JP6448922B2 - Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same - Google Patents
Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP6448922B2 JP6448922B2 JP2014118781A JP2014118781A JP6448922B2 JP 6448922 B2 JP6448922 B2 JP 6448922B2 JP 2014118781 A JP2014118781 A JP 2014118781A JP 2014118781 A JP2014118781 A JP 2014118781A JP 6448922 B2 JP6448922 B2 JP 6448922B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- model animal
- stroke
- stroke model
- brain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 111
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 80
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 73
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 claims description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 49
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 claims description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 30
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 claims description 30
- 102100033902 Endothelin-1 Human genes 0.000 claims description 29
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 29
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 27
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 27
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 21
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims description 21
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 claims description 20
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 17
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 16
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 claims description 16
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 claims description 16
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 5
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000011631 stroke animal model Methods 0.000 claims 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 93
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 64
- 230000006870 function Effects 0.000 description 44
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 39
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 39
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 37
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 24
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 23
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 21
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 21
- 241000282564 Macaca fuscata Species 0.000 description 19
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 17
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 17
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 15
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 12
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 11
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 10
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 9
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 9
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 9
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 9
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 9
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 9
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 9
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 8
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 8
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 8
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 5
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 5
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 5
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 5
- 208000022084 motor paralysis Diseases 0.000 description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 5
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 5
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 4
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 4
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 4
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 4
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002637 putamen Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 4
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241001515796 Cebinae Species 0.000 description 3
- 102000003965 Endothelin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000387 Endothelin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102100029109 Endothelin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108010072844 Endothelin-3 Proteins 0.000 description 3
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 3
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 3
- 241001507252 Japanese monkeys Species 0.000 description 3
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000001159 caudate nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N chembl1790180 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CC=3C=CC=CC=3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](CCC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)[C@H](C)O)=O)NC(=O)[C@@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N 0.000 description 3
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 3
- MLFJHYIHIKEBTQ-IYRKOGFYSA-N endothelin 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 MLFJHYIHIKEBTQ-IYRKOGFYSA-N 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 2
- 206010019468 Hemiplegia Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004247 hand Anatomy 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N medetomidine Chemical compound C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CN=C[N]1 HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002140 medetomidine Drugs 0.000 description 2
- DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N midazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F DDLIGBOFAVUZHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003793 midazolam Drugs 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 2
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 2
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288950 Callithrix jacchus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000008574 Intracranial Hemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282561 Macaca nemestrina Species 0.000 description 1
- 206010027926 Monoplegia Diseases 0.000 description 1
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 241000282696 Saimiri sciureus Species 0.000 description 1
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 208000032851 Subarachnoid Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 102000016913 Voltage-Gated Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010053752 Voltage-Gated Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000002425 internal capsule Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000003863 physical function Effects 0.000 description 1
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000003639 vasoconstrictive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、内包領域に血管障害を有する非ヒト霊長類モデル動物、当該モデル動物の作成方法、当該モデル動物を用いたスクリーニング方法、および当該モデル動物を用いた機能回復訓練の評価方法に関する。 The present invention relates to a non-human primate model animal having a vascular disorder in an inclusion region, a method for producing the model animal, a screening method using the model animal, and a method for evaluating functional recovery training using the model animal.
現在、日本人の死因の第四位は脳卒中である。脳卒中とは、脳梗塞や脳出血により脳の血管に障害が起こることにより脳の一部が壊死してしまう病態の総称であり、脳血管障害ともいう。日本においては、数十年前と比較して脳卒中の症状が生じても命を落とさずに済むケースが増加している。しかしながら、そのような場合であっても脳卒中による重い後遺症を残すケースが多い。特に、脳内の内包とよばれる領域の血管に、血管障害が起こりやすいことが知られている。この内包領域は運動性神経線維等の様々な神経線維が走行していることでも知られており、例えば、内包領域の中で運動性神経線維が走行する部分が壊死すると、手足等の麻痺が後遺症として残ってしまう。このような後遺症は、患者のＱＯＬ(Quality of Life)を著しく低下させるため、内包領域の壊死に由来する後遺症回復のための治療法確立が長く望まれている。 Currently, the fourth leading cause of death among Japanese is stroke. Stroke is a general term for a pathological condition in which a part of the brain is necrotized due to damage to a blood vessel of the brain due to cerebral infarction or cerebral hemorrhage, and is also referred to as cerebrovascular disorder. In Japan, compared to decades ago, there are an increasing number of cases where it is not necessary to lose life even if stroke symptoms occur. However, even in such cases, there are many cases in which severe sequelae due to stroke remain. In particular, it is known that a blood vessel disorder is likely to occur in a blood vessel in a region called an internal brain. This inclusion region is also known to run various nerve fibers such as motor nerve fibers. For example, if the part where the motor nerve fibers run in the inclusion region is necrotic, paralysis of limbs and the like may occur. It remains as a sequelae. Since such sequelae significantly lower the quality of life (QOL) of patients, establishment of a therapeutic method for recovery of sequelae resulting from necrosis in the encapsulated region has long been desired.
これまでにライフサイエンス研究分野において、多くのモデル動物が作成されており、ライフサイエンス分野の研究の進展や特定の疾患に対する治療法の確立に貢献してきた。脳科学研究においても例外ではなく、例えば脳の損傷に由来する疾患のメカニズム解明のため、また、当該疾患の治療法確立のために多くのモデル動物が作出されてきた。
特許文献１には、脳梗塞に対する治療薬の開発に有効なモデル動物として、非ヒト霊長類のモデル動物が記載されている。より詳細には、光感受性色素を非ヒト霊長類の末梢血中に投与し、さらに当該非ヒト霊長類の大脳皮質表面に対してコールドランプを照射することにより、所望する大脳皮質(灰白質)の部位に限局的なラクナ性脳梗塞を生じさせる方法が開示されている。しかしながら、特許文献１に開示される方法では、内包領域のような脳内深部の所望する領域に対して血管障害を起こすことができない。
So far, many model animals have been created in the life science research field and have contributed to the progress of research in the life science field and the establishment of treatments for specific diseases. There are no exceptions in brain science research, and many model animals have been created for elucidating the mechanisms of diseases resulting from brain damage, for example, and for establishing treatments for the diseases.
