JP6472960B2 - 魚体内での他家組織の継代維持法 - Google Patents
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従って、本発明の課題は、魚類において同種異系組織を移植しても免疫拒絶反応を生じず、稚魚本体、正常な器官や組織、腫瘍組織等を継代維持する方法及びこれを用いた薬物のスクリーニング方法を提供することにある。
〔2〕魚が、ゼブラフィッシュである〔1〕記載の継代維持法。
〔3〕他家組織が、魚の他家組織である〔1〕又は〔2〕記載の継代維持法。
〔4〕他家組織が、他家腫瘍組織である〔1〕又は〔2〕記載の継代維持法。
〔5〕rag1遺伝子が機能しない、又はrag1遺伝子、alb1遺伝子及びroy遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該移植の前又は後に被検物質を投与し、当該他家組織に対する被検物質の作用を検出することを特徴とする当該他家組織に作用する薬物のスクリーニング法。
〔6〕rag1遺伝子、alb1遺伝子及びroy遺伝子が機能しないフィッシュ。
なお、rag1、alb1及びroy遺伝子が機能しない魚を宿主とした場合には、体表面が透明となり、移植後の組織が生着、成長する様子が肉眼で観察可能である。
まず最初にゼブラフィッシュrag1突然変異体(rag1-/-)において移植片に対する免疫拒絶反応がおこるか検討を行った。図1に示す様にAB/Tu系統の精巣断片を各系統に移植した。すなわち、AB/Tu系統の精巣を約5分割し、rag1-/-、wild-type(IndiaもしくはTM系統)の雄の皮下に移植した。移植した宿主は10μg/mLの抗生物質(gentamicin)を含む0.4×PBS中で暗所で4日間餌を与えずに飼育して傷口を修復させ、その後は通常の飼育水中で4週間飼育した。移植片の解析は、移植片が回収された場合はブアン固定し組織切片を作成して観察した。その結果を表1に示す。各系統に移植されたAB/Tu系統の精巣断片(同種異系)のうち、4週間後に移植片が拒絶反応によって消失せずに回収された数を示す。Rag1突然変異体に移植された移植片の大部分は拒絶されずに生存し、その他の系統に移植された場合は全て拒絶された事が分かる。この結果は、rag1突然変異体では少なくとも同種異系組織に対しては免疫拒絶反応をおこさない事を明らかに示している。
rag1突然変異体が腫瘍化組織の移植実験に使用可能か検討を行った。すなわち、腫瘍化精巣を取り出し(図3A)、腫瘍化精巣は巨大でそのままでは移植困難なため移植可能なサイズに断片化した(図3B)。この断片をrag1突然変異体の雄に皮下移植した(図3D,E)。3ヶ月後には移植部分が大きく膨らみ(図3F,G)、元の腫瘍化精巣とほぼ同サイズにまで成長していた。BとCは同じ倍率の写真であるため、移植により大きく成長する事が分かる。移植断片の成長は宿主の外見からも観察することができる(D−G,矢印)。これらの写真は図4のB系統の腫瘍化精巣を用いた時の写真である。この様に大きくなった移植片を取り出し、更に移植を行って継代を行いその結果を図4にまとめた。
この実験に用いた4種の腫瘍化精巣は再度断片化して移植しても大きく成長し、1年以上の長期間に渡って維持できることが明らかとなった。
A系統の腫瘍精巣では継代によって宿主が早期に死亡してしまう現象が見られ、図5に示す様にこの様なケースでは移植した断片の性質が変性している事が分かった。本来であれば腫瘍化精巣が発生した個体は長くは生きられないため、ここまで精巣が変性してしまうまえに死亡してしまう。宿主が早期に死亡してしまう事から、腫瘍化精巣が長期間生き続ける事によって、悪性度が高まったといえる。この事から、移植された腫瘍化精巣の性質は必ずしも完全に維持出来る訳ではなく、継代には注意が必要である事が分かった。一方、その他の3種の腫瘍化精巣では宿主が早期に死亡してしまう傾向は見られず、組織学的にも大きな差は今のところ見られないため、移植による腫瘍組織の変性はそう頻繁に起こるものではないものと思われる。また多くの場合、移植後の宿主の精巣が見つからない現象が見られたため、宿主の精巣と移植された腫瘍化精巣は拮抗することが示唆された。以上の結果から、rag1突然変異体は腫瘍化組織の移植実験の宿主として十分に使用可能である事が示唆された。
これまでrag1突然変異体を宿主に用いる事によって、精巣および腫瘍化精巣の移植が可能である事が明らかとなった。次のステップとしてその他の組織も移植可能であるか検討を行った。その際、移植可能な大きさであり、かつ全ての種類の器官を備えている3日胚を用いて移植実験を行った。すなわち、形態形成がほぼ終了した3日胚2つをrag1突然変異体1個体に移植し、2ヶ月間飼育した。移植胚は融合していたが、宿主中で拒絶されず大きく成長し、眼球や拍動する心臓を観察する事が出来た(図6A)。この胚をブアン固定し、組織切片を作成してHE染色を行ったところ、眼球(図6B)、筋肉(図6C)、腸管(図6D)等が観察された。
しかし、この時の移植胚では生殖巣を観察する事が出来なかった。移植精巣は宿主の精巣と拮抗する傾向がある事が把握出来ていたため、次にdead−end遺伝子のノックダウンによって生殖細胞を除去したrag1突然変異体を用いて再度胚移植実験を行った。この実験では生殖細胞でEGFP遺伝子を発現するvas::EGFPトランスジェニック個体の3日胚と6日胚を1匹丸ごと、および胴体のみの状態で移植した。
これまでの結果より、ゼフラフィッシュrag1突然変異体は少なくとも同種異系組織の移植実験に宿主として使用可能である事が示された。しかし、この突然変異体では正常に色素細胞が形成されるため、成体に組織を移植するとそのままでは移植片を観察出来ず、解析するには宿主を殺して移植片を取り出す必要がある。この点を改良するため、色素細胞が形成されないために成体でも魚体が透明になるalb;roy二重突然変異体とかけ合わせてalb;roy;rag1三重突然変異体を作成した。この個体を宿主としてsox17::EGFPトランスジェニック個体由来の腫瘍化精巣断片3つを3個体に移植した。この移植片ではsox17プロモーターによって移植片内の多数を占める精原細胞でEGFPが発現するため、移植片をEGFPの蛍光により観察することができる。移植1ヶ月後に宿主を麻酔して生かしたまま観察したところ、移植片が観察され(図9A、矢印)、蛍光観察ではさらに明瞭に移植片が観察された(図9a、矢印)。この結果はalb;roy;rag1三重突然変異体を宿主に用いる事によって移植組織を生きたまま観察する事が可能になった事を示している。
Claims (6)
- rag1遺伝子が機能しない、又はrag1遺伝子、alb1遺伝子及びroy遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該成魚を移植傷口が修復するまで抗生物質存在下で飼育することを特徴とする他家組織の魚体内での継代維持法。
- 魚が、ゼブラフィッシュである請求項1記載の継代維持法。
- 他家組織が、魚の他家組織である請求項1又は2記載の継代維持法。
- 他家組織が、他家腫瘍組織である請求項1又は2記載の継代維持法。
- rag1遺伝子が機能しない、又はrag1遺伝子、alb1遺伝子及びroy遺伝子が機能しない成魚皮下に他家組織を移植し、当該成魚を移植傷口が修復するまで抗生物質存在下で飼育し、当該移植の前又は後に被検物質を投与し、当該他家組織に対する被検物質の作用を検出することを特徴とする当該他家組織に作用する薬物のスクリーニング法。
- rag1遺伝子、alb1遺伝子及びroy遺伝子が機能しないフィッシュ。
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