JP6478375B2 - High expression promoter gene - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、高発現プロモーター遺伝子に関する。 The present invention relates to a high expression promoter gene.
現在、化石資源枯渇、地球温暖化の促進などの問題から、持続可能な社会の構築を目指し、化石資源由来の工業原料やエネルギーを再生可能資源由来へとシフトする試みが行われている。このような試みのうちの一つとして、再生可能資源由来の原料として農作物廃棄物やおがくず、廃紙、木屑などのリグノセルロース系バイオマスの利用が挙げられる。 At present, attempts are being made to shift fossil resource-derived industrial raw materials and energy to renewable resources with the aim of building a sustainable society due to problems such as fossil resource depletion and the promotion of global warming. One of such attempts is the use of lignocellulosic biomass such as crop waste, sawdust, waste paper, and wood waste as raw materials derived from renewable resources.
リグノセルロース系バイオマスを有用物質に変換するプロセスとして、合成ガスプラットフォームがある。これは国内の生物廃棄物の約８割を占める糖化が難しいバイオマスを微生物によって発酵して乳酸、エタノールなどの有用物質に変換するプロセスである。 There is a syngas platform as a process for converting lignocellulosic biomass into useful substances. This is a process in which about 80% of domestic biowaste is difficult to saccharify and is fermented by microorganisms to convert it into useful substances such as lactic acid and ethanol.
このような状況のなか、合成ガス資化性好熱性細菌であるモーレラ（Moorella）属細菌が注目されてきた（特許文献１）。これまで、モーレラ（Moorella）属細菌を用いた乳酸またはエタノール生産能の向上を目指し、遺伝子組換え技術の開発が行われてきた結果、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）を破壊した、５−フルオロオロト酸耐性を示すウラシル要求性変異株（ｄｐｙｒＦ株）が作製され（特許文献２、３）、これを宿主として、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子導入株が作製されている（特許文献４、５）。なお、ｄｐｙｒＦ株（ｐｙｒＦ破壊株）は、受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−１０５７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。 Under such circumstances, a bacterium belonging to the genus Moorella, which is a thermophilic bacterium syngas utilization, has attracted attention (Patent Document 1). So far, as a result of the development of genetic recombination technology aimed at improving the ability to produce lactic acid or ethanol using bacteria belonging to the genus Moorella, the orotidine--Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain- A uracil-requiring mutant strain (dpyrF strain) exhibiting 5-fluoroorotic acid resistance in which the 5′-phosphate decarboxylase gene (pyrF) is disrupted was prepared (patent documents 2 and 3), and this was used as a host for thermonero. Lactate dehydrogenase gene introduced strain derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 has been produced (Patent Documents 4 and 5). The dpyrF strain (pyrF disruption strain) has been deposited with the Patent Microorganism Deposit Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number “NITE P-1057”.
しかしながら、より効率的な物質生産を行うため、合成ガス資化性好熱性細菌における外来遺伝子の高発現技術が求められている。 However, in order to carry out more efficient substance production, a high expression technology for foreign genes in syngas-utilizing thermophilic bacteria is required.
そこで、本発明は、合成ガス資化性好熱性細菌での外来遺伝子発現を強化することができる高発現プロモーターを提供することを課題とする。 Then, this invention makes it a subject to provide the high expression promoter which can strengthen the foreign gene expression in a synthesis gas utilization thermophilic bacterium.
本発明者らは上記課題を解決すべく遺伝子プロモーターに着目して鋭意検討を重ね、ｍＲＮＡ相対発現量および遺伝子産物であるタンパク質の酵素活性を合わせて検討したところ、合成ガス資化性好熱性細菌において、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（ＣＯＤＨプロモーター）を外来遺伝子に付加して宿主細菌に導入した場合に、高い翻訳量を示すことを知得し、本発明を完成させた。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made extensive studies focusing on gene promoters, and studied the relative expression level of mRNA and the enzyme activity of the protein that is the gene product. In (1), it was found that when a carbon monoxide dehydrogenase gene promoter (CODH promoter) was added to a foreign gene and introduced into a host bacterium, a high translation amount was shown, and the present invention was completed.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（２）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、連続する少なくとも５ヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（３）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、第６５番目から第９０番目までのヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含む、（１）に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（４）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号１により示される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列に含まれる、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（５）前記一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される前記外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を基準にして評価する、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。
（６）サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法。
（７）前記レポーター遺伝子の転写量および翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（８）プロモーター本来の遺伝子の転写量および前記レポーター遺伝子の翻訳産物の活性の両方を評価する、（６）に記載の方法。
（９）クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子プロモーターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法によってスクリーニングされた、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーター。
（１０）β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
（１１）β−ガラクトシダーゼ遺伝子および前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが染色体上に組み込まれた、（１０）に記載のモーレラ属細菌。
（１２）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーターが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つである、（１１）に記載のモーレラ属細菌。
（１３）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子がサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である、（１１）または（１２）に記載のモーレラ属細菌。
That is, the present invention provides the following (1) to (13).
(1) A carbon monoxide dehydrogenase gene promoter that highly expresses a foreign gene in a syngas-utilizing thermophilic bacterium.
(2) The carbon monoxide dehydrogenase according to (1), wherein the nucleotide sequence of the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter includes a nucleotide sequence represented by at least 5 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Gene promoter.
(3) The nucleotide sequence of the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter includes the nucleotide sequence represented by the 65th to 90th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Carbon monoxide dehydrogenase gene promoter.
(4) The nucleotide sequence of the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter described in any one of (1) to (3), which is included in the nucleotide sequence of the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter region represented by SEQ ID NO: 1. Carbon monoxide dehydrogenase gene promoter.
(5) The activity of a protein that is a translation product of a foreign gene expressed by the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter is expressed as a protein that is a translation product of the foreign gene expressed by a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter. The carbon monoxide dehydrogenase gene promoter according to any one of (1) to (4), which is evaluated based on the activity of.
(6) Thermoanaerobacter pseudethanolicus Method for screening a gene promoter that highly expresses a foreign gene in a synthetic gas-assimilating thermophilic bacterium using a β-galactosidase gene derived from ATCC 33223 as a reporter gene .
(7) The method according to (6), wherein both the transcription amount of the reporter gene and the activity of the translation product are evaluated.
(8) The method according to (6), wherein both the transcription amount of the promoter original gene and the activity of the translation product of the reporter gene are evaluated.
(9) The citrate synthase gene promoter, the DNA primase gene promoter, the DNA adenine methylase gene promoter and the carbon monoxide dehydrogenase gene promoter are at least one gene promoter. A gene promoter that is screened by the method according to claim 1 and highly expresses a foreign gene in a syngas-utilizing thermophilic bacterium.
(10) A Morella bacterium that expresses β-galactosidase.
(11) The bacterium belonging to the genus Morella according to (10), wherein a β-galactosidase gene and a promoter for expressing the β-galactosidase gene are integrated on a chromosome.
(12) The promoter for expressing the β-galactosidase gene is glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter, citrate synthase gene promoter, DNA primase gene promoter, DNA adenine methylase gene promoter, and carbon monoxide. The bacterium belonging to the genus Morella according to (11), which is any one selected from the group consisting of dehydrogenase gene promoters.
(13) The bacterium belonging to the genus Morella according to (11) or (12), wherein the β-galactosidase gene is a β-galactosidase gene derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 strain.
本発明によれば、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが提供される。
また、本発明によれば、合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法およびその方法によりスクリーニングされた合成ガス資化性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターが提供される。
さらに、本発明によれば、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌が提供される。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the promoter of the carbon monoxide dehydrogenase gene which highly expresses a foreign gene in a synthesis gas utilization thermophilic bacterium is provided.
Further, according to the present invention, there is provided a method for screening a gene promoter that highly expresses a foreign gene in a synthetic gas-assimilating bacterium, and a gene promoter that highly expresses a foreign gene in a synthetic gas-assimilating bacterium screened by the method. Provided.
Furthermore, according to the present invention, a Morella bacterium that expresses β-galactosidase is provided.
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターである。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The first aspect of the present invention is a carbon monoxide dehydrogenase gene promoter that highly expresses a foreign gene in a syngas-utilizing thermophilic bacterium.
合成ガスとは、水素、一酸化炭素、二酸化炭素および不可避的不純物からなるガスをいう。水素、一酸化炭素および二酸化炭素の組成比は特に限定されない。
合成ガス資化性好熱性細菌とは、上記合成ガスを唯一の炭素源として増殖が可能な好熱性細菌をいい、好熱性細菌とは、至適生育温度が４５℃以上、あるいは生育限界温度が５５℃以上の細菌をいう。合成ガス資化性好熱性細菌としては、例えば、モーレラ（Moorella）属細菌を挙げることができ、中でもモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、とりわけ、ＡＴＣＣ ３９０７３株またはそれに由来する株が、技術的な観点および命名法上の観点から扱い易いため、好ましい。
Syngas refers to a gas composed of hydrogen, carbon monoxide, carbon dioxide and unavoidable impurities. The composition ratio of hydrogen, carbon monoxide and carbon dioxide is not particularly limited.