Patent Document 1 describes a non-human primate model animal as a model animal effective in developing a therapeutic agent for cerebral infarction. More specifically, a desired cerebral cortex (grey matter) is obtained by administering a photosensitive dye into the peripheral blood of a non-human primate and further irradiating a cold lamp on the surface of the non-human primate cerebral cortex. A method for producing a local lacunar cerebral infarction at the site is disclosed. However, the method disclosed in Patent Document 1 cannot cause a vascular disorder in a desired region deep in the brain, such as an encapsulated region.
上記の特許文献１の他にも脳卒中のモデル動物は存在するが、その多くは中大脳動脈と呼ばれる血管に梗塞を作成したものであり(例えば、非特許文献１)、内包領域内に血管障害を有するモデル動物は知られていない。なお、これらのモデル動物は、急性期(脳卒中の発症直後から１〜２週間以内)に血栓を溶解するための薬品の評価には使用することができる。しかしながら、これらのモデル動物では脳の損傷が大きくなってしまうため、脳の損傷により失った機能についてほとんど回復が見込めない。よって、慢性期に投与する治療薬(例えば、損傷部位以外の脳の領域で神経回路の再構成を促すための治療薬)や機能回復訓練が機能の回復を促進するか評価するためにはふさわしくない。 In addition to the above-mentioned Patent Document 1, there are stroke model animals, many of which are infarcted in blood vessels called middle cerebral arteries (for example, Non-Patent Document 1), and vascular disorders in the inclusion region No model animal is known. In addition, these model animals can be used for evaluation of chemicals for dissolving thrombus in the acute phase (within 1 to 2 weeks from immediately after the onset of stroke). However, in these model animals, the brain damage becomes large, so that almost no recovery can be expected for the function lost due to the brain damage. Therefore, it is appropriate to evaluate whether therapeutic drugs administered in the chronic phase (e.g., therapeutic drugs that promote reconfiguration of the neural circuit in the brain region other than the damaged site) or functional recovery training promotes functional recovery. Absent.
また、非特許文献２には、ラットの脳内における内包領域の周辺にコラゲネースＩＶを注入することにより出血を引き起こし、運動機能障害を有するラットを作成したことが開示されている。しかしながら、非特許文献２に作成されたモデルラットでは、内包領域の周辺に出血を起こしたものであり、当該モデル動物は内包領域以外の脳の領域に血管障害を有している。すなわち、当該モデル動物は内包領域内に限局して血管障害が生じていないため、内包領域以外の領域における血管障害の影響を排除することができない。また、脳損傷後には損傷していない他の脳の部分が機能を代償するために神経回路が再構成されることが知られている。しかしながら、内包領域周辺の領域にも血管障害を有する当該モデル動物では、内包領域損傷時の内包領域以外の領域における神経回路の再構成を正しく評価することが困難である。 Non-Patent Document 2 discloses that a rat having motor dysfunction was produced by causing bleeding by injecting collagenase IV into the periphery of the encapsulated region in the brain of the rat. However, in the model rat created in Non-Patent Document 2, bleeding occurred around the inclusion region, and the model animal has a vascular disorder in a brain region other than the inclusion region. That is, since the model animal is confined within the inclusion region and no vascular injury has occurred, the influence of the vascular injury in a region other than the inclusion region cannot be excluded. It is also known that after a brain injury, a neural circuit is reconfigured so that other parts of the brain that are not damaged compensate for the function. However, in the model animal having a vascular disorder also in the region around the inclusion region, it is difficult to correctly evaluate the reconstruction of the neural circuit in the region other than the inclusion region when the inclusion region is damaged.
また、脳卒中の後遺症を患う患者において、手先の器用な動作等の高度な機能については、麻痺の回復が特に難しいことが知られている。そして、高度な機能である故に、脳卒中の後遺症を患う患者のＱＯＬを大きく損ねる原因となることが多い。しかしながら、このような高度な機能について、機能回復を評価できるモデル動物は現在までに知られていない。 It is also known that in patients suffering from sequelae of stroke, it is particularly difficult to recover from paralysis with respect to advanced functions such as dexterous hand movement. And since it is an advanced function, it often causes the QOL of patients suffering from sequelae of stroke to be greatly impaired. However, there is no known model animal that can evaluate functional recovery for such advanced functions.
上記問題点に鑑み、本発明の課題は、内包領域内に血管障害を有する脳卒中モデル動物であって、内包領域内の血管障害に由来する機能障害を回復するための治療法を評価することのできる脳卒中モデル動物を作成することにある。
また、本発明の課題は、内包領域内の血管障害に由来する機能障害であって、かつ、高度な機能に関する機能障害についての機能回復を評価することのできる脳卒中モデル動物を作成することにある。
In view of the above problems, an object of the present invention is a stroke model animal having a vascular disorder in an inclusion region, and evaluating a treatment method for recovering a dysfunction derived from the vascular disorder in the inclusion region. The goal is to create a stroke model animal.
Another object of the present invention is to create a stroke model animal that is a dysfunction derived from a vascular disorder in an inclusion region and that can evaluate functional recovery for a dysfunction related to advanced functions. .
本発明者らは、上記課題に鑑みて研究を重ねた結果、非ヒト霊長類である被験体の脳内を核磁気共鳴画像法等により画像化して内包領域を同定し、内包領域のうちの目的とする領域全体に血管障害誘導剤を注入することにより、内包領域の一部に血管障害を有する脳卒中モデル動物を作成することに成功した。 As a result of repeated research in view of the above problems, the present inventors identified the inclusion region by imaging the brain of a subject that is a non-human primate by nuclear magnetic resonance imaging, etc. By injecting a vascular disorder inducer into the entire target region, we succeeded in creating a stroke model animal having a vascular disorder in a part of the inclusion region.
即ち、本発明は、
非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部であって、
前記脳卒中モデル動物は、脳の内包領域の一部に血管障害を有し、
それにより、血管障害を有する前記内包領域の一部に対応する身体の機能に障害を有する、脳卒中モデル動物またはその生体の一部に関する。
That is, the present invention
A non-human primate stroke model animal or part of its living body,
The stroke model animal has a vascular disorder in a part of the brain inclusion region,
Accordingly, the present invention relates to a stroke model animal or a part of its living body having a disorder in a body function corresponding to a part of the inclusion region having a vascular disorder.
ここで、本発明の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の一実施の形態においては、
前記身体の機能における障害が、回復可能なものであることを特徴とする。
また、本発明の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の一実施の形態においては、
内包領域を除く他の脳の領域に血管障害を有しないことを特徴とする。
また、本発明の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の一実施の形態においては、
前記内包領域が内包後脚領域の中の上肢または下肢の運動性神経線維が走行する領域であって前記障害が上肢または下肢であることを特徴とする。
また、本発明の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の一実施の形態においては、
前記脳卒中モデル動物が、マカクザルであることを特徴とする。
Here, in one embodiment of the stroke model animal of the present invention or a part of its living body,
The disorder in the function of the body is recoverable.
