JP6508741B2 - Method and system for analyzing procyanidins - Google Patents
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Description
本発明は、プロシアニジン類の分析方法及び分析システムに関する。 The present invention relates to a method and system for analyzing procyanidins.
プロシアニジン類は、ポリフェノール類の一種であり、カテキン類が重合した複合体である。また、プロシアニジン類は、リンゴやブドウ等の果実、香辛料、穀類、茶類、カカオ等、広く食物に含まれている。近年、プロシアニジン類について、強い抗酸化作用、脂肪蓄積抑制効果、肥満予防効果、中性脂肪吸収抑制効果、発癌抑制効果、末梢循環改善作用、血液流動性改善作用及び血小板凝集抑制効果等の様々な効果が報告されている。上記のとおり、プロシアニジン類は、広く食物に含まれていることから、プロシアニジン類を含む特定保健用食品や機能性表示食品の開発等が期待されている。 Procyanidins are a kind of polyphenols and are complexes in which catechins are polymerized. In addition, procyanidins are widely contained in foods such as fruits such as apples and grapes, spices, grains, teas, cacao and the like. In recent years, with regard to procyanidins, various effects such as strong antioxidant action, fat accumulation inhibiting effect, obesity preventing effect, neutral fat absorption inhibiting effect, carcinogenesis inhibiting effect, peripheral circulation improving action, blood fluidity improving action and platelet aggregation inhibiting effect The effects have been reported. As described above, since procyanidins are widely contained in food, development of food for specified health use including procyanidins and functional display food is expected.
一方、特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保し、食品や商品の品質保証を行うことが重要になっている。これまで、プロシアニジン類の分析には、比色定量法やＨＰＬＣ法が使用されてきた。近年では、プロシアニジン類を重合度別に分離する順相クロマトグラフィー法による分析が行われている（例えば、非特許文献１参照）。 On the other hand, in food for specified health use and food with functionality indicated, it is important to secure functional ingredients involved and to guarantee the quality of food and goods. So far, colorimetric and HPLC methods have been used to analyze procyanidins. In recent years, analysis by normal phase chromatography in which procyanidins are separated according to their degree of polymerization has been performed (see, for example, Non-Patent Document 1).
プロシアニジン類は、カテキン類の結合数、結合位置及び種類によって、多くの異性体が存在し、逆相クロマトグラフィーによる分析では、ピークが重なって溶出されることから定量可能なプロシアニジン類に限界がある（図５参照）。 Procyanidins have many isomers depending on the binding number, binding position and type of catechins, and analysis by reverse phase chromatography limits the quantifiable procyanidins because the peaks are eluted in an overlapping manner (See Figure 5).
また、非特許文献１に記載の方法では、プロシアニジン類の各重合度の標準品は市販されていないため、調製する必要がある。さらに、測定時間が１試料に対し７５分程度と長い。 Further, in the method described in Non-Patent Document 1, standard products of each degree of polymerization of procyanidins are not commercially available, and therefore, need to be prepared. Furthermore, the measurement time is as long as about 75 minutes for one sample.
特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保するために、数多くの試料を分析することが必要である。そのため、短時間でプロシアニジン類を容易に分析できる分析方法が求められていた。 In food for specified health food and functional indication food, it is necessary to analyze a large number of samples in order to secure functional involved components. Therefore, there is a need for an analysis method that can easily analyze procyanidins in a short time.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、短時間でプロシアニジン類を容易に分析できるプロシアニジン類の分析方法及び分析システムを提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method and system for analyzing procyanidins which can easily analyze procyanidins in a short time.
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備える方法であり、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出しており、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように前記２成分移動相をカラムに通過させる。
That is, the present invention includes the following aspects.
The analysis method of procyanidins according to the first aspect of the present invention is a method comprising an analysis step of separating and detecting a sample containing procyanidins using normal phase high performance liquid chromatography, wherein the analysis step includes the steps of: A sample containing procyanidins is introduced into a liquid chromatography column packed with a stationary phase, and it comprises a mobile phase A consisting essentially of a polar aprotic solvent and a mobile phase B consisting essentially of a polar protic solvent The procyanidins are separated and detected by the step elution method using a two-component mobile phase, and the concentration of the mobile phase B solution is the mobile phase A solution and the above, from 1 minute to 2 minutes from the start of analysis. The two-component mobile phase is passed through the column so as to be 5% by volume or more and 9% by volume or less based on the total volume of the mobile phase B liquid .
上記第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法において、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。 In the method of analyzing procyanidins according to the first aspect, the polar aprotic solvent is selected from the group consisting of acetonitrile, acetone, cyclohexanone, methyl ethyl ketone, methyl tert-butyl ether, diethyl ether, dimethyl ether, methyl acetate, ethyl acetate and nitromethane may be at least one member, the polar protic solvent medium is methanol, ethanol, n- propanol, isopropanol, may be one or more selected from the group consisting of n- butanol and isobutanol.
上記第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法において、前記固定相がジオール相であってもよい。 In the method of analyzing procyanidins according to the first aspect, the stationary phase may be a diol phase.
本発明の第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムは、固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、を備え、前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御する。 An analysis system for procyanidins according to a second aspect of the present invention comprises a high performance liquid chromatograph having a normal phase column packed with a stationary phase, a mobile phase A substantially consisting of a polar aprotic solvent, and a polar protic solvent A control unit configured to control a volume ratio of the mobile phase A liquid to be sent to the normal phase column and the mobile phase B liquid substantially sent from the liquid phase column ; analysis the following 2 minutes or 1 minute from the start, that controls so that the concentration of the mobile phase B solution is 9 volume% 5 volume% or more or less to the total volume of the mobile phase liquid a and the mobile phase B solution .
上記第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムにおいて、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。 In the analysis system for procyanidins according to the second aspect, the polar aprotic solvent is selected from the group consisting of acetonitrile, acetone, cyclohexanone, methyl ethyl ketone, methyl tert-butyl ether, diethyl ether, dimethyl ether, methyl acetate, ethyl acetate and nitromethane. may be at least one member, the polar protic solvent medium is methanol, ethanol, n- propanol, isopropanol, may be one or more selected from the group consisting of n- butanol and isobutanol.
上記第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムにおいて、前記固定相がジオール相であってもよい。 In the procyanidins analysis system according to the second aspect, the stationary phase may be a diol phase.
上記態様のプロシアニジン類の分析方法及び分析システムによれば、短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。 According to the method and system for analyzing procyanidins of the above aspect, procyanidins can be easily analyzed in a short time.
≪プロシアニジン類の分析方法≫
本発明の一実施形態に係るプロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備える方法である。また、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入する。次いで、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。
«Analytical method of procyanidins»
An analysis method of procyanidins according to an embodiment of the present invention is a method comprising an analysis step of separating and detecting a sample containing procyanidins using normal phase high performance liquid chromatography. In the analysis step, a sample containing the procyanidins is introduced into a liquid chromatography column packed with a stationary phase. Then, the procyanidins are separated by a step elution method using a two-component mobile phase comprising a mobile phase A consisting essentially of a polar aprotic solvent and a mobile phase B consisting essentially of a polar protic solvent, To detect.
本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、従来では１試料あたりの分析時間が６０分間程度かかっていたの対し、１０分間程度の短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。 According to the method of analyzing procyanidins of this embodiment, procyanidins can be easily analyzed in a short time of about 10 minutes, whereas the analysis time per sample conventionally took about 60 minutes.
また、特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保するために、プロシアニジン類の各重合度の含有濃度を定量する必要はなく、２量体以上の重合体の合計濃度を容易に定量する方法が求められている。本実施形態のプロシアニジン類の分析方法では、液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分析結果であるクロマトグラムにおいて、２量体以上の重合体の同じピークに現れる。そのため、試料中の２量体以上の重合体の合計濃度を容易に算出することができる。 In addition, it is not necessary to quantify the content concentration of each degree of polymerization of procyanidins in food for specified health use or food for displaying functional content in order to secure functional involved components, but the total concentration of polymers of dimer or more There is a need for a method of quantifying easily. In the method of analyzing procyanidins of the present embodiment, in the chromatogram which is the analysis result of procyanidins by liquid chromatography, it appears in the same peak of the dimer or higher polymer. Therefore, the total concentration of the dimer and higher polymers in the sample can be easily calculated.
［分析工程］
分析工程において、まず、プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入する。
[Analytical process]
In the analysis step, first, a sample containing procyanidins is introduced into a liquid chromatography column packed with a stationary phase.
プロシアニジン類を含む試料としては、特別な限定はなく、例えば、リンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、ライチ、ブルーベリー、カシス、アボカド、大麦、グァバ、ホップ、小豆、クルミ、クリ、カカオ、松樹皮、紅茶、緑茶、ワイン等が挙げられ、これらに限定されない。プロシアニジン類を含む試料としては、１種類の植物から由来するものを用いてもよく、複数種の植物から由来するものを組み合わせて用いてもよい。 There is no special limitation as a sample containing procyanidins, for example, apple, pear, peach, grape, lychee, blueberry, cassis, avocado, barley, guava, hop, azuki bean, walnut, chestnut, cacao, pine bark, black tea , Green tea, wine and the like, without being limited thereto. As a sample containing procyanidins, those derived from one kind of plant may be used, or those derived from plural kinds of plants may be used in combination.
プロシアニジン類を含む試料を調製する方法としては、例えば、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料である場合、特開平７−２８５８７６号公報（参考文献１）、特開２００２−８７９７８号公報（参考文献２）等に記載の方法等が挙げられる。 As a method of preparing a sample containing procyanidins, for example, when it is a sample containing procyanidins derived from apple, JP-A-7-285876 (reference 1), JP-A 2002-87978 (reference 2) And the like.
また、液体クロマトグラフィーカラムに導入される試料中のプロシアニジン類の濃度は、５μｇ／ｍＬ以上５００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。 Further, the concentration of procyanidins in the sample introduced to the liquid chromatography column is preferably 5 μg / mL or more and 500 μg / mL or less.
カラムに充填された固定相としては、極性物質が結合しているものであればよく、例えば、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、ニトロ相等が挙げられる。 The stationary phase packed in the column may be any one to which a polar substance is bound, for example, diol phase, glycerol phase, amino phase, cyano phase, trimethylsilyl phase, dimethylsilyl phase, propyl phase, butyl phase, Examples include pentyl phase, hexyl phase, phenyl phase, halogenated phase, nitro phase and the like.
中でも、固定相としては、ジオール相であることが好ましい。ジオール相が充填されたカラムとしては、例えば、Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ １００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ３００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等が挙げられる。
Among them, the stationary phase is preferably a diol phase. Examples of columns filled with a diol phase include Inertial Diol (inner diameter 4.6 mm ×
また、固定相の粒径は、３μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the particle size of a stationary phase is 3 micrometers or more and 10 micrometers or less.
また、カラムの内径は、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましい。カラムの長さは、１００ｍｍ以上５００ｍｍ以下であることが好ましい。 The inner diameter of the column is preferably 1 mm or more and 10 mm or less. The length of the column is preferably 100 mm or more and 500 mm or less.
次いで、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。 Then, the procyanidins are separated by a step elution method using a two-component mobile phase comprising a mobile phase A consisting essentially of a polar aprotic solvent and a mobile phase B consisting essentially of a polar protic solvent, To detect.
極性非プロトン溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、ニトロメタン等が挙げられる。これらの溶媒を
１種を用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。中でも、極性非プロトン溶媒としては、アセトニトリルであることが好ましい。
Examples of the polar aprotic solvent include acetonitrile, acetone, cyclohexanone, methyl ethyl ketone, methyl tert-butyl ether, diethyl ether, dimethyl ether, methyl acetate, methyl acetate, ethyl acetate, nitromethane and the like. One of these solvents may be used, or two or more thereof may be used in combination. Among them, acetonitrile is preferable as the polar aprotic solvent.
極性プロトン溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等が挙げられる。これらの溶媒を
１種を用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。中でも、極性非プロトン溶媒としては、メタノールであることが好ましい。
As a polar protic solvent, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol etc. are mentioned, for example. One of these solvents may be used, or two or more thereof may be used in combination. Among them, methanol is preferred as the polar aprotic solvent.
本明細書において、「極性非プロトン溶媒から実質的になる」及び「極性プロトン溶媒から実質的になる」とは、Ａ液中の極性非プロトン溶媒又はＢ液中の極性プロトン溶媒が１００容量％である、又は、極性非プロトン溶媒又は極性プロトン溶媒の移動相としての性質を妨げない程度の任意の鉱酸、有機酸（例えば、酢酸等）及び水からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む状態を意味する。中でも、Ａ液中の極性非プロトン溶媒又はＢ液中の極性プロトン溶媒が５０容量％以上であることが好ましく、９０容量％以上であることがより好ましい。また、Ａ液中の極性非プロトン溶媒は９８容量％以上のアセトニトリルであることが特に好ましく、Ｂ液中の極性プロトン溶媒は９５容量％以上のメタノールであることが特に好ましい。 In the present specification, "consisting essentially of polar aprotic solvent" and "consisting essentially of polar protic solvent" mean that the polar aprotic solvent in solution A or the polar protic solvent in solution B is 100% by volume. Or at least one member selected from the group consisting of organic acid (eg, acetic acid etc.) and water to such an extent that the property of the polar aprotic solvent or polar protic solvent as mobile phase is not impaired Means state. Among them, the polar aprotic solvent in the solution A or the polar proton solvent in the solution B is preferably 50% by volume or more, and more preferably 90% by volume or more. The polar aprotic solvent in solution A is particularly preferably 98% by volume or more of acetonitrile, and the polar proton solvent in solution B is particularly preferably 95% by volume or more of methanol.
また、段階溶出法のパターンとしては、分析開始から１分間以上２分間以下、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるようにカラムに通過させることが好ましい。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、即座にＢ液の濃度を上昇させてカラムに通過させることが好ましい。これにより、液体クロマトグラフィーによる分析の結果として得られるクロマトグラムにおいて、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをより明確に分離することができる。 Moreover, as a pattern of the step elution method, the concentration of the mobile phase B is from 5% by volume to 9% of the total volume of the mobile phase A and the mobile phase B from the beginning of the analysis for 1 minute to 2 minutes. It is preferable to pass through the column so as to be at most%. Then, the concentration of the liquid B is immediately raised so that the concentration of the mobile phase B becomes 90% by volume or more and 98% by volume or less with respect to the total volume of the mobile phase A and the mobile phase B, To pass through. Thereby, in the chromatogram obtained as a result of the analysis by liquid chromatography, the peak of the procyanidins monomer and the peak of the dimer or higher polymer can be more clearly separated.
また、液体クロマトグラフィーを用いて分離されたプロシアニジン類は、蛍光検出器の波長を励起波長２３０ｍｍ及び蛍光波長３２１ｍｍ、又は、励起波長２７６ｎｍ及び蛍光波長３１６ｎｍに設定することで検出することができる。 Further, procyanidins separated using liquid chromatography can be detected by setting the wavelength of the fluorescence detector to an excitation wavelength of 230 mm and a fluorescence wavelength of 321 mm, or an excitation wavelength of 276 nm and a fluorescence wavelength of 316 nm.
また、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体の濃度を定量することができる。 In addition, the concentration of the dimer or higher dimer of procyanidins in the sample can be quantified using the method for analyzing procyanidins of the present embodiment.
定量方法としては、まず、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて、プロシアニジン類を含む試料、及び、既知の濃度のプロシアニジン類の標準液を分析する。次いで、得られたクロマトグラムから、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体のピーク、及び、既知の濃度のプロシアニジン類のピークの面積をそれぞれ算出する。次いで、以下の式（Ａ）を用いて、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体の濃度を算出することができる。 First, using the method for analyzing procyanidins of this embodiment, a sample containing procyanidins and a standard solution of procyanidins of known concentration are analyzed. Then, from the obtained chromatogram, the area of the polymer peak of dimer or more of procyanidins in the sample and the peak of procyanidins of known concentration are calculated respectively. Then, the concentration of the dimer or higher polymer of procyanidins in the sample can be calculated using the following formula (A).
ＣＥＸ＝ＣＳＴＤ／ＡＥＸ×ＡＳＴＤ ・・・（Ａ） C EX = C STD / A EX × A STD (A)
上記式（Ａ）中の各成分は、以下に示すとおりである。
ＣＥＸ…試料中のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＣＳＴＤ…試料のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
ＡＥＸ…標準液のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＡＳＴＤ…標準液のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
Each component in the said Formula (A) is as showing below.
C EX ... concentration of procyanidins in the sample [μg / L]
C STD ... Peak area of procyanidins calculated from the chromatogram of the sample A EX ... Concentration of procyanidins in the standard solution [μg / L]
A STD ... Peak area of procyanidins calculated from chromatogram of standard solution
≪プロシアニジン類の分析システム≫
本発明のプロシアニジン類の分析システムは、以下の構成を備える。
固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフ；
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液；
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液；
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部。
«Prusocyanidins analysis system»
The analysis system for procyanidins of the present invention has the following configuration.
High performance liquid chromatograph with normal phase column packed with stationary phase;
Mobile phase A consisting essentially of polar aprotic solvent;
Mobile phase B consisting essentially of polar protic solvent;
A control unit that controls a volume ratio of the mobile phase A liquid and the mobile phase B liquid which are fed to the normal phase column.
本実施形態のプロシアニジン類の分析システムによれば、従来では１試料あたりの分析時間が６０分間程度かかっていたの対し、１０分間程度の短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。 According to the analysis system for procyanidins of the present embodiment, while analysis time per sample conventionally took about 60 minutes, procyanidins can be easily analyzed in a short time of about 10 minutes.
図１は、本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの一例を示す概略構成図である。本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの各構成について、図１を参照しながら以下に詳細を説明する。 FIG. 1 is a schematic configuration view showing an example of an analysis system of procyanidins of this embodiment. Each configuration of the analysis system of procyanidins of the present embodiment will be described in detail below with reference to FIG.
図１に示すプロシアニジン類の分析システム１００は、高速液体クロマトグラフ１０と制御部２０とを備える。高速液体クロマトグラフ１０は、移動相Ａ液１が貯蔵された移動相Ａ液貯槽２と、移動相Ｂ液３が貯蔵された移動相Ｂ液貯槽４と、移動相Ａ液１及び移動相Ｂ液３をカラムに送液するためのポンプ５と、サンプル注入装置６と、順相カラム７と、検出器８と、を有する。
An
移動相Ａ液及び移動相Ｂ液としては、上述のプロシアニジン類の分析方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、Ａ液中の極性非プロトン溶媒は９８容量％以上のアセトニトリルであることが特に好ましく、Ｂ液中の極性プロトン溶媒は９５容量％以上のメタノールであることが特に好ましい。 Examples of mobile phase A and mobile phase B include the same ones as exemplified in the above-described method for analyzing procyanidins. Among them, the polar aprotic solvent in solution A is particularly preferably 98% by volume or more of acetonitrile, and the polar proton solvent in solution B is particularly preferably 95% by volume or more of methanol.
順相カラム７には、固定相が充填されている。固定相としては、上述のプロシアニジン類の分析方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、ジオール相であることが好ましい。ジオール相が充填されたカラムとしては、例えば、Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ １００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ３００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等が挙げられる。
The normal phase column 7 is packed with a stationary phase. As a stationary phase, the thing similar to what was illustrated in the analysis method of the above-mentioned procyanidins is mentioned. Among them, the diol phase is preferred. Examples of columns filled with a diol phase include Inertial Diol (inner diameter 4.6 mm ×
また、ポンプ５は、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっている。制御部２０は、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように、ポンプを制御してカラムに移動相を送液することが好ましい。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、ポンプを制御して、カラムに即座にＢ液の濃度を上昇させた移動相を送液することが好ましい。これにより、液体クロマトグラフによる分析の結果として得られるクロマトグラムにおいて、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをより明確に分離することができる。
In addition, the
また、図示していないが、試料注入装置６も、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。これにより、試料注入のタイミングを制御することができ、試料注入と同時にポンプ５の制御によって段階溶出法による分析を開始することができる。
Although not shown, the
検出器８は、プロシアニジン類を検出されたためのものである。検出器８としては、蛍光検出器であればよく、例えば、ＲＦ−２０ＡＸＳ（株式会社島津製作所製）等が挙げられ、これに限定されない。 The detector 8 is for detecting procyanidins. The detector 8 may be a fluorescence detector, and examples thereof include RF-20AXS (manufactured by Shimadzu Corporation) and the like, and the present invention is not limited thereto.
また、図示していないが、検出器８も、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。これにより、検出器８からの検出結果が制御部２０に伝達されて、コンピュータ画面上にクロマトグラムを作成することができる。さらに、作成されたクロマトグラムを用いて、上記式（Ａ）により、試料中のプロシアニジン類の濃度を自動で算出することができる。
Although not illustrated, the detector 8 may also be electrically connected to a computer as the
また、高速液体クロマトグラフ１０は、図１に示すように廃液瓶９及び記録計１１を有してもよい。廃液瓶９は、検出器８においてプロシアニジン類が検出された後の試料を排出するためのものである。また、記録計１１は、検出器８において検出されたクロマトグラムを記録するためのものである。
The high
本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの使用方法は、以下に示すとおりである。まず、高速液体クロマトグラフ１０の移動相Ａ液貯槽２に移動相Ａ液１を、移動相Ｂ液貯槽４に移動相Ｂ液３を充填する。次いで、コンピュータ６は、キーボードやマウスからの入力（送液速度、送液量、初期での移動相組成及び送液時間の入力）に基づき、ポンプ５を始動させるための指令を発する。次いで、ポンプ５の始動により、移動相を送液してライン中を移動相で置換する。次いで、カラムオーブン温度を３０℃以上３５℃以下程度に設定し、安定化させる。次いで、検出器８の波長を励起波長２３０ｍｍ及び蛍光波長３２１ｍｍ、又は、励起波長２７６ｎｍ及び蛍光波長３１６ｎｍに設定し、平衡化する。次いで、コンピュータ６に段階溶出パターン（移動相の組成及び送液時間等）を入力してポンプ５に指令を発し、さらに、試料注入装置６から、プロシアニジン類を含む試料を１μＬ以上１０μＬ以下程度注入し、試料中のプロシアニジン類の分離及び検出を開始する。具体的には、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように、ポンプを制御してカラムに移動相を送液する。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、ポンプを制御して、カラムに即座にＢ液の濃度を上昇させた移動相を送液する。これにより、検出器８において、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとが検出される。この検出結果は記録計１１に伝達されて、記録計１１を用いて、検出されたプロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをクロマトグラムとして記録することができる。
The usage method of the analysis system of procyanidins of this embodiment is as follows. First, the mobile phase A liquid 1 is filled in the mobile phase A
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］段階溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
１．試料の調製
試料としてリンゴの抽出液を調製した。まず、凍結乾燥したリンゴをワーリングブレンダーを用いて粉末化した。次いで、粉末を１．０ｇ遠心沈殿管に量り取り、抽出溶媒（アセトン：水：酢酸＝７０：２９．５：０．５）９ｍＬを加えた。次いで、高速攪拌機を用いて１０分間撹拌した。次いで、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、１０℃、１５分間）した。次いで、遠心沈殿管を傾けずに垂直に保ったまま、ディスポーザブルスポイトを用いて、沈殿を乱さないように注意しながら、固形部以外の上清をフラスコに移した。次いで、試料残渣が残った遠心沈殿管に抽出溶媒（アセトン：水：酢酸＝７０：２９．５：０．５）８ｍＬを加えて、撹拌、遠心分離及び上清回収の抽出操作を２回繰り返した。次いで、得られた抽出液に抽出溶媒を加えて、２５ｍＬに定容した。次いで、転倒混和し、均一な溶液としてリンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
Example 1 Separation and detection of procyanidins by normal phase high performance liquid chromatography using step elution method Sample Preparation An apple extract was prepared as a sample. First, freeze-dried apples were powdered using a Waring blender. Next, the powder was weighed into a 1.0 g centrifugal precipitation tube, and 9 mL of an extraction solvent (acetone: water: acetic acid = 70: 29.5: 0.5) was added. It was then stirred for 10 minutes using a high speed stirrer. Then, it was centrifuged (1,500 rpm, 10 ° C., 15 minutes). Next, while keeping the centrifugal precipitation tube vertical without tilting, using a disposable dropper, the supernatant other than the solid portion was transferred to the flask, taking care not to disturb the precipitate. Next, 8 mL of extraction solvent (acetone: water: acetic acid = 70: 29.5: 0.5) is added to the centrifugal precipitation tube in which the sample residue remains, and the extraction operation of stirring, centrifugation and supernatant collection is repeated twice. The Then, the extraction solvent was added to the obtained extract, and the volume was adjusted to 25 mL. Then, it was mixed by inversion and a sample containing procyanidins derived from apple was obtained as a homogeneous solution.
２．段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、以下に示す測定条件及び段階溶出パターン（表１）にて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図１に示す。
2. Separation and detection of procyanidins by high performance liquid chromatography using step elution method Next, using the sample obtained in “1.”, high speed liquid under the measurement conditions and step elution pattern (Table 1) shown below Separation and detection were performed using chromatography. The obtained chromatogram is shown in FIG.
（測定条件）
高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製
検出器：蛍光検出器、ＲＦ−２０ＡＸＳ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製
カラム温度：３５℃
移動相：（Ａ液）アセトニトリル及び酢酸の混合溶液（アセトニトリル：酢酸＝９８：２）
（Ｂ液）メタノール、水及び酢酸の混合溶液（メタノール：水：酢酸＝９５：３：２）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：２３０ｎｍ
蛍光波長：３２１ｎｍ
注入量：５μＬ
(Measurement condition)
High-performance liquid chromatograph: Prominence, Shimadzu Corporation detector: fluorescence detector, RF-20AXS, Shimadzu Corporation column: Inertsil WP300 Diol (inner diameter 4.6 mm ×
Mobile phase: (Liquid A) mixed solution of acetonitrile and acetic acid (acetonitrile: acetic acid = 98: 2)
(Liquid B) Mixed solution of methanol, water and acetic acid (methanol: water: acetic acid = 95: 3: 2)
Flow rate: 1.0 mL / min
Excitation wavelength: 230 nm
Fluorescence wavelength: 321 nm
Injection volume: 5 μL
また、２量体の標準液（プロシアニジンＢ２標準品、和光純薬工業社製、ＡＢ−０００１６２３１−００５）５μＬについても同様に段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによる分離及び検出を行った。以下に示す式（Ａ）を用いて、試料中のプロシアニジン類の濃度（ＣＥＸ）を算出した。結果は、５８．１μｇ／Ｌであった。 Moreover, the separation and detection by high performance liquid chromatography using the step elution method was similarly performed on 5 μL of a dimer standard solution (Prusenidin B2 standard product, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., AB-00016231-005). The concentration (C EX ) of procyanidins in the sample was calculated using Formula (A) shown below. The result was 58.1 μg / L.
ＣＥＸ＝ＣＳＴＤ／ＡＥＸ×ＡＳＴＤ ・・・（Ａ） C EX = C STD / A EX × A STD (A)
上記式（Ａ）中の各成分は、以下に示すとおりである。
ＣＥＸ…試料中のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＣＳＴＤ…試料のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
ＡＥＸ…標準液のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＡＳＴＤ…標準液のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
Each component in the said Formula (A) is as showing below.
C EX ... concentration of procyanidins in the sample [μg / L]
C STD ... Peak area of procyanidins calculated from the chromatogram of the sample A EX ... Concentration of procyanidins in the standard solution [μg / L]
A STD ... Peak area of procyanidins calculated from chromatogram of standard solution
［比較例１］勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
Comparative Example 1 Separation and detection of procyanidins by normal phase high performance liquid chromatography using gradient elution method Preparation of Samples Using the same method as in "1." of Example 1, a sample containing procyanidins derived from apple was obtained.
２．勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、以下に示す測定条件及び段階溶出パターン（表２）にて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図２に示す。
2. Separation and detection of procyanidins by normal phase high performance liquid chromatography using gradient elution method Next, using the sample obtained in “1.”, under the measurement conditions and step elution patterns (Table 2) shown below Separation and detection were performed using high performance liquid chromatography. The obtained chromatogram is shown in FIG.
（測定条件）
高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製
検出器：蛍光検出器、ＲＦ−２０ＡＸＳ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＷＰ３００ Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）、ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製
カラム温度：３５℃
移動相：（Ａ液）アセトニトリル及び酢酸の混合溶液（アセトニトリル：酢酸＝９８：２）
（Ｂ液）メタノール、水及び酢酸の混合溶液（メタノール：水：酢酸＝９５：３：２）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：２３０ｎｍ
蛍光波長：３２１ｎｍ
注入量：５μＬ
(Measurement condition)
High-performance liquid chromatograph: Prominence, Shimadzu Corporation detector: fluorescence detector, RF-20AXS, Shimadzu Corporation column: Inertsil WP300 Diol (inner diameter 4.6 mm ×
Mobile phase: (Liquid A) mixed solution of acetonitrile and acetic acid (acetonitrile: acetic acid = 98: 2)
(Liquid B) Mixed solution of methanol, water and acetic acid (methanol: water: acetic acid = 95: 3: 2)
Flow rate: 1.0 mL / min
Excitation wavelength: 230 nm
Fluorescence wavelength: 321 nm
Injection volume: 5 μL
［実施例１及び比較例１の考察］
図１から、段階溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーでは、単量体のピークが分析開始から５分程度に見られ、２量体以上のプロシアニジン類のピークが８分程度に見られ、１０分以内という短時間で分析が終了した。
[Consideration of Example 1 and Comparative Example 1]
From FIG. 1, in the normal phase high performance liquid chromatography using the step elution method, the peak of the monomer is observed about 5 minutes from the start of the analysis, and the peak of procyanidins having a dimer or more is observed about 8 minutes. The analysis was completed in a short time of less than 10 minutes.
一方、図２から、勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーでは、単量体、２量体〜８量体まで重合度に基づいたピークが見られたが、分析完了まで６０分程度と長時間かかった。 On the other hand, according to FIG. 2, in the normal phase high performance liquid chromatography using the gradient elution method, a peak based on the degree of polymerization was observed from monomer to dimer to octamer, but it takes about 60 minutes to complete the analysis And it took a long time.
以上のことから、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、短時間で容易にプロシアニジン類を分析できることが明らかとなった。また、２量体以上のプロシアニジン類の合計濃度について、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、容易に算出できることが明らかとなった。 From the above, it has become clear that, according to the method of analyzing procyanidins of the present embodiment, procyanidins can be easily analyzed in a short time. Moreover, it became clear that it can calculate easily about the total density | concentration of procyanidins more than a dimer according to the analysis method of procyanidins of this embodiment.
［実施例２］順相高速液体クロマトグラフィーにおける段階溶出パターンの検討
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
[Example 2] Examination of step elution pattern in normal phase high performance liquid chromatography Preparation of Samples Using the same method as in "1." of Example 1, a sample containing procyanidins derived from apple was obtained.
２．順相高速液体クロマトグラフィーにおける段階溶出パターンの検討
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、上記実施例１に示す測定条件及び表３に示す段階溶出パターンにて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。結果を表３に示す。
2. Examination of step elution pattern in normal phase high performance liquid chromatography Next, using the sample obtained in “1.”, high performance liquid chromatography under the measurement conditions shown in Example 1 and the step elution pattern shown in Table 3 The separation and detection were performed using The results are shown in Table 3.
表３から、開始から１分間以上１．５分間以下に、移動相Ｂ液の濃度が移動相Ａ液及び移動相Ｂ液の合計容量に対して、７容量％程度となるように溶媒組成を調整することで、単量体と２量体以上の重合体とのピークを分離できることが明らかとなった。 From Table 3, the solvent composition is set so that the concentration of mobile phase B is about 7% by volume with respect to the total volume of mobile phase A and mobile phase B in the range from 1 minute to 1.5 minutes from the start. It became clear that the peak of a monomer and a polymer more than a dimer could be isolate | separated by adjustment.
［実施例３］
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。また、プロシアニジン類の単量体、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体及び７量体について市販品又は化学合成品を準備し、抽出溶媒に溶解した。
[Example 3]
1. Preparation of Samples Using the same method as in "1." of Example 1, a sample containing procyanidins derived from apple was obtained. In addition, commercially available products or chemically synthesized products were prepared for monomers, dimers, trimers, tetramers, pentamers, hexamers and trimers of procyanidins, which were dissolved in an extraction solvent.
２．段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、上記実施例１に示す測定条件及び上記表１に示す段階溶出パターンにて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。なお、図４において、Ａ：単量体、Ｂ：２量体、Ｃ：３量体、Ｄ：４量体、Ｅ：５量体、Ｆ：６量体、Ｇ：７量体、及び、Ｈ：リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料の結果である。
2. Separation and detection of procyanidins by high performance liquid chromatography using step elution method Next, using the sample obtained in “1.”, measurement conditions shown in Example 1 above and step elution patterns shown in Table 1 above The separation and detection were performed using high performance liquid chromatography. The obtained chromatogram is shown in FIG. In FIG. 4, A: monomer, B: dimer, C: trimer, D: tetramer, E: pentamer, F: hexamer, G: 7-mer, and H: It is a result of the sample containing procyanidins derived from apple.
図４から、２量体以上の重合体について、同じ位置にピークが出現することが確かめられた。 It was confirmed from FIG. 4 that a peak appears at the same position for the dimer and higher polymers.
本実施形態のプロシアニジン類の分析方法及び分析システムによれば、短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。 According to the method and system for analyzing procyanidins of this embodiment, procyanidins can be easily analyzed in a short time.
１…移動相Ａ液、２…移動相Ａ液貯槽、３…移動相Ｂ液、４…移動相Ｂ液貯槽、５…ポンプ、６…サンプル注入装置、７…順相カラム、８…検出器、９…廃液瓶、１０…高速液体クロマトグラフ、１１…記録計、２０…制御部（コンピュータ）、１００…プロシアニジン類の分析システム。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Mobile phase A
Claims (6)
前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出しており、
分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように前記２成分移動相をカラムに通過させるプロシアニジン類の分析方法。 Equipped with an analysis step of separating and detecting a sample containing procyanidins using normal phase high performance liquid chromatography,
In the analysis step, a sample containing the procyanidins is introduced into a liquid chromatography column packed with a stationary phase, and it consists essentially of a mobile phase A consisting essentially of a polar aprotic solvent and a polar protic solvent The procyanidins are separated and detected by a step elution method using a two-component mobile phase containing a mobile phase B solution.
The two components so that the concentration of the mobile phase B liquid is 5% by volume to 9% by volume with respect to the total volume of the mobile phase A liquid and the mobile phase B liquid from 1 minute to 2 minutes from the start of analysis. Analysis method of procyanidins which make a mobile phase pass to a column.
前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項１に記載のプロシアニジン類の分析方法。 The polar aprotic solvent is one or more selected from the group consisting of acetonitrile, acetone, cyclohexanone, methyl ethyl ketone, methyl tert-butyl ether, diethyl ether, dimethyl ether, methyl acetate, ethyl acetate and nitromethane,
The polar protic solvent medium is methanol, ethanol, n- propanol, isopropanol, procyanidins analysis method according to claim 1 is at least one selected from the group consisting of n- butanol and isobutanol.
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、
を備え、
前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御するプロシアニジン類の分析システム。 High performance liquid chromatograph having a normal phase column packed with stationary phase;
Mobile phase A substantially consisting of a polar aprotic solvent;
A mobile phase B liquid substantially consisting of a polar protic solvent,
A control unit that controls a volume ratio of the mobile phase A liquid and the mobile phase B liquid to be fed to the normal phase column;
Equipped with
In the control unit, the concentration of the mobile phase B liquid is 5% by volume to 9% by volume with respect to the total volume of the mobile phase A liquid and the mobile phase B liquid for 1 minute to 2 minutes from the start of analysis. Analysis system of procyanidins to control.
前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項４に記載のプロシアニジン類の分析システム。 The polar aprotic solvent is one or more selected from the group consisting of acetonitrile, acetone, cyclohexanone, methyl ethyl ketone, methyl tert-butyl ether, diethyl ether, dimethyl ether, methyl acetate, ethyl acetate and nitromethane,
The polar protic solvent medium is methanol, ethanol, n- propanol, isopropanol, procyanidins analysis system according to claim 4, wherein at least one selected from the group consisting of n- butanol and isobutanol.
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