Syngas-utilizing thermophilic bacteria refers to thermophilic bacteria that can be grown using the above-mentioned syngas as the sole carbon source. Thermophilic bacteria have an optimum growth temperature of 45 ° C. or higher, or a growth limit temperature. Bacteria at 55 ° C or higher. Examples of the syngas-utilizing thermophilic bacterium include bacteria belonging to the genus Moorella, among which Moorella thermoacetica, in particular, the ATCC 39073 strain or a strain derived therefrom is technically used. This is preferable because it is easy to handle from the viewpoints of no particular point and nomenclature.
本発明において、高発現とは、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｇ３ＰＤプロモーター）を用いて外来遺伝子を発現させた場合に比べて高いことをいう。一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ＣＯＤＨプロモーター）を用いて外来遺伝子を発現させた場合には、Ｇ３ＰＤプロモーターを用いて外来遺伝子を発現させた場合と比べて、遺伝子の翻訳産物であるタンパク質が、少なくとも１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２．０倍以上の高い比活性を示す。 In the present invention, high expression means that the activity of a protein that is a translation product of a gene is higher than when a foreign gene is expressed using a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter (G3PD promoter). Say. When a foreign gene is expressed using a carbon monoxide dehydrogenase gene promoter (CODH promoter), the protein that is a translation product of the gene is at least 1 in comparison with the case where a foreign gene is expressed using the G3PD promoter. It exhibits a high specific activity of 2 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2.0 times or more.
上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、連続する少なくとも５ヌクレオチドによって表されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。 The nucleotide sequence of the CODH promoter preferably includes a nucleotide sequence represented by at least 5 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列のうち、第６５番目のヌクレオチドから第９０番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この部分は、ＣＯＤＨプロモーターにおいて、遺伝子を発現する上で重要な部分だからである。 The nucleotide sequence of the CODH promoter preferably includes a nucleotide sequence from the 65th nucleotide to the 90th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. This is because this part is an important part in expressing the gene in the CODH promoter.
また、上記ＣＯＤＨプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号１により示されるヌクレオチド配列に含まれることが好ましい。 The nucleotide sequence of the CODH promoter is preferably contained in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
上記ＣＯＤＨプロモーターは、それによって発現される外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによって発現される前記外来遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の活性を基準にして評価することが好ましい。ｍＲＮＡ発現量だけでは、真に、外来遺伝子を高発現するものであるか否かを確定できないからである。 The CODH promoter is based on the activity of a protein that is a translation product of a foreign gene expressed thereby, and the activity of a protein that is a translation product of the foreign gene expressed by a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter. It is preferable to evaluate it. This is because it cannot be determined whether or not a foreign gene is truly highly expressed only by the mRNA expression level.
ＣＯＤＨプロモーターにより外来遺伝子を発現する合成ガス資化性好熱性細菌を作製する方法としては、例えば、特開２０１３−９０６００号公報に記載の外来遺伝子導入方法において、Ｇ３ＰＤプロモーター領域の代わりにＣＯＤＨプロモーター領域を用い、さらに、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ）の代わりに、所望の外来遺伝子を用いることができる。外来遺伝子としては、例えば、後述する実施例にも記載した、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）などが挙げられる。 As a method for producing a synthesis gas-utilizing thermophilic bacterium that expresses a foreign gene by a CODH promoter, for example, in the foreign gene introduction method described in JP2013-90600A, a CODH promoter region can be used instead of the G3PD promoter region. Furthermore, a desired foreign gene can be used in place of the lactate dehydrogenase gene (ldh) derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223. Examples of the foreign gene include the β-galactosidase gene (lacZ) of Thermoanaerobacter pseudethanolicus described in Examples described later.
本発明の第二の態様は、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（以下「ｌａｃＺ」という。）をレポーター遺伝子として用いる、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングする方法である。 The second aspect of the present invention is a synthetic gas-utilizing thermophilic using a β-galactosidase gene (hereinafter referred to as “lacZ”) derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 as a reporter gene. This is a method for screening a gene promoter that highly expresses a foreign gene in bacteria.
本発明のスクリーニング方法は、Ｇ３ＰＤプロモーターよりも遺伝子の転写量が少ないＣＯＤＨプロモーターの方が、遺伝子の翻訳産物の活性が高かったという驚くべき実験事実に基づくものである。これは、ＣＯＤＨプロモーターの配列の中にｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を特に活性化する仕組みがあるためと推察される。 The screening method of the present invention is based on the surprising experimental fact that the activity of the translation product of the gene was higher in the CODH promoter having a smaller amount of gene transcription than in the G3PD promoter. This is presumably because there is a mechanism that particularly activates translation from mRNA to protein in the sequence of the CODH promoter.
本発明のスクリーニング方法においては、レポーター遺伝子またはプロモーター本来の遺伝子、好ましくはプロモーター本体の遺伝子の転写量、およびレポーター遺伝子の翻訳産物の活性の両方を評価することが好ましい。遺伝子の転写量によって予備的なスクリーニングを行い、高発現が予想されるものについてのみ翻訳産物の活性を評価して本スクリーニングすることで、工程数を省くことができるからである。 In the screening method of the present invention, it is preferable to evaluate both the transcription amount of the reporter gene or the original gene of the promoter, preferably the gene of the promoter body, and the activity of the translation product of the reporter gene. This is because the number of steps can be reduced by conducting preliminary screening based on the amount of gene transcription, evaluating the activity of translation products only for those that are expected to be highly expressed, and performing this screening.
このスクリーニング方法は、次の（１）〜（４）の工程を含んでもよい。
（１）定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡの転写量を測定して、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子以外の候補遺伝子について、転写量が多い方から５〜１０程度の遺伝子にまで絞り込む工程
（２）合成ガス資化性好熱性細菌において、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（以下「Ｇ３ＰＤプロモーター」という。）を付加したサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「対照株」という。）およびＧ３ＰＤプロモーター以外のプロモーターを付加したｌａｃＺを染色体上に組み込んだ形質転換株（以下「試験株」という。）を準備する工程
（３）対照株および試験株においてｌａｃＺを発現させ、ＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定する工程
（４）試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性と、対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性とを比較し、試験株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性が対照株のＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性よりも高い場合に、前記試験株に組み込んだ遺伝子プロモーターを、合成ガス資化性好熱性細菌において外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターとして選択する工程
This screening method may include the following steps (1) to (4).
(1) The amount of mRNA transcription is measured using quantitative RT-PCR, and candidate genes other than the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene are narrowed down to genes of about 5 to 10 from the one with the highest transcription amount. Step (2) Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 to which a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter (hereinafter referred to as “G3PD promoter”) is added in a thermophilic bacterium syngas-utilizing thermophilic bacterium A transformant in which a β-galactosidase gene (lacZ) derived from the strain is integrated on the chromosome (hereinafter referred to as “control strain”) and a transformant in which lacZ added with a promoter other than the G3PD promoter is integrated on the chromosome (hereinafter “ Prepare a test strain.) Step (3) Step of expressing lacZ in a control strain and a test strain and measuring β-galactosidase activity of LacZ protein (4) β-galactosidase activity of LacZ protein of test strain and β-galactosidase of LacZ protein of control strain When the β-galactosidase activity of the LacZ protein of the test strain is higher than the β-galactosidase activity of the LacZ protein of the control strain, the gene promoter incorporated in the test strain is synthesized gas-utilizing thermophilic A process for selecting a gene promoter that highly expresses a foreign gene in bacteria
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされたプロモーターとしては、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを挙げることができる。 Examples of the promoter screened by the screening method of the present invention include citrate synthase gene promoter, DNA primase gene promoter, DNA adenine methylase gene promoter, and carbon monoxide dehydrogenase gene promoter.
本発明の第三の態様は、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ（Moorella）属細菌である。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３ 株のゲノム情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２）を参照しても、染色体上にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は存在していないなど、野生型のモーレラ属細菌はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持たないため、β−ガラクトシダーゼを発現させるためには、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびそれを発現するためのプロモーターを導入する必要がある。 The third aspect of the present invention is a bacterium belonging to the genus Moorella that expresses β-galactosidase. When referring to the genome information (GenBank Accession No. CP000232) of the Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain, there is no β-galactosidase gene on the chromosome. Since it does not have a β-galactosidase gene, it is necessary to introduce a β-galactosidase gene and a promoter for expressing it in order to express β-galactosidase.
β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびそれを発現するためのプロモーターは、容易に脱落しないように、プラスミド上ではなく、染色体上に組み込まれることが好ましい。 It is preferable that the β-galactosidase gene and the promoter for expressing it are integrated not on the plasmid but on the chromosome so that they are not easily lost.