In one embodiment of the stroke model animal of the present invention or a part of its living body,
It is characterized by having no vascular disorder in other brain regions except the inclusion region.
In one embodiment of the stroke model animal of the present invention or a part of its living body,
The inner region is a region in which a motor nerve fiber of an upper limb or a lower limb in an inner hind leg region runs, and the disorder is an upper limb or a lower limb.
In one embodiment of the stroke model animal of the present invention or a part of its living body,
The stroke model animal is a macaque monkey.
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法であって、
（ａ）前記脳卒中モデル動物の脳のうち内包領域を含む部分を画像化して、内包領域のうちの目的の領域を同定する工程と、
（ｂ）同定した内包領域の目的の領域に血管障害誘導剤を注入する工程と
を含むことを特徴とする、作成方法に関する。
ここで、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、
前記(ａ)工程において、内包領域を含む部分の画像化が核磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)によって行われることを特徴とする。
また、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、
上記の作成方法のうち、前記工程(ｂ)の前に、下記の工程(ａ’)をさらに含むことを特徴とする；
（ａ’）同定した内包領域の一部に、一時的かつ可逆的に神経線維の伝達機能を阻害する薬剤を注入する工程であって、前記脳卒中モデル動物に目的とする障害が生じることを確認する工程。
また、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、
前記一時的かつ可逆的に神経線維の伝達機能を阻害する薬剤が、テトロドトキシンであることを特徴とする。
また、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、
前記血管障害誘導剤が、エンドセリン-１またはコラゲネースＩＶであることを特徴とする。
また、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、上記の作成方法であって、
前記脳卒中モデル動物は脳の内包領域の目的の領域に血管障害を有することにより、前記内包領域の目的の領域に対応する身体の機能に回復可能な障害を有することを特徴とする。
また、本発明の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物またはその生体の一部の作成方法の一実施の形態においては、上記の作成方法であって、
前記脳卒中モデル動物が内包領域を除く他の脳の領域に血管障害を有しないことを特徴とする。
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a non-human primate stroke model animal or a part of its living body,
(A) imaging a portion including an inclusion region of the brain of the stroke model animal, and identifying a target region of the inclusion region;
And (b) a step of injecting a vascular disorder inducer into a target region of the identified inclusion region.
Here, in one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of its living body,
In the step (a), imaging of the portion including the inclusion region is performed by nuclear magnetic resonance imaging (MRI).
In one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of the living body thereof,
Of the above preparation methods, the method further comprises the following step (a ′) before the step (b);
(A ′) A step of injecting a drug that temporarily and reversibly inhibits the nerve fiber transmission function into a part of the identified inclusion region, and confirming that the target disorder occurs in the stroke model animal Process.
In one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of the living body thereof,
The agent that temporarily and reversibly inhibits nerve fiber transmission function is tetrodotoxin.
In one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of the living body thereof,
The vascular disorder inducer is endothelin-1 or collagenase IV.
Further, in one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of the living body thereof, the production method described above,
The stroke model animal has a disorder in which the body function corresponding to the target region of the inclusion region can be recovered by having a vascular disorder in the target region of the inclusion region of the brain.
Further, in one embodiment of the method for producing a non-human primate stroke model animal of the present invention or a part of the living body thereof, the production method described above,
The stroke model animal is characterized by having no vascular disorder in other brain regions except the inclusion region.
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、脳卒中に由来する機能障害の機能回復ための治療薬のスクリーニング方法であって、
上記の脳卒中モデル動物に対して被験物質を投与する工程と、
前記脳卒中モデル動物が有する機能障害に対する前記被験物質の効果を測定する工程とを含む、スクリーニング方法に関する。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は、脳卒中に由来する機能障害の機能回復のための機能回復訓練の評価方法であって、
上記の脳卒中モデル動物が機能回復訓練を行う工程と、
前記脳卒中モデル動物が有する機能障害に対する前記機能回復訓練の効果を測定する工程と
を含む、脳卒中に由来する機能障害の機能回復のための機能回復訓練の評価方法；
に関する。
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a therapeutic agent for functional recovery of dysfunction derived from stroke,
Administering a test substance to the above stroke model animal;
And measuring the effect of the test substance on the dysfunction of the stroke model animal.
According to another aspect of the present invention, the present invention is a method for evaluating functional recovery training for functional recovery of dysfunction derived from stroke,
The above stroke model animal performs a function recovery training,
Measuring the effect of the function recovery training on the dysfunction of the stroke model animal, and evaluating the function recovery training for function recovery of the dysfunction derived from stroke;
About.
本発明の脳卒中モデル動物は、内包領域内の一部に血管障害を有するため、当該血管障害に起因する機能障害を有する。すなわち、本発明の脳卒中モデル動物は、当該機能障害に対する治療法の確立に貢献することができる。特に、従来のラット等のモデル動物では、脳が小さいために核磁気共鳴画像法等を用いたとしても内包での損傷の拡がりを正しく評価するのはほぼ不可能であった。一方で、本願の脳卒中モデル動物によれば、核磁気共鳴画像法等による内包領域の画像化による評価が可能であり、治療法の確立に使用される評価系としてより好ましい。
また、本発明の脳卒中モデル動物は非ヒト霊長類であるため、回復が困難な高度な機能の後遺症についての治療薬のスクリーニングや機能回復訓練の評価をすることが可能となる。
Since the stroke model animal of the present invention has a vascular disorder in a part of the inclusion region, it has a functional disorder caused by the vascular disorder. That is, the stroke model animal of the present invention can contribute to the establishment of a treatment method for the functional disorder. In particular, in a conventional model animal such as a rat, since the brain is small, it has been almost impossible to correctly evaluate the extent of damage in the inclusion even if nuclear magnetic resonance imaging or the like is used. On the other hand, according to the stroke model animal of the present application, the evaluation can be performed by imaging the inclusion region by nuclear magnetic resonance imaging or the like, which is more preferable as an evaluation system used for establishing a treatment method.
Furthermore, since the stroke model animal of the present invention is a non-human primate, it becomes possible to screen for therapeutic drugs and evaluate functional recovery training for sequelae of advanced functions that are difficult to recover.
