JP6529835B2 - Dendritic cell activator - Google Patents
Dendritic cell activator Download PDFInfo
- Publication number
- JP6529835B2 JP6529835B2 JP2015126019A JP2015126019A JP6529835B2 JP 6529835 B2 JP6529835 B2 JP 6529835B2 JP 2015126019 A JP2015126019 A JP 2015126019A JP 2015126019 A JP2015126019 A JP 2015126019A JP 6529835 B2 JP6529835 B2 JP 6529835B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- dendritic cell
- dendritic cells
- dendritic
- milk
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、樹状細胞の活性化に有用な、樹状細胞活性化剤に関するものである。 The present invention relates to dendritic cell activators useful for dendritic cell activation.
樹状細胞は、病原菌やウイルス感染細胞などを検知して排除する免疫応答の中心的な役割を担う細胞であり、外来性の抗原を自己の細胞表面上に提示し、その情報をT細胞等の他の免疫細胞に伝達して、異物排除のための免疫応答を活性化させる役割を担っている。近年では、樹状細胞は、樹状細胞ワクチン療法などにも利用価値が見出されており、樹状細胞を活性化する有効成分の開発が望まれている。 Dendritic cells are cells that play a central role in the immune response, which detects and eliminates pathogenic bacteria and virus-infected cells, etc. Foreign antigens are presented on the surface of their own cells, and the information is displayed on T cells and the like. It is transmitted to other immune cells and plays a role in activating the immune response for eliminating foreign substances. In recent years, dendritic cells have found utility in dendritic cell vaccine therapy and the like, and development of an active ingredient that activates dendritic cells is desired.
一方、本出願人は、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)、とくにラクトバチルス ケフィリP-IF株を含む乳発酵物には、ヒト腸内細菌叢の悪玉菌と言われているクロストリジウム属微生物に対して強い抗菌効果を示す成分が含まれ、腸内環境改善剤の有効成分として優れていることを報告している(下記特許文献1、2)。 On the other hand, in the case of milk fermented products containing Lactobacillus kefiri, in particular Lactobacillus kefili P-IF strain, the present applicant has been directed to Clostridium microorganisms which are said to be bad bacteria of human intestinal microflora. It is reported that it contains a component showing a strong antibacterial effect and is excellent as an active ingredient of the intestinal environment-improving agent (patent documents 1 and 2 below).
樹状細胞活性化剤の新たな有効成分を提供できれば治療や処置の選択の幅が広がる。また、天然産物もしくはその一次的な処理物が有効成分であれば、副作用のリスクも少ないと考えられるので、望ましい。 Providing new active ingredients for dendritic cell activators broadens the range of treatment and treatment options. In addition, if a natural product or its primary processed product is an active ingredient, it is desirable because the risk of side effects is considered to be small.
したがって、本発明の目的は、天然産物もしくはその一次的な処理物を有効成分とし、樹状細胞の活性化に有用な、樹状細胞活性化剤を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a dendritic cell activating agent which contains a natural product or a primary processed product thereof as an active ingredient and is useful for activating dendritic cells.
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1]ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物又はその処理物を有効成分として含有することを特徴とする樹状細胞活性化剤。
[2]未熟樹状細胞を活性化するために用いられる、上記[1]記載の樹状細胞活性化剤。
[3]樹状細胞の免疫調節性サイトカインの産生能を高めるために用いられる、上記[1]記載の樹状細胞活性化剤。
[4]培養された樹状細胞に投与されるように用いられる、上記[1]記載の樹状細胞活性化剤。
[5]病原に由来するワクチン又は抗原とともに投与されるように用いられる、上記[1]記載の樹状細胞活性化剤。
[6]前記ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)は、ラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus Kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)である、上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載の樹状細胞活性化剤。
The present inventors earnestly studied in order to achieve the above-mentioned object, and came to complete the present invention. That is, the present invention is as follows.
[1] A dendritic cell activating agent comprising a fermented milk product of Lactobacillus kefiri or a processed product thereof as an active ingredient.
[2] The dendritic cell activating agent according to the above [1], which is used to activate immature dendritic cells.
[3] The dendritic cell activator according to [1], which is used to enhance the ability of dendritic cells to produce an immunomodulatory cytokine.
[4] The dendritic cell activating agent according to the above [1], which is used to be administered to cultured dendritic cells.
[5] The dendritic cell activating agent according to the above [1], which is used to be administered together with a vaccine or antigen derived from a pathogen.
[6] Any one of the above-mentioned [1] to [5], wherein the Lactobacillus kefiri (Lactobacillus kefiri) is Lactobacillus Kefiri P-IF (Accession No. FERM BP-10896) The dendritic cell activator according to claim 1.
