JP6533760B2

JP6533760B2 - Antibacterial agent combination

Info

Publication number: JP6533760B2
Application number: JP2016093562A
Authority: JP
Inventors: 関水　和久; 和久関水; 靖彦松本
Original assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Current assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2016-05-09
Publication date: 2019-06-19
Anticipated expiration: 2036-05-09
Also published as: JP2016210776A; JP2019141104A; JP6749617B2

Description

本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物を有効成分として含有する抗菌性合剤に関する。 The present invention relates to an antibacterial combination containing a glycopeptide antibacterial compound and a β-lactam antibacterial compound as an active ingredient.

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、健康を脅かす薬剤耐性病原体として最もよく知られている病原体の１つである。ＭＲＳＡの爆発的な流行に立ち向かうため、グリコペプチド系抗菌化合物であるバンコマイシン（以下、「ＶＣＭ」と略記する場合がある）は世界中の病院で患者の治療に用いられている。一方、ＶＣＭの乱用により、近年耐性株が出現するようになった。 Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the best known pathogens for drug-resistant pathogens that threatens health. In order to cope with the explosive epidemic of MRSA, vancomycin (hereinafter sometimes abbreviated as "VCM"), which is a glycopeptide antibacterial compound, is used to treat patients in hospitals all over the world. On the other hand, the abuse of VCM has led to the emergence of resistant strains in recent years.

ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institutes）では、バンコマイシン低感受性（中間耐性）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）は、ＶＣＭのＭＩＣ（minimum inhibitory concentration；最小発育阻止濃度）値が４〜８μｇ／ｍＬであると定義され、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）はＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であると定義されている。
ＶＲＳＡは蔓延してはいないが、βラクタム系抗生物質と同様に、黄色ブドウ球菌感染にＶＣＭが全く効かなくなることは時間の問題に過ぎない。よって、ＶＣＭ等の抗生物質に対して耐性を獲得するメカニズムの解明及び代替治療方法の開発は、近い将来に起こり得るＶＲＳＡの蔓延に備えるために極めて重要である。 In CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institutes), vancomycin low sensitivity (intermediate resistance) Staphylococcus aureus (VISA) is defined as having a MIC (minimum inhibitory concentration) value of 4 to 8 μg / mL for VCM. , Vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA) is defined as having a MIC value of VCM of 16 μg / mL or more.
Although VRSA is not widespread, as with beta-lactam antibiotics, it is only a matter of time that VCM does not work at all for S. aureus infections. Therefore, elucidation of the mechanism for acquiring resistance to antibiotics such as VCM and development of alternative therapeutic methods are extremely important to prepare for the spread of VRSA which may occur in the near future.

これまでに、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との併用により、ＶＩＳＡの増殖阻害について相乗効果を示すことが示唆されている（非特許文献１、２）。
非特許文献１、２で用いられているＶＩＳＡに対する、ＶＣＭのＭＩＣ値は２μｇ／ｍＬ以下であり、そのＶＩＳＡについて、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果により、ＶＣＭのＭＩＣ値が１μｇ／ｍＬになったことが開示されている。
しかしながら、一般に抗菌化合物（抗生物質）の力価の評価において、２倍以下の差を評価することは難しいとされている。したがって、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果が本当にあるのか否かについて議論が残っている。また、非特許文献１、２において抗菌の対象となっている菌はＶＲＳＡではなくＶＩＳＡである。 Heretofore, it has been suggested that a combination of vancomycin and a β-lactam antibacterial compound has a synergistic effect on the growth inhibition of VISA (Non-patent Documents 1 and 2).
The MIC value of VCM against VISA used in Non Patent Literatures 1 and 2 is 2 μg / mL or less, and the synergistic effect of vancomycin and a β-lactam antibacterial compound on the VISA results in a MIC value of 1 μg / VCM. It is disclosed that it became mL.
However, it is generally considered difficult to evaluate a difference of 2 times or less in the evaluation of the titer of an antibacterial compound (antibiotic). Therefore, debate remains as to whether there is a synergistic effect between vancomycin and β-lactam antibacterial compounds. Moreover, the microbe which is the object of an antimicrobial in a nonpatent literature 1 and 2 is not VRSA but VISA.

また、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との併用により、臨床現場で分離されたＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果があるとしている文献がある（非特許文献３）。
非特許文献３で用いられているＶＲＳＡは、ＶＣＭ耐性エンテロコッカス菌からｖａｎＡ遺伝子を獲得したことにより、ＶＣＭ高耐性を獲得したと考えられている。
しかしながら、本当にｖａｎＡ遺伝子が転移することにより、ＶＣＭ高耐性を獲得するかどうかという点について議論が残っている。
更に、今後蔓延する可能性が指摘されているＶＣＭ耐性菌は、ｖａｎＡ遺伝子等の外来遺伝子の獲得によらず、菌自体が変異してＶＣＭ耐性を獲得するのではないかと考えられている。
したがって、ｖａｎＡ遺伝子転移に起因しない、ＶＣＭ高耐性菌に効果がある抗菌剤の開発が急がれる。 In addition, there is a document that a combination effect of vancomycin and a β-lactam antibacterial compound has a synergistic effect on the growth inhibition of VRSA isolated at the clinical site (Non-patent Document 3).
It is believed that VRSA used in Non-Patent Document 3 has acquired high resistance to VCM by acquiring the vanA gene from VCM resistant Enterococcus.
However, there remains controversy as to whether VCM hypertolerance is acquired by truly transferring the vanA gene.
Furthermore, it is thought that the VCM-resistant bacteria, which are likely to spread in the future, are likely to be mutated to acquire VCM resistance regardless of the acquisition of foreign genes such as the vanA gene.
Therefore, development of an antibacterial agent effective for VCM highly resistant bacteria which is not caused by vanA gene transfer is urgently required.

Steinkraus, G. et al, J Antimicrob Chemother., 60, 788-94, 2007Steinkraus, G. et al, J Antimicrob Chemother., 60, 788-94, 2007 Werth, B. J. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57, 2376-9, 2013Werth, B. J. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 57, 2376-9, 2013 Paige, M. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 2951-6, 2006Paige, M. et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 2951-6, 2006

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、ＶＲＳＡに対しても十分に抗菌活性を発揮する新規の抗菌剤を提供することである。 The present invention has been made in view of the above background art, and an object thereof is to provide a novel antibacterial agent which sufficiently exhibits antibacterial activity against VRSA.

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ｖａｎＡ遺伝子転移とは別の、変異蓄積により黄色ブドウ球菌に高ＶＣＭ耐性を獲得させる、すなわちＶＲＳＡを作製することができることを見出した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have been able to make Staphylococcus aureus acquire high VCM resistance by mutation accumulation other than vanA gene transfer, that is, to be able to produce VRSA. Found out.

そして、作製したＶＲＳＡを用いて初めて検討できた結果、本発明者らは、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物との併用により、上記作製したＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果を示すことを見出した。更に、これらの抗菌化合物の体内動態を一致させることにより、上記相乗効果が増強することを見出した。 And, as a result of being able to be examined for the first time using the produced VRSA, the present inventors demonstrate that the combined use with a glycopeptide antibacterial compound and a β-lactam antibacterial compound exhibits a synergistic effect on the growth inhibition of the above produced VRSA. I found it. Furthermore, it was found that the synergetic effect was enhanced by matching the pharmacokinetics of these antibacterial compounds.

すなわち、本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及びβラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗菌性合剤であり、該グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び該βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることにより相乗作用を発揮することを特徴とする抗菌性合剤を提供するものである。 That is, the present invention is an antibacterial combination comprising a glycopeptide antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a β-lactam antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. And exerting synergy by matching the pharmacokinetics of the glycopeptide antibacterial compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof, and the β-lactam antibacterial compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof. The present invention provides an antimicrobial combination characterized by the features.

本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、既に医療現場に蔓延しているＶＩＳＡや、将来医療現場で蔓延する危険性が指摘されている菌自体が変異することによりＶＣＭ耐性を獲得したＶＲＳＡに対して十分に抗菌活性を発揮する抗菌性合剤を提供することができる。 According to the present invention, VCM resistance is solved by solving the above problems and the problems, and mutating the VISA that has already spread to medical sites and the bacteria themselves that are pointed out to be at risk in future medical sites. It is possible to provide an antimicrobial combination that exhibits sufficient antimicrobial activity against acquired VRSA.

また本発明は、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物の体内動態を一致させることによって抗菌活性について相乗効果を発揮させるという特異な技術思想に基づいており、本発明の抗菌性合剤は新規性・進歩性を有する。 Furthermore, the present invention is based on the unique technical concept of exerting a synergistic effect on the antibacterial activity by matching the in vivo kinetics of the glycopeptide antibacterial compound and the β-lactam antibacterial compound, and the antibacterial combination of the present invention It has novelty and inventive step.