本明細書において、「非ヒト霊長類」とは、内包領域の血管障害による後遺症の機能回復を評価できる非ヒト霊長類であればよく、ヒトを除く霊長類から適宜選択することができる。特に、本発明の脳卒中モデル動物は、母指と示指で小さな物体を保持するつまみ動作(精密把握)等の高度な機能についての後遺症の機能回復を評価できるものである。このような高度な機能は、霊長類の中でも一部の種のみが行うことができる。このような高度な機能を行うことができる非ヒト霊長類としては、類人猿またはオナガザル科に属するサル、オマキザル科に属するサルを挙げることができる。類人猿としては、例えばチンパンジー、ゴリラ、オランウータンを挙げることができる。また、オナガザル科に属するサルとしては、例えばマカク属に属するニホンザル、アカゲザル、カニクイザル、ブタオザル、ボンネットモンキーなどのマカクザルを挙げることができる。また、オマキザル科に属するサルとしては、例えば、オマキザル類に属するフサオマキザルもしくはコモンリスザル、または、マーモセット類に属するコモンマーモセットなどを挙げることができる。
なお、高度な機能としては、霊長類において発達した機能であれば以下に限定されないが、例えば、手におけるつまみ動作の他、両手を用いた協調動作、対象の視覚入力による把握の選択(把握対象を視覚により認識した瞬間に把握の方法について準備をする機能)等を挙げることができる。なお、上述したつまみ動作の機能については大脳皮質運動野から脊髄運動神経細胞に至る経路(皮質運動神経路)が深く関係していることが知られているが、この皮質運動神経路は、霊長類以外には存在しない。また、両手を用いた協調動作についても二本足で体を支えられる霊長類ならではの機能であり、さらに対象の視覚入力による把握の選択も、視覚の発達した霊長類において発達した機能である。本発明の脳卒中モデル動物では、内包領域の血管障害に由来するこれらの高度な機能に対する障害について、機能回復を評価することが可能である。このように、霊長類以外のモデル動物と比べて、より有用な脳卒中モデル動物を提供することができる。
In the present specification, the “non-human primate” may be any non-human primate that can evaluate the functional recovery of sequelae due to vascular disorders in the inclusion region, and can be appropriately selected from primates other than humans. In particular, the stroke model animal of the present invention can evaluate the functional recovery of sequelae for advanced functions such as a pinch operation (precision grasping) that holds a small object with the thumb and index finger. Such advanced functions can only be performed by some species of primates. Non-human primates that can perform such advanced functions include monkeys belonging to the apes or rhesus monkeys and monkeys belonging to capuchin monkeys. Examples of apes include chimpanzees, gorillas, and orangutans. Examples of macaque monkeys belonging to the family rhesus include macaque monkeys such as Japanese macaques, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, pigtail monkeys, and bonnet monkeys belonging to the macaque genus. Examples of monkeys belonging to the family Capuchinaceae include, for example, capuchin monkeys or common squirrel monkeys belonging to capuchin monkeys, or common marmoset belonging to marmosets.
The advanced functions are not limited to the following as long as they are functions developed in primates.For example, in addition to the pinch operation in the hand, cooperative operation using both hands, selection of grasp by visual input of the target (understand target) For example, a function for preparing a grasping method at the moment when the image is visually recognized. In addition, it is known that the path from the cerebral cortex motor area to the spinal motor neurons (cortical motor nerve tract) is deeply related to the function of the knob movement described above. There is no other than the kind. Moreover, the cooperative action using both hands is a function unique to primates that can support the body with two legs, and the selection of grasping by visual input of the target is also a function developed in primates with advanced vision. In the stroke model animal of the present invention, it is possible to evaluate the functional recovery of these advanced functional disorders derived from vascular disorders in the inclusion region. Thus, a more useful stroke model animal can be provided as compared with model animals other than primates.
また、「脳卒中モデル動物の生体の一部」も本発明の「脳卒中モデル動物」と同様の目的で使用することができる。「脳卒中モデル動物の生体の一部」とは、作成された脳卒中モデル動物由来の細胞、組織、臓器などを含み、例えば、脳、血管、その他の臓器や臓器由来の組織片および細胞などを挙げることができる。これら脳卒中モデル動物の生体の一部も、例えば、機能回復の評価試験や機能回復のメカニズムの解明のための試験(例えば、組織学的な解析等)に供することができる。 In addition, “a part of the living body of a stroke model animal” can be used for the same purpose as the “stroke model animal” of the present invention. “Part of living body of a stroke model animal” includes cells, tissues, organs, etc. derived from the created stroke model animal, for example, brain, blood vessels, other organs, organ-derived tissue pieces and cells, etc. be able to. A part of the living body of these stroke model animals can also be subjected to, for example, an evaluation test of functional recovery and a test for elucidating the mechanism of functional recovery (for example, histological analysis).
本明細書において、「脳卒中」とは、脳内の血管障害により脳細胞の一部が壊死する病気であり、虚血性の脳梗塞および一過性脳虚血発作、ならびに、出血性の脳出血およびくも膜下出血を含む。また、本明細書において「血管障害」とは、虚血性および出血性の両方の血管障害を含む。特に、本発明の脳卒中モデル動物における血管障害は、血管障害誘導剤の脳内への注入により誘起される。 As used herein, “stroke” is a disease in which a portion of brain cells is necrotic due to vascular injury in the brain, and ischemic stroke and transient ischemic attack, as well as hemorrhagic cerebral hemorrhage and Includes subarachnoid hemorrhage. In addition, the term “vascular disorder” used herein includes both ischemic and hemorrhagic vascular disorders. In particular, the vascular disorder in the stroke model animal of the present invention is induced by injection of a vascular disorder inducing agent into the brain.