本発明の樹状細胞活性化剤によれば、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物又はその処理物を有効成分にするので、安全で副作用少なく樹状細胞を活性化することができる。よって、本発明の樹状細胞活性化剤は、樹状細胞ワクチン療法などに有用である。 According to the dendritic cell activating agent of the present invention, a fermented milk product of Lactobacillus kefiri or a processed product thereof is used as an active ingredient, and therefore dendritic cells can be activated safely with less side effects. Thus, the dendritic cell activator of the present invention is useful for dendritic cell vaccine therapy and the like.
ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)としては、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)に属する微生物であればよく、特に制限はないが、好ましくはラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus Kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)を用いる。ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)は、公知の方法により、又はそれに準じて培養を行うことができ、例えば、市販のMRS培地「Lactobacilli MRS Broth」(商品名、Difco社製品)を用いて嫌気静置培養することなどにより、大量培養が可能である。 The Lactobacillus kefiri is not particularly limited as long as it is a microorganism belonging to Lactobacillus kefiri, and preferably Lactobacillus Kefiri P-IF (Accession No. FERM). Use BP-10896). Lactobacillus kefiri can be cultured by a known method or in accordance therewith, and for example, it is anaerobically kept using a commercially available MRS medium "Lactobacilli MRS broth" (trade name, a product of Difco). Mass culture is possible by culturing or the like.
ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物は、乳原料にラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)をスターターとして接種して所定の発酵条件に曝すことによって得ることができる。乳発酵のための乳原料としては、例えば、牛乳、乳清、発酵乳、乳酸菌飲料、脱脂乳、脱脂粉乳、調製粉乳、全脂粉乳、濃縮乳、脱脂濃縮乳、練乳、脱脂練乳、加糖練乳、加糖脱脂練乳などが挙げられる。これらはそのまま、あるいは適宜水等に溶解又は希釈したり、濃縮したりした後、必要に応じてオートクレーブ滅菌等の処理を施して、乳発酵のための原料とすることができる。発酵用微生物(スターター)の接種方法としては、MRS培地等による前培養液を添加する方法や、前に発酵を行ったときの残りの乳発酵物を添加する方法などが挙げられる。培養条件としては、20〜30℃、より好ましくは24〜26℃で、1〜10日、より好ましくは3〜7日間嫌気静置培養する方法などが好ましく採用される。 A fermented milk of Lactobacillus kefiri can be obtained by inoculating Lactobacillus kefiri as a starter with a milk raw material and exposing it to predetermined fermentation conditions. As a milk raw material for milk fermentation, for example, milk, whey, fermented milk, lactic acid bacteria beverage, skimmed milk, skimmed milk powder, whole milk powder, concentrated milk, skimmed concentrated milk, condensed milk, skimmed milk, sugared condensed milk , Sweetened skimmed milk and the like. These may be dissolved or diluted or concentrated in water or the like as appropriate, and then subjected to a process such as autoclave sterilization as necessary to be used as a raw material for milk fermentation. As a method for inoculating a microorganism for fermentation (starter), a method of adding a preculture solution in MRS medium or the like, a method of adding the remaining milk fermented material when fermentation is performed before, and the like can be mentioned. As culture conditions, a method of anaerobically standing culture at 20 to 30 ° C., more preferably 24 to 26 ° C., for 1 to 10 days, more preferably 3 to 7 days is preferably employed.
