protecting at least one of these polar groups to reduce the overall polarity. For example, protection of polar groups enables extraction with an organic solvent, and separation from water-soluble compounds is possible without using ion exchange column chromatography or neutralization crystallization. In addition, the target compound protected by adding a poor solvent to the extract can be easily crystallized and purified, or when only the amino group is protected, by making the extract basic, When only the carboxy group is protected, crystallization can be performed by acidifying the extract. In addition, by reducing the polarity of the compound, purification by column chromatography may be facilitated. In addition, by selecting an appropriate protecting group, deprotection reaction and subsequent purification of the target compound (hydroxy-L-pipecolic acid) can be easily carried out.
保護基の選択や保護反応および脱保護反応は、当業者であれば公知方法から適宜選択することができるが、例えば、T．W．Green，P．G．M．Wuts，"PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS"，JOHN WILEY & SONS，Inc．を参照することができる。アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニルやベンジルオキシカルボニルなどのカルバメート系保護基；ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチルなどのアルカノイル系保護基；ベンゾイルなどのアリールカルボニル系保護基などを挙げることができる。カルボキシ基の保護基としては、メチルエステルなどのアルキルエステル系保護基；メトキシメチルやベンジルオキシメチルなどのオキシメチル系保護基；ベンジルエステルやトリフェニルメチルなどのアリールメチルエステル系保護基などを挙げることができる。 The selection of the protective group, the protective reaction and the deprotection reaction can be appropriately selected from known methods by those skilled in the art. W. Green, P.I. G. M. Wuts, "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS", JOHN WILEY & SONS, Inc. Can be referenced. Examples of protecting groups for amino groups include carbamate protecting groups such as t-butoxycarbonyl and benzyloxycarbonyl; alkanoyl protecting groups such as formyl, acetyl and trifluoroacetyl; and arylcarbonyl protecting groups such as benzoyl and the like. it can. Examples of protecting groups for carboxy groups include alkyl ester-based protecting groups such as methyl ester; oxymethyl-based protecting groups such as methoxymethyl and benzyloxymethyl; aryl methyl ester-based protecting groups such as benzyl ester and triphenylmethyl. Can.
以上で説明した本発明方法で得られるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、有用な医薬品中間体となるため、本発明方法は非常に有益な反応である。 Since the hydroxy-L-pipecolic acid obtained by the method of the present invention described above becomes a useful pharmaceutical intermediate, the method of the present invention is a very useful reaction.
本願は、２０１３年１２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１３−２６８３３１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年１２月２６日に出願された日本国特許出願第２０１３−２６８３３１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。 The present application claims the benefit of priority based on Japanese Patent Application No. 2013-268331 filed on December 26, 2013. The entire content of the specification of Japanese Patent Application No. 2013-268331 filed on December 26, 2013 is incorporated herein by reference.
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）；
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８９）。In addition, the detailed operation method etc. regarding the recombinant DNA technology used in the following examples are described in the following documents:
Molecular Cloning 2nd Edition (Joseph Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989);
Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience) (1989).
実施例１： オクロバクトラム・アンスロピーＡＴＣＣ４９１８８株由来の、Ｌ−リジン環化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
オクロバクトラム・アンスロピー（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）ＡＴＣＣ４９１８８株より、Ｌ−リジンに対する環化活性を有するポリペプチド（表１に記載のＣＯＡ）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより取得した。詳細な実験条件は、以下のとおりである。Example 1: Acquisition of a DNA encoding a polypeptide having L-lysine cyclization activity derived from Ochrobactrum anthropia strain ATCC 49188. A polypeptide having a cyclization activity for L-lysine from Ochrobactrum anthropi strain ATCC 49188. DNA encoding (COA described in Table 1) was obtained by PCR. The detailed experimental conditions are as follows.
（１） オクロバクトラム・アンスロピーＡＴＣＣ４９１８８株の染色体ＤＮＡの調製
５００ｍＬ容坂口フラスコに、１Ｌ当たりバクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇを含む組成を有する液体培地（ｐＨ７）５０ｍＬを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたオクロバクトラム・アンスロピーＡＴＣＣ４９１８８株の培養液を５ｍＬ接種し、３０℃で１８時間振盪しながら培養した。この培養液から、Ｍｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４３２１（１９８０））に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。(1) Preparation of chromosomal DNA of Ochrobactrum anthropus ATCC 49188 strain A composition containing 16 g of Bacto tryptone per liter, 10 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride and 0.1 g of Adecanol LG-109 (manufactured by NOF Corporation) in a 500 mL volume Sakaguchi flask Fifty mL of liquid medium (pH 7) was prepared and steam-sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. Into this medium, 5 mL of a culture solution of Ochrobactrum anthropii ATCC 49188 strain, which was previously precultured in the same medium, was inoculated, and cultured while shaking at 30 ° C. for 18 hours. From this culture solution, chromosomal DNA was extracted according to the method described in Murray et al. (Nucl. Acids Res., 8, 4321 (1980)).