本発明に使用される血管障害誘導剤は、脳内の注入された部位において虚血性の血管障害または出血性の血管障害を誘起できる薬剤であればよく、公知の薬剤を使用することができる。虚血性の血管障害を誘起する血管障害誘導剤としては、例えば、エンドセリン(エンドセリン-１(ＥＴ-１)、エンドセリン-２(ＥＴ-２)、エンドセリン-３(ＥＴ-３))等の血管収縮剤を挙げることができる。なお、エンドセリン-３は組織により活性が弱い場合があり、その点においてはエンドセリン-１およびエンドセリン-２の使用が好ましい。また、出血性の血管障害を誘起する血管障害誘導剤としては、コラゲネースＩＶ(collagenase IV)を好適に使用することができる。なお、コラゲネースＩＶ以外のコラゲネースでは、血管以外の組織や神経細胞の受容体等を破壊する可能性があるため、この点においてコラゲネースＩＶの使用が好ましい。 The vascular disorder inducer used in the present invention may be any drug that can induce ischemic vascular disorder or hemorrhagic vascular disorder at the site of injection in the brain, and known drugs can be used. Examples of the vascular injury inducer that induces ischemic vascular injury include vasoconstriction such as endothelin (endothelin-1 (ET-1), endothelin-2 (ET-2), endothelin-3 (ET-3)). An agent can be mentioned. Endothelin-3 may be less active depending on the tissue, and in that respect, endothelin-1 and endothelin-2 are preferably used. In addition, collagenase IV can be preferably used as a vascular disorder inducer that induces hemorrhagic vascular disorder. Since collagenase other than collagenase IV may destroy tissues other than blood vessels, receptors of nerve cells, and the like, the use of collagenase IV is preferable in this respect.
また、本発明において、「内包領域」とは、尾状核・視床と、レンズ核(被殻および淡蒼球)に挟まれた繊維側と定義される領域であり、内包前脚、内包膝、内包後脚の３つの部分に区別することができる領域である。例えば、内包領域のうちの内包後脚領域には、手足等の運動機能に関係する運動性神経線維が走行している。
本発明の脳卒中モデル動物は、この内包領域の一部において血管障害を有する。ここで、「内包領域の一部」とは、目的とする機能障害に関連した神経線維が走行する内包領域の部分を意味する。例えば、上肢の機能が麻痺した脳卒中モデル動物を作成する際には、内包領域の一部は、内包後脚領域のうち上肢の神経線維が走行する領域を意味する。同様に、下肢の機能が麻痺した脳卒中モデル動物を作成する際には、内包領域の一部は、内包後脚領域のうちの下肢の神経線維が走行する領域を意味する。また、顔の機能が麻痺した脳卒中モデル動物を作成する際には、内包領域の一部は、内包後脚領域のうちの顔の神経線維が走行する領域を意味する。
なお、当業者であれば、上記に列挙した上肢、下肢、または顔に関連した神経走行領域以外についても、公知の文献(例えば、Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain)を参照することにより、身体の部位に対応する神経線維の走行領域を内包領域内に同定することができる。
このように、目的とする各機能に対応する内包領域の部分に血管障害を起こすことにより、目的の障害を有するモデル動物を作成することができる。
Further, in the present invention, the `` inclusion area '' is an area defined as the fiber side sandwiched between the caudate nucleus / thalamus and the lens nucleus (putamen and pallidum), the inner leg, the inner knee, This is a region that can be distinguished into three parts of the inner leg. For example, a motor nerve fiber related to a motor function such as a limb runs in an inner hind leg region in the inner region.
The stroke model animal of the present invention has a vascular disorder in a part of this inclusion region. Here, “part of the inclusion region” means a portion of the inclusion region where nerve fibers associated with the target functional disorder travel. For example, when creating a stroke model animal in which the function of the upper limb is paralyzed, a part of the encapsulated area means an area in which the nerve fiber of the upper limb runs in the hind leg area. Similarly, when a stroke model animal in which the function of the lower limb is paralyzed is created, a part of the encapsulated area means an area where nerve fibers of the lower limb run in the encapsulated rear leg area. Further, when creating a stroke model animal with a paralyzed facial function, a part of the encapsulated area means an area where the nerve fibers of the face of the encapsulated rear leg area run.
It should be noted that those skilled in the art should refer to known literature (eg, Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain) other than the above-listed nerve running regions related to the upper limbs, lower limbs, or face. Thus, the running region of the nerve fiber corresponding to the body part can be identified in the inclusion region.
In this way, a model animal having a target disorder can be created by causing a vascular disorder in a portion of the inclusion region corresponding to each target function.
また、本発明の脳卒中モデル動物は、内包領域の血管障害による機能障害が、回復可能なものであることを特徴としている。ここで、機能障害が回復可能であるとは、内包領域の血管障害に起因する障害が、自然治癒力により時間の経過とともに完全または不完全に回復可能なことをいう。これにより、機能障害の回復過程における回復促進のための薬剤のスクリーニングや機能回復訓練の評価を行うことが可能となる。
なお、本発明の一実施の形態によれば、脳卒中モデル動物の脳内の内包領域に限局した血管障害を生じさせることができ、これにより脳卒中モデル動物は、内包領域以外の脳の領域に血管障害を有さない。このような脳卒中モデルによれば、内包以外の他の脳の領域における血管障害による直接の影響を排除することができ、内包領域に血管障害が生じた脳卒中患者の後遺症の治療法確立のためのより適した脳卒中モデル動物を提供することが可能となる。さらに、内包領域以外の他の脳の領域に血管障害を有さないので、内包領域内に血管障害を有するモデル動物として、内包領域以外の脳内の領域における神経回路の再構成を正しく評価することができる。なお、より好ましい形態は、本発明の脳卒中モデル動物は内包領域のうちの目的とする領域以外の内包領域にも血管障害を有しない。例えば、上肢のみに麻痺を有する脳卒中モデル動物は、上肢の運動性神経線維が内包後脚領域に走行していることから、内包領域内であっても内包前脚または内包膝に血管障害を有しない。また、さらに好ましい形態は、内包後脚領域のうち上肢の運動性神経線維が走行する領域のみに血管障害を有し、内包後脚領域の他の部分にも血管障害を有しない脳卒中モデル動物である。
In addition, the stroke model animal of the present invention is characterized in that a functional disorder caused by a vascular disorder in the inclusion region can be recovered. Here, that the functional disorder is recoverable means that the disorder caused by the vascular disorder in the inclusion region can be completely or incompletely recovered over time by natural healing power. This makes it possible to perform screening of drugs for promoting recovery and evaluation of functional recovery training in the recovery process of functional impairment.