上記乳発酵のスターターとしては、複数の菌種を併用してもよい。これによれは、複数の微生物が共生的に生育することによって乳発酵が起こるので、味や外観がよい乳発酵物が得られる。例えば、カザツタニア ツリセンシス(Kazachstania turicensis)、カザツタニア ユニスポラ(Kazachstania unispora)、及びクリュイベロミセス マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)からなる群から選ばれた少なくとも1種の酵母菌を併用してもよい。あるいは、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)として、上記ラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus Kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)に加えてラクトバチルス ケフィリP-B1(Lactobacillus kefiri P-B1)(受託番号FERM BP-11115)などを併用してもよい。特に好ましい態様では、上記乳発酵のスターターとして、ラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)、ラクトバチルス ケフィリP-B1(Lactobacillus kefiri P-B1)(受託番号FERM BP-11115)、カザツタニア ツリセンシスP-Y3(Kazachstania turicensis P-Y3)(受託番号FERM BP-11116)、カザツタニア ユニスポラP-Y4(Kazachstania unispora P-Y4)(受託番号FERM BP-11117)、及びクリュイベロミセス マルシアヌスP-Y5(Kluyveromyces marxianus P-Y5)(受託番号FERM BP-11118)を少なくとも含む複合微生物を用いて、発酵後の乳発酵物の微生物群中に、ラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)が80菌数%以上、より好ましくは90菌数%以上占めるように調製された乳発酵物を用いることが好ましい。 A plurality of bacterial species may be used in combination as a starter for the above-mentioned milk fermentation. According to this, since milk fermentation is caused by the symbiotic growth of a plurality of microorganisms, a milk fermented product having good taste and appearance can be obtained. For example, at least one yeast selected from the group consisting of Kazachstania thulensis (Kazachstania turicensis), Kazatzania unispora (Kazachstania unispora), and Kluyveromyces marxianus may be used in combination. Alternatively, Lactobacillus kefiri P-IF (Lactobacillus kefiri P-B1) (Lactobacillus kefiri P-B1) (Lactobacillus kefiri P-IF) (Accession No. FERM BP-10896) as Lactobacillus kefiri P Accession No. FERM BP-11115) may be used in combination. In a particularly preferred embodiment, Lactobacillus kefiri P-IF (Accession No. FERM BP-10896), Lactobacillus kefiri P-B1 (Lactobacillus kefiri P-B1) (Accession No.) as a starter for the above-mentioned milk fermentation FERM BP-11115), Kazattania thulensis P-Y3 (Kazachstania turicensis P-Y3) (Accession No. FERM BP-11116), Kazattania unispora P-Y4 (Kazachstania unispora P-Y4) (Accession No. FERM BP-11117), and Lactobacillus kefili P-IF (Lactobacillus) in the microbial community of a fermented milk after fermentation using a complex microorganism containing at least I. m. P. Y 5 (Kluyveromyces marxianus P-Y 5) (Accession No. FERM BP-11118) It is preferable to use a fermented milk prepared so that kefiri P-IF) (Accession No. FERM BP-10896) occupies 80% or more, more preferably 90% or more.
本発明においては、樹状細胞活性化剤の有効成分として、上記のように得られたラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物又はその処理物を用いる。ここで「処理物」には、乳発酵物に対して加熱殺菌、濃縮、乾燥、菌体の分離、菌体の除去、菌体の破砕、水系溶媒や含水アルコール系溶媒等による希釈、水系溶媒や含水アルコール系溶媒等への抽出などの処理の1種又は2種以上の組み合わせを施して調製したものが含まれる。また、水系溶媒あるいは含水アルコール系溶媒等で抽出した抽出物に対して加熱殺菌、濃縮、乾燥、固形物の除去などの処理の1種又は2種以上の組み合わせを施して調製したものも含まれる。 In the present invention, a fermented milk product of Lactobacillus kefiri obtained as described above or a processed product thereof is used as an active ingredient of the dendritic cell activating agent. Here, “processed material” includes heat sterilization, concentration and drying of fermented milk, separation of bacterial cells, removal of bacterial cells, crushing of bacterial cells, dilution with aqueous solvent or water-containing alcohol solvent, etc., aqueous solvent And those prepared by applying one or a combination of two or more types of treatment such as extraction to a water-containing alcohol solvent or the like. In addition, it includes those prepared by applying one or a combination of two or more kinds of treatments such as heat sterilization, concentration, drying, removal of solid matter, etc. to an extract extracted with an aqueous solvent or a hydroalcoholic solvent etc. .
例えば、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)は、その菌体に60〜120℃、より好ましくは、95〜120℃の加熱処理を施すことにより、死菌化される。よって、乳発酵物を噴霧乾燥により粉末化することができるが、それと同時に付加される熱で死菌化されていてもよい。あるいは、乳発酵物の粉末化は凍結乾燥によって行ってもよい。これによれば、乳発酵物の凍結乾燥物を水等で戻すことにより、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)を生きた状態で提供することができる。 For example, Lactobacillus kefiri is killed by subjecting the cells to a heat treatment at 60 to 120 ° C., more preferably 95 to 120 ° C. Thus, the fermented milk can be powdered by spray drying, but it may be sterilized by the heat applied at the same time. Alternatively, the powdering of the fermented milk may be performed by lyophilization. According to this, Lactobacillus kefiri can be provided in a live state by returning the freeze-dried product of the milk fermented product with water or the like.
本発明の樹状細胞活性化剤においては、上記有効成分以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤、注射剤、吸引剤、塗布剤等の形態にして利用することができる。 In the dendritic cell activating agent of the present invention, there is no particular limitation in blending other materials in addition to the above-mentioned active ingredient, and if necessary, a pharmaceutically acceptable base material or carrier is added. Using, for example, in the form of tablets, granules, capsules, pills, powders, solutions, powders, jellies, lozenges, injections, aspirants, coatings, etc. Can.