前記プロモーターは、特に限定されるものではないが、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、クエン酸合成酵素遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡアデニンメチラーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つであることが好ましく、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ＤＮＡプライマーゼ遺伝子プロモーターおよび一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターからなる群から選択されるいずれか１つであることがより好ましい。これらのプロモーターにより、比較的高い発現量が得られるからである。 The promoter is not particularly limited, but glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter, citrate synthase gene promoter, DNA primase gene promoter, DNA adenine methylase gene promoter, and carbon monoxide dehydrogenase gene promoter Any one selected from the group consisting of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter, DNA primase gene promoter and carbon monoxide dehydrogenase gene promoter is preferable. More preferably, it is one. This is because a relatively high expression level can be obtained by these promoters.
上記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、特に限定されるものではないが、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株に由来するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。モーレラ属細菌で遺伝子発現させた実績があるとともに、モーレラ属細菌の培養温度でも十分な活性を有する酵素をコードしているからである。 The β-galactosidase gene is not particularly limited, but is preferably a β-galactosidase gene derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 strain. This is because there is a track record of gene expression in a bacterium belonging to the genus Morella and it encodes an enzyme having sufficient activity even at the culture temperature of the bacterium belonging to the genus Morella.
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the scope of the present invention is not limited to an Example.
以下の実施例では、合成ガス資化性好熱性細菌であるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株について、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡ相対発現量を測定し、発現量上位５位までの遺伝子について、そのプロモーター領域をサーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）に付加してモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株に導入して、ＬａｃＺタンパク質を発現させ、そのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。 In the following examples, the relative expression level of mRNA was measured using quantitative RT-PCR for the Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain, which is a thermophilic bacterium that synthesizes syngas. The promoter region was introduced into the Mororella thermoacetica dpyrF strain by adding the promoter region to the β-galactosidase gene (lacZ) derived from Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223. Then, LacZ protein was expressed and its β-galactosidase activity was measured.
１．モーレラ用基本培地
表１−１に示す成分をイオン交換水に溶解し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．９に調整し、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップし、培地の色が青から赤に変色するまで２０分間ボイルし、窒素ガス／炭酸ガス（８０：２０）を注入しながら氷中で２０分間冷却した後、予め炭酸ガスを注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、さらに３分間、炭酸ガスを注入し、ブチルゴム栓とアルミシールで密封し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）してモーレラ用基本培地を調製した。
なお、完全合成培地調製時には酵母エキスを加えずに培地を調製した。
1. Basic medium for Morella Dissolve the components shown in Table 1-1 in ion-exchanged water, adjust the pH to 6.9 with 5N HCl, make up to 900 mL with ion-exchanged water, and change the color of the medium from blue to red. Boil for 20 minutes until it cools, cool in ice for 20 minutes while injecting nitrogen gas / carbon dioxide (80:20), then dispense 45 mL each into a 125 mL vial into which carbon dioxide has been previously injected. Carbon dioxide gas was injected for 3 minutes, sealed with a butyl rubber stopper and an aluminum seal, and autoclaved (121 ° C., 15 minutes) to prepare a basic medium for Morella.
In addition, the medium was prepared without adding the yeast extract when preparing the complete synthetic medium.
モーレラ用基本培地は、クロストリジウム・リュングダーリィ（Clostridium ljungdahlii）の培養に用いられるＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ培地を改変したものである。改変として、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物の最終濃度を０．３ｇ／Ｌに減らし、硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）を除いた。培地作製は、還元剤（システイン塩酸塩一水和物、６０ｇ／Ｌ）と基質（フルクトース等）とを別々に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、ハンゲートの方法（Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol.; 3B: 117-32 (1969)）を改変したミラーらの方法（Miller, T. L. and Wolin, M. J.: A serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl. Microbiol.; 27 (5): 985-7 (1974)）を用いた。各成分の組成および調製手順は上記したとおりである。 The basic medium for Morella is a modification of the ATCC 1754 PETC medium used for culturing Clostridium ljungdahlii. As a modification, the final concentration of L-cysteine hydrochloride monohydrate was reduced to 0.3 g / L and sodium sulfide nonahydrate (Na 2 S · 9H 2 O) was removed. The medium was prepared by separately preparing a reducing agent (cysteine hydrochloride monohydrate, 60 g / L) and a substrate (fructose, etc.). Miller's method (Miller, RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol .; 3B: 117-32 (1969)) was prepared as an anaerobic medium. TL and Wolin, MJ: A serum bottle modification of the Hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl. Microbiol .; 27 (5): 985-7 (1974)). The composition and preparation procedure of each component are as described above.
２．定量的ＲＴ−ＰＣＲによるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株のｍＲＮＡ相対発現量の測定
２−１）転写量を測定する遺伝子の選択
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株の全ゲノム情報から、発現量が多いと考えられる一次代謝関連遺伝子およびハウスキーピング遺伝子を中心に、表２−１に示す２３遺伝子を選択した。表２−１には、選択した２３遺伝子の産物のＯＲＦの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）も示す。
2. Measurement of mRNA relative expression level of Moorella thermoacetica ATCC 39073 by quantitative RT-PCR 2-1) Selection of gene for measuring transcription level Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain From the whole genome information, 23 genes shown in Table 2-1 were selected with a focus on primary metabolism-related genes and housekeeping genes that are considered to have a high expression level. Table 2-1 also shows the ORF start position and end position (position in GenBank Accession No. CP000232) of the selected 23 gene products.
プロモーターの選択をするために定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、選択した２３遺伝子のｍＲＮＡ相対転写量を測定した。
表２−２には、選択した２３遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲで使用するプライマーの名称、配列、ゲノムの開始位置および終端位置（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＣＰ０００２３２での位置）、長さ（ｍｅｒ）を示す。
In order to select a promoter, quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was used to measure the mRNA relative transcription amount of the selected 23 genes.
Table 2-2 shows the names and sequences of primers used in quantitative RT-PCR of selected 23 genes, the start position and end position of genome (position in GenBank Accession No. CP000232), length (mer) Indicates.
２−２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件を以下に示す。
2-2) Quantitative RT-PCR
Total RNA was extracted using NucleoSpin (R) RNA II a (MACHEREY-NAGEL). The extraction method followed the attached standard protocol. The conditions for quantitative RT-PCR are shown below.
２−３）結果
選択した２３遺伝子のｍＲＮＡ相対発現量を、ｇｙｒＢを基準として、図１に示す。
2-3) Results The mRNA relative expression levels of the selected 23 genes are shown in FIG. 1 based on gyrB.
選択した２３遺伝子から高いｍＲＮＡ相対発現量を示した５遺伝子を選抜した（表２−４）。これらの遺伝子のプロポーターについて、さらに検討を行った。 Five genes showing high mRNA relative expression level were selected from the selected 23 genes (Table 2-4). Further investigation was conducted on the reporter of these genes.
３．レポーター遺伝子の選定
３−１）概要
レポーター遺伝子として、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株由来の耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）のモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への導入を試みた。
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（本明細書において「Ｇ３ＰＤプロモーター」という場合がある。）およびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＦ）と共にモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株株の染色体上に組み込んだ（図２を参照）。
製作したｌａｃＺ（遺伝子）導入株（本明細書において「ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株」という場合がある。）からＨｉｓＴａｇを用いてＬａｃＺ（タンパク質）を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて発現を確認し、精製ＬａｃＺの活性測定によって、ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用可能か否かの検討を行った。
3. Selection of Reporter Gene 3-1) Outline As a reporter gene, Thermoanaerobacter pseudethanolicus, thermostable β-galactosidase gene (lacZ) derived from ATCC 33223 strain, Moorella thermoacetica dpyrF strain Tried to introduce to.
Transcription and expression are regulated by the promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene from Moorella thermoacetica ATCC 39073 (sometimes referred to herein as the “G3PD promoter”) and the SD sequence. Then, it was integrated into the chromosome of the Moorella thermoacetica dpyrF strain together with the orotidine-5′-phosphate decarboxylase gene (pyrF) by using double crossover homologous recombination (see FIG. 2). ).
LacZ (protein) is purified using HisTag from the produced lacZ (gene) -introduced strain (sometimes referred to as “lacZ-G3PD strain” in this specification), expression is confirmed using SDS-PAGE, and purification is performed. By measuring the activity of LacZ, it was examined whether lacZ can be used as a reporter gene.
３−２）使用菌株およびプラスミド
使用した菌株およびプラスミドを下記に示す。
3-2) Strain and plasmid used The strain and plasmid used are shown below.