また、本発明の抗菌性合剤は、少なくともバンコマイシン耐性低感受性菌（ＶＩＳＡ）やバンコマイシン耐性菌（ＶＲＳＡ）の両者に上記相乗作用を発揮することができる。 In addition, the antibacterial combination drug of the present invention can exert the above-mentioned synergetic effect on at least both vancomycin resistant low susceptibility bacteria (VISA) and vancomycin resistant bacteria (VRSA).

（Ａ）ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示したグラフである。（Ｂ）ＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数とＶＣＭのＭＩＣ値との関係を示すグラフである。(A) It is the graph which showed the relationship between EMS / VCM selection frequency and the MIC value of VCM. (B) It is a graph which shows the relationship between the number of times of EMS / VCM selection after OXA selection, and the MIC value of VCM. ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（左）ＭＲ３、（右）ＶＲ３It is a photograph which shows the result of having measured the MIC value of VCM. (Left) MR3, (right) VR3 本発明で作製した細菌変異株に対して行ったポピュレーション解析の結果を示すグラフである。（Ａ）親株がＭＲ３である細菌変異株、（Ｂ）親株がＭＲ７である細菌変異株It is a graph which shows the result of the population analysis performed with respect to the bacterial mutant produced by this invention. (A) Bacterial mutant strain whose parent strain is MR3; (B) Bacterial mutant strain whose parent strain is MR7 （Ａ）ＶＲ７（ＯＸＡ＋）に対するＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を示す写真である。（Ｂ）ＯＸＡの濃度と、ＯＸＡとＶＣＭとの相乗効果との関係を示すグラフである。（Ｃ）ＯＸＡ存在下／非存在下におけるポピュレーション解析の結果を示すグラフである。(A) It is a photograph which shows the result of having measured the MIC value of VCM to VR7 (OXA +). (B) It is a graph which shows the relationship between the concentration of OXA and the synergistic effect of OXA and VCM. (C) It is a graph which shows the result of population analysis in the presence / absence of OXA. 変異原処理により得られたＶＲＳＡに対するＶＣＭとの併用効果における、セフトリアキソン及びサイクロセリンの用量依存性の検討を行った結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having investigated the dose dependency of ceftriaxone and cycloserine in the combined effect with VCM with respect to VRSA obtained by mutagen treatment. 変異原処理により得られたＶＲＳＡに対する抗生物質の併用による治療効果の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of the therapeutic effect by the combination of the antibiotic with respect to VRSA obtained by mutagenic process.

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。 Hereinafter, the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following specific embodiments, and can be arbitrarily modified within the scope of the technical idea.

本発明の抗菌性合剤は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩（以下、単に「グリコペプチド系抗菌化合物」と略記する場合がある）、及び、βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩（以下、単に「βラクタム系抗菌化合物」と略記する場合がある）を有効成分として含有する抗菌性合剤であり、該グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び該βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることにより相乗作用を発揮することを特徴とする。 The antibacterial combination drug of the present invention comprises a glycopeptide antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as “glycopeptide antibacterial compound”), and a β-lactam antibacterial compound Or an antibacterial agent containing the pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as “β-lactam antibacterial compound”) as an active ingredient, and the glycopeptide antibacterial compound or the pharmaceutical thereof It is characterized by exerting synergy by matching the pharmacokinetics of a chemically acceptable salt, and the β-lactam antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

本発明の抗菌性合剤は、グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及びβラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する。 The antibacterial combination of the present invention contains a glycopeptide antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a β-lactam antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

上記グリコペプチド系抗菌化合物の例として、バンコマイシン、テイコプラニン等が挙げられる。バンコマイシンを用いることが好ましい。 Examples of the above-mentioned glycopeptide antibacterial compounds include vancomycin, teicoplanin and the like. It is preferred to use vancomycin.

上記βラクタム系抗菌化合物の例として、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、チモシリン、アモキシシリン、ピペラシリン、タランピシリン、バカンピシリン、アンピシリン、チカルシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン等のペニシリン系抗菌化合物；セファロチン、セファゾリン、セフォチアム、セフメタゾール、セフォタキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォペラゾン、セフミノクス、ラタモキセフ、フロモキセフ、セフピロム、セフェピム、セフォゾプラン、セファレキシン等のセフェム系抗菌化合物；イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、テビペネム等のカルバペネム系抗菌化合物；等が挙げられる。
上記グリコペプチド系抗菌化合物と体内動態を一致させる点で、セフェム系抗菌化合物を用いることが好ましく、セフォジジム、セフトリアキソン又はセフミノクスを用いることがより好ましい。 Examples of the above-mentioned β-lactam antibacterial compounds include penicillin antibacterial compounds such as methicillin, oxacillin, nafcillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, thymocillin, amoxicillin, piperacillin, thalampicillin, bacampicillin, ampicillin, ticarcillin, benzylpenicillin, carbenicillin and the like; Cephemum such as cephemum such as cefalothine, cefazolin, cefotiam, cefmetazole, cefotaxime, cefmenoxime, cefodizime, ceftriaxone, cefedazime, cefoperazone, cefminox, latamoxef, cefpirome, cefizomem, cefezorine, etc. Carbapenes such as doripenem, ertapenem and tibipenem System antimicrobial compounds; and the like.
It is preferable to use a cephem antibacterial compound, and more preferable to use cefodizim, ceftriaxone or cefminox, from the viewpoint of matching the pharmacokinetics with the above glycopeptide antibacterial compound.

本発明の抗菌性合剤は、上記グリコペプチド系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩、及び上記βラクタム系抗菌化合物又はその製薬学的に許容される塩の体内動態を一致させることによって、抗菌活性について相乗作用を発揮する。本明細書において、「体内動態」とは、「体内での化合物の吸収、分布、代謝、排泄等の動態」を指す。「体内での化合物の吸収」には、別化合物で該化合物の吸収が制御されている場合も含む。別化合物の例として、腸溶剤等が挙げられる。
上記体内動態が血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランス等の血中動態であることが好ましく、血中半減期であることがより好ましい。
カイコとヒトの体内動態が類似していることは既に知られている（例えば、特開２００９−０４７５５２号公報、特開２０１０−０７５０９６号公報等）。 The antibacterial combination drug of the present invention is to match the pharmacokinetics of the above glycopeptide antibacterial compound or pharmaceutically acceptable salt thereof, and the above β-lactam antibacterial compound or pharmaceutically acceptable salt thereof Exert a synergistic effect on the antimicrobial activity. As used herein, the term "biokinetic" refers to "kinetics such as absorption, distribution, metabolism, excretion etc. of a compound in the body". "Absorption of a compound in the body" also includes the case where absorption of the compound is controlled by another compound. Examples of other compounds include enteric agents and the like.
The above-mentioned pharmacokinetics are preferably blood kinetics such as blood half life, mean blood residence time, blood clearance and the like, and more preferably blood half life.
It is already known that the in vivo pharmacokinetics of silkworms and humans are similar (for example, JP-A-2009-047552, JP-A-2010-075096, etc.).

例えば、グリコペプチド系抗菌化合物及びβラクタム系抗菌化合物の血中半減期を１〜１０時間にすることが好ましく、２〜９時間にすることがより好ましく、４〜８時間にすることが特に好ましい。 For example, it is preferable to make the blood half life of the glycopeptide antibacterial compound and the β-lactam antibacterial compound 1 to 10 hours, more preferably 2 to 9 hours, and particularly preferably 4 to 8 hours. .

グリコペプチド系抗菌化合物に併用するβラクタム系抗菌化合物の血中半減期は、グリコペプチド系抗菌化合物の血中半減期の１／３倍〜３倍が好ましく、１／２倍〜２倍がより好ましく、１／１．５倍〜１．５倍が特に好ましく、１／１．２倍〜１．２倍が更に好ましい。
上記範囲であると、体内動態が一致していると言え、両者の相乗効果に基づく血中の細菌数の減少、並びにそれによる治療等の効果を発揮する。 The blood half-life of the β-lactam antibacterial compound used in combination with the glycopeptide antibacterial compound is preferably 1/3 to 3 times, more preferably 1/2 to 2 times the blood half-life of the glycopeptide antibacterial compound. Preferably, 1 / 1.5-fold to 1.5-fold is particularly preferable, and 1 / 1.2-fold to 1.2-fold is more preferable.
If it is in the above-mentioned range, it can be said that the pharmacokinetics are in agreement, and effects such as reduction of the number of bacteria in the blood based on the synergistic effect of both, and treatment by it and the like are exerted.

グリコペプチド系抗菌化合物がバンコマイシンの場合、バンコマイシンの血中半減期は４．３〜５．２時間であるので、バンコマイシンと併用するβラクタム系抗菌化合物の血中半減期は、１．４３〜１５．６時間が好ましく、２．２〜１０．４時間がより好ましく、２．９〜７．８時間が特に好ましく、３．６〜６．２時間が更に好ましい。 When the glycopeptide antibacterial compound is vancomycin, the half life of vancomycin in blood is 4.3 to 5.2 hours, so the blood half life of a β-lactam antibacterial compound used in combination with vancomycin is 1.43 to 15 .6 hours are preferable, 2.2 to 10.4 hours are more preferable, 2.9 to 7.8 hours are particularly preferable, and 3.6 to 6.2 hours are further preferable.