本発明の樹状細胞活性化剤は、ヒト又は動物に投与すればよく、その投与形態に特に制限はない。例えば、経口投与、静脈内投与、脳内局所投与、腹腔内投与、吸引、経鼻投与などが挙げられる。なかでも、摂取者の負担の軽減や服用のし易さの観点からは、経口投与の形態が好ましい。 The dendritic cell activating agent of the present invention may be administered to humans or animals, and the administration form is not particularly limited. For example, oral administration, intravenous administration, intracerebral local administration, intraperitoneal administration, aspiration, nasal administration and the like can be mentioned. Among them, the oral administration form is preferred from the viewpoint of reducing burden on the user and ease of taking.
本発明の樹状細胞活性化剤を経口投与する場合、その1日当りの投与量としては、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物の乾燥物の状態の量で換算した量で0.01(g/kg体重)〜10(g/kg体重)であることが好ましく、0.05(g/kg体重)〜5(g/kg体重)であることがより好ましく、0.1(g/kg体重)〜1(g/kg体重)であることが更により好ましい。あるいは、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物中に含まれる該ケフィリ菌の菌数で換算した量で1×1013(個/kg体重)〜1×1016(個/kg体重)であることが好ましく、5×1013(個/kg体重)〜5×1015(個/kg体重)であることがより好ましく、1×1014(個/kg体重)〜1×1015(個/kg体重)であることが更により好ましい。投与量がそれらの範囲よりも少ないと、十分な効果が得られにくく、投与量がその範囲よりも多いと、何らかの副作用を生じるリスクが高まる。なお、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物の乾燥物中に含まれる該ケフィリ菌の菌数は、5×1012(個/g)〜3×1015(個/g)であることが好ましく、5×1013(個/g)〜2×1015(個/g)であることがより好ましく、5×1014(個/g)〜1×1015(個/g)であることが更により好ましい。 When the dendritic cell activating agent of the present invention is orally administered, the daily dose is 0.01 in terms of the amount of the dry matter of a fermented milk product of Lactobacillus kefiri. It is preferably (g / kg body weight) to 10 (g / kg body weight), more preferably 0.05 (g / kg body weight) to 5 (g / kg body weight), 0.1 (g / kg body weight) It is even more preferable that it is kg body weight to 1 (g / kg body weight). Alternatively, it may be 1 × 10 13 (in / kg body weight) to 1 × 10 16 (in / kg body weight) in terms of the number of kefili bacteria contained in the fermented milk of Lactobacillus kefiri. Is preferably 5 × 10 13 (in / kg body weight) to 5 × 10 15 (in / kg body weight), more preferably 1 × 10 14 (in / kg body weight) to 1 × 10 15 (in. Even more preferably, If the dose is lower than these ranges, a sufficient effect can not be obtained, and if the dose is higher than the range, the risk of producing any side effect is increased. In addition, the number of Kefiridium bacteria contained in the dried product of the fermented milk of Lactobacillus kefiri is 5 × 10 12 (cells / g) to 3 × 10 15 (cells / g). Is preferable, and 5 × 10 13 (in / g) to 2 × 10 15 (in / g) is more preferable, and 5 × 10 14 (in / g) to 1 × 10 15 (in / g) It is even more preferred.
本発明の樹状細胞活性化剤を投与するための製品の形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、など各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。あるいはペット動物等のための動物用製品であってもよい。 The form of the product for administering the dendritic cell activating agent of the present invention is not particularly limited as long as the effect is not impaired. For example, it can be used in various product forms such as pharmaceuticals, quasi-drugs, health foods, functional foods, nutraceuticals, supplements, etc., or in combination with such products. Alternatively, it may be an animal product for pet animals and the like.
本発明の樹状細胞活性化剤の別の使用態様としては、病原に由来するワクチン又は抗原とともに投与することが挙げられる。これによれば、そのワクチンや抗原に対して特異的に、樹状細胞による免疫機能を高めることができる。ワクチン又は抗原としては、がん病原組織、がん病原細胞、がん病原組織/細胞由来ペプチド、弱毒化した病原ウイルス、病原ウイルス由来ペプチド、弱毒化した病原細菌、病原細菌由来ペプチドなどが挙げられる。 Another mode of use of the dendritic cell activating agent of the present invention is administration with a vaccine or antigen derived from a pathogen. According to this, the immune function by dendritic cells can be enhanced specifically to the vaccine and the antigen. Vaccines or antigens include oncogenic tissues, oncogenic cells, oncogenic tissue / cell-derived peptides, attenuated pathogenic viruses, pathogenic virus-derived peptides, attenuated pathogenic bacteria, pathogenic bacterial-derived peptides, etc. .