３−３）実験方法
３−３−１ 大腸菌の培養
大腸菌は２×ＹＴ培地およびＳＯＢ培地を使用し、３７℃で培養した。培地にはカナマイシンを２０μｇ／ｍＬを含み、カナマイシン耐性のスクリーニングを行った。
3-3) Experimental method
3-3-1 Cultivation of E. coli Escherichia coli was cultured at 37 ° C. using 2 × YT medium and SOB medium. The medium contained 20 μg / mL of kanamycin and screened for kanamycin resistance.
３−３−２ コンピテントセルの作製
コンピテントセルの作製は、井上の方法（Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). Gene 96 (1): 23-28）を参考に以下の手順で行った。
まず、大腸菌を寒天末に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ培地 ５ｍＬに植菌し、６〜８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。
さらに、得られた培養液を１００ｍＬのＳＯＢ培地に２ｍＬ植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。
得られた培養液を５０ｍＬずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷した１６ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷した４ｍＬのInoue Transformation Bufferで菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。３００μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは−８０℃で保存した。
3-3-2 Production of competent cells Competent cells are produced by the method of Inoue (Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). Gene 96 (1): 23-28) The following procedure was performed with reference to
First, E. coli was applied to agar powder and cultured at 37 ° C. overnight. The obtained single colony was inoculated into 5 mL of 2 × YT medium, and cultured with shaking (37 ° C., 280 rpm) for 6 to 8 hours.
Furthermore, 2 mL of the obtained culture solution was inoculated into 100 mL of SOB medium, and cultured with shaking (18 ° C., 120 rpm) until OD 600 was about 0.55.
The obtained culture solution was dispensed in 50 mL portions and allowed to stand on ice for 10 minutes. Ten minutes later, the mixture was centrifuged (2500 × g, 4 ° C.), the supernatant was removed, and the cell pellet was gently suspended by tapping with ice-cooled 16 mL Inoue Transformation Buffer. After suspension, the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes and centrifuged (2500 × g, 4 ° C.). After centrifugation, the supernatant was removed, and the cell pellet was gently suspended by tapping with ice-cold 4 mL of Inoue Transformation Buffer. 300 μL of DMSO (dimethyl sulfoxide) was added, mixed, dispensed in an appropriate amount, and quickly frozen with liquid nitrogen. The produced competent cell was stored at −80 ° C.
３−３−３ プラスミドの構築
まず、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺを、Ｇ３ＰＤプロモーターを連結したｌａｃＺを含むｐＫ１８ｍｏｂプラスミドを鋳型として、表３−２に示すプライマーセット「ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−Ｇ３ＰＤ−ｉｎ−Ｒ」およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）を用いてＰＣＲにより増幅した。
3-3-3 Construction of Plasmid First, a primer set “pk18-G3PD-in-F / pk18” shown in Table 3-2 using lacZ added with the G3PD promoter as a template with the pK18mob plasmid containing lacZ linked with the G3PD promoter as a template. -G3PD-in-R "and KOD FX Neo (manufactured by Toyobo) as the DNA polymerase were used for amplification by PCR.
上記Ｇ３ＰＤプロモーターを連結したｌａｃＺを含むｐＫ１８ｍｏｂ プラスミドの構築は、次のとおり行った。
サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３ 株の全ＤＮＡ、およびプライマーｐｙｒＦ−１７６５−ＦとｐｙｒＦ−１７６４−Ｒとを用いて、ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦを鋳型として、ｐｙｒＦ領域を含むベクター領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
Construction of the pK18mob plasmid containing lacZ linked to the G3PD promoter was performed as follows.
Thermoanaerobacter pseudethanolicus Using the total DNA of ATCC 33223 strain and primers pyrF-1765-F and pyrF-1764-R, the pyrF complementary vector pK18-epyrF is used as a template and the pyrF region is included. The vector region was PCR amplified. The conditions for PCR are as follows. In addition, what was contained in KOD FX (made by Toyobo Co., Ltd.) was used for KOD FX (PCR enzyme), 2 * PCR Buffer for KOD FX, and 2 mM dNTPs.
プライマーＧ３ＰＤ−Ｆ１１とＧ３ＰＤ−ＳＤ−Ｒ１２とを用いて、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＳＤ配列を含むプロモーター領域（Ｇ３ＰＤプロモーター領域）を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。 Using the primers G3PD-F11 and G3PD-SD-R12, a promoter region (G3PD promoter region) containing the SD sequence of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene derived from Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain ) Was amplified. The conditions for PCR are as follows. Incidentally, KOD-Plus-Neo (PCR enzyme), 10 × PCR Buffer for KOD -Plus-Neo, 2mM dNTPs and 25 mM MgSO 4 was used as contained in KOD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株のトータルＤＮＡ、およびプライマーｌａｃＺ−Ｆ−１とｌａｃＺ−Ｒ−１との組合せを用いて、サーモアネロバクター・シュードエタノリクス（Thermoanaerobacter pseudethanolicus） ＡＴＣＣ ３３２２３株のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）領域を増幅した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。ＰＣＲ反応終了後、各ＰＣＲ産物をゲル抽出した。なお、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＰＣＲ酵素）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび２５ｍＭ ＭｇＳＯ４は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。 Thermoanaerobacter pseudethanolicus Thermoanaerobacter pseudethanolicus Using the total DNA of ATCC 33223 strain and the combination of primers lacZ-F-1 and lacZ-R-1, Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 The β-galactosidase gene (lacZ) region of 33223 strain was amplified. The conditions for PCR are as follows. After the PCR reaction, each PCR product was gel extracted. Incidentally, KOD-Plus-Neo (PCR enzyme), 10 × PCR Buffer for KOD -Plus-Neo, 2mM dNTPs and 25 mM MgSO 4 was used as contained in KOD-Plus-Neo (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
下記表に記載の反応溶液でＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲを行った。反応条件は、３７℃３０分→５０℃１５分とした。なお、５×Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒおよびＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｒ） Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれるものを用いた。 In-Fusion PCR was performed with the reaction solutions described in the following table. The reaction conditions were 37 ° C. for 30 minutes → 50 ° C. for 15 minutes. In addition, 5 * In-Fusion Reaction Buffer and In-Fusion Enzyme used what is contained in In-Fusion (R) Advantage PCR Cloning Kit (made by Takara Bio Inc.).
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎサンプルに滅菌水を５０μＬ加えて希釈した。
希釈したサンプル１０μＬを形質転換に用いた。
ダイレクトＰＣＲによりコロニーを選択した。
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲおよび形質転換の結果、複数のコロニーを得た。
ｌａｃＺ−Ｆ−１およびｌａｃＺ−Ｒ−１をプライマーとしたコロニーダイレクトＰＣＲの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から３株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、またはＰｓｔＩ）処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてｌａｃＺの挿入が確認できた。
The In-Fusion sample was diluted by adding 50 μL of sterilized water.
10 μL of diluted sample was used for transformation.
Colonies were selected by direct PCR.
As a result of In-Fusion PCR and transformation, multiple colonies were obtained.
As a result of colony direct PCR using lacZ-F-1 and lacZ-R-1 as primers, the target band was confirmed in all strains. Three of these strains were cultured and the plasmid was extracted. As a result of restriction enzyme (EcoRI, EcoRV, or PstI) treatment and confirmation by electrophoresis, lacZ insertion was confirmed in all strains.
なお、上記ｐｙｒＦ相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦは、次に記載する方法で作製した。
以下に示すプライマーｐｙｒＦ−ｕｐ−Ｆ１とｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１との組み合わせを用いて、以下の条件でＰＣＲを行い、ｐｙｒＦ遺伝子翻訳領域とその５’側の約１０００ｂｐ、３’側の約１０００ｂｐを含む約２．７ｋｂの遺伝子断片を増幅した。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
The pyrF complementary vector pK18-epyrF was prepared by the method described below.
PCR was performed under the following conditions using the combination of primers pyrF-up-F1 and pyrF-dn-R1 shown below, and the pyrF gene translation region and its 5′-side about 1000 bp and 3′-side about 1000 bp were obtained. A gene fragment of about 2.7 kb containing was amplified. In addition, what was contained in KOD FX (made by Toyobo Co., Ltd.) was used for KOD FX (PCR enzyme), 2 * PCR Buffer for KOD FX, and 2 mM dNTPs.
得られたＰＣＲ産物についてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いてゲル抽出を行った。
２μＬのＳｍａＩ処理をしたプラスミド ｐＫ１８ｍｏｂを、８μＬのゲル抽出したＰＣＲ産物、１０μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（東洋紡製）と混合し、１６℃で１時間インキュベートした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ コンピテントセル（タカラバイオ製）にライゲーション溶液１０μＬを添加して軽く攪拌した。
氷中に１０分静置した。
４２℃で１分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
ＳＯＣ培地を１ｍＬ加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ含有）に塗沫した。
３７℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
生育が見られたコロニーをカナマイシン添加ＬＢ寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、インサートの確認を行った。プライマーはｐｙｒＦｕｐ−Ｆ１およびｐｙｒＦ−ｄｎ−Ｒ１を用いた。コロニーダイレクトＰＣＲの条件を以下に示す。なお、ＫＯＤ ＦＸ（ＰＣＲ酵素）、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸおよび２ｍＭ ｄＮＴＰｓは、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）に含まれるものを用いた。
Gel extraction was performed about the obtained PCR product using MagExtractor Kit (made by Toyobo).