According to one embodiment of the present invention, it is possible to cause a vascular disorder limited to an inclusion region in the brain of a stroke model animal, whereby the stroke model animal has a blood vessel in a region of the brain other than the inclusion region. There are no obstacles. According to such a stroke model, it is possible to eliminate the direct influence of vascular disorders in other brain regions other than the endothelium, and to establish a treatment method for the sequelae of stroke patients who have vascular disorders in the encapsulated area. A more suitable stroke model animal can be provided. Furthermore, since there is no vascular disorder in other brain regions other than the inclusion region, as a model animal having a vascular disorder in the inclusion region, the reconfiguration of the neural circuit in the brain region other than the inclusion region is correctly evaluated. be able to. In a more preferred embodiment, the stroke model animal of the present invention does not have a vascular disorder in the inclusion region other than the target region in the inclusion region. For example, a stroke model animal that has paralysis only in the upper limb has no vascular disorder in the inner leg or inner knee even in the inner region because the motor nerve fibers of the upper limb run in the rear leg region. . Furthermore, a more preferable form is a stroke model animal that has a vascular disorder only in the region where the motor nerve fiber of the upper limb runs in the inner hind leg region and has no vascular disorder in other parts of the inner hind leg region. is there.
本発明の脳卒中モデル動物は、（ａ）脳卒中モデル動物の脳のうち内包領域を含む部分を画像化して、内包領域のうちの目的の領域を同定し、（ｂ）同定した内包領域のうちの目的の領域に血管障害誘導剤を注入することにより作成することができる。
上述のように、本発明の脳卒中モデル動物を作成する工程としては、まず、（ａ）脳卒中モデル動物の脳のうち内包領域を含む部分を画像化して、内包領域のうちの目的の領域の同定を行う。
内包領域を含む部分の画像化は、各被験体の脳内の構造を把握し、目的とする領域を同定するために行うことができる。このような脳内の構造の画像化は、当業者であれば公知の方法により行うことができ、例えば、核磁気共鳴装置を用いた核磁気共鳴画像法(ＭＲＩ；magnetic resonance imaging)、コンピュータ断層撮影法(ＣＴ；computed tomography)により画像化することができる。
また、核磁気共鳴画像法等により画像化された脳内の断面図は、公知の画像解析装置やプログラム等を用いて三次元再構築することができる。三次元再構築された脳内の画像により、内包領域のうち目的の領域を同定することができる。
The stroke model animal of the present invention comprises (a) imaging a portion including an inclusion region in the brain of a stroke model animal, identifying a target region in the inclusion region, and (b) out of the identified inclusion regions. It can be created by injecting a vascular disorder inducer into the target region.
As described above, the step of creating the stroke model animal of the present invention includes (a) imaging a portion including the inclusion region in the brain of the stroke model animal and identifying a target region in the inclusion region. I do.
The imaging of the part including the inclusion region can be performed in order to grasp the structure in the brain of each subject and identify the target region. Such imaging of the structure in the brain can be performed by a person skilled in the art by a known method, for example, nuclear magnetic resonance imaging (MRI) using a nuclear magnetic resonance apparatus, computer tomography. It can be imaged by a CT (computed tomography).
In addition, a cross-sectional view in the brain imaged by nuclear magnetic resonance imaging or the like can be reconstructed three-dimensionally using a known image analysis device or program. The target region of the inclusion region can be identified by the three-dimensionally reconstructed brain image.
内包領域における目的の領域の同定については、当業者であれば、公知の情報および得られた脳内の画像を用いて適宜行うことができる。例えば、上述したように、公知の文献(例えば、Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain)を参考にして内包領域における目的の領域を決定することができる。
例えば、上肢の神経線維が走行する領域は、内包後脚領域のうち、前後軸として中心溝の前端から３ｍｍ後方、内外側としては被殻または淡蒼球と尾状核または視床との間に存在する白質領域として同定することができる。また、下肢の神経線維が走行する領域は、内包後脚領域のうち、被殻の後端付近の前額断面における領域として同定することができる。また、顔の神経線維が走行する領域は、内包後脚領域のうち、中心後前端から３ｍｍ前方の前額断面における領域として同定することができる。
なお、神経線維の走行はマカク属に属するサルで詳細に調べられているが、非ヒト霊長類として上記に列挙したオナガザル科に属するサルまたはオマキザル科に属するサルにおいても内包領域の神経線維の走行はほぼ同一であり、マカク属のサルの脳内の情報を基にこれらのサルについても内包領域における目的の領域を同定することが可能である。また、類人猿の脳においてもマカク属のサルと神経線維の走行はほぼ同じであると考えられ、同様に内包領域における目的の領域を同定することができる。
このように、本発明の脳卒中モデル動物は、内包領域のうち目的とする領域を予め画像化により同定するため、内包領域の目的とする領域に血管障害を誘導することができる。
A person skilled in the art can appropriately identify the target region in the inclusion region using known information and the obtained image in the brain. For example, as described above, a target region in the inclusion region can be determined with reference to known literature (for example, Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain).
For example, the region in which the nerve fiber of the upper limb runs is 3 mm rearward from the front end of the central groove as the anteroposterior axis in the inner posterior leg region, and between the putamen or pallidum and the caudate nucleus or thalamus as the inner and outer sides It can be identified as an existing white matter region. Moreover, the area | region where the nerve fiber of a lower limb runs can be identified as an area | region in the forehead cross section near the rear end of the putamen among the inner hind leg areas. Further, the region where the nerve fibers of the face run can be identified as a region in the
In addition, although the nerve fiber running has been examined in detail in monkeys belonging to the macaque genus, the nerve fiber running in the encapsulated region is also found in the monkeys belonging to the rhesus family listed above as non-human primates or the monkeys belonging to the macaque family. Are substantially the same, and it is possible to identify the target region in the inclusion region for these monkeys based on the information in the brains of macaque monkeys. In the apes brain, it is considered that the running of nerve fibers is almost the same as that of macaque monkeys, and the target region in the inclusion region can be identified in the same manner.
As described above, the stroke model animal of the present invention identifies the target region of the inclusion region in advance by imaging, and thus can induce a vascular disorder in the target region of the inclusion region.
なお、脳内の画像化の際には、被験体に麻酔を導入しておくことが好ましい。麻酔の導入については、当業者であれば、各被験体のサルの種別、体重等により適宜好ましい麻酔の導入方法を選択することができる。例えば、ニホンザルに対しては、ケタミン、メデトミジン、およびミダゾラムの筋肉注射により麻酔を導入することができる。 Note that it is preferable to introduce anesthesia into the subject when imaging in the brain. Regarding the introduction of anesthesia, those skilled in the art can appropriately select a preferable method for introducing anesthesia according to the type of monkey, body weight, etc. of each subject. For example, Japanese monkeys can be anesthetized by intramuscular injection of ketamine, medetomidine, and midazolam.