本発明の樹状細胞活性化剤の他の別の使用態様としては、培養された樹状細胞に投与することが挙げられる。より具体的には、樹状細胞ワクチン療法などに利用することが挙げられる。樹状細胞ワクチン療法では、ドナー(患者)から末梢血単核球(PBMC)等の単球を分離して、これを培養プレート中で培養するとともにサイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)やインターロイキン4(IL−4)などで刺激することで、単球由来の未熟樹状細胞を調製する。得られた細胞が樹状細胞性を獲得したか否かは、樹状細胞マーカーであるCD11cなどの発現によって判定することができる。マーカーの発現はフローサイトメトリーなどで測定することができる。この未熟樹状細胞に所望のワクチン又は抗原を接触させて、そのワクチンや抗原に対する免疫担当能を高めたうえで、所定量でドナー(患者)に戻す。これによって、その免疫機能によって病原を体内から排除することができる。 Another alternative mode of use of the dendritic cell activating agent of the present invention is administration to cultured dendritic cells. More specifically, utilization for dendritic cell vaccine therapy and the like can be mentioned. In dendritic cell vaccine therapy, monocytes such as peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are separated from a donor (patient) and cultured in a culture plate and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM- Monocyte-derived immature dendritic cells are prepared by stimulation with CSF), interleukin 4 (IL-4) or the like. Whether or not the obtained cells acquire dendritic cellularity can be determined by the expression of a dendritic cell marker such as CD11c. The expression of the marker can be measured by flow cytometry or the like. The immature dendritic cells are brought into contact with a desired vaccine or antigen to enhance the immunocompetence for the vaccine or antigen, and then returned to the donor (patient) in a predetermined amount. Thereby, the pathogen can be eliminated from the body by its immune function.
本発明の樹状細胞活性化剤は、上記の未熟樹状細胞が免疫担当能を獲得したり、更には特定のワクチンや抗原に対する免疫担当能を高めたりするのを促進することができる。この場合、培養された樹状細胞に、病原に由来するワクチン又は抗原とともに投与することが好ましい。ワクチン又は抗原としては、がん病原組織、がん病原細胞、がん病原組織/細胞由来ペプチド、弱毒化した病原ウイルス、病原ウイルス由来ペプチド、弱毒化した病原細菌、病原細菌由来ペプチドなどが挙げられる。未熟樹状細胞が免疫担当能を獲得したか否かは、樹状細胞の成熟化マーカーであるCD80、CD86などの発現によって判定することができる。マーカーの発現はフローサイトメトリーなどで測定することができる。 The dendritic cell activating agent of the present invention can promote the above-mentioned immature dendritic cells to acquire immunocompetence, and further to enhance the immunocompetence against a specific vaccine or antigen. In this case, preferably, the cultured dendritic cells are administered together with a vaccine or antigen derived from a pathogen. Vaccines or antigens include oncogenic tissues, oncogenic cells, oncogenic tissue / cell-derived peptides, attenuated pathogenic viruses, pathogenic virus-derived peptides, attenuated pathogenic bacteria, pathogenic bacterial-derived peptides, etc. . Whether or not the immature dendritic cells have acquired immunocompetence can be determined by the expression of the dendritic cell maturation marker CD80, CD86 and the like. The expression of the marker can be measured by flow cytometry or the like.