2 μL of SmaI-treated plasmid pK18mob was added to 8 μL of the gel-extracted PCR product, 10 μL of Ligation high Ver. 2 (manufactured by Toyobo) and incubated at 16 ° C. for 1 hour. 10 μL of the ligation solution was added to Escherichia coli HST08 Premium competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) and stirred gently.
Let stand in ice for 10 minutes.
A heat shock was applied at 42 ° C. for 1 minute, and immediately left on ice.
1 mL of SOC medium was added, incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then smeared on LB agar medium (containing kanamycin, X-gal and IPTG).
After overnight culture at 37 ° C., colonies that grew were obtained.
After transplanting the colonies in which growth was observed on LB agar medium supplemented with kanamycin, colony direct PCR was performed to confirm the insert. As primers, pyrFup-F1 and pyrF-dn-R1 were used. The conditions for colony direct PCR are shown below. In addition, what was contained in KOD FX (made by Toyobo Co., Ltd.) was used for KOD FX (PCR enzyme), 2 * PCR Buffer for KOD FX, and 2 mM dNTPs.
電気泳動によりバンドを確認した。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したＬＢ液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびＥｃｏＲＩまたはＰｓｔＩ処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のｐｙｒＦ遺伝子相補ベクターｐＫ１８−ｅｐｙｒＦが構築できていることを確認した。
Bands were confirmed by electrophoresis.
The strain in which the band was confirmed was cultured overnight in LB liquid medium supplemented with kanamycin, and plasmid extraction was performed.
Concentration measurement by absorbance and electrophoresis of EcoRI or PstI-treated samples were performed.
Furthermore, it was confirmed that the target pyrF gene-complementing vector pK18-epyrF was constructed by decoding the base sequence based on the sequence.
さらに、上流および下流配列を含むｐｙｒＦ、およびＧ３ＰＤプロモーターを連結した耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎＲ）を含むｐｋ１８ｍｏｂプラスミドを鋳型に、表３−３に示すプライマーセット「ｐＫ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｒ」およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いてインバースＰＣＲにより線状ベクターを構築し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてＧ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺと線状ベクターをつなげ、プラスミドを構築した。 Furthermore, a primer set “pK18-pyrF-inv-F / pk18” shown in Table 3-3 was prepared using as a template a pk18mob plasmid containing a pyrF containing upstream and downstream sequences and a thermostable kanamycin resistance gene (kanR) linked to a G3PD promoter. -PyrF-inv-R "and KOD FX Neo (Toyobo) as a DNA polymerase were used to construct a linear vector by inverse PCR, and InFusion HD Cloning Kit (Clontech) was added to lacZ and G3PD promoter. The vectors were connected to construct a plasmid.
３−３−４ 大腸菌の形質転換
大腸菌への遺伝子導入はコンピテントセルを用いて以下の手順でヒートショックにより行った。
まず、コンピテントセルを−８０℃から取り出し、氷上で１０分間静置し、解凍した。
コンピテントセル １００μＬに対して５μＬのＤＮＡ溶液を添加し、氷上で３０分間静置した。３０分後、４２℃で９０秒間インキュベートし、ヒートショックを行った。ヒートショック後、直ぐに氷上に移し、１〜２分間静置した。
その後、ＳＯＣ培地を８００ｍＬ添加し、３７℃で４５分間培養した。４５分後、抗生物質を含む２×ＹＴプレートに塗布し、３７℃で１２〜１６時間培養した。
形成されたコロニーを５ｍＬの２×ＹＴブロスに植菌し、プラスミド抽出を行った。
3-3-4 Transformation of E. coli The gene was introduced into E. coli by heat shock using a competent cell according to the following procedure.
First, the competent cell was taken out from −80 ° C., left on ice for 10 minutes, and thawed.
5 μL of DNA solution was added to 100 μL of competent cells and allowed to stand on ice for 30 minutes. After 30 minutes, the plate was incubated at 42 ° C. for 90 seconds and subjected to heat shock. Immediately after the heat shock, it was transferred to ice and allowed to stand for 1-2 minutes.
Thereafter, 800 mL of SOC medium was added and cultured at 37 ° C. for 45 minutes. After 45 minutes, they were applied to 2 × YT plates containing antibiotics and cultured at 37 ° C. for 12-16 hours.
The formed colonies were inoculated into 5 mL of 2 × YT broth, and plasmid extraction was performed.
３−３−５ 大腸菌からのプラスミド抽出
大腸菌からのプラスミド抽出はＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（バイオラッド）を用いて、付属のプロトコルに従って行った。抽出したプラスミドは制限酵素処理により目的のプラスミドが構築されていることを確認した。
3-3-5 Plasmid Extraction from E. coli Plasmid extraction from E. coli was performed using Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit (Bio-Rad) according to the attached protocol. From the extracted plasmid, it was confirmed that the target plasmid was constructed by restriction enzyme treatment.
３−３−６ バイアルを用いた回分培養
バイアル瓶への還元剤の添加や植菌、サンプリングには２２Ｇ×１・１／４、あるいは２７Ｇ×１・１／４の注射針（ニプロ）を付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて嫌気的に行った。操作はクリーンベンチ内で行い、注射針を刺すブチルゴム栓の部分は、ガスバーナーであぶって滅菌した。フルクトースで培養する場合は、植菌直前にフルクトース水溶液（２００ｇ／Ｌ）を培地に対し１％（ｖ／ｖ）、還元剤（６０ｇ／Ｌ）を２％（ｖ／ｖ）、クエン酸チタン（ＩＩＩ）水溶液を１、２滴添加し、前培養液を５％（ｖ／ｖ）植菌した。培養は５５℃で、静置培養を行った。
3-3-6 Add a reducing agent to a batch culture vial using a vial, inoculate, or sample with a 22G x 1/1/4 or 27G x 1/4 1/4 injection needle (Nipro) Anaerobically using a plastic syringe (Terumo). The operation was carried out in a clean bench, and the part of the butyl rubber stopper that pierced the injection needle was sterilized with a gas burner. When culturing with fructose, immediately before inoculation, fructose aqueous solution (200 g / L) is 1% (v / v) with respect to the medium, reducing agent (60 g / L) is 2% (v / v), titanium citrate ( III) One or two drops of aqueous solution was added, and 5% (v / v) of the preculture was inoculated. The culture was stationary culture at 55 ° C.
３−３−７ ロールチューブ法によるコロニー形成
ロールチューブの作成はハンゲートの方法（Hungate, R. E.: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol.; 3B: 117-32 (1969)）に従った。ロールチューブ作成にはモーレラ用基本培地が１８ｍＬ入ったバイアルに、０．３７ｇの低温ゲル化用寒天末（ナカライテスク、ゲル化温度３０−３１℃）を添加し、オートクレーブ（１２５℃、１５分間）した培地を使用した。使用前に培地を湯煎により融解し、４０℃程度に保ちながら還元剤を０．４ｍＬ、フルクトース水溶液を０．２ｍＬ、クエン酸チタン（ＩＩＩ）溶液を１滴添加した後、菌体を気泡ができないように植菌した。植菌後、氷水を入れたロールチューブ作成装置で回転させながら寒天をバイアルビン側面に固めた。その後、５５℃で５〜７日間静置培養した。形成されたコロニーは、クリーンベンチ内で滅菌済みのパスツールピペットを用いて培地ごと取り出し、５ｍＬの培地に植菌し、フルクトースを基質として静置培養した。
3-3-7 Preparation of colony-forming roll tubes by the roll tube method followed the method of Hangate (RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol .; 3B: 117-32 (1969)) . To create a roll tube, add 0.37 g of low temperature gelling agar powder (Nacalai Tesque, gelation temperature 30-31 ° C) to a vial containing 18 mL of basic Morella medium, and autoclave (125 ° C, 15 minutes) Medium was used. Before use, melt the medium in a hot water bath and keep the temperature at about 40 ° C. Add 0.4 mL of reducing agent, 0.2 mL of fructose aqueous solution, and 1 drop of titanium (III) citrate solution. Inoculated as follows. After inoculation, the agar was hardened on the side of the vial while being rotated with a roll tube preparation apparatus containing ice water. Then, static culture was performed at 55 ° C. for 5 to 7 days. The formed colonies were taken out together with the medium using a pasteur pipette sterilized in a clean bench, inoculated into 5 mL of medium, and statically cultured using fructose as a substrate.