上述のように内包領域のうちの目的とする領域を同定した後、(ｂ)同定した内包領域の目的の領域に血管障害誘導剤を注入することにより、目的の障害を有する脳卒中モデル動物を作成することができる。
血管障害誘導剤の注入の方法は、以下に記載の方法に限定されないが、例えば下記のようにして行うことができる。
まず、血管障害誘導剤を内包領域の目的の領域へ注入するために、被験体に麻酔を導入し、頭皮の切開および頭蓋骨の除去を行う。これにより、内包領域の背側に位置する硬膜を露出させ、露出した硬膜から内包領域へ向けてマイクロシリンジ等を用いて血管障害誘導剤を注入する。なお、マイクロシリンジの内包領域への刺入の方向は、内包領域内へ正しく血管障害誘導剤を注入でき、脳内の他の領域への障害を最小限に留められる限りにおいて、上記に限定されず、よって、頭皮の切開部位および頭蓋骨の除去部位も適宜変更することができる。
なお、脳内への正確な薬剤の注入には、公知の脳定位固定装置や固定装置用マイクロマニュピレーターを使用することができる。
After identifying the target region of the inclusion region as described above, (b) creating a stroke model animal having the target disorder by injecting a vascular disorder inducer into the target region of the identified inclusion region can do.
The method of injecting the vascular disorder inducer is not limited to the method described below, but can be performed, for example, as follows.
First, in order to inject a vascular disorder inducer into a target region of the inclusion region, anesthesia is introduced into the subject, and the scalp is incised and the skull is removed. Thereby, the dura mater located on the back side of the inclusion region is exposed, and a vascular disorder inducer is injected from the exposed dura into the inclusion region using a microsyringe or the like. The direction of insertion into the inclusion region of the microsyringe is limited to the above as long as the vascular injury inducing agent can be correctly injected into the inclusion region and damage to other regions in the brain can be minimized. Therefore, the incision site of the scalp and the removal site of the skull can be changed as appropriate.
A known brain stereotaxic device or a micromanipulator for a fixing device can be used for accurate drug injection into the brain.
内包領域のうちの目的とする領域への血管障害誘導剤の注入は、１箇所ではなく、複数個所に対して行うことが好ましい。内包領域は前後および背腹側に拡がっているため、一箇所に過剰な薬剤の量を注入してしまうと内包領域を超えて内外側方向に隣接した脳領域(視床やレンズ核)に薬剤が拡がることになる。それにより認知や感覚機能に重篤な障害が生じてしまうと、特に、運動機能回復を評価するためにふさわしくない。このような問題に対し、本発明者らは、鋭意検討の結果、血管障害誘導剤が目的とする領域全体に広がるように複数個所へ血管障害誘導剤を注入することにより、脳卒中モデル動物に目的とする回復可能な障害を生じさせることができることを見出した。例えば、上肢に麻痺を生じた脳卒中モデル動物を作成する場合には、内包後脚領域のうち、上肢に関わる神経線維が走行する領域全体に薬剤が分布するように血管障害誘導剤を注入することが好ましい。 The injection of the vascular disorder inducer into the target region of the inclusion region is preferably performed at a plurality of locations rather than at one location. Since the encapsulated area extends to the front and rear and to the dorsoventral side, if an excessive amount of drug is injected into one place, the drug will enter the brain area (thalamus and lens nucleus) adjacent to the inner and outer sides beyond the encapsulated area. Will spread. If it causes severe impairments in cognition and sensory function, it is not particularly suitable for assessing motor function recovery. As a result of diligent investigations, the present inventors have investigated the purpose of a stroke model animal by injecting a vascular disorder inducer into a plurality of locations so that the vascular disorder inducer spreads over the entire target region. And found that it can cause a recoverable failure. For example, when creating a stroke model animal with paralysis in the upper limb, injecting a vascular disorder inducing agent so that the drug is distributed throughout the area where nerve fibers related to the upper limb run in the rear leg area of the internal capsule. Is preferred.
また、血管障害誘導剤の注入は、所望する障害により適宜設定することができ、右脳または左脳のいずれか一方または両方に血管障害誘導剤を注入することができ、また、１種または複数種(例えば、上肢に関する神経線維と下肢に関する神経線維の組み合わせ)の神経線維が走行する領域に血管障害誘導剤を注入することができる。所望する障害とは、例えば、上下肢のうち一肢のみにおける麻痺(単麻痺)、身体の同側の上下肢における麻痺(片麻痺)、または、身体の両側上下肢における麻痺(四肢麻痺)等を挙げることができる。 Further, the injection of the vascular disorder inducer can be appropriately set depending on the desired disorder, the vascular disorder inducer can be injected into one or both of the right brain and the left brain, and one or more types ( For example, a vascular disorder inducing agent can be injected into a region where nerve fibers of a combination of nerve fibers related to the upper limb and nerve fibers related to the lower limb run. The desired disorder is, for example, paralysis in only one of the upper and lower limbs (monoplegia), paralysis in the upper and lower limbs on the same side of the body (hemiplegia), or paralysis in both upper and lower limbs of the body (limb paralysis), etc. Can be mentioned.
目的とする領域全体に血管障害誘導剤を注入するには、脳内における目的とする領域の形状を考慮して、脳の前後方向、内外方向、または背腹側方向に１ｍｍ〜３ｍｍの間隔を空けて複数個所に血管障害誘導剤を注入すればよい。各注入箇所における血管障害誘導剤の注入量は等量であることが好ましいが、これに限定されない。例えば、脳の前後方向および背腹側方向に広がる領域に対して脳の背側から薬剤を注入する場合、前後方向に上記の間隔を空けて複数箇所にマイクロシリンジを刺入し、それぞれの刺入箇所において、刺入深度方向(背腹側方向)に上記の間隔を空けて複数個所に注入すればよい。また、注入箇所の数については、目的とする領域の大きさ、上記の好ましい間隔の範囲、血管障害誘導剤の注入量を考慮して適宜選択することができる。 In order to inject a vascular disorder inducer into the entire target region, considering the shape of the target region in the brain, an interval of 1 mm to 3 mm in the anteroposterior direction, inward / external direction, or dorsoventral direction of the brain It is only necessary to inject a vascular disorder inducing agent at a plurality of positions. The injection amount of the vascular disorder inducer at each injection site is preferably equal, but is not limited thereto. For example, when injecting a drug from the back side of the brain to an area extending in the front-rear direction and dorsoventral direction of the brain, the microsyringes are inserted at a plurality of locations with the above-mentioned interval in the front-rear direction. It is only necessary to inject into a plurality of places with the above-mentioned interval in the insertion depth direction (the dorsal ventral side direction). In addition, the number of injection sites can be appropriately selected in consideration of the size of the target region, the above preferable interval range, and the injection amount of the vascular disorder inducer.
なお、本発明において好適に使用されるエンドセリン-１の注入量は、各注入箇所において、それぞれ４〜１２μｌの範囲で注入することが好ましく、６〜１０μｌの範囲で注入することがより好ましい。４μｌよりも少ないと目的とする機能障害を引き起こすことができず、また、１２μｌよりも多いと内包を超えて隣接した脳領域(視床やレンズ核)に拡がってしまう。また、エンドセリン-１の各注入箇所の合計である注入総量は、６０〜２４０μｌの範囲とすることが好ましく、９０〜１５０μｌの範囲で注入することがより好ましい。６０μｌよりも少ないと目的とする機能障害を引き起こすことができず、また、２４０μｌよりも多いと隣接脳領域の損傷により運動機能以外に障害が生じる。また、本発明において好適に使用されるコラゲネースＩＶの注入量は、各注入箇所において、それぞれ２〜８μｌの範囲で注入することが好ましく、３〜６μｌの範囲で注入することがより好ましい。また、コラゲネースＩＶの各注入箇所の合計である注入総量は、１８〜７２μｌの範囲とすることが好ましく、２７〜５４μｌの範囲で注入することがより好ましい。なお、コラゲネースＩＶの上記範囲外の投与は、エンドセリン-１と同様の結果を招くため好ましくない。 In addition, it is preferable to inject | pour the amount of endothelin-1 used suitably in this invention in the range of 4-12 microliters in each injection | pouring location, and it is more preferable to inject in the range of 6-10 microliters. If the amount is less than 4 μl, the target functional disorder cannot be caused, and if the amount is more than 12 μl, it extends beyond the inner capsule to the adjacent brain region (thalamus or lens nucleus). Moreover, it is preferable to make the injection total amount which is the sum total of each injection | pouring location of endothelin-1 into the range of 60-240 microliters, and it is more preferable to inject | pour in the range of 90-150 microliters. If the amount is less than 60 μl, the target dysfunction cannot be caused. If the amount is more than 240 μl, damages other than the motor function occur due to damage to adjacent brain regions. In addition, the amount of collagenase IV preferably used in the present invention is preferably in the range of 2 to 8 μl and more preferably in the range of 3 to 6 μl at each injection location. Moreover, it is preferable to make the injection total amount which is the sum total of each injection | pouring location of collagenase IV into the range of 18-72 microliters, and it is more preferable to inject | pour in the range of 27-54 microliters. In addition, administration outside the above range of collagenase IV is not preferable because it causes the same results as endothelin-1.
また、本発明の脳卒中モデルを製造する方法の一実施の形態として、（ｂ）特定した内包領域の一部に血管障害誘導剤を注入する前に、（ａ’）特定した内包領域の一部に、一時的かつ可逆的に神経線維の情報伝達機能を阻害する薬剤を注入し、脳卒中モデル動物に目的とする障害が生じることを確認することもできる。
本発明に使用される一時的かつ可逆的に神経細胞の機能を阻害する薬剤としては、神経細胞に作用してその機能を抑制し、それにより身体の一部の機能に一時的かつ可逆的な障害を生じさせることのできる薬剤であればよい。これにより、血管障害誘導剤を注入する前に、内包領域のうち目的とする領域をより正確に同定することが可能となる。また、当該薬剤は、一時的かつ可逆的に神経細胞の機能を阻害するものであるため、時間の経過により代謝され、体内から排除されるもの薬剤が選択される。なお、当該薬剤の使用により、被験体に望んだ機能障害が得られなかった場合には、当該薬剤が代謝・除去され、神経細胞および身体の機能が回復するのを待って、再度内包領域の目的の領域へ注入を試みることが可能である。
本発明に好適に使用される当該薬剤としては、テトロドトキシン等を挙げることができる。特に、テトロドトキシンは、１〜２週間で身体より代謝され除去されることから好適に使用される。テトロドトキシンは、電位依存性ナトリウムチャネルに結合し、活動電位を一時的かつ可逆的に抑制することが知られている神経毒である。例えば、テトロドトキシンを内包領域へ注入する際には、０.５〜４μｌの範囲で注入することが好ましい。
Further, as one embodiment of the method for producing a stroke model of the present invention, (b) before injecting a vascular disorder inducer into a part of the specified inclusion region, (a ′) a part of the specified inclusion region In addition, it is also possible to inject a drug that temporarily and reversibly inhibits the information transmission function of nerve fibers to confirm that the target disorder occurs in the stroke model animal.
As a drug that temporarily and reversibly inhibits the function of a nerve cell used in the present invention, it acts on the nerve cell to suppress its function, thereby temporarily and reversibly affecting the function of a part of the body. Any drug that can cause a disorder may be used. This makes it possible to more accurately identify the target region of the inclusion region before injecting the vascular disorder inducer. In addition, since the drug temporarily and reversibly inhibits the function of nerve cells, a drug that is metabolized over time and eliminated from the body is selected. In addition, when the functional disorder desired for the subject is not obtained by using the drug, the drug is metabolized / removed, and the function of nerve cells and the body is restored. It is possible to attempt injection into the target area.
Examples of the drug preferably used in the present invention include tetrodotoxin. In particular, tetrodotoxin is preferably used because it is metabolized and removed from the body in 1 to 2 weeks. Tetrodotoxin is a neurotoxin that is known to bind to voltage-gated sodium channels and temporarily and reversibly suppress action potentials. For example, when injecting tetrodotoxin into the inclusion region, it is preferable to inject in the range of 0.5 to 4 μl.
上記のようにして作成された脳卒中モデル動物において、内包領域の目的とする領域に正しく血管障害誘導剤が注入されたかどうかは、例えば、核磁気共鳴画像法により確認することができる。血管障害誘導剤の注入直後では、核磁気共鳴画像法によるＴ１強調画像においてマイクロシリンジ等の刺入跡を確認することができる。核磁気共鳴画像法による血管障害誘導剤の注入位置の確認は、例えば、血管障害誘導剤の注入時から数日経過するまでに確認することができる。
また、血管障害誘導剤の注入により生じた脳損傷の経時的変化についても、例えば、核磁気共鳴画像法により評価することが可能である。血