本発明の樹状細胞活性化剤を培養された樹状細胞に投与する場合、その樹状細胞個数当りの投与量としては、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物の乾燥物の状態の量で換算した量で0.1(μg/1×106個)〜1000(μg/1×106個)であることが好ましく、1(μg/1×106個)〜100(μg/1×106個)であることがより好ましく、5(μg/1×106個)〜50(μg/1×106個)であることが更により好ましい。あるいは、ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵物中に含まれる該ケフィリ菌の菌数で換算した量で1×1011(個/1×106個)〜1×1015(個/1×106個)であることが好ましく、1×1012(個/1×106個)〜1×1014(個/1×106個)であることがより好ましく、5×1012(個/1×106個)〜5×1013(個/1×106個)であることが更により好ましい。投与量がそれらの範囲よりも少ないと、十分な効果が得られにくく、投与量がその範囲よりも多いと、細胞毒性を生じるリスクが高まる。 When the dendritic cell activating agent of the present invention is administered to cultured dendritic cells, the dose per number of dendritic cells is in the state of a dry matter of a milk fermentation product of Lactobacillus kefiri. The amount is preferably 0.1 (μg / 1 × 10 6 ) to 1000 (μg / 1 × 10 6 ), preferably 1 (μg / 1 × 10 6 ) to 100 (μg / L). more preferably 1 × 10 6), 5 ([mu] g / 1 × 10 6) it is even more preferred is to 50 ([mu] g / 1 × 10 6 cells). Alternatively, it is 1 × 10 11 (units / 1 × 10 6 ) to 1 × 10 15 (units / 1) in terms of the number of kefili bacteria contained in the fermented milk of Lactobacillus kefiri. It is preferable that it is × 10 6, more preferably 1 × 10 12 (unit / 1 × 10 6 ) to 1 × 10 14 (unit / 1 × 10 6 ), and 5 × 10 12 it is even more preferred is a number / 1 × 10 6 cells) to 5 × 10 13 (number / 1 × 10 6 cells). If the dose is lower than these ranges, a sufficient effect can not be obtained, and if the dose is higher than the range, the risk of cytotoxicity is increased.
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。 The invention will now be described by way of example, which do not limit the scope of the invention.
[材料及び方法]
(1)ラクトバチルス ケフィリ(Lactobacillus kefiri)の乳発酵処理物の調製
ラクトバチルス ケフィリP-IF(Lactobacillus kefiri P-IF)(受託番号FERM BP-10896)をMRS液体培地に植菌して、25℃で前培養し、その一部を脱脂乳培地(イオン交換水90質量部に脱脂粉乳10質量部を混合し、オートクレーブ滅菌して調製した培地)に植菌して、25℃、5日間嫌気静置培養し発酵させた。得られた発酵培養物は、黄褐色をしたヨーグルト状の液体であった。加熱殺菌処理後、凍結乾燥した。これを1mg/mLの濃度で蒸留水に懸濁後、1200×gで5分間遠心分離して、その上澄みをフィルター滅菌して、以下これを「LbK-PFT」として試験に用いた。なお、以下の試験において、「LbK-PFT」の濃度は、上記凍結乾燥物の状態の量で換算した濃度である。
[Materials and Methods]
(1) Preparation of milk-fermented product of Lactobacillus kefiri
Lactobacillus kefiri P-IF (Accession No. FERM BP-10896) is inoculated into MRS liquid medium, precultured at 25 ° C., and a part thereof is used as a defatted milk medium (ion-exchanged water 90). 10 parts by mass of skimmed milk powder was mixed with the parts by mass, inoculated into a medium prepared by autoclave sterilization and inoculated, and anaerobically incubated and fermented at 25 ° C. for 5 days. The resulting fermented culture was a yellow-brown, yogurt-like liquid. After heat sterilization, it was lyophilized. The suspension was suspended in distilled water at a concentration of 1 mg / mL, centrifuged at 1200 × g for 5 minutes, the supernatant was filter-sterilized, and this was used as “LbK-PFT” in the test. In the following tests, the concentration of “LbK-PFT” is the concentration converted by the amount of the above-mentioned lyophilizate.
(2)単球由来樹状細胞の調製
常法により、単球由来樹状細胞を調製した。具体的には以下のように調製した。
フィコール−ハイパーク密度勾配遠心分離により、健常なドナー(チャールズドリュー大学治験審査委員会(IRB)が承認した)から得た末梢血単核球(PBMC)を分離した。培養プレートにこれらの細胞を2時間接着させ、次いで、非接着細胞を除去した。接着単球を、37℃5%CO2の加湿雰囲気下、10%FBS、1mMグルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、50ng/mLヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)及び10ng/mL組換えヒトIL−4を添加したRPMI 1640培地中で、6時間培養した。2日毎に培地の半分を新鮮な培地と交換し、6日後に樹状細胞を回収した。樹状細胞マーカーであるCD11cを発現している細胞の割合によると、得られた樹状細胞の純度は95%超であった。
(2) Preparation of Monocyte-Derived Dendritic Cells Monocyte-derived dendritic cells were prepared by a conventional method. Specifically, it was prepared as follows.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy donors (approved by Charles Drew University Institutional Review Board (IRB)) were separated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. The cells were allowed to adhere to the culture plate for 2 hours and then non-adherent cells were removed. Adherent monocytes were treated with 10% FBS, 1 mM glutamine, 100 U / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin, 50 ng / mL human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and a humidified atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 The cells were cultured for 6 hours in RPMI 1640 medium supplemented with 10 ng / mL recombinant human IL-4. Half of the medium was replaced with fresh medium every two days, and dendritic cells were collected after six days. According to the percentage of cells expressing the dendritic cell marker CD11c, the purity of the obtained dendritic cells was over 95%.