本発明の抗菌性合剤は、少なくとも、バンコマイシン耐性低感受性菌とバンコマイシン耐性菌の両者に上記相乗作用を発揮する。バンコマイシン耐性低感受性菌として、バンコマイシン低感受性（中間耐性）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）等が挙げられる。バンコマイシン耐性菌として、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等が挙げられる。本発明は特に、バンコマイシン耐性菌用抗菌性合剤であり、更には、ＶＲＳＡ用抗菌性合剤である。
また、本発明の抗菌性合剤は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対しても抗菌活性を発揮する。 The antibacterial combination of the present invention exerts the above-mentioned synergistic action at least on both vancomycin-resistant insensitive bacteria and vancomycin-resistant bacteria. Vancomycin resistant insensitive bacteria include vancomycin insensitive (intermediate resistant) Staphylococcus aureus (VISA) and the like. Examples of vancomycin resistant bacteria include vancomycin resistant Staphylococcus aureus (VRSA). The present invention is, in particular, an antibacterial combination for vancomycin resistant bacteria, and further, an antibacterial combination for VRSA.
The antibacterial combination of the present invention also exhibits antibacterial activity against methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) and methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).

本発明の抗菌性合剤に対する、各抗菌化合物の含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができる。該抗菌性合剤全体を１００質量部としたときに、上記グリコペプチド系抗菌化合物は、０．１〜９０質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．５〜８５質量部、特に好ましくは１〜８０質量部の含量で配合することができる。また、上記βラクタム系抗菌化合物は、０．１〜９０質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．５〜８５質量部、特に好ましくは１〜８０質量部の含量で配合することができる。 There is no restriction | limiting in particular in content of each antibacterial compound with respect to the antibacterial combination of this invention, According to the objective, it can select suitably. The total amount of the glycopeptide-based antibacterial compound is preferably 0.1 to 90 parts by mass, more preferably 0.5 to 85 parts by mass, based on 100 parts by mass of the entire antibacterial combination. Particularly preferably, it can be blended at a content of 1 to 80 parts by mass. The above-mentioned β-lactam antibacterial compound is preferably blended in a content of 0.1 to 90 parts by mass, more preferably 0.5 to 85 parts by mass, particularly preferably 1 to 80 parts by mass be able to.

本発明の抗菌性合剤は、上記有効成分に加えて、「その他の成分」を含有することができる。 The antimicrobial combination of the present invention can contain "other components" in addition to the above active ingredients.

前記抗菌性合剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記抗菌性合剤中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as said "other component" in the said antimicrobial combination, According to the objective, it can select suitably in the range which does not impair the effect of this invention, For example, pharmacologically acceptable And the like.
There is no restriction | limiting in particular as this carrier | carrier, For example, it can select suitably according to the formulation etc. which are mentioned later. Further, the content of the “other component” in the antibacterial mixture is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.

本発明の抗菌性合剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a dosage form of the antibacterial combination of this invention, For example, it can select suitably according to the desired administration method which is mentioned later.
Specifically, for example, oral solid agents (tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.), oral liquids (internal solutions, syrups, elixirs, etc.), injections (solvents, suspensions, etc.) And ointments, patches, gels, creams, powders for external use, sprays, inhalation sprays and the like.

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。 As the oral solid preparation, for example, an excipient and, if necessary, additives such as a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring / flavoring agent and the like are added to the active ingredient, It can be manufactured by
Examples of the excipient include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like.
Examples of the binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. Be
Examples of the disintegrant include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, lactose and the like.
Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol and the like.
Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
Examples of the flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。 As the oral liquid preparation, for example, additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffer, a stabilizer and the like can be added to the active ingredient, and the composition can be manufactured by a conventional method.
Examples of the flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like. Examples of the buffer include sodium citrate and the like. Examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, gelatin and the like.

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。 As the injection, for example, a pH regulator, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic and the like are added to the active ingredient, and subcutaneous, intramuscular or intravenous according to a conventional method. And other injections can be produced.
Examples of the pH adjuster and the buffer include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like. Examples of the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like. Examples of the tonicity agent include sodium chloride and glucose. Examples of the local anesthetic include procaine hydrochloride, lidocaine hydrochloride and the like.

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。 As the ointment, for example, a known base, a stabilizer, a wetting agent, a preservative and the like can be blended with the active ingredient and mixed and manufactured by a conventional method.
Examples of the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like. Examples of the preservative include methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate and the like.

本発明の抗菌性合剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。 The target animals for administration of the antibacterial combination drug of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include humans; mice; monkeys; horses; livestock such as cows, pigs, goats and chickens; pets such as cats and dogs; It can be mentioned.

また、前記抗菌性合剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記抗菌性合剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度、投与方法等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の経口投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記抗菌性合剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療（改善）的に投与されてもよい。 The method of administering the antibacterial combination is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on, for example, the dosage form, and oral administration, intraperitoneal administration, injection into blood, enteral Injection etc. are mentioned.
The dose of the antibacterial combination is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the age and weight of the individual to be administered, the degree of the desired effect, the method of administration, etc. The daily oral dose for adults is preferably 1 mg to 30 g, more preferably 10 mg to 10 g, and particularly preferably 100 mg to 3 g, as the amount of the active ingredient.
Also, the administration time of the antimicrobial combination is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. For example, it may be administered prophylactically or administered therapeutically (improved) It is also good.

＜合剤の評価方法＞
また、本発明は、カイコでの体内動態が一致する２つ以上の化合物を、それぞれ合剤の候補とすることを特徴とする合剤のスクリーニング方法である。 <Method of evaluating combination drug>
The present invention is also a method of screening a combination drug, characterized in that two or more compounds having the same in vivo pharmacokinetics as silkworms are candidates for the combination drug.

本発明の合剤のスクリーニング方法において、上記体内動態は、血中半減期、平均血中滞留時間、血中クリアランス等のカイコの血中動態であることが好ましく、カイコの血中半減期であることがより好ましい。 In the screening method of the combination drug of the present invention, the above-mentioned pharmacokinetics is preferably the blood dynamics of silkworm such as blood half life, average blood residence time, blood clearance, etc., and the blood half life of silkworm is Is more preferred.

上記体内動態が血中半減期であり、２つの化合物を合剤の候補とするとき、一方の化合物の血中半減期は、他方の血中半減期の１／３倍〜３倍が好ましく、１／２倍〜２倍がより好ましく、１／１．５倍〜１．５倍が特に好ましく、１／１．２倍〜１．２倍が更に好ましい。
上記範囲であると、体内動態が一致していると言え、両者の相乗効果に基づく効果を十分に発揮する。 When the above-mentioned pharmacokinetics is a half life in blood and two compounds are candidates for combination, the half life of one compound in blood is preferably 1/3 to 3 times the half life of the other blood, 1/2 times to 2 times is more preferable, 1 / 1.5 times to 1.5 times is particularly preferable, and 1 / 1.2 times to 1.2 times is further preferable.
Within the above range, it can be said that the in-vivo dynamics are in agreement, and the effects based on the synergistic effects of the both are sufficiently exerted.

［作用］
本発明において、グリコペプチド系抗菌化合物とβラクタム系抗菌化合物が相乗効果を発揮する作用・原理は明らかではなく、また、本発明は、かかる作用・原理の範囲に限定されるわけではないが、以下のことが考えられる。
βラクタム系抗菌化合物は、黄色ブドウ球菌のペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ、Penicillin Binding Proteins）に結合し、ペプチドグリカン生合成におけるペプチド鎖の架橋構造の形成を阻害し、抗菌活性を示す（Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775-781, doi:10.1038/35021219 (2000)）。ＭＲＳＡは、βラクタム系抗菌化合物に対する親和性が著しく低いＰＢＰ２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣ−ｍｅｃ領域をゲノムＤＮＡ中に含んでいることが知られており、このＰＢＰ２’の発現により菌は、βラクタム系抗生物質に対して耐性となる。
ＯＸＡは０．１２５μｇ／ｍＬ、ＣＴＲＸは０．５μｇ／ｍＬ、という単独では抗菌効果を示さない濃度で、ＶＲＳＡのＶＣＭに対するＭＩＣの顕著な低下を引き起こす。これらのβラクタム系抗菌化合物は、ＶＲＳＡのＰＢＰ２’以外のＰＢＰｓに作用して細胞壁合成に影響を及ぼしていると考えらえる。ＶＣＭは伸長しているＧｌｃＮＡＣ−ＭｕｒＮＡＣ単位末端のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａと結合してペプチドの架橋反応を阻害する。
よって、βラクタム系抗菌化合物のＰＢＰｓへの作用が、ＶＲＳＡの細胞壁の構造変化をもたらした結果、ＶＣＭが効果的に作用できるようになり、ＶＲＳＡの生育を止めると考えられる。 [Effect]
In the present invention, the action / principle in which the glycopeptide antibacterial compound and the β-lactam antibacterial compound exert a synergistic effect is not clear, and the present invention is not limited to the scope of such action / principle, The following can be considered.
β-lactam antibacterial compounds bind to Staphylococcus aureus penicillin binding proteins (PBP, Penicillin Binding Proteins), inhibit the formation of cross-linked structures of peptide chains in peptidoglycan biosynthesis, and exhibit antibacterial activity (Walsh, C. Molecular Mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775-781, doi: 10.1038 / 35021219 (2000)). MRSA is known to contain in the genomic DNA an SCC-mec region containing a mecA gene encoding PBP2 ', which has a remarkably low affinity for β-lactam antibacterial compounds, and expression of this PBP 2' results in And β-lactam antibiotics.
Concentrations such as OXA at 0.125 μg / mL and CTRX at 0.5 μg / mL alone, which do not show an antibacterial effect, cause a marked decrease in MIC against VCM in VRS. These β-lactam antibacterial compounds are considered to affect cell wall synthesis by acting on PBPs other than PBP 2 'of VRSA. VCM binds to D-Ala-D-Ala at the end of extending GlcNAC-MurNAC unit to inhibit the cross-linking reaction of the peptide.
Therefore, as a result of the structural change of the cell wall of VRSA resulting in the action of β-lactam antibacterial compounds on PBPs, it is considered that VCM can effectively act and the growth of VRSA is stopped.

以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples and test examples, but the present invention is not limited to the specific scope of the following examples and the like.

＜＜アルキル化剤処理及び薬剤耐性株の選択＞＞
アルキル化剤としてメタンスルホン酸エチル（以下、「ＥＭＳ」と略記する場合がある）を使用した。黄色ブドウ球菌（８種類のＭＲＳＡ及び４種類のＭＳＳＡ（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌））をそれぞれ０．１％ＥＭＳ存在下で培養した。一晩培養後、ＥＭＳが存在しない培地に播種した。その後、薬剤を含有する寒天培地を用いて薬剤耐性菌を選択した。 << Alkylating agent treatment and selection of drug resistant strains >>
Ethyl methanesulfonate (hereinafter sometimes abbreviated as "EMS") was used as the alkylating agent. S. aureus (8 MRSA and 4 MSSA (methicillin-sensitive S. aureus)) were each cultured in the presence of 0.1% EMS. After overnight culture, the cells were seeded in a medium without EMS. Thereafter, drug-resistant bacteria were selected using a drug-containing agar medium.

＜＜ポピュレーション解析＞＞
ＢＨＩ培地（brain heart infusion broth）で培養し、一晩培養した培養液をＯＤ_５７６が０．３になるように希釈し、８、１６、２４、又は２８μｇ／ｍＬの薬剤（ＶＣＭ）を含む寒天培地に播いた。７２時間３７℃でインキュベーション後、プレート中のコロニー数を数えた。 << Population Analysis >>
The culture cultured in BHI medium (brain heart infusion broth) and diluted overnight is diluted to an OD ₅₇₆ of 0.3, and agar containing 8, 16, 24 or 28 μg / mL of a drug (VCM) The medium was seeded. After incubation for 72 hours at 37 ° C., the number of colonies in the plate was counted.

＜＜抗菌活性の測定＞＞
各種抗菌化合物のＭＩＣ値の測定は、Ishii, et al., Sci Rep, 5, 17092, 2015に記載の方法を参考にした。簡潔に記述すると、寒天培地上で培養した各菌株のコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に懸濁後、ＯＤ_６００が０．５になるように調整した。調整した菌液をＣａ^２＋およびＭｇ^２＋を加えたMueller Hinton Broth（ＭＨＢ、Ｄｉｆｃｏ）に１／４００に希釈し、９６ウェル丸底プレートに分注した。この時、適当な濃度の抗菌化合物をＭＨＢに加えた。その後、分注した菌液入りＭＨＢに抗菌化合物を適当な濃度を各ウェルに２倍ずつ希釈した各種抗菌化合物を加え、３７℃で４８時間培養後、各ウェル内の菌液の生育を観察した。本実施例においては、ＭＩＣ値の比較において４倍以上の差がある場合、顕著な差があるとした。 << Measurement of antibacterial activity >>
The measurement of the MIC value of various antibacterial compounds referred to the method described in Ishii, et al., Sci Rep, 5, 17092, 2015. Briefly, colonies of each strain cultured on agar medium were scraped off, suspended in sterile saline, and adjusted to an OD ₆₀₀ of 0.5. The adjusted bacterial solution was diluted to 1/400 in Mueller Hinton Broth (MHB, Difco) added with Ca ²⁺ and Mg ²⁺ and aliquoted into 96 well round bottom plates. At this time, the appropriate concentration of the antimicrobial compound was added to the MHB. Thereafter, various antibacterial compounds in which an appropriate concentration of an antibacterial compound was diluted by 2 times each were added to each of the MHB containing microbe liquid and cultured at 37 ° C. for 48 hours, and growth of the microbe liquid in each well was observed . In this example, when there is a difference of 4 times or more in comparison of MIC values, it is considered that there is a significant difference.

＜＜カイコの飼育＞＞
実験に用いたカイコ幼虫は、Kaito, et al., Microb Pathog, 32, 183-190, 2002に記載の方法を参考にし、飼育した。簡潔に記述すると、愛媛蚕種株式会社から購入した受精卵（交雑種ふ・よう×つくば・ね）を、消毒した２７℃のインキュベーター内で孵化させて飼育した。飼料には、日本農産工業株式会社から購入した抗生物質入りの人工飼料であるシルクメイト２Ｓを用いた。４齢眠のカイコを分離し、１終夜絶食させ、脱皮したものを５齢１日目とした。 << rearing of silkworms >>
The silkworm larvae used for the experiment were bred with reference to the method described in Kaito, et al., Microb Pathog, 32, 183-190, 2002. Briefly described, fertilized eggs (crossbred cows · yo × Tsukuba · Ne) purchased from Ehime Co., Ltd. were hatched and bred in a disinfected 27 ° C incubator. As feed, Silkmate 2S, which is an artificial feed containing antibiotics, purchased from Japan Agro-Industrial Co., Ltd. was used. Four instar silkworms were separated and fasted overnight, and those that had been molted were designated as fifth instar day 1.

＜＜黄色ブドウ球菌カイコ感染モデルを用いた抗菌化合物の治療効果の検証＞＞
カイコ感染モデルを用いた抗菌化合物の治療効果の検証は、Hamamoto, et al., Antimicrob Agents Chemother, 48, 774-779, 2004に記載の方法を一部改変して行った。５齢１日目のカイコに対して、１．１〜１．２ｇの人工飼料（抗生物質を含まない、日本農産工業株式会社製）を与え、２７℃で約２０〜２４時間飼育した。翌日、黄色ブドウ球菌の終夜培養菌液の希釈液を５０μＬカイコに注射し（注射菌量は１匹のカイコ当たり１．１×１０^８細胞）、引き続いて生理食塩水又は様々な濃度の抗菌化合物を５０μＬずつカイコの体液内に注射した。注射に用いた各抗菌化合物の濃度は、バンコマイシン（ＶＣＭ）１００μｇ／ｍＬ、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ）８００μｇ／ｍＬ、オキサシリン（ＯＸＡ）８００μｇ／ｍＬであった。 << Verification of therapeutic effect of antibacterial compound using Staphylococcus aureus silkworm infection model >>
Verification of the therapeutic effect of the antibacterial compound using a silkworm infection model was performed by partially modifying the method described in Hamamoto, et al., Antimicrob Agents Chemother, 48, 774-779, 2004. The first to fifth instar silkworms were given 1.1 to 1.2 g of an artificial feed (containing no antibiotics, manufactured by Nippon Agro-Industrial Co., Ltd.) and reared at 27 ° C. for about 20 to 24 hours. The next day, 50 μL silkworms are injected with a dilution of overnight culture of S. aureus (the injection volume is 1.1 × 10 ⁸ cells per silkworm), followed by saline or various concentrations of antibacterial compounds Of 50 μl each into the silkworm body fluid. The concentrations of each antibacterial compound used for injection were 100 μg / mL of vancomycin (VCM), 800 μg / mL of ceftriaxone (CTRX), and 800 μg / mL of oxacillin (OXA).

菌液及び抗菌化合物を注射後、カイコを３７℃のインキュベーター内で培養し、経時的にカイコの生死を観察した。また、統計処理としてＰｒｉｓｍソフトによるログランクテスト（Log-rank test）を使用し、菌液と抗菌化合物を注射した後のカイコの生存率の経時的変化を求めた。更に、菌液と薬剤を注射した後の経過時間とその時のカイコの生存率をプロットして作成した生存曲線をもとに、黄色ブドウ球菌感染カイコの生存率が５０％となるのに要した時間を、半数致死時間（ＬＴ_５０）として求めた。 After injection of the bacterial solution and the antibacterial compound, the silkworm was cultured in an incubator at 37 ° C., and survival of the silkworm was observed over time. Moreover, the log rank test (Log-rank test) by Prism software was used as a statistical processing, and the time-dependent change of the survival rate of the silkworm after injecting a microbe liquid and an antibacterial compound was calculated | required. Furthermore, based on the survival curve prepared by plotting the elapsed time after injection of the bacterial fluid and the drug and the survival rate of the silkworm at that time, it was necessary for the survival rate of S. aureus infected silkworm to be 50%. The time was determined as half lethal time (LT ₅₀ ).