（２） ＰＣＲ反応
プライマー１：５’−ＡＧＣＡＴＣＧＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＴＧＡＡ−３’（配列表の配列番号９）と、プライマー２：５’−ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴ−３’（配列表の配列番号１０）を用い、上記で得られたオクロバクトラム・アンスロピーＡＴＣＣ４９１８８株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。(2) PCR reaction Primer 1: Obtained using the above: using 5'-AGCATCGTACATATGACCCAACCGAACCTGAA-3 '(SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing) and Primer 2: 5'-GCAGAATTCTTATCAGGCCGCTGGGCTTGGTCT-3' (SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing) PCR was carried out using the chromosomal DNA of the O. bacthratrum anthropi ATCC 49188 strain as a template.
その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列を有し、遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、且つ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＣＯＡ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。 As a result, a double-stranded DNA (COA gene having a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, an NdeI recognition site added to the start codon of the gene, and an EcoRI recognition site added immediately after the termination codon) )was gotten. PCR was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) as a DNA polymerase, and the reaction conditions were according to the instruction manual.
実施例２： 組換えベクターｐＮＯＡの構築
実施例１で得られたＣＯＡ遺伝子を制限酵素であるＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＯＡを構築した。なお、上記プラスミドｐＵＣＮ１８は、ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、さらに４７１〜４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入して作製したものである。Example 2: Construction of recombinant vector pNOA The COA gene obtained in Example 1 is digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and inserted between the NdeI recognition site and the EcoRI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUCN18. The recombinant vector pNOA was constructed. The above plasmid pUCN18 was newly modified by modifying the 185th T of pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.) to A by PCR to destroy the NdeI site, and further modifying the 471 to 472th GC to TG. It is produced by introducing an NdeI site.
実施例３： ポリペプチドＣＯＡを発現する組み換え生物の作製
実施例２で構築した組換えベクターｐＮＯＡを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ）を得た。また、プラスミドｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。Example 3: Preparation of recombinant organisms expressing the polypeptide COA The recombinant vector pNOA constructed in Example 2 was used to E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pNOA) was obtained. In addition, plasmid pUCN18 was used to transform E. coli. E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pUCN18) was obtained.
実施例４： 組換え生物におけるＣＯＡ遺伝子の発現
実施例３で得た２種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）とＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＣＯＡ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のＬ−リジン環化活性を測定した。Example 4: Expression of COA gene in recombinant organisms The two recombinant organisms obtained in Example 3, E. coli. coli HB101 (pUCN18) and E. coli. Inoculate 5 mL of E. coli HB101 (pCOA) in 2 × YT medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The L-lysine cyclization activity of these cell-free extracts was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に１０ｍＭのＬ−リジンを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析し、Ｌ−リジンとＬ−ピペコリン酸のピーク面積比から変換率を計算した。 Specifically, 10 mM L-lysine was added to 500 μL of the cell-free extract and stirred at 30 ° C. for 24 hours. The reaction solution was diluted 10 times with water and centrifuged, and then the supernatant was subjected to HPLC analysis under the following conditions, and the conversion rate was calculated from the peak area ratio of L-lysine and L-pipecolic acid.
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： １．０ｍＬ／ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−リジン − 約５．９分
Ｌ−ピペコリン酸 − 約１３．８分
その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＣＯＡ）の無細胞抽出液を用いた場合のみ、Ｌ−リジンから変換率１００％でＬ−ピペコリン酸が生成していることが確認された。[HPLC analysis conditions]
Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, inside diameter 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 1.0 mL / min
Retention time: L-lysine-about 5.9 minutes
L-pipecolic acid-about 13.8 minutes, as a result, E. coli. It was confirmed that L-pipecolic acid was produced at a conversion rate of 100% from L-lysine only when using a cell-free extract of E. coli HB101 (pCOA).
実施例５： 組換えベクターｐＮＳＭの構築
シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＮＢＲＣ１４７８２株より、Ｌ−ピペコリン酸に対する水酸化活性を有するポリペプチド（表２に記載のＨＳＭ）をコードするＤＮＡ（配列番号４）の合成を外部（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）に委託し、当該ＤＮＡがｐＵＣ５７に結合されたプラスミドの形態で得た。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＳＭを構築した。Example 5: Construction of recombinant vector pNSM DNA encoding a polypeptide having a hydroxylating activity to L-pipecolic acid (HSM described in Table 2) from Sinorhizobium meliloti NBRC 14782 strain (SEQ ID NO: 4) Was synthesized to the outside (Eurogentec), and the DNA was obtained in the form of a plasmid linked to pUC57. This plasmid was digested with restriction enzymes EcoRI and SacI, and inserted between the EcoRI recognition site and SacI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUC18 to construct a recombinant vector pNSM.