<試験例1>
異なる濃度のLbK−PFT(1、10,20、40μg/mL)を添加した以外は、上記樹状細胞の調製のときと同じ培養条件で、単球由来樹状細胞(細胞数およそ0.5×106)を24時間培養して、培養後の樹状細胞の表現型を調べた。具体的には、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーであるCD80、CD86、及びHLA−DRの発現を解析した。図1A、図1Bには、4つの個別の実験から任意に選択した代表的な解析結果を示す。
<Test Example 1>
Monocyte-derived dendritic cells (cell number about 0.5) under the same culture conditions as in the preparation of dendritic cells except that different concentrations of LbK-PFT (1, 10, 20, 40 μg / mL) were added. X 10 6 ) was cultured for 24 hours, and the phenotype of dendritic cells after culture was examined. Specifically, the expression of cell surface markers CD80, CD86 and HLA-DR was analyzed by flow cytometry. FIGS. 1A and 1B show representative analysis results arbitrarily selected from four individual experiments.
図1A,図1Bに示すように、CD80、CD86、及びHLA−DRの発現は、LbK−PFTの用量に依存して増加した(図中、矢印で示す。)。これらの細胞表面マーカーは樹状細胞の抗原提示能を亢進する共刺激及び成熟促進分子であり、LbK−PFTには、未熟樹状細胞の活性化を促進して抗原提示能を亢進する作用効果があることが明らかとなった。 As shown in FIGS. 1A and 1B, the expression of CD80, CD86, and HLA-DR increased depending on the dose of LbK-PFT (indicated by arrows in the figure). These cell surface markers are costimulatory and maturation promoting molecules that enhance the antigen presentation ability of dendritic cells, and LbK-PFT has the effect of promoting the activation of immature dendritic cells and enhancing the antigen presentation ability It became clear that there was.
<試験例2>
試験例1の培養後の上清を採取し、その上清中のサイトカイン(TNF−α、IL−6、IL−10)を、それぞれ特定のELISAキット(BDファーミンゲン)により測定した。
Test Example 2
The supernatant after culture of Test Example 1 was collected, and the cytokines (TNF-α, IL-6, IL-10) in the supernatant were each measured by a specific ELISA kit (BD Pharmingen).
図2に示すように、LbK−PFTの添加により、樹状細胞のTNF−α及びIL−6の産生量が有意に増加した。なお、IL−10はLbK−PFTを添加しても検出限界以下であった。 As shown in FIG. 2, addition of LbK-PFT significantly increased the production of TNF-α and IL-6 in dendritic cells. In addition, IL-10 was below the detection limit even if it added LbK-PFT.
<試験例3>
LbK−PFTに加えて大腸菌LPS(1μg/mL)を添加した以外は、試験例1と同様にして、単球由来樹状細胞を24時間培養して、培養後の樹状細胞の表現型を調べた。図3A,図3Bには、4つの個別の実験から任意に選択した代表的な解析結果を示す。
<Test Example 3>
Monocyte-derived dendritic cells were cultured for 24 hours in the same manner as in Test Example 1 except that E. coli LPS (1 μg / mL) was added in addition to LbK-PFT, and the phenotype of dendritic cells after culture was determined Examined. FIGS. 3A and 3B show representative analysis results arbitrarily selected from four individual experiments.
図3A,図3Bに示すように、CD80、CD86、及びHLA−DRの発現は、LbK−PFTの用量に依存して増加した。これらの細胞表面マーカーは樹状細胞の抗原提示能を亢進する共刺激及び成熟促進分子であり、LbK−PFTには、大腸菌LPSでの刺激下の樹状細胞の活性化をより促進して抗原提示能を亢進する作用効果があることが明らかとなった。 As shown in FIGS. 3A and 3B, the expression of CD80, CD86, and HLA-DR increased depending on the dose of LbK-PFT. These cell surface markers are costimulatory and maturation promoting molecules that enhance the antigen presentation ability of dendritic cells, and LbK-PFT is an antigen that further stimulates dendritic cell activation under stimulation with E. coli LPS. It became clear that there is an action effect that enhances the presentation ability.
<試験例4>
試験例3の培養後の上清を採取し、その上清中のサイトカイン(TNF−α、IL−6、IL−10)を、それぞれ特定のELISAキット(BDファーミンゲン)により測定した。
<Test Example 4>
The supernatant after culture of Test Example 3 was collected, and the cytokines (TNF-α, IL-6, IL-10) in the supernatant were each measured by a specific ELISA kit (BD Pharmingen).