３−３−８ エレクトロポレーションを用いたモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株への遺伝子の導入はエレクトロポレーションを用いた。
まず、ｄｐｙｒＦ株をＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１程度まで培養し、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。残った菌体にエレクトロポレーション緩衝液を１０ｍＬ加え、再懸濁後、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心して上清を除去した。
この操作をもう一度繰り返した後、ＯＤ６００＝１．０程度になるように菌体をエレクトロポレーション緩衝液により再懸濁した。
プラスミド（ｐＫ１８−ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ）のＤＮＡ ２μｇを含む溶液を加えた菌体懸濁液 ４００μＬをエレクトロポレーション用キュベット（２ｍｍギャップ）に移し、１５００Ｖ、５００Ω、５０μＦの条件でパルスをかけた。パルス後、すぐにキュベットを氷中に移し、３〜５分間静置して冷却した。冷却後、菌体懸濁液を、ウラシルを１μｇ／ｍＬ含む培地に植菌し、フルクトースにより５５℃で４８時間静置培養した。培養後、ロールチューブ法（ウラシルを含まない培地を使用）により形質転換体の単離を行った。
3-3-8 Introduction of gene into Morella thermoacetica using electroporation Gene introduction into Moorella thermoacetica dpyrF strain was performed using electroporation.
First, the dpyrF strain was cultured with H 2 —CO 2 to about OD 600 = 0.1, and centrifuged at 5800 × g for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. 10 mL of electroporation buffer was added to the remaining cells, resuspended, and centrifuged at 5800 × g for 10 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant.
After this operation was repeated once more, the cells were resuspended with an electroporation buffer so that OD 600 = about 1.0.
400 μL of a cell suspension containing a solution containing 2 μg of DNA of plasmid (pK18-lacZ-G3PD) was transferred to an electroporation cuvette (2 mm gap), and pulsed under conditions of 1500 V, 500Ω, and 50 μF. Immediately after the pulse, the cuvette was transferred to ice and allowed to cool for 3-5 minutes. After cooling, the cell suspension was inoculated into a medium containing 1 μg / mL of uracil, and statically cultured at 55 ° C. for 48 hours with fructose. After the culture, the transformant was isolated by a roll tube method (using a medium not containing uracil).
３−３−９ モーレラ・サーモアセティカからのゲノムＤＮＡの抽出
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）からのゲノムＤＮＡの抽出は、定常期まで培養した菌体を使用して行った。ゲノムＤＮＡ抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（Ｒ） Ｔｉｓｓｕｅ キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。抽出プロトコルは一部添付のマニュアルを改変して行った。改変としては、Ｐｒｅ−ｌｙｓｅの段階で、１８０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｔ１で再懸濁するところを、リゾチーム（東京化成工業）とアクロモペプチダーゼ（和光純薬）を、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解させたＴＥ緩衝液 １８０μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。その後、２５μＬのプロテイナーゼＫを加え、３７℃で１５分間反応させた。このあとの操作は添付のマニュアルに従った。抽出したゲノムは−２０℃で保存し、必要なときに適宜解凍して使用した。
3-3-9 Extraction of genomic DNA from Moorella thermoacetica Extraction of genomic DNA from Moorella thermoacetica was performed using cells cultured until stationary phase. Genomic DNA extraction was performed using the NucleoSpin (R) Tissue kit (Macherey-Nagel). The extraction protocol was partially modified from the attached manual. As a modification, lysozyme (Tokyo Kasei Kogyo) and achromopeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were dissolved at 10 mg / mL respectively in the pre-lyse stage where 180 μL of Buffer T1 was resuspended. The bacterial cell pellet was suspended in 180 μL of TE buffer and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 25 μL of proteinase K was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. Subsequent operations followed the attached manual. The extracted genome was stored at −20 ° C., and was appropriately thawed and used when necessary.
３−３−１０ ＰＣＲによる形質転換体の確認
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表３−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素は、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
3-3-10 Confirmation of transformant by PCR Confirmation of the transformant was performed by PCR using the extracted genome as a template. The primers used for PCR are shown in Table 3-4. As an enzyme for PCR reaction, KOD FX Neo (Toyobo) was used.
３−３−１１ 超音波破砕機による粗酵素液の抽出
粗酵素液の抽出にはＨ２−ＣＯ２でＯＤ６００＝０．１〜０．１５、フルクトースでＯＤ６００＝０．４〜０．８まで培養した菌体を使用した。
培養液を、５８００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を取り除いた。その後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １０ｍＬで菌体ペレットを再懸濁し、５８００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を取り除いた。
この洗浄操作を再度行った後、ソニケーション緩衝液 ３〜５ｍＬに菌体ペレットを再懸濁し、超音波破砕機（デジタルソニファイアー、ブランソン）により破砕した。
破砕液を、２０４００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。
回収した粗酵素液を用いて、その後のタンパク質濃度測定や、酵素活性測定に用いた。
3-3-11 sonicator the crude enzyme solution extracted crude enzyme solution OD 600 = 0.1 to 0.15 in H 2 -CO 2 to extraction, OD 600 fructose = 0.4 to 0. Cells cultured up to 8 were used.
The culture solution was centrifuged at 5800 × g and 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was removed. Thereafter, the cell pellet was resuspended with 10 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), centrifuged at 5800 × g and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was removed.
After performing this washing operation again, the bacterial cell pellet was resuspended in 3-5 mL of sonication buffer, and crushed with an ultrasonic crusher (Digital Sonifier, Branson).
The disrupted solution was centrifuged at 20400 × g and 4 ° C. for 30 minutes, and the supernatant was collected.
The recovered crude enzyme solution was used for subsequent protein concentration measurement and enzyme activity measurement.
３−３−１２ ＨｉｓＴａｇを用いたＬａｃＺ精製
ＬａｃＺ精製はｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ−Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ（ロシュ・アプライド・サイエンス）のプロトコル、また、回収した精製ＬａｃＺを脱塩するために、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（ミリポア）のプロトコルに従って行った。まず、レジン（１５０μＬ）をマイクロ試験管に移し、分取したレジンの２０倍容の結合バッファーＡを添加し、十分に撹拌した。次に、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除き、レジンを平衡化し、そこにＨｉｓＴａｇタンパク質を含む溶液を平衡化したレジンに加え、１ｈ転倒混和での穏やかな撹拌を実施した。その後、５００×ｇで１０秒間遠心し、上清を取り除いた。次に、レジン量の５倍容の洗浄バッファーを加え、十分に混和し、穏やかに遠心し、上清を取り除いた。本操作を５回繰り返した。レジン量と同量の溶出バッファーを添加し、１０分間撹拌し、遠心上清を回収した。次に、脱塩するため、回収した上清をフィルターに入れて、１４０００×ｇで１０分間遠心した。次にフィルターを逆にして１０００×ｇで２ｍｉｎ遠心を行い、バッファー５００μＬで洗浄を２回行った。ＬａｃＺを精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、発現の確認を行った。
3-3-12 LacZ purification using HisTag LacZ purification can be carried out using the protocol of cComplete His-Tag Purification Resin (Roche Applied Science) and the Centrifugal filter unit (Millipore) for desalting the recovered purified LacZ. Performed according to protocol. First, the resin (150 μL) was transferred to a micro test tube, and 20 times as much binding buffer A as the collected resin was added, and the mixture was sufficiently stirred. Next, the mixture was centrifuged at 500 × g for 10 seconds, the supernatant was removed, the resin was equilibrated, the solution containing the HisTag protein was added to the equilibrated resin, and gentle stirring was performed by inversion mixing for 1 h. Thereafter, centrifugation was performed at 500 × g for 10 seconds, and the supernatant was removed. Next, a washing buffer of 5 times the amount of the resin was added, mixed well, gently centrifuged, and the supernatant was removed. This operation was repeated 5 times. The same amount of elution buffer as that of the resin was added, and the mixture was stirred for 10 minutes, and the centrifugal supernatant was recovered. Next, in order to desalinate, the collected supernatant was put in a filter and centrifuged at 14000 × g for 10 minutes. Next, the filter was reversed, centrifuged at 1000 × g for 2 min, and washed twice with 500 μL of buffer. After LacZ was purified, expression was confirmed by SDS-PAGE.
３−３−１３ タンパク質濃度の測定
粗酵素液のタンパク濃度の測定は、サンプルをソニケーション緩衝液で適宜希釈したうえで、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）を用いて行った。定量のための標準タンパク溶液にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を用い、検量線を求めた。
3-3-13 Measurement of protein concentration The protein concentration of the crude enzyme solution was measured using a Pierce 660 nm Protein Assay Kit (Thermo Scientific) after appropriately diluting the sample with a sonication buffer. A calibration curve was obtained using a bovine serum albumin (BSA) aqueous solution as the standard protein solution for quantification.