実施例６：ポリペプチドＨＳＭを発現する組み換え生物の作製
実施例５で構築した組換えベクターｐＮＳＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。Example 6 Preparation of Recombinant Organism Expressing Polypeptide HSM The recombinant vector pNSM constructed in Example 5 was used to E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pNSM) was obtained. Also, using pUCN18, E. coli. E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pUCN18) was obtained.
実施例７： 組換え生物におけるＨＳＭ遺伝子の発現
実施例６で得た２種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）とＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のＬ−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。Example 7: Expression of HSM gene in recombinant organisms The two recombinant organisms obtained in Example 6 E. coli. coli HB101 (pUCN18) and E. coli. E. coli HB101 (pNSM) is inoculated into 5 mL of 2 × YT medium (1. 6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The L-pipecolic acid hydroxylation activity of these cell-free extracts was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に１０ｍＭ Ｌ−ピペコリン酸、１ｍＭ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸二ナトリウム二水和物、および１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析し、Ｌ−ピペコリン酸とシス−５−Ｌ−ピペコリン酸およびシス−３−Ｌ−ピペコリン酸のピーク面積から変換率を計算した（以下、「ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸」を「ＨＰＡ」と略記する場合がある）。Specifically, 10 mM L-pipecolic acid, 1 mM FeSO 4 · 7 H 2 O, 1 mM α-ketoglutarate disodium dihydrate, and 10 mM sodium ascorbate are added to 500 μL of the cell-free extract, and the mixture is heated to 30 ° C. Stir for 24 hours. The reaction solution is diluted 10-fold with water and centrifuged, and the supernatant is analyzed by HPLC under the following conditions, and L-pipecolic acid, cis-5-L-pipecolic acid and cis-3-L-pipecolic acid The conversion rate was calculated from the peak area (hereinafter, "hydroxy-L-pipecolic acid" may be abbreviated as "HPA").
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍおよび１５０ｍｍを直列に接続して使用，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長：２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： ０．９ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−ピペコリン酸 − ２６．３分
シス−５−ＨＰＡ − ２２．３分
シス−３−ＨＰＡ − ２４．８分
シス−５−ＨＰＡの標品はＡｕｒｕｍ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ社から、シス−３−ＨＰＡの標品はＮｅｔＣｈｅｍ社から購入した。[HPLC analysis conditions]
Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm and 150 mm connected in series, using an inner diameter of 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 0.9 mL / min
Retention time: L-pipecolic acid-26.3 minutes
Cis-5-HPA-22.3 minutes
Cis-3-HPA-24.8 min. The preparation of cis-5-HPA was purchased from Aurum Pharmatech and the preparation of cis-3-HPA from NetChem.
ＨＰＬＣ分析結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）の無細胞抽出液を用いた場合には、６．３ｍＭのシス−５−ＨＰＡおよび３．２ｍＭシス−３−ＨＰＡが生成していることが確認された。 From the HPLC analysis results, E.I. When cell-free extract of E. coli HB101 (pNSM) was used, it was confirmed that 6.3 mM cis-5-HPA and 3.2 mM cis-3-HPA were produced.
実施例８： 組換え生物によるＬ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のワンポット合成１
実施例３および実施例６で得た３種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液を表３に示したように単独または等量ずつ混合し、Ｌ−リジンからのシス−５−ＨＰＡおよびシス−３−ＨＰＡへの変換活性を測定した。Example 8: One-pot synthesis of hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine by recombinant organisms 1
The three recombinant organisms E. coli obtained in Example 3 and Example 6 were used. coli HB101 (pUCN18), E. coli. coli HB101 (pNOA), and E. coli. E. coli HB101 (pNSM) is inoculated into 5 mL of 2 × YT medium (1. 6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. These cell-free extracts were mixed alone or in equal amounts as shown in Table 3, and the conversion activity of L-lysine to cis-5-HPA and cis-3-HPA was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に、１０ｍＭ Ｌ−リジン、１ｍＭ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸二ナトリウム二水和物、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析した。Specifically, 10 mM L-lysine, 1 mM FeSO 4 · 7 H 2 O, 1 mM α-ketoglutarate disodium dihydrate, 10 mM sodium ascorbate are added to 500 μL of the cell-free extract, and the mixture is incubated at 30 ° C. for 24 hours. Stir for hours. The reaction solution was diluted 10 times with water and centrifuged, and then the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
［ＨＰＬＣ分析条件］
Ａ． 反応液中のＬ−リジンとＬ−ピペコリン酸の分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： １．０ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−リジン − 約５．９分
Ｌ−ピペコリン酸 − 約１３．８分
Ｂ． 反応液中のＬ−ピペコリン酸、シス−５−ＨＰＡ、シス−３−ＨＰＡの分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）を２本直列に接続
カラム温度： ３０℃
検出波長：２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： ０．５ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−ピペコリン酸 − 約６０．３分
シス−５−ＨＰＡ − 約５１．９分
シス−３−ＨＰＡ − 約５７．９分
分析結果を表３に示す。[HPLC analysis conditions]
A. Analysis of L-lysine and L-pipecolic acid in the reaction solution Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, internal diameter 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 1.0 mL / min
Retention time: L-lysine-about 5.9 minutes
L-pipecolic acid-about 13.8 minutes Analysis of L-pipecolic acid, cis-5-HPA, cis-3-HPA in the reaction column Column: Two SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, ID 4.6 μm, manufactured by Sumika Analysis Center Co., Ltd.) are connected in series Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 0.5mL / min
Retention time: L-pipecolic acid-about 60.3 minutes
Cis-5-HPA-about 51.9 minutes
Cis-3-HPA-about 57.9 minutes The analysis results are shown in Table 3.
以上の結果から、ワンポットであっても、ポリペプチドＣＯＡによりＬ−リジンからＬ−ピペコリン酸が生成し、さらにＨＳＭの作用によりヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が生成することが確認された。 From the above results, it was confirmed that L-pipecolic acid is produced from L-lysine by the polypeptide COA and that hydroxy-L-pipecolic acid is further produced by the action of HSM, even with one pot.
実施例９： 組換えベクターｐＮＭＬの構築
メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９株よりＬ−ピペコリン酸に対する水酸化活性を有するポリペプチド（表２に記載のＨＭＬ）をコードするＤＮＡの合成を外部（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）に委託し、当該ＤＮＡがｐＵＣ５７に結合されたプラスミドの形態で得た。このプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流のＫｐｎＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＭＬを構築し、配列番号６に示すＤＮＡを得た。Example 9: Construction of recombinant vector pNML The synthesis of a DNA encoding a polypeptide (HML described in Table 2) having hydroxylating activity to L-pipecolic acid from Mesorhobium loti MAFF 303099 is externalized (Eurogentec) And the DNA was obtained in the form of a plasmid bound to pUC57. This plasmid was digested with restriction enzymes KpnI and SacI and inserted between the KpnI recognition site and SacI recognition site downstream of the lac promoter of plasmid pUC18 to construct a recombinant vector pNML to obtain the DNA shown in SEQ ID NO: 6 .
実施例１０： ポリペプチドＨＭＬを発現する組み換え生物の作製
実施例９で構築した組換えベクターｐＮＭＬを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＭＬ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。Example 10 Preparation of Recombinant Organisms Expressing Polypeptide HML The recombinant vector pNML constructed in Example 9 was used to E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pNML) was obtained. Also, using pUCN18, E. coli. E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and the recombinant organism E. coli was transformed. coli HB101 (pUCN18) was obtained.
実施例１１： 組換え生物におけるＨＭＬ遺伝子の発現
実施例１０で得た２種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）とＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＭＬ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液のＬ−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。Example 11: Expression of HML gene in recombinant organisms The two recombinant organisms obtained in Example 10, E. coli. coli HB101 (pUCN18) and E. coli. E. coli HB101 (pNML) is inoculated into 5 mL of 2 × YT medium (1. 6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The L-pipecolic acid hydroxylation activity of these cell-free extracts was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に２５ｍＭ Ｌ−ピペコリン酸、１ｍＭ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸二ナトリウム二水和物、１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。各反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析した。Specifically, 25 mM L-pipecolic acid, 1 mM FeSO 4 · 7 H 2 O, 1 mM α-ketoglutarate disodium dihydrate, and 10 mM sodium ascorbate are added to 500 μL of the cell-free extract, and 24 mM at 30 ° C. Stir for hours. Each reaction solution was diluted 10-fold with water and centrifuged, and then the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍおよび１５０ｍｍを直列に接続して使用，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： ０．９ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−ピペコリン酸 − ２６．３分
シス−５−ＨＰＡ − ２２．３分
シス−３−ＨＰＡ − ２４．８分
分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＭＬ）の無細胞抽出液を用いた場合にはＬ−ピペコリン酸から０．４ｍＭのシス−５−ＨＰＡと２．１ｍＭのシス−３−ＨＰＡが生成していることが確認された。[HPLC analysis conditions]
Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm and 150 mm connected in series, using an inner diameter of 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 0.9 mL / min
Retention time: L-pipecolic acid-26.3 minutes
Cis-5-HPA-22.3 minutes
Cis-3-HPA-24.8 min Analysis results, E. coli When cell-free extract of E. coli HB101 (pNML) was used, it was confirmed that 0.4 mM cis-5-HPA and 2.1 mM cis-3-HPA were produced from L-pipecolic acid .
実施例１２： 組換え生物によるＬ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のワンポット合成２
実施例３および実施例１０で得た３種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＭＬ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液を表４に示したように単独または等量ずつ混合し、Ｌ−リジンからのシス−５−ＨＰＡおよびシス−３−ＨＰＡへの変換活性を測定した。Example 12: One-pot synthesis of hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine by recombinant organisms 2
The three types of recombinant organisms obtained in Example 3 and Example 10, E. coli. coli HB101 (pUCN18), E. coli. coli HB101 (pNOA), and E. coli. E. coli HB101 (pNML) is inoculated into 5 mL of 2 × YT medium (1. 6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. These cell-free extracts were mixed alone or in equal amounts as shown in Table 4, and the conversion activity of L-lysine to cis-5-HPA and cis-3-HPA was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に１０ｍＭ Ｌ−リジン、１ｍＭ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸二ナトリウム二水和物、および１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析した。Specifically, 10 mM L-lysine, 1 mM FeSO 4 · 7 H 2 O, 1 mM α-ketoglutarate disodium dihydrate, and 10 mM sodium ascorbate are added to 500 μL of the cell-free extract, and 24 mM at 30 ° C. Stir for hours. The reaction solution was diluted 10 times with water and centrifuged, and then the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
［ＨＰＬＣ分析条件］
Ａ． 反応液中のＬ−リジンとＬ−ピペコリン酸の分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： １．０ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−リジン − 約５．９分
Ｌ−ピペコリン酸 − 約１３．８分
Ｂ． 反応液中のＬ−ピペコリン酸、シス−５−ＨＰＡ、シス−３−ＨＰＡの分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）を２本直列に接続
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： ０．５ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−ピペコリン酸 − 約６０．３分
シス−５−ＨＰＡ − 約５１．９分
シス−３−ＨＰＡ − 約５７．９分
分析結果を表４に示す。[HPLC analysis conditions]
A. Analysis of L-lysine and L-pipecolic acid in the reaction solution Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, internal diameter 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 1.0 mL / min
Retention time: L-lysine-about 5.9 minutes
L-pipecolic acid-about 13.8 minutes Analysis of L-pipecolic acid, cis-5-HPA, cis-3-HPA in the reaction column Column: Two SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, ID 4.6 μm, manufactured by Sumika Analysis Center Co., Ltd.) are connected in series Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 0.5mL / min
Retention time: L-pipecolic acid-about 60.3 minutes
Cis-5-HPA-about 51.9 minutes
Cis -3- HPA-about 57.9 minutes Table 4 shows the analysis results.
実施例１３： 組換え生物によるＬ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のワンポット合成３
実施例３および実施例６で得た２種類の組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ）とＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）１００ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。各培養液について、遠心分離により菌体を集め、１００ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液によるＬ−リジンからのシス−５−ＨＰＡおよびシス−３−ＨＰＡへの変換活性を測定した。Example 13: One-pot synthesis of hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine by recombinant organisms 3
Two recombinant organisms, E. coli, obtained in Example 3 and Example 6, respectively. coli HB101 (pNOA) and E. coli. E. coli HB101 (pNSM) is inoculated into 100 mL of 2 × YT medium (1. 6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. For each culture, cells were collected by centrifugation and suspended in 100 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The conversion activity from L-lysine to cis-5-HPA and cis-3-HPA by these cell-free extracts was measured.
具体的には、それぞれの無細胞抽出液５０ｍＬずつを混合し、３５ｍＭ Ｌ−リジン、１ｍＭ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ α−ケトグルタル酸二ナトリウム二水和物、および１０ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析した。Specifically, 50 mL of each cell-free extract was mixed, and 35 mM L-lysine, 1 mM FeSO 4 · 7 H 2 O, 1 mM α-ketoglutarate disodium dihydrate, and 10 mM sodium ascorbate were added. The mixture was stirred at 30 ° C. for 24 hours. The reaction solution was diluted 10 times with water and centrifuged, and then the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
［ＨＰＬＣ分析条件］
Ａ． 反応液中のＬ−リジンとＬ−ピペコリン酸の分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相：２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： １．０ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−リジン − 約５．９分
Ｌ−ピペコリン酸 − 約１３．８分
Ｂ． 反応液中のＬ−ピペコリン酸、シス−５−ＨＰＡ、シス−３−ＨＰＡの分析
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）を２本直列に接続
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相：２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： ０．５ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： Ｌ−ピペコリン酸 − 約６０．３分
シス−５−ＨＰＡ − 約５１．９分
シス−３−ＨＰＡ − 約５７．９分
分析の結果、Ｌ−リジンのピークが消失しており、５．２ｍＭ Ｌ−ピペコリン酸、１８．７ｍＭ シス−５−ＨＰＡと９．４ｍＭ シス−３−ＨＰＡの生成が見られた。これらの結果から、ポリペプチドＣＯＡとＨＳＭの作用により、Ｌ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が生成することが確認された。[HPLC analysis conditions]
A. Analysis of L-lysine and L-pipecolic acid in the reaction solution Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, internal diameter 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2 mM CuSO 4
Flow rate: 1.0 mL / min
Retention time: L-lysine-about 5.9 minutes
L-pipecolic acid-about 13.8 minutes Analysis of L-pipecolic acid, cis-5-HPA, cis-3-HPA in the reaction column Column: Two SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, ID 4.6 μm, manufactured by Sumika Analysis Center Co., Ltd.) are connected in series Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2 mM CuSO 4
Flow rate: 0.5mL / min
Retention time: L-pipecolic acid-about 60.3 minutes
Cis-5-HPA-about 51.9 minutes
Cis-3-HPA-about 57.9 minutes Analysis shows that the L-lysine peak has disappeared, and 5.2 mM L-pipecolic acid, 18.7 mM cis-5-HPA and 9.4 mM cis-3-3. Generation of HPA was seen. From these results, it was confirmed that the action of polypeptides COA and HSM produces hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine.
実施例１４： シス−５−ＨＰＡの精製 Example 14: Purification of cis-5-HPA
実施例１３記載の反応液１００ｍＬ（Ｌ−ピペコリン酸５．２ｍＭ，シス−３−ＨＰＡ ９．４ｍＭ，シス−５−ＨＰＡ １８．７ｍＭを含む）を３０質量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ＝１２とし、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．７２７ｍｇ，３．３３ｍｍｏｌ）を添加した。原料が消失するまで３０質量％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ＝１０以上を維持した。反応液を３５質量％塩酸でｐＨ＝３．０とし、酢酸エチル（１００ｍＬ）で３回抽出した。抽出液を水（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、Ｎ−Ｂｏｃ−シス−５−ＨＰＡ（０．４１３ｇ，収率９０％）を得た。得られたＮ−Ｂｏｃ−シス−５−ＨＰＡにイソプロパノール（５ｇ）、および塩化水素のイソプロパノール溶液（２０質量％，１．０ｇ）を添加し、１２時間攪拌後、析出した固体を濾別し、減圧乾燥することで、シス−５−ＨＰＡの塩酸塩（０．２８４ｇ，収率９０％）を取得した。 100 mL of the reaction solution described in Example 13 (containing 5.2 mM L-pipecolic acid, 9.4 mM cis-3-HPA, 18.7 mM cis-5-HPA) was adjusted to pH = 12 with a 30% by mass aqueous solution of sodium hydroxide , Di-tert-butyl dicarbonate (0.727 mg, 3.33 mmol) was added. The pH was maintained at 10 or more with a 30% by mass aqueous sodium hydroxide solution until the raw materials disappeared. The reaction solution was adjusted to pH = 3.0 with 35 mass% hydrochloric acid, and extracted three times with ethyl acetate (100 mL). The extract was washed with water (100 mL) and concentrated in vacuo. The residue was purified by silica gel column chromatography to obtain N-Boc-cis-5-HPA (0.413 g, yield 90%). Isopropanol (5 g) and a solution of hydrogen chloride in isopropanol (20% by mass, 1.0 g) are added to the obtained N-Boc-cis-5-HPA, and after stirring for 12 hours, the precipitated solid is filtered off, Drying under reduced pressure gave the hydrochloride salt of cis-5-HPA (0.284 g, yield 90%).
実施例１５： 組み換え生物によるヒドロキシリジンからヒドロキシピペコリン酸の合成
実施例３で得た組み換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＣＯＡ）を、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，イーストエキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％，ｐＨ７．０）５ｍＬに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。当該培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に懸濁した。当該懸濁菌体を、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。当該無細胞抽出液のヒドロキシリジン環化活性を測定した。Example 15 Synthesis of Hydroxypipecolic Acid from Hydroxylysine by Recombinant Organisms Inoculate 5 mL of E. coli HB101 (pCOA) in 2 × YT medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.0) containing 200 μg / mL ampicillin at 37 ° C. Shake culture for 24 hours. About the culture solution, cells were collected by centrifugation and suspended in 5 mL of 100 mM HEPES (pH 7.0). The suspended cells were disrupted using a UH-50 ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The hydroxylysine cyclization activity of the cell-free extract was measured.
具体的には、５００μＬの無細胞抽出液に１０ｍＭ ５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンを添加し、３０℃で２４時間撹拌した。この反応液を水で１０倍希釈して遠心分離した後、上清を下記条件にてＨＰＬＣ分析した。 Specifically, 10 mM 5-hydroxy-DL-lysine was added to 500 μL of the cell-free extract, and stirred at 30 ° C. for 24 hours. The reaction solution was diluted 10 times with water and centrifuged, and then the supernatant was analyzed by HPLC under the following conditions.
［ＨＰＬＣ分析条件］
カラム： ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ５０００（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，住化分析センター社製）
カラム温度： ３０℃
検出波長： ２５４ｍｍ
移動相： ２ｍＭ ＣｕＳＯ4
流速： １．０ｍＬ/ｍｉｎ
保持時間： ５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジン − 約３．６分
シス−５−ＨＰＡ − 約１２．４分
トランス−５−ＨＰＡ − 約１１．４分
分析の結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンから変換率１００％でシス−５−ヒドロキシピペコリン酸およびトランス−５−ヒドロキシピペコリン酸が生成していることが確認された。[HPLC analysis conditions]
Column: SUMICHIRAL OA 5000 (250 mm, inside diameter 4.6 μm, manufactured by Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.)
Column temperature: 30 ° C
Detection wavelength: 254 mm
Mobile phase: 2mM CuSO 4
Flow rate: 1.0 mL / min
Retention time: 5-hydroxy-DL-lysine-about 3.6 minutes
Cis-5-HPA-about 12.4 minutes
Trans-5-HPA-about 11.4 minutes Analysis results, E.I. It was confirmed that cis-5-hydroxypipecolic acid and trans-5-hydroxypipecolic acid were produced from E. coli 5-hydroxy-DL-lysine at a conversion rate of 100%.
実施例１６： 様々な水酸化酵素を用いたピペコリン酸の水酸化
上記実施例５に準じて、表５に示す水酸化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを構築した。なお、表５に示すポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列に対して１以上、１４以下の変異を有するものであり、９５％以上の相同性を示す。次いで、上記実施例６に準じて、得られた組換えベクターによりＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物を得た。さらに、上記実施例７に準じて、得られた組換え生物の無細胞抽出液を得て、そのＬ−ピペコリン酸水酸化活性を測定した。結果を表５に示す。なお、導入ＤＮＡの発現効率が悪い場合には、シャペロンも導入して共発現させた。また、表中の水酸化活性の評価基準は、生成した５−ヒドロキシピペコリン酸（５−ＨＰＡ）または３−ヒドロキシピペコリン酸（３−ＨＰＡ）の濃度から求めた生成比に基づいて、以下の通り定めた。Example 16: Hydroxylation of Pipecolic Acid Using Various Hydroxylases In accordance with Example 5 above, a recombinant vector containing a DNA encoding a polypeptide having a hydroxylation activity shown in Table 5 was constructed. The amino acid sequence of the polypeptide shown in Table 5 is one having one or more and 14 or less mutations with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and shows 95% or more homology. Then, according to the above-mentioned Example 6, the recombinant vector obtained was used to obtain E. coli. E. coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed to obtain recombinant organisms. Furthermore, according to Example 7 above, a cell-free extract of the obtained recombinant organism was obtained, and its L-pipecolic acid hydroxylating activity was measured. The results are shown in Table 5. In addition, when the expression efficiency of the introduced DNA was bad, the chaperone was also introduce | transduced and coexpressed. The evaluation criteria for the hydroxylation activity in the table are as follows based on the formation ratio determined from the concentration of 5-hydroxypipecolic acid (5-HPA) or 3-hydroxypipecolic acid (3-HPA) formed: It was decided as follows.
＋： ５−ＨＰＡ／３−ＨＰＡ＝１．５以上、３未満
＋＋： ５−ＨＰＡ／３−ＨＰＡ＝３以上、５未満
＋＋＋： ５−ＨＰＡ／３−ＨＰＡ＝５以上+: 5-HPA / 3-HPA = 1.5 or more, less than 3 ++: 5-HPA / 3-HPA = 3 or more, less than 5 +++: 5-HPA / 3-HPA = 5 or more
実施例１７： 組換え生物によるＬ−リジンからヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸のワンポット合成４
上記実施例８に準じて、実施例３で得た組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）と実施例６で得た組換え生物であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＳＭ）に加え、実施例３のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＯＡ）の代わりに、表６に示す環化酵素をコードする遺伝子を導入した組換え生物を用い、無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液を等量ずつ混合し、Ｌ−リジンからのシス−５−ＨＰＡおよびシス−３−ＨＰＡへの変換活性を測定した。結果を表６に示す。なお、表６中の「＋」は、反応溶液中に１ｍＭ以上のＨＰＡの生成が確認されたことを示す。Example 17: One-pot synthesis of hydroxy-L-pipecolic acid from L-lysine by recombinant organisms 4
In accordance with Example 8 above, E. coli which is the recombinant organism obtained in Example 3. E. coli, which is a recombinant organism obtained in Example 6 and E. coli HB101 (pUCN18). E. coli in Example 3 in addition to E. coli HB101 (pNSM). A cell-free extract was obtained using a recombinant organism into which a gene encoding a cyclization enzyme shown in Table 6 was introduced instead of E. coli HB101 (pNOA). Equal amounts of the obtained cell-free extracts were mixed, and the conversion activity of L-lysine to cis-5-HPA and cis-3-HPA was measured. The results are shown in Table 6. In addition, "+" in Table 6 shows that production | generation of 1 mM or more of HPA was confirmed in the reaction solution.
Claims (11)
Ｌ−リジンを出発物質として、環化酵素および水酸化酵素の両方を作用させることにより、中間体を単離することなくヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させる工程を含み、
前記環化酵素が、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）からなる群より選択されるものであり：
（Ａ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列を有する環化酵素；
（Ｂ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１のアミノ酸配列の１個以上、１５個以下のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素；
（Ｃ） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−リジンに作用してＬ−ピペコリン酸またはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する環化酵素；
前記水酸化酵素が、下記（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）からなる群より選択されるものであることを特徴とする製造方法：
（Ｄ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列を有する水酸化酵素；
（Ｅ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列の１個以上、１５個以下のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素；
（Ｆ） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有し、且つ、Ｌ−リジンまたはＬ−ピペコリン酸に作用してヒドロキシ−Ｌ−リジンまたはヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を有する水酸化酵素。 A method for producing 5 -hydroxy-L-pipecolic acid and / or 3-hydroxy-L-pipecolic acid , comprising
The L- lysine as the starting material, by the action of both Waka酵containing Contact and hydroxylase, the step of generating a no-hydroxy -L- pipecolic acid to isolate the intermediate seen including,
The cyclization enzyme is selected from the group consisting of the following (A), (B) and (C):
(A) a cyclase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141;
(B) has an amino acid sequence wherein one or more and 15 or less amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141 are substituted, deleted and / or added, and L-lysine or hydroxy- A cyclization enzyme having an activity of acting on L-lysine to generate L-pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid;
(C) has an amino acid sequence having a sequence identity of 95% or more with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141, and acts on L-lysine or hydroxy-L-lysine to effect L- A cyclizing enzyme having the activity of producing pipecolic acid or hydroxy-L-pipecolic acid;
The production method characterized in that the above-mentioned hydroxylase is selected from the group consisting of the following (D), (E) and (F) :
(D) a hydroxylase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7;
(E) has an amino acid sequence in which one or more and 15 or less amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 is substituted, deleted and / or added, and L-lysine or L- A hydroxylase having an activity of acting on pipecolic acid to generate hydroxy-L-lysine or hydroxy-L-pipecolic acid;
(F) has at least 95% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7, and acts on L-lysine or L-pipecolic acid to produce hydroxy-L-lysine or hydroxy-L -A hydroxylase having the activity of producing pipecolic acid .
（Ａ１） 配列番号２に記載のＤＮＡ；
（Ｂ１） 配列番号１、１３９、１４０または１４１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。 The cyclization enzyme, the following (A1) and (B1) or Ranaru a polypeptide encoded by a DNA selected from the group claim 1-4 process according to any one of:
(A1) DNA described in SEQ ID NO: 2;
(B1) A DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 139, 140 or 141 .
（Ｄ１） 配列番号４、６または８に記載のＤＮＡ；
（Ｅ１） 配列番号３、５または７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。 The hydroxylase is the following (D1) and (E1) or Ranaru a polypeptide encoded by a DNA selected from the group claim 1-5 The process according to any one of:
(D1) the DNA of SEQ ID NO: 4, 6 or 8;
(E1) A DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, 5 or 7 .
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