図4に示すように、LbK−PFTの添加により、大腸菌LPSでの刺激下の樹状細胞のIL−6及びIL−10の産生量が有意に増加した。一方、大腸菌LPSでの刺激下の樹状細胞のTNF−αの産生量は、LbK−PFTの添加により減少した。 As shown in FIG. 4, addition of LbK-PFT significantly increased the production of IL-6 and IL-10 by dendritic cells under stimulation with E. coli LPS. On the other hand, the production of TNF-α by dendritic cells under stimulation with E. coli LPS was reduced by the addition of LbK-PFT.
Claims (5)
The dendritic cell activator according to claim 1, which is used to be administered together with a vaccine or antigen derived from a pathogen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015126019A JP6529835B2 (en) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Dendritic cell activator |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015126019A JP6529835B2 (en) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Dendritic cell activator |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017007983A JP2017007983A (en) | 2017-01-12 |
JP6529835B2 true JP6529835B2 (en) | 2019-06-12 |
Family
ID=57763070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015126019A Active JP6529835B2 (en) | 2015-06-23 | 2015-06-23 | Dendritic cell activator |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6529835B2 (en) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003310154A (en) * | 2002-04-19 | 2003-11-05 | Nippon Kefia Kk | Method for fermenting soybean milk by using kefir grain and fermented product |
FR2889958A1 (en) * | 2005-08-25 | 2007-03-02 | Lyoct Sa Lab | USE OF A SYMBIOTIC FOR THE TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS |
US7374924B2 (en) * | 2006-06-05 | 2008-05-20 | Biogaia Ab | Use of selected lactic acid bacteria for reducing infantile colic |
US20160000838A1 (en) * | 2013-03-05 | 2016-01-07 | Rijksuniversiteit Groningen | Use of Faecalibacterium Prausnitzii Htf-f (DSM 26943) to Suppress Inflammation |
-
2015
- 2015-06-23 JP JP2015126019A patent/JP6529835B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2017007983A (en) | 2017-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5718917B2 (en) | Novel Lactobacillus plantarum and composition containing the same | |
DK2455450T3 (en) | NOVEL Lactobacillus plantarum AND COMPOSITION CONTAINING THIS | |
KR100908254B1 (en) | Antiallergic composition | |
DK2360237T3 (en) | NEW Lactobacillus plantarum AND COMPOSITION CONTAINING SAME | |
RU2748839C2 (en) | Compositions, methods and kits for stimulating the mucosal immune system | |
JP5791009B2 (en) | Lactic acid bacteria and food or drink using them | |
Yang et al. | Oral administration of live Bifidobacterium substrains isolated from healthy centenarians enhanced immune function in BALB/c mice | |
JP4917025B2 (en) | A composition having an immunomodulatory action, comprising Lactobacillus pentosus | |
EP2722386B1 (en) | Crushed cells and composition thereof | |
JP5337535B2 (en) | NK activity enhancer | |
CN111212575A (en) | Composition for muscle building | |
KR20190046858A (en) | A method for culturing a salt tolerant lactic acid bacterium, a salt tolerant lactic acid bacterium, | |
Pimentel et al. | Postbiotics: An overview of concepts, inactivation technologies, health effects, and driver trends | |
RU2535974C2 (en) | Immunomodulatory probiotic lactic-acid bacteria | |
JP5019961B2 (en) | Interleukin 10 production promoter | |
CN106262931A (en) | Lactobacillus plantarum application in preparation antiallergic product | |
JP7358001B2 (en) | Lactic acid bacteria, interleukin-22 production inducer, skin barrier function enhancer | |
JP7183301B2 (en) | Modulation of immune function by Bacillus coagulans | |
JP4515157B2 (en) | Lactic acid bacteria with immunomodulatory action | |
Rolny et al. | Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CIDCA 133 modulates response of human epithelial and dendritic cells infected with Bacillus cereus. | |
WO2023074820A1 (en) | SARS-CoV-2 PROLIFERATION INHIBITOR | |
WO2019160116A1 (en) | Bacterium of genus bacillus, interleukin-22 production inducing agent, skin barrier function enhancing agent | |
JP6529835B2 (en) | Dendritic cell activator | |
TWI230611B (en) | Anti-infection composition and food containing such anti-infection composition | |
JP2005225841A (en) | Agent for protecting infection with pathogen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190124 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190423 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190515 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6529835 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |