JP6501349B2 - 微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤 - Google Patents
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Description
1. 微粒子状物質(Particulate Matter, PM; PM2.5)による鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊を抑制し得る被検物質を選択することにより、微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤をスクリーニングする方法。
2. 以下の工程1)〜3)を含む、アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物を用いた、前項1に記載のスクリーニング方法:
1)微粒子状物質を投与し、被検物質を投与していないアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
2)微粒子状物質および被検物質を投与したアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
3)工程1)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物と比較して、工程2)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物において鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊が抑制された場合に、当該被検物質を微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤として選択する工程。
3. 工程1)および工程2)において、微粒子状物質の投与の後、ならびに、微粒子状物質および被検物質の投与の後に、アレルゲンが投与される、前項2に記載のスクリーニング方法。
4. 工程1)および工程2)において、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度が、アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物のくしゃみ回数により測定される、前項3に記載のスクリーニング方法。
5. 工程2)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物が、微粒子状物質と被検物質とが同時に投与されたか、または、被検物質が微粒子状物質よりも前に投与されたものである、前項2〜4のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
6. アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物が、アレルゲンとアジュバントとを投与し、その後アレルゲンを投与することによりアレルゲン感作した非ヒト動物であり、アレルゲン感作した後にアレルゲンを投与することにより鼻炎症状を呈する非ヒト動物である、前項2〜5のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
7. 以下の工程i)〜iii)を含む、培養鼻粘膜上皮細胞を用いた前項1に記載のスクリーニング方法:
i)微粒子状物質を接触させ、被検物質を接触させていない培養鼻粘膜上皮細胞について、タイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
ii)微粒子状物質および被検物質を接触させた培養鼻粘膜上皮細胞について、タイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
iii)工程i)の培養鼻粘膜上皮細胞と比較して、工程ii)の培養鼻粘膜上皮細胞において、タイトジャンクションの破壊が抑制された場合に、被検物質を微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤として選択する工程。
8. 工程i)および工程ii)において、培養鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度が、以下のいずれかの手段により測定される、前項7に記載のスクリーニング方法:
a)培養鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションを構成するタンパク質の免疫染色;
b)培養鼻粘膜上皮細胞の細胞膜電気抵抗の測定;
c)培養鼻粘膜上皮細胞の細胞膜透過性の測定。
9. 有効成分として、微粒子状物質による鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊を抑制する作用を有する抗酸化剤を含む、微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤。
10. 投与対象が微粒子状物質に曝露される前または同時に、前記予防又は抑制剤が投与される、前項9に記載の微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤。
11. 前記抗酸化剤が、N-アセチルシステインである、前項9または10に記載の微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤。
1)PM2.5を投与し、被検物質を投与していないアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程。
2)PM2.5および被検物質を投与したアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程。
3)工程1)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物と比較して、工程2)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物において鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊が抑制された場合に、当該被検物質をPM2.5によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤として選択する工程。
i)PM2.5を接触させ、被検物質を接触させていない培養鼻粘膜上皮細胞について、タイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程。
ii)PM2.5および被検物質を接触させた培養鼻粘膜上皮細胞について、タイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程。
iii)工程i)の培養鼻粘膜上皮細胞と比較して、工程ii)の培養鼻粘膜上皮細胞において、タイトジャンクションの破壊が抑制された場合に、被検物質をPM2.5によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤として選択する工程。
特許文献1(特開2013-070653号公報)を参考にして、アレルギー性鼻炎モデル動物を作製した(図1)。具体的には、6〜8週齢のBalb/cマウス(オリエンタル酵母工業株式会社)にブタクサ花粉(0.1mg/200μL/回)と水酸化アルミニウム(1mg/200μL/回)(RW+Alum)をday0に、ブタクサ花粉(0.1mg/200μL/回)のみ(RW)をday7に腹腔内投与して、ブタクサ花粉に感作したアレルギー性鼻炎モデルマウスを作製した。
以下の各実施例では種々の条件下で、アレルギー性鼻炎モデルマウスに、ブタクサ花粉およびPM2.5を点鼻投与し、最終点鼻後10分間のくしゃみ回数(早期相)と、24時間後の鼻粘膜の組織染色、血清IgE値、頸部リンパ節細胞からのTh2サイトカイン産生(遅発相)を検討した。また以下の各実施例おいては、各群3〜5匹のマウスを使用し、2〜3回繰り返して実験を行った。結果は、平均値±SEMで示しており、統計学的有意差はt検定(two tailed Student's t-test)により確認した。
PM2.5として、国立環境衛生研究所にて、ディーゼルエンジンを燃焼し、排気ガスから精製調節した直径0.4μmのDEPを用いた。かかるDEPは、8-Lディーゼルエンジン(Jo8C, 日野自動車)をDEPの発生源として使用し、エンジンを一定の状態(速度:2,000 rpm、eエンジントルク:0 Nm、ディーゼル燃料:JIS No.2)で、5時間作動させて、回収したものである。DEPを0.05% Tween 80に懸濁して、実験に使用した。
参考例1にて花粉に感作した花粉特異的アレルギー性鼻炎モデルマウスに、ブタクサ花粉とPM2.5とを、day14〜day17の1〜4日間(1回/day)同時に点鼻した(RW+PM2.5)。またコントロールとして、ブタクサ花粉とPM2.5に代えて、Vehicle(0.05%Tween80をPBSに混合した溶液)を20μL/回、ブタクサ花粉単独(RW)、またはPM2.5単独(PM2.5)を点鼻した(図2a、図3a)。その後、鼻炎症状の早期相と遅発相のパラメーターを測定した。
なお、環境省の定めたPM2.5の環境基準(35μg/m3)、および、成人が1日の呼吸で体内へ取り込む空気量(14m3)を考慮し、マウスへのPM2.5点鼻量を10μg/20μL/回とした。またday14以後のマウスへのブタクサ花粉点鼻量は、鼻炎症状を発症できない通常の1/10量の0.1mg/20μL/回とした。
その結果を図2bに示す。図2bの横軸には、最終点鼻の日を示す。ブタクサ花粉単独点鼻ではくしゃみ回数が経時的に増加しなかったのに対し、ブタクサ花粉とPM2.5を4日間同時点鼻すると、経時的にくしゃみ回数は著明に上昇した(図2b)。
鼻粘膜組織を、4% (w/v)ホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋切片(4μm厚)を、脱パラフィン化し、ヘマトキシリン・エオジン染色または過ヨウ素酸シッフ染色を行い、好酸球数を確認した。
マウスから採取した頸部リンパ節細胞(2×105 cells/well)と、野生型マウス由来の抗原提示細胞(T細胞を除いたBALB/c脾臓細胞)(1×105cells/well)とを、96穴プレートにて5日間共培養した。RPMI 1640(10% FBS、2-ME (50 μM)、L-グルタミン(2 mM)、ペニリシン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)添加)を培地として使用し、IL-2およびブタクサ花粉抽出物を添加して培養した。IL-2による刺激後、培地上清中のIL-4、IL-5、IL-13量を、ELISA kit(R&D Systems)により測定した。
4日間連続してブタクサ花粉とPM2.5を同時点鼻した場合の結果を示す(図3b)。鼻粘膜好酸球数、頸部リンパ節細胞からのTh2サイトカイン産生は、ブタクサ花粉とPM2.5の同時点鼻の場合と、ブタクサ花粉単独点鼻の場合とで差が認められなかった。よってPM2.5は、Th2免疫応答には影響しないと考えられた。
参考例1にて花粉に感作したアレルギー性鼻炎モデルマウスに、PM2.5をday9〜day12の4日間単独点鼻した後、ブタクサ花粉をday14〜day17の1〜4日間単独点鼻した以外は、実施例1と同様にしてマウスにブタクサ花粉とPM2.5を点鼻した(図4a)。コントロールとして、PM2.5に代えてVehicleを点鼻し、ブタクサ花粉に代えてPBSを点鼻した。またVehicleをday9〜day12の4日間単独点鼻した後、day14〜day17の1〜4日間PM2.5およびブタクサ花粉の同時点鼻を行った。鼻炎症状の早期相のパラメーターとして、最終点鼻後10分間のくしゃみ回数を確認した。
ヒト鼻粘膜上皮細胞株(RPMI2650)(American Type Culture Collectionから購入)を用いて、鼻粘膜上皮細胞のバリア機能に対するPM2.5の影響を、以下の手段により確認した(図5)。PM2.5は、実施例1と同様のものを用いた。
ヒト鼻粘膜上皮細胞株はイーグル最小必須培地(DS Pharmingen)に、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml)、L-グルタミン(2 mmol/l)を添加した培地により培養した。細胞(5×104 cells/cm2)を、24ウェルプレートに設置したトランスウェル内の0.4μm孔フィルター(Millipore)上に播種した。培地は、2〜3日毎に交換した。播種後、12〜14日後に、細胞の単層が得られた。
ヒト鼻粘膜上皮細胞株にPM2.5を添加して24時間培養後、細胞間接着構造であるタイトジャンクション(tight junction)を構成するタンパク質であるzonula occludens-1(ZO-1)を、抗マウスZO-1ウサギIgG抗体とAlexa 488抗ウサギIgG(Invitrogen)を用いて免疫染色し、ZO-1の発現を確認した。まず、細胞を4%パラホルムアルデヒドにより10分間固定し、0.05%Triton X-100で15分間浸透処理を行った。2%スキムミルクで30分間ブロッキングを行った後、細胞を抗マウスZO-1抗体と反応させ、その後2次抗体により染色した。
また、トランスウェルのフィルター上で培養したヒト鼻粘膜上皮細胞株に、PM2.5(50μg/ml)を添加し、24時間後の経上皮電気抵抗(細胞膜の電気抵抗)と、FITC標識したデキストラン(2mg/ml)の上皮細胞透過性(細胞膜の透過性)を測定した。経上皮電気抵抗はMillicell ERS-2 epithelial voltohmmeter (Millipore)を用いて測定し、上皮細胞透過性は通過したFITC標識したデキストランをanalyzed by a multi-mode microplate reader (Infinite M200 Pro, TECAN)を用いて測定した。
これらの結果から、PM2.5がタイトジャンクションを破壊し、鼻粘膜上皮細胞のバリア機能を損なわせることがわかった。
実施例2と同様にして、PM2.5を4日間アレルギー性鼻炎モデルマウスに点鼻した後、マウスの鼻粘膜を採取し、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションを構成するZO-1の発現を確認した。ZO-1の発現の確認は、実施例3と同様にして行った。
マウスから採取した鼻粘膜組織を、4% (w/v)ホルムアルデヒドに固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋切片(4μm厚)を脱パラフィン化し、クエン酸緩衝液により抗原を賦活化させた。 実施例3と同様にして、ブロッキング、抗体による染色をおこなった。切片を、Prolong Antifade Gold with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(Invitrogen)を用いて染色し、顕微鏡(Zeiss LSM 510, Carl Zeiss)を用いて観察および解析を行った。
実施例2と同様にして、花粉感作したアレルギー性鼻炎モデルマウスにPM2.5をday8、day10、day12、day14のいずれか1回点鼻し、その後ブタクサ花粉をday16に点鼻した(図8a)。その後、鼻炎症状の早期相のパラメーターとして最終点鼻後10分間のくしゃみ回数を測定し、遅発相のパラメーターとして、実施例3と同様にして鼻粘膜上皮細胞のZO-1の発現を免疫染色により確認した。
実施例2と同様にして、花粉感作したアレルギー性鼻炎モデルマウスに、PM2.5(10μg/20μL)と抗酸化剤であるN-アセチルシステイン(Sigma-Aldrich Japan)(10mmol)(NAC)を、day14に同時点鼻し、2日後のday18にブタクサ花粉を点鼻した(図9a)。その後、鼻炎症状の早期相のパラメーターとして最終点鼻後10分間のくしゃみ回数を測定し、遅発相のパラメーターとして、鼻粘膜上皮細胞のZO-1の発現を免疫染色により確認した。
Claims (4)
- 微粒子状物質による鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊を抑制し得る被検物質を選択することにより、微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤をスクリーニングする方法であって、
以下の工程1)〜3)を含む、アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物を用いた、スクリーニング方法:
1)微粒子状物質を投与し、その後アレルゲンが投与された、被検物質を投与していないアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
2)微粒子状物質および被検物質を投与し、その後アレルゲンが投与された、アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物について、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度を測定する工程;
3)工程1)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物と比較して、工程2)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物において鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊が抑制された場合に、当該被検物質を微粒子状物質によるアレルギー性鼻炎増悪の予防又は抑制剤として選択する工程。 - 工程1)および工程2)において、鼻粘膜上皮細胞のタイトジャンクションの破壊の程度が、アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物のくしゃみ回数により測定される、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 工程2)のアレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物が、微粒子状物質と被検物質とが同時に投与されたか、または、被検物質が微粒子状物質よりも前に投与されたものである、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- アレルギー性鼻炎非ヒトモデル動物が、アレルゲンとアジュバントとを投与し、その後アレルゲンを投与することによりアレルゲン感作した非ヒト動物であり、アレルゲン感作した後にアレルゲンを投与することにより鼻炎症状を呈する非ヒト動物である、請求項1〜3のいずれか1に記載のスクリーニング方法。
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