３−３−１４ 精製ＬａｃＺ活性測定
精製ＬａｃＺ、試薬および滅菌水を混合して試料を調製し、５５℃でインキュベートした後、ＯＤ４０５を測定した。精製ＬａｃＺ活性測定用試料の組成を表３−５に示す。
3-3-14 Purified LacZ activity measurement Purified LacZ, a reagent and sterilized water were mixed to prepare a sample. After incubation at 55 ° C, OD 405 was measured. The composition of the sample for measuring purified LacZ activity is shown in Table 3-5.
３−４）結果および考察
３−４−１ Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株の作成
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株由来のＧ３ＰＤプロモーターおよびＳＤ配列により転写および発現を制御し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦと共にｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
作製した変異株をＰＣＲにより確認した結果、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た（図３）。図３は、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のＰＣＲ結果を示す電気泳動像である。また、ＰＣＲ産物のシーケンスによっても、正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
3-4) Results and discussion
3-4-1 Preparation of lacZ-introduced strain with G3PD promoter added Transcription and expression are controlled by G3PD promoter and SD sequence derived from Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain, and homologous recombination of double crossover is performed. Utilized and integrated on the chromosome of the dpyrF strain together with pyrF.
As a result of confirming the prepared mutant strain by PCR, a band about 2.5 kb longer than the wild strain (about 4.8 kb) in lane 1 was detected. Since the length of lacZ to which the G3PD promoter was added was 2.5 kb, it was confirmed that recombination was performed correctly (FIG. 3). FIG. 3 is an electrophoretic image showing the PCR results of the lacZ-introduced strain added with the G3PD promoter. It was also confirmed that the DNA sequence was correct by the PCR product sequence.
３−４−２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＬａｃＺ発現の確認
ＨｉｓＴａｇを利用してＬａｃＺ（タンパク質）の精製を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＬａｃＺ発現の確認を行った。ＬａｃＺは分子量約８７ｋＤａのタンパク質であり、レーン５のバンドが約８７ｋＤａの位置に検出されたため、ＬａｃＺの発現が確認出来た（図４）。
3-4-2 Purification of purified LacZ expression by SDS-PAGE LacZ (protein) was purified using HisTag, and LacZ expression was confirmed using SDS-PAGE. LacZ is a protein having a molecular weight of about 87 kDa, and since the band in lane 5 was detected at a position of about 87 kDa, the expression of LacZ could be confirmed (FIG. 4).
３−４−３ ＬａｃＺ活性測定
３−３−１４に示したプロトコルと組成によってＬａｃＺの活性測定を行った。図５から、精製ＬａｃＺの活性を確認することが出来た。下記表にその結果を示した。
3-4-3 LacZ Activity Measurement LacZ activity was measured according to the protocol and composition shown in 3-3-14. From FIG. 5, the activity of purified LacZ could be confirmed. The results are shown in the following table.
３−４−４ 考察
３−４−２および３−４−３の結果によれば、ＬａｃＺの発現が確認でき、活性が見られた。これにより、ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用出来ることが確認された。そこで、以下では、ｌａｃＺの転写量および翻訳量に及ぼすプロモーターの影響を調べた。
3-4-4 Discussion According to the results of 3-4-2 and 3-4-3, the expression of LacZ was confirmed and the activity was observed. This confirmed that lacZ can be used as a reporter gene. Therefore, in the following, the influence of the promoter on the transcription amount and translation amount of lacZ was examined.
４．ｌａｃＺ転写量に及ぼすプロモーターの影響
４−１）概要
３の結果からｌａｃＺをレポーター遺伝子として使用できることが確認できたため、３で選択したプロモーターおよびそのＳＤ配列を付加したｌａｃＺをダブルクロスオーバーの相同組換えを利用して、ｐｙｒＦとともにｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。
次に、プロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のｍＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてｌａｃＺ転写量を測定した。
4). 4. Effect of promoter on lacZ transcription amount 4-1) Summary Since it was confirmed from the results of 3 that lacZ can be used as a reporter gene, homologous recombination of the promoter selected in 3 and lacZ to which the SD sequence was added was double crossover. Was incorporated into the chromosome of dpyrF strain together with pyrF.
Next, mRNA of the lacZ-introduced strain added with a promoter was extracted, and the amount of lacZ transcription was measured using quantitative RT-PCR.
４−２）実験方法
４−２−１ 使用菌株およびプラスミド
4-2) Experimental method
4-2-1 Strains and plasmids used
４−２−２ プラスミドの構築
プラスミドの構築は３−３−３と同様に行った。２の結果からｌａｃＺに５つのプロモーターとプロモーター由来のＳＤ配列を付加したプラスミドの構築を行った。選択した転写量の高かった遺伝子を下記表に示す。
4-2-2 Plasmid Construction Plasmid construction was performed in the same manner as in 3-3-3. From the results of 2, a plasmid was constructed by adding 5 promoters and a promoter-derived SD sequence to lacZ. The selected genes with high transcription levels are shown in the table below.
各プロモーターを付加したｌａｃＺを作成するために、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株のゲノムを鋳型として、表４−３に示すプライマーセット「ｐｋ１８−ｃｉｓ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ｃｉｓ−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−ｐｒｉｍａｓｅ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｒｉｍａｓｅ−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−Ｍ１７３７−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−Ｍ１７３７−ｉｎ−Ｒ」、「ｐｋ１８−ＣＯＤＨ−ｉｎ−Ｆ／ｐｋ１８−ＣＯＤＨ−ｉｎ−Ｒ」を用いてＰＣＲにより各プロモーターを増幅した。さらにｐｋ１８−ｌａｃＺ−Ｇ３ＰＤを鋳型にプライマーセット「ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｆ／ｐｋ１８−ｐｙｒＦ−ｉｎｖ−Ｒ」を用いてインバースＰＣＲにより線状ベクターを構築し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて各プロモーターと線状ベクターをつなげ、プラスミドを構築した。 In order to prepare lacZ with each promoter added, using the genome of Moorella thermoacetica lacZ-G3PD as a template, the primer set “pk18-cis-in-F / pk18− cis-in-R "," pk18-primase-in-F / pk18-primase-in-R "," pk18-M1737-in-F / pk18-M1737-in-R "," pk18-CODH-in- " Each promoter was amplified by PCR using “F / pk18-CODH-in-R”. Furthermore, a linear vector was constructed by inverse PCR using pk18-lacZ-G3PD as a template and a primer set “pk18-pyrF-inv-F / pk18-pyrF-inv-R”, and each of these was constructed using In Fusion HD Cloning Kit. A promoter was connected to a linear vector to construct a plasmid.
４−２−３ 各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
構築したプラスミドを３−３−１と同様に大腸菌の形質転換を行い、３−３−２から３−３−１０までの同様の工程を経て、各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）への遺伝子導入を行い、ｌａｃＺ導入株を構築した。
形質転換体の確認は、抽出したゲノムを鋳型にＰＣＲすることにより行った。ＰＣＲに使用したプライマーを表４−４に示す。ＰＣＲ反応用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。
4-2-3 Transduction of Escherichia coli in the same manner as in 3-3-1 with the plasmid in which lacZ to which each promoter has been added is introduced into Morella thermosetica, and 3-3-2 to 3-3 Through the same process up to 10, lacZ to which each promoter was added was introduced into Moorella thermoacetica to construct a lacZ-introduced strain.
The transformant was confirmed by PCR using the extracted genome as a template. The primers used for PCR are shown in Table 4-4. As an enzyme for PCR reaction, KOD FX Neo (Toyobo) was used.
４−２−４ プロモーターを付加したｌａｃＺ導入株のｍＲＮＡ抽出
製作したプロモーターを付加したｌａｃＺ導入株をバイアルを用いてフルクトースを基質として回分培養を行い（３−３−６参照）、ＯＤ６００＝０．５〜０．６５でｍＲＮＡ抽出を行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩを用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出方法は付属の標準プロトコルに従った。一部改変した点は、抽出の前処理としてリゾチームとアクロモペプチダーゼをそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解したＴＥ緩衝液 １００μＬに菌体ペレットを懸濁し、３７℃で１０分間反応させた。抽出したトータルＲＮＡは−２０℃で保存した。
4-2-4 Extraction of mRNA of lacZ-introduced strain with added promoter The lacZ-introduced strain with the prepared promoter is batch-cultured using fructose as a substrate using a vial (see 3-3-6), and OD 600 = 0 MRNA extraction was performed at 0.5 to 0.65. Total RNA was extracted using NucleoSpin RNA II. The extraction method followed the attached standard protocol. A part of the modification was that the cell pellet was suspended in 100 μL of TE buffer in which lysozyme and achromopeptidase were each dissolved at 10 mg / mL as pretreatment for extraction, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. The extracted total RNA was stored at -20 ° C.