実施例１
［黄色ブドウ球菌臨床株からのＶＣＭ耐性変異株の選択］
まず、ＲＮ４２２０（メチシリン感受性実験室株）を親株として、連続突然変異誘発（ｓｅｒｉａｌｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によるＶＣＭ耐性株を得ることを試みた。ＥＭＳ処理及びＶＣＭ耐性株選択（以下、「ＥＭＳ／ＶＣＭ選択」と略記する場合がある）により得られた変異株について、ＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ａに示す。 Example 1
[Selection of VCM-resistant mutants from S. aureus clinical strains]
First, we tried to obtain a VCM resistant strain by serial mutagenesis using RN4220 (methicillin sensitive laboratory strain) as a parent strain. The results of measuring the MIC value of VCM for the mutant obtained by EMS treatment and VCM resistant strain selection (hereinafter sometimes abbreviated as “EMS / VCM selection”) are shown in FIG. 1A.

図１Ａの横軸はＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。
その結果、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択回数が多くなるほど、ＶＣＭのＭＩＣ値が上昇することがわかった（図１Ａ、◇印）。 The horizontal axis in FIG. 1A indicates the number of times of EMS / VCM selection, and the vertical axis indicates the MIC value (μg / mL) of VCM. MIC values were determined by microdilution after incubation of the strains for 48 hours.
As a result, it was found that the MIC value of VCM increased as the number of EMS / VCM selection times increased (FIG. 1A, ◇ mark).

次に、日本においてそれぞれ異なる地域で単離された臨床ＭＲＳＡ株及びＭＳＳＡ株に対してＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った。結果を表１、図１Ａ及び図２に示す。 Next, EMS / VCM selection was performed on clinical MRSA strains and MSSA strains isolated in different regions in Japan. The results are shown in Table 1, FIG. 1A and FIG.

図１Ａの結果、親株に関わらず、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、全ての変異株においてＶＣＭのＭＩＣ値が上昇していた。 As a result of FIG. 1A, regardless of the parent strain, the MIC value of VCM was increased in all mutant strains by EMS / VCM selection.

図２はＥｔｅｓｔ（登録商標、ビオメリュー社）を用いてＭＩＣ値の測定を行った結果である。３７℃で７２時間インキュベーション後にＭＩＣ値を測定した。左がＭＲ３（親株）、右がＶＲ３（ＶＲ３−ＥＭＳ２１、変異株）の結果である。
図２の結果より、微量希釈法以外の測定法でも、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株について、ＶＩＣのＭＩＣ値が上昇していたことがわかった。 FIG. 2 shows the result of measurement of MIC value using Etest (registered trademark, BioMérieux Inc.). MIC values were determined after 72 hours incubation at 37 ° C. The left is the result of MR3 (parent strain) and the right is the result of VR3 (VR3-EMS21, mutant).
From the results shown in FIG. 2, it was found that the MIC value of VIC was increased for the mutant obtained by EMS / VCM selection even by measurement methods other than the micro dilution method.

また、１０回以上のＥＭＳ／ＶＣＭ選択後、ＭＲＳＡ由来変異株において、オキサシリン（ＯＸＡ）の感受性が増大していた（ＭＩＣ値が２μｇ／ｍＬ以下だった）。この結果は、ＶＣＭ耐性株の選択により、本来ＭＲＳＡが有する性質（βラクタム抗生物質に対する耐性）が欠損したことを意味し、既に報告されている結果と一致している（Sieradzki et al，1999）。 Moreover, after 10 or more EMS / VCM selection, the sensitivity of oxacillin (OXA) was increased in the MRSA-derived mutant strain (MIC value was 2 μg / mL or less). This result means that the selection of the VCM-resistant strain is deficient in the properties (resistance to β-lactam antibiotics) originally possessed by MRSA, which is consistent with the previously reported results (Sieradzki et al, 1999). .

また、ＯＸＡ含有寒天培地におけるＶＣＭ耐性株の表現型の特徴を調べる過程において、ＯＸＡ感受性株の中に、ＯＸＡ耐性株が存在していることがわかった。そこで、得られた変異株を、５０μｇ／ｍＬのＯＸＡが存在する培地に移して、ＯＸＡ耐性株を単離（ＯＸＡ選択）し、更にその中からＶＣＭ耐性株の単離（ＥＭＳ／ＶＣＭ選択）を続けた。ＯＸＡ選択後にＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られた変異株についてＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果を図１Ｂ及び表２に示す。 In addition, in the process of examining the phenotypic characteristics of the VCM-resistant strain in the OXA-containing agar medium, it was found that the OXA-resistant strain is present among the OXA-sensitive strains. Therefore, the obtained mutant strain is transferred to a medium in which 50 μg / mL OXA is present, and an OXA resistant strain is isolated (OXA selection), and a VCM resistant strain is further isolated therefrom (EMS / VCM selection) Continued. The results of measuring the MIC value of VCM for mutant strains obtained by EMS / VCM selection after OXA selection are shown in FIG. 1B and Table 2.

図１Ｂの横軸はＯＸＡ選択後のＥＭＳ／ＶＣＭ選択を行った回数、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示す。ＭＩＣ値は菌株を４８時間インキュベーション後に微量希釈法により測定した。 The horizontal axis in FIG. 1B indicates the number of times of EMS / VCM selection after OXA selection, and the vertical axis indicates the MIC value (μg / mL) of VCM. MIC values were determined by microdilution after incubation of the strains for 48 hours.

表２中のＭＩＣ値は３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法を用いて測定した。「ＶＣＭ」はバンコマイシン、「ＶＣＭ＋ＯＸＡ」はオキサシリン（２μｇ／ｍＬ）存在下でのバンコマイシンのＭＩＣ値を示す。表２中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＲ１〜ＶＲ８については、それぞれＥＭＳ／ＶＣＭ選択の途中で、ＯＸＡ選択を行っており、Ｍｕ３及びＭｕ５０はＯＸＡ選択を行っていない。 The MIC values in Table 2 were measured using a microdilution method after incubation for 48 hours at 37 ° C. "VCM" indicates vancomycin and "VCM + OXA" indicates the MIC value of vancomycin in the presence of oxacillin (2 μg / mL). The unit in Table 2 is unit (μg / mL). For VR1 to VR8, OXA selection is performed during EMS / VCM selection, respectively, and Mu3 and Mu50 are not performed OXA selection.

表２の結果、合計１９〜２６回のＥＭＳ／ＶＣＭ選択により、ＶＣＭに対して高い耐性を有するＭＲＳＡ由来変異株が得られた。更に該変異株は、ＯＸＡのＭＩＣ値も１２８μｇ／ｍＬ以上であり、ＯＸＡに対しても高い耐性を有していた。
また、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択により得られたＶＲ１〜８については、オキサシリン存在下において、ＶＣＭのＭＩＣ値は、何れの変異株においても２μｇ／ｍＬとなった。この結果は、バンコマイシンとオキサシリンを併用することによって、ＶＣＭのＭＩＣ値が１６μｇ／ｍＬ以上であるＶＲＳＡの増殖阻害について相乗効果が確認されたことを示している。 As a result of Table 2, a total of 19 to 26 EMS / VCM selections resulted in MRSA-derived mutant strains highly resistant to VCM. Furthermore, the mutant strain had a MIC value of OXA of 128 μg / mL or more, and also had high resistance to OXA.
In addition, for VR1 to 8 obtained by EMS / VCM selection, in the presence of oxacillin, the MIC value of VCM was 2 μg / mL in any of the mutant strains. This result indicates that the combined use of vancomycin and oxacillin confirmed a synergistic effect on the growth inhibition of VRSA having a MIC value of VCM of 16 μg / mL or more.

検討例１
［ＶＣＭ耐性株における抗生物質の感受性］
実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７）について、ＭＲＳＡ感染治療に用いられる抗生物質（アレベカシン（ＡＢＫ）、リネゾリド（ＬＮＺ）、ダプトマイシン（ＤＡＰ）、ゲンタマイシン（ＧＴＭ）及びリファンピシン（ＲＦＰ））の感受性を検証した。また近年本発明者らによって同定された、細胞膜中のメナキノンを標的としているライソシンＥ（ＬＹＥ）（Hamamoto，H et al，Nat Chem Biol.，11，127-33，2015、特許第５８７８３０２号等）についても感受性を検証した。更に、バンコマイシンとβラクタム系抗菌化合物との相乗効果についても検証した。結果を表３及び図４に示す。 Examination example 1
Antibiotic Susceptibility in VCM Resistant Strains
Antibiotics (arebekacin (ABK), linezolid (LNZ), daptomycin (DAP), gentamycin (GTM) and rifampicin (RFP)) used for the treatment of MRSA infection for the mutant strains (VR3 and VR7) obtained in Example 1 The sensitivity of the Furthermore, lysocine E (LYE) targeting menaquinone in cell membranes, which has been identified by the present inventors in recent years (Hamamoto, H et al, Nat Chem Biol., 11, 127-33, 2015, Patent No. 5878302, etc.) The sensitivity was also verified for Furthermore, the synergy between vancomycin and a β-lactam antibacterial compound was also examined. The results are shown in Table 3 and FIG.

３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法によりＭＩＣ値を測定した。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。
表３の結果より、実施例１で得られた変異株（ＶＲ３及びＶＲ７株）は、ＶＲ７に対するダプトマイシンのＭＩＣ値を除いて、親株に対するＭＩＣ値とほぼ同じＭＩＣ値を示していた。これらの結果より、ＥＭＳ／ＶＣＭ選択を繰り返すことによる高レベルのＶＣＭ耐性獲得には多剤耐性表現型は伴わないことがわかった。 After incubation for 48 hours at 37 ° C., MIC values were determined by microdilution. The unit in the table is unit (μg / mL).
From the results in Table 3, the mutant strains (VR3 and VR7 strains) obtained in Example 1 showed MIC values almost the same as the MIC values for the parent strain except for the MIC value of daptomycin for VR7. From these results, it was found that high levels of VCM resistance acquisition by repeating EMS / VCM selection are not accompanied by a multidrug resistance phenotype.

また、表３の結果より、ライソシンＥはＶＲ３、ＶＲ７何れについても効果があった。よって、ライソシンＥはＶＣＭ耐性株に対して、代替化学療法の１つとして使用することができることがわかった。ライソシンＥは細菌の細菌膜に存在するメナキノンと相互作用し、細胞溶解を引き起こすことがわかっている。このような抗菌メカニズムは他の抗生物質の作用機序とは異なる。以上の結果は、ライソシンＥはＶＣＭ及び他の抗生物質とは異なる、新規の抗菌ターゲットを有することを示している。 From the results in Table 3, lysosin E was effective for both VR3 and VR7. Thus, it was found that lysocin E can be used as one of alternative chemotherapy against VCM resistant strains. Lysosin E is known to interact with menaquinone present in bacterial membranes of bacteria to cause cell lysis. Such an antimicrobial mechanism is different from the mechanism of action of other antibiotics. The above results indicate that lysosin E has a novel antimicrobial target different from VCM and other antibiotics.

また、表３中、「ＶＣＭ＋ＯＸＡ」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＣＦＺ」は２μｇ／ｍＬのＣＦＺを含む培地を用いたとき、「ＶＣＭ＋ＧＴＭ」は０．２５μｇ／ｍＬ（ＭＲ３及びＶＲ３）又は８μｇ／ｍＬ（ＭＲ７及びＶＲ７）のＧＴＭを含む培地を用いたときの、ＶＣＭのＭＩＣ値を示す。 In Table 3, "VCM + OXA" uses 2 μg / mL OXA, "VCM + CFZ" uses 2 μg / mL CFZ, "VCM + GTM" measures 0.25 μg / mL The MIC values of VCM are shown when using media containing MR3 and VR3) or 8 μg / mL (MR7 and VR7) GTM.

表３の結果より、２μｇ／ｍＬのＯＸＡ存在下における、ＶＲ３及びＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値を微量希釈法によって測定した結果、それぞれ親株とほとんど変わらなかった。ＯＸＡと同じくβラクタム系抗生物質であるセファゾリンでも同様に、ＶＣＭ耐性株に対するＶＣＭの感受性が増加したが、アミノ配糖体系抗生物質であるゲンタマイシンでは変化がなかった。 From the results in Table 3, the MIC values of VCM against VR3 and VR7 in the presence of 2 μg / mL of OXA were measured by the microdilution method. Similarly to OXA, cephazolin, which is a β-lactam antibiotic, increased the sensitivity of VCM to a VCM-resistant strain, but did not change it with gentamicin, which is an aminoglycoside antibiotic.

図４Ａは２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有するミューラーヒントン寒天培地を用い、Ｅｔｅｓｔ（登録商標）によりＭＩＣ値を測定した結果である。図の写真は３７℃で７２時間インキュベーション後の結果であり、ＶＲ７に対するＶＣＭのＭＩＣ値の結果である。
微量希釈法以外の測定法でも、ＯＸＡの存在下でのＶＣＭ耐性株のＶＣＭ感受性が上昇することを確認した。 FIG. 4A shows the result of measurement of MIC value by Etest (registered trademark) using Mueller Hinton agar medium containing 2 μg / mL OXA. The photograph in the figure is the result after incubation for 72 hours at 37 ° C., which is the result of the MIC value of VCM against VR7.
It was also confirmed that the VCM sensitivity of the VCM-resistant strain is increased in the presence of OXA even by measurement methods other than the micro dilution method.

図４ＢはＯＸＡ存在下で２４時間インキュベーション後に、微量希釈法によりＶＣＭのＭＩＣ値を測定した結果である。横軸はＯＸＡの濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸はＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）である。○はＭＲ７（親株）、◆はＶＲ７（変異株）の結果を示す。
ＶＲ７に対するＶＣＭ感受性は、ＯＸＡの濃度が０．１２５μｇ／ｍＬ以上の場合では、用量依存的に増加していた。 FIG. 4B shows the result of measuring the MIC value of VCM by the microdilution method after incubation for 24 hours in the presence of OXA. The horizontal axis is the concentration of OXA (μg / mL), and the vertical axis is the MIC value of VCM (μg / mL). ○ indicates the results of MR7 (parent strain) and ◆ indicate the results of VR7 (mutant).
VCM sensitivity to VR7 increased in a dose-dependent manner when the concentration of OXA was 0.125 μg / mL or more.

図４ＣはＯＸＡ存在／非存在下のポピュレーション解析の結果を示すグラフである。ＭＲ７又はＶＲ７を、ＶＣＭを含有するＢＨＩ寒天培地に播き、３７℃７２時間インキュベーション後のコロニー数を測定した。グラフ中の「ＯＸＡ−」はＯＸＡを含まない培地を用いた場合、「ＯＸＡ＋」は２μｇ／ｍＬのＯＸＡを含有する培地を用いた場合を示す。
ＯＸＡ存在下におけるＶＲ７のポピュレーション解析を行った結果、ＯＸＡの存在により劇的に、ＶＣＭに対して感受性を有する変異株が増えていた。 FIG. 4C is a graph showing the results of population analysis in the presence / absence of OXA. MR7 or VR7 were seeded on BHI agar medium containing VCM, and the number of colonies after incubation at 37 ° C. for 72 hours was determined. "OXA-" in a graph shows the case where the medium which does not contain OXA is used, and "OXA +" shows the case where the culture medium containing 2 micrograms / mL OXA is used.
As a result of performing population analysis of VR7 in the presence of OXA, the presence of OXA dramatically increased the number of mutant strains sensitive to VCM.

表３及び図４の結果より、本発明により作製されたＶＣＭ耐性菌においてβラクタム系抗生物質がＶＣＭと相乗的に作用していると考えられる。 From the results of Table 3 and FIG. 4, it is considered that the β-lactam antibiotic acts synergistically with VCM in the VCM-resistant bacteria prepared according to the present invention.

実施例２
［錠剤の製造］
バンコマイシン塩酸塩１０ｍｇ、セフォジジムナトリウム１０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。これに滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５〜１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し、錠剤とした。 Example 2
[Manufacture of tablets]
After uniformly mixing 10 mg of vancomycin hydrochloride, 10 mg of cefodizime sodium, 40 mg of lactose, 20 mg of starch and 5 mg of low substituted hydroxypropyl cellulose, the mixture is wet-granulated using an aqueous solution of 8% by mass of hydroxypropyl methylcellulose as a binder. Tablet granules were produced. After adding 0.5 to 1 mg of magnesium stearate necessary for imparting lubricity thereto, the mixture was compressed into tablets using a tableting machine.

実施例３
［液剤の製造］
テイコプラニン６ｍｇ及びセフトリアキソンナトリウム水和物４ｍｇを、２質量％２−ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し、注射用液剤とした。 Example 3
[Manufacturing of solution]
6 mg of teicoplanin and 4 mg of ceftriaxone sodium hydrate were dissolved in 10 mL of a 2% by weight aqueous solution of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, and used as a solution for injection.

実施例４
［セフトリアキソンとバンコマイシンとの併用効果］
次に、別のβラクタム系抗生物質であるセフトリアキソン（ＣＴＲＸ）とＶＣＭとの相乗効果の有無を、上記ＭＲ１〜８株及びＶＲ１〜８株について、検討した。
ＣＴＲＸ又はＶＣＭのＭＩＣ値、若しくはＣＴＲＸを併用した時のＶＣＭのＭＩＣ値を、３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法により測定した。
結果を表４に示す。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＣＭと併用したＣＴＲＸの濃度は４μｇ／ｍＬである。 Example 4
[Combination effect of ceftriaxone and vancomycin]
Next, the presence or absence of a synergistic effect of another β-lactam antibiotic, ceftriaxone (CTRX) and VCM was examined for the MR1 to 8 strains and the VR1 to 8 strains.
The MIC value of CTRX or VCM, or the VCM MIC value when used in combination with CTRX was measured by microdilution after incubation at 37 ° C. for 48 hours.
The results are shown in Table 4. The unit in the table is unit (μg / mL). The concentration of CTRX combined with VCM is 4 μg / mL.