４−２−５ 定量的ＲＴ−ＰＣＲ
まず、抽出したｍＲＮＡを鋳型として、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、ｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。逆転写反応はＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いて行った。逆転写に用いた反応液の組成と反応条件を表４−５に示す。
4-2-5 Quantitative RT-PCR
First, reverse transcription reaction to cDNA was performed using the extracted mRNA as a template, and using One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Takara Bio). Reverse transcription reaction was performed using RiverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (Toyobo). The composition and reaction conditions of the reaction solution used for reverse transcription are shown in Table 4-5.
ｃＤＮＡへの逆転写の後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲで転写量測定を行った。使用したプライマーを表４−６に、定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件を表４−７および表４−８に、それぞれ示す。また、ハウスキーピング遺伝子であるＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ（ｇｙｒＢ）のｍＲＮＡ量を内部標準として各遺伝子の相対転写量を測定した。 After reverse transcription to cDNA, transcription amount was measured by quantitative RT-PCR using One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Takara Bio). The primers used are shown in Table 4-6, and the conditions for quantitative RT-PCR are shown in Table 4-7 and Table 4-8, respectively. Further, the relative transcription amount of each gene was measured using the amount of mRNA of DNA gyase subunit B (gyrB), which is a housekeeping gene, as an internal standard.
４−３）実験結果・考察
４−３−１ 各プロモーターを付加したｌａｃＺのモーレラ・サーモアセティカへの遺伝子導入
ｃｉｓ、ＣＯＤＨまたはｐｒｉｍａｓｅの各遺伝子のプロモーターを付加したｌａｃＺを導入したプラスミドを構築し、ダブルクロスオーバーの相同組換えを利用してｐｙｒＦとともにモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ｄｐｙｒＦ株の染色体上に組み込んだ。作成した変異株をＰＣＲにより確認した結果（図６〜８）、レーン１の野生株（約４．８ｋｂ）と比べて、約２．５ｋｂ長いバンドが検出された。プロモーターを付加したｌａｃＺの長さが２．５ｋｂであることから、正しく組換えが行われたことが確認出来た。また、シーケンスでも正しいＤＮＡ配列であることが確認出来た。
4-3) Experimental results and discussion
4-3-1 Gene introduction of lacZ added with each promoter into Morella thermosetica A plasmid introduced with lacZ added with a promoter of each gene of cis, CODH, or primese is constructed, and double crossover homologous recombination Was incorporated into the chromosome of Moorella thermoacetica dpyrF strain together with pyrF. As a result of confirming the prepared mutant strain by PCR (FIGS. 6 to 8), a band about 2.5 kb longer than the wild strain (about 4.8 kb) in lane 1 was detected. Since the length of lacZ to which the promoter was added was 2.5 kb, it was confirmed that the recombination was performed correctly. It was also confirmed that the DNA sequence was correct in the sequence.
４−３−２ 定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた転写量測定
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて製作したｌａｃＺ導入株の転写量測定を行った。
図９に各プロモーターが及ぼす転写量の影響のグラフを示した。
4-3-2 Transcription amount measurement using quantitative RT-PCR The transcription amount of the lacZ-introduced strain produced using quantitative RT-PCR was measured.
FIG. 9 shows a graph of the influence of the transcription amount exerted by each promoter.
４−３−３ 考察
図９からＧ３ＰＤプロモーターが最もｌａｃＺのｍＲＮＡ転写量に及ぼす影響が大きいことが分かった。他のプロモーターと比較して約３倍もの転写量を示し、他のプロモーターはほぼ同等の値を示した。モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＡＴＣＣ ３９０７３株（Ｃｏｎｔｒｏｌ−１）の遺伝子転写量測定と比較すると双方ともＧ３ＰＤプロモーターが最も転写活性が高いことが確認できた。
4-3-3 Discussion FIG. 9 shows that the G3PD promoter has the greatest influence on the amount of lacZ mRNA transcription. The amount of transcription was about 3 times that of other promoters, and the other promoters showed almost the same value. It was confirmed that the G3PD promoter had the highest transcriptional activity in both cases as compared with the gene transcription level measurement of Moorella thermoacetica ATCC 39073 strain (Control-1).
５．ＬａｃＺ（タンパク質）の活性測定
５−１）概要
３、４で製作した株を用いて超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、タンパク質濃度測定、活性測定を行った。
5. Measurement of activity of LacZ (protein) 5-1) Outline The crude enzyme solution was extracted by an ultrasonic crusher using the strains prepared in 3 and 4, and protein concentration and activity were measured.
５−２）実験方法
３−３−１１のプロトコルと同様に超音波破砕機による粗酵素液の抽出を行い、３−３−１３、１４のプロトコルと同様にタンパク質濃度を測定し、活性測定を行った。その際、基質：フルクトース、ＯＤ４０５＝０．５〜０．６５で粗酵素液の抽出を行った。
5-2) Experimental method Extract the crude enzyme solution with an ultrasonic crusher as in the protocol of 3-3-11, measure the protein concentration as in the protocol of 3-3-13 and 14, and measure the activity. went. At that time, the crude enzyme solution was extracted with the substrate: fructose, OD 405 = 0.5 to 0.65.
５−３）実験結果・考察
驚くべきことに、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合に、最もＬａｃＺ活性が高く、他のプロモーターを付加した場合と比較して、約２倍もの活性値の差が得られた（図１０を参照）。一方、ｍＲＮＡ転写量が最も高かったＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合には、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合の約１／２に止まり、高い活性値は得られなかった。これは、ＣＯＤＨプロモーターの配列の中にｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を特に活性化する仕組みがあるためと推察される。
5-3) Experimental results and discussion Surprisingly, when the CODH promoter was added, the LacZ activity was the highest, and the difference in activity value was about twice that of the case where other promoters were added. (See FIG. 10). On the other hand, when the G3PD promoter having the highest mRNA transcription amount was added, it was only about ½ that when the CODH promoter was added, and a high activity value was not obtained. This is presumably because there is a mechanism that particularly activates translation from mRNA to protein in the sequence of the CODH promoter.
６．総括
ｌａｃＺをレポーター遺伝子として利用可能であることが確認出来た。
転写活性はＧ３ＰＤプロモーターを付加した場合に最も高く、他のプロモーターを付加した場合に比べて約３倍以上の転写活性を示した。しかし、産物であるＬａｃＺタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＣＯＤＨプロモーターを付加した場合が最も高く、Ｇ３ＰＤプロモーターを付加した場合に比べて約２倍の比活性を示した。このことから、外来遺伝子を高発現する遺伝子プロモーターをスクリーニングするためには、遺伝子産物のタンパク質の活性を測定することが必須であり、ｍＲＮＡ転写活性は予備的スクリーニングのために有用であることがわかった。
なお、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica） ＬａｃＺ−Ｇ３ＰＤ株は、Ｍ−Ｇ３ＰＤ−ｌａｃＺ株と名付け、独立行政法人評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託を申請した（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４）。
6). Summary It was confirmed that lacZ can be used as a reporter gene.
The transcriptional activity was the highest when the G3PD promoter was added, and the transcriptional activity was about 3 times or more that when other promoters were added. However, the β-galactosidase activity of the product LacZ protein was highest when the CODH promoter was added, and the specific activity was about twice as high as when the G3PD promoter was added. This indicates that in order to screen for gene promoters that highly express foreign genes, it is essential to measure the protein activity of the gene product, and mRNA transcriptional activity is useful for preliminary screening. It was.
The Moorella thermoacetica LacZ-G3PD strain was named M-G3PD-lacZ strain and applied for deposit at the National Institute of Technology and Evaluation Microorganisms (Reception number: NITE AP-01904). ).
識別の表示：Ｍ−Ｇ３ＰＤ−ＬａｃＺ
受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−０１９０４
受領日：平成２６年７月２９日
受託機関：独立行政法人評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
Identification display: M-G3PD-LacZ
Receipt Number: NITE AP-01904
Date of receipt: July 29, 2014 Trustee: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary Center
Claims (3)
ヌクレオチド配列が以下により表される、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域。
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3' A carbon monoxide dehydrogenase gene promoter region that expresses a foreign gene higher than a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter in a syngas-utilizing thermophilic bacterium ,
A carbon monoxide dehydrogenase gene promoter region, the nucleotide sequence of which is represented by:
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3 '
前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するためのプロモーター領域が、以下のヌクレオチド配列で表される一酸化炭素デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領域である、β−ガラクトシダーゼを発現するモーレラ属細菌。
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3' A bacterium belonging to the genus Morella that expresses β-galactosidase, in which a β-galactosidase gene and a promoter region for expressing the β-galactosidase gene are integrated on a chromosome,
A bacterium belonging to the genus Morella that expresses β-galactosidase, wherein the promoter region for expressing the β-galactosidase gene is a carbon monoxide dehydrogenase gene promoter region represented by the following nucleotide sequence .
5'- accagattaccggggtatacggcggggggaaccggagttctctccggaaaaaaatgggtaataacacctgttaacccaacgggtgtaggattaaatgtaccaaggaggtaagcagt -3 '
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