表４の結果、８株のＶＣＭ耐性株（ＶＲ１〜８株）全てがＣＴＲＸ耐性（ＭＩＣ＞１２８μｇ／ｍＬ）を示したが、４μｇ／ｍＬのＣＴＲＸ存在下では、ＶＲ８株を除く７株において、ＶＣＭに対するＭＩＣ値が顕著に低下することが分かった。特にＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３、ＶＲ６、ＶＲ７のＶＣＭに対するＭＩＣ値は、１／８に低下していた。ＶＲ８においても、ＶＣＭに対するＭＩＣ値は、ＣＴＲＸにより１／２に低下した。 As a result of Table 4, all the 8 VCM resistant strains (VR1 to 8) showed CTRX resistance (MIC> 128 μg / mL), but in the presence of 4 μg / mL of CTRX, in 7 strains excluding VR8 strain, It was found that the MIC value for VCM was significantly reduced. In particular, the MIC values for VCM of VR1, VR2, VR3, VR6, and VR7 were reduced to 1/8. Also in VR8, the MIC value for VCM dropped to 1/2 by CTRX.

ＶＲ１〜ＶＲ８株の８株は、それぞれ異なるＭＲＳＡから独立に分離されたＶＣＭ体制株である。したがって、βラクタム系抗菌化合物とＶＣＭの相乗効果は、今後出現することが危惧されるＶＲＳＡ全般に対しても見られるであろうと予想される。 Eight strains of VR1 to VR8 strains are VCM system strains independently separated from different MRSA. Therefore, it is expected that the synergistic effect of the β-lactam antibacterial compound and VCM will be seen also for the general VRSA which is feared to appear in the future.

更に、種々の濃度のセフトリアキソン（ＣＴＲＸ）存在下でのＶＣＭとの相乗効果の有無を検討した。結果を図５に示す。
図５中、縦軸がＶＣＭのＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸がＣＴＲＸの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。 Furthermore, the presence or absence of a synergistic effect with VCM in the presence of various concentrations of ceftriaxone (CTRX) was examined. The results are shown in FIG.
In FIG. 5, the vertical axis indicates the MIC value of VCM (μg / mL), and the horizontal axis indicates the concentration of CTRX (μg / mL).

図５の結果、ＶＲ７に対して、０．５μｇ／ｍＬ以上の濃度のＣＴＲＸが、ＶＣＭに対するＭＩＣ値の顕著な低下をもたらすことが分かった。 As a result of FIG. 5, it was found that for VR7, CTRX at a concentration of 0.5 μg / mL or more resulted in a significant decrease in MIC value for VCM.

次に、ＯＸＡやＣＴＲＸ以外の様々なβラクタム系抗菌化合物が、ＶＲＳＡ株のＶＣＭに対するＭＩＣ値に及ぼす効果を検討した。結果を表５及び表６に示す。
表中、ＣＦＺはセファゾリン、ＤＭＰＰＣはメチシリン、ＡＢＰＣはアンピシリン、ＰＣＧはベンジルペニシリン、ＣＢＰＣはカルベニシリン、ＣＴＲＸはセフトリアキソン、ＣＥＸはセファレキシン、及びＭＣＩＰＣはクロキサシリンを示す。 Next, the effects of various β-lactam antibacterial compounds other than OXA and CTRX on the MIC value of VRSA for VCM were examined. The results are shown in Tables 5 and 6.
In the table, CFZ shows cefazolin, DMPPC shows methicillin, ABPC shows ampicillin, PCG shows benzylpenicillin, CBPC shows carbenicillin, CTRX shows ceftriaxone, CEX shows cephalexin, and MCIPC shows cloxacillin.

ＭＲ７株とＶＲ７株を用い、３７℃で４８時間インキュベーション後、微量希釈法によりＭＩＣ値を測定した。表中の単位は、ｕｎｉｔ（μｇ／ｍＬ）である。ＶＣＭと併用した各βラクタム系抗菌化合物の濃度は２μｇ／ｍＬである。
表５及び表６の結果、検討した９種類何れのβラクタム系抗菌化合物についても、ＶＲ７のＶＣＭに対するＭＩＣ値（１６μｇ／ｍＬ）が、顕著に低下する（４μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ）ことが分かった。 After incubation for 48 hours at 37 ° C. using the MR7 strain and the VR7 strain, the MIC value was measured by the microdilution method. The unit in the table is unit (μg / mL). The concentration of each β-lactam antibacterial compound used in combination with VCM is 2 μg / mL.
As a result of Table 5 and Table 6, the MIC value (16 μg / mL) against VCM of VR7 significantly decreases (4 μg / mL to 1 μg / mL) for any of the 9 types of β-lactam antibacterial compounds examined. I understood.

実施例５
［カイコ感染モデルを用いた、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物の併用による治療効果の評価］
一般に、抗菌化合物の治療効果の評価には、動物実験が必要不可欠である。なぜなら、抗菌化合物の体内動態の問題のために、試験管内の結果が必ずしも動物体内では反映されないからである。そこで、カイコの感染モデルを用いて、上記で分離したＶＲＳＡ株による感染症に対するＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物の併用による治療効果が見られるか否かを検討した。
ＶＲ７に感染したカイコに対して、生理食塩水、ＶＣＭ（５μｇ／匹）、ＯＸＡ（４０μｇ／匹）、及びＣＴＲＸ（４０μｇ／匹）を単独投与、またはＶＣＭとＯＸＡ、ＶＣＭとＣＴＲＸを併用投与した際の（ＶＣＭは５μｇ／匹、ＯＸＡ又はＣＴＲＸは４０μｇ／匹投与）、各時間におけるカイコの生存率（ＬＴ_５０、半数致死時間）を測定した。注射菌数は１．１×１０^８ｃｆｕ／匹であり、１群あたりｎ＝５で行った。
また統計処理として、ＶＣＭを単独投与した群、及びＶＣＭとＯＸＡ又はＣＴＲＸを併用投与した群の生存曲線をログランクテストに供し、Ｐ値を算出した。
検討結果を図６及び表７に示す。
図６中の縦軸はカイコの生存率（Survival silkworms）を示し、横軸はＶＲ７及び抗菌化合物を投与後の時間を示す。 Example 5
[Evaluation of therapeutic effect of combined use of VCM and β-lactam antibacterial compound using silkworm infection model]
In general, animal studies are essential for the evaluation of the therapeutic effects of antimicrobial compounds. This is because the in vitro results are not always reflected in the animal due to the pharmacokinetics of the antibacterial compound. Therefore, using a silkworm infection model, it was examined whether or not the therapeutic effect of combined use of VCM and a β-lactam antibacterial compound could be observed against the infection caused by the VRSA strain isolated above.
Physiological saline, VCM (5 μg / animal), OXA (40 μg / animal), and CTRX (40 μg / animal) were singly administered, or VCM and OXA, and VCM and CTRX were coadministered to VR7-infected silkworms The survival rate (LT ₅₀ , half lethal time) of silkworms at each time was measured (VCM: 5 μg / mouse, OXA or CTRX: 40 μg / mouse). The number of injected bacteria was 1.1 × 10 ⁸ cfu / animal, and n = 5 per group.
In addition, as statistical processing, survival curves of a group to which VCM alone was administered and a group to which VCM and OXA or CTRX were coadministered were subjected to a log rank test to calculate P values.
The examination results are shown in FIG. 6 and Table 7.
The vertical axis in FIG. 6 indicates the survival rate of silkworm (Survival silkworms), and the horizontal axis indicates the time after administration of VR7 and the antibacterial compound.

ＶＲ７をカイコの体液中に注射するとカイコは感染死した。一方、ＶＣＭとＣＴＲＸを併用した場合には、ＶＣＭ単独に比べ、統計的に有意な差の延命効果が認められた（図６及び表７）。これに対してＶＣＭとＯＸＡを併用投与した群では、ＶＣＭ単独投与群と比べ延命効果に統計的に有意な差は認められなかった（図６及び表７）。また、４０μｇ／匹のＯＸＡ又はＣＴＲＸを単独投与したときは、延命効果はみられなかった（表７）。 When VR7 was injected into the body fluid of silkworm, the silkworm died of infection. On the other hand, when VCM and CTRX were used in combination, a survival effect of statistically significant difference was observed compared to VCM alone (FIG. 6 and Table 7). On the other hand, in the group in which VCM and OXA were coadministered, no statistically significant difference was observed in the survival benefit compared with the VCM alone administration group (FIG. 6 and Table 7). In addition, no survival benefit was observed when 40 μg / mouse of OXA or CTRX was administered alone (Table 7).

＜実施例のまとめ＞
ＭＲＳＡの変異原処理により得られたＶＣＭ高度耐性ＭＲＳＡ（ＶＲＳＡ）を用いて、βラクタム系抗菌化合物（オキサシリン、セフトリアキソン、セファゾリン、メチシリン、アンピシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、セファレキシン、クロキサシリン）がインビトロ（in vitro）での抗菌効果の評価系において顕著なＶＣＭに対するＭＩＣの低下を引き起こすことを明らかにした。また、ＶＣＭとＣＴＲＸが、カイコを用いたインビボ（in vivo）での治療効果評価系において、相乗効果をもたらすことを見出した。
一方、ＶＣＭとＯＸＡの組み合わせは、カイコ感染モデルでは治療効果を示さなかった。これらの結果は、将来問題となることが危惧される高度ＶＣＭ耐性ＭＲＳＡ感染症に対して、ＶＣＭと特定のβラクタム系抗菌化合物の併用療法が有効であることを示唆された。 <Summary of Examples>
Using VCM highly resistant MRSA (VRSA) obtained by mutagenic treatment of MRSA, a β-lactam antibacterial compound (oxacillin, ceftriaxone, cefazolin, methicillin, ampicillin, benzylpenicillin, carbenicillin, cephalexin, cloxacillin) is in vitro In vitro evaluation of the antibacterial effect was found to cause a marked decrease in MIC to VCM. In addition, we found that VCM and CTRX provide a synergistic effect in a system for evaluating the therapeutic effect in vivo using silkworms.
On the other hand, the combination of VCM and OXA showed no therapeutic effect in the silkworm infection model. These results suggest that combination therapy with VCM and a specific β-lactam antibacterial compound is effective for advanced VCM-resistant MRSA infections that may be problematic in the future.

これまでに、in vitroにおけるＶＩＳＡに対する抗菌活性に、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合物が相乗効果を示すことが指摘されている（非特許文献２）。しかしながら、従来の試験に用いられているＶＩＳＡのＶＣＭに対する耐性が低いため（ＭＩＣ≦８μｇ／ｍＬ）、ＭＩＣの低下で判定される相乗効果の有無については議論が残っていた。また、動物モデルでの治療効果に対するデータは得られていなかった。 Heretofore, it has been pointed out that VCM and a β-lactam antibacterial compound exhibit a synergistic effect on the antibacterial activity against VISA in vitro (Non-patent Document 2). However, due to the low resistance of VISA to VCM used in the conventional tests (MIC ≦ 8 μg / mL), there has been controversy as to the presence or absence of synergy as determined by the reduction in MIC. Also, no data were obtained on the therapeutic effects in animal models.

本実施例で、変異原処理により得られたＶＲＳＡに対してin vitroにおいて抗菌活性の上昇が見られた８種類のβラクタム系抗菌化合物とＶＣＭの組み合わせが何れも、試験管内での菌の増殖に対して明瞭な相乗効果を示すことを明らかにした。さらに、カイコを用いたin vivoの感染治療評価系においても、ＣＴＲＸとＶＣＭが相乗効果をもたらすことを見出した（図６、表７）。
一方、カイコを用いたin vivoでの薬効評価において、ＯＸＡはＶＣＭとの併用効果を示さなかった（図６、表７）。ＯＸＡはヒトにおいて、血中半減期が短く、血清タンパク質の結合率が高く、体内動態に問題があることが指摘されている（Barza, M. & Weinstein, L. Some determinants of the distribution of penicillins and cephalosporins in the body. Practical and theoretical considerations. Ann N Y Acad Sci, 235, 613-620 (1974)）。ＯＸＡの血中半減期はカイコでも短いことが予測される。よって、ＯＸＡとＶＣＭによる治療に対する両者の相乗効果が、カイコ感染モデルで見られない原因であると示唆された。 In this example, all of the combinations of eight types of β-lactam antibacterial compounds and VCM in which the antibacterial activity was increased in vitro against VRSA obtained by mutagen treatment, the bacterial growth in the test tube. It showed that it showed a clear synergetic effect. Furthermore, in the in vivo infection treatment evaluation system using a silkworm, it was found that CTRX and VCM have a synergistic effect (FIG. 6, Table 7).
On the other hand, OXA did not show the combined effect with VCM in the in vivo drug efficacy evaluation using silkworm (FIG. 6, Table 7). OXA has been shown to have a short half-life in blood, high serum protein binding rate, and problems with pharmacokinetics in humans (Barza, M. & Weinstein, L. Some determinants of the distribution of penicillins and Practical and theoretical considerations. Ann NY Acad Sci, 235, 613-620 (1974)). The half-life in blood of OXA is expected to be short even in silkworms. Therefore, it was suggested that the synergistic effect of both OXA and VCM treatment was the cause not seen in the silkworm infection model.

ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合の相乗効果は、ＭＲＳＡの各種株に対してもわずかであるが見出された（表２、表５）。何れのＭＲＳＡもＶＣＭに対して感受性である為、ＭＩＣ値の低下を顕著な差として明確に判定することは困難である。しかしながら、現在問題となっている、ＭＲＳＡのＶＣＭ感受性に関するＭＩＣＣｒｅｅｐと呼ばれる現象に対して、ＶＣＭとβラクタム系抗菌化合の併用効果は有用性があると示唆された。 The synergistic effect of VCM and β-lactam antibacterial compounds was also found to be slight against various strains of MRSA (Table 2, Table 5). Since any MRSA is sensitive to VCM, it is difficult to clearly determine the decrease in MIC value as a significant difference. However, it has been suggested that the combined effect of VCM and a β-lactam antibacterial compound is useful for the phenomenon called MIC Creep related to VCM sensitivity of MRSA, which is currently a problem.

既存薬を見直し、適用疾患を拡張させるドラッグリポジショニングが提唱されている（Ashburn, T. T. & Thor, K. B. Drug repositioning: identifying and developing new uses for existing drugs. Nat Rev Drug Discov 3, 673-683, doi:10.1038/nrd1468 (2004)）。このドラッグリポジショニングの考え方を元に、耐性菌の出現で使用が不適当であると判定される抗菌化合物を併用することにより再利用するとい「ドラッグリユース（Drug reuse）」という新たなコンセプトを本明細書で提案する。既に安全性や体内動態の問題がないことが立証されている抗菌化合物の組み合わせによる治療法の確立は、急速に出現する薬剤耐性菌感染症を低コストでしかも迅速に克服する上で有用であると示唆された。 Drug repositioning has been proposed to review existing drugs and extend applicable disease (Ashburn, TT & Thor, KB Drug repositioning: identifying and developing new uses for existing drugs. Nat Rev Drug Discov 3, 673-683, doi: 10.1038 / nrd 1468 (2004)). Based on the idea of drug repositioning, this new concept of "drug reuse" is to be reused by combining it with an antibacterial compound that is judged to be unsuitable for use due to the emergence of resistant bacteria. Suggested in the description. The establishment of therapy by combination of antibacterial compounds, which has already been proved to be free from safety and pharmacokinetic problems, is useful to overcome rapidly emerging drug-resistant bacterial infections at low cost and quickly It was suggested.

本発明である新規の抗菌性合剤は、今後蔓延する可能性が指摘されているバンコマイシン耐性菌に対して有効性を示すことから、新たな感染症治療薬として利用可能である。
The novel antibacterial combination of the present invention is effective against vancomycin-resistant bacteria, which has been shown to be likely to spread in the future, and can be used as a new therapeutic drug for infectious diseases.

Claims

To vancomycin, not due to vanA gene, a antimicrobial mixture used for the VRSA that won resistant (vancomycin-resistant Staphylococcus aureus),
Vancomycin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and, beta-lactam antibiotic compound or antimicrobial mixture characterized that you containing a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

The VRSA is, by continuous mutagenesis (serial mutagenesis), an antimicrobial mixture according to claim 1, wherein the bacteria have acquired resistance to resistance to vancomycin.

The VRSA is, by mutation accumulation, antimicrobial mixture according to claim 1 or claim 2 which is a bacterium that has acquired resistance to resistance to vancomycin.

The above-mentioned β-lactam antibacterial compound is selected from the group consisting of cephem antibacterial compounds selected from the group consisting of cefazolin, cefodizime, ceftriaxone and cephalexin, or oxacillin, methicillin, ampicillin, benzylpenicillin, carbenicillin and cloxacillin The antibacterial combination according to any one of claims 1 to 3, which is a penicillin antibacterial compound.

The antibacterial combination drug according to any one of claims 1 to 4 , which is for use as an antibacterial agent of VRSA ( vancomycin-resistant Staphylococcus aureus ) .

With regard to a combination of vancomycin or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a β-lactam antibacterial compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, “serial mutagenesis is not caused by transfer of the vanA gene. A method of searching for an antibacterial combination drug, which comprises using VRSA (vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) having acquired resistance to vancomycin by mutation accumulation due to

The method according to claim 6, wherein the combination exhibiting a therapeutic effect is selected from the combination by measuring the survival rate of the silkworm in the S. aureus silkworm infection model using the VRSA which has acquired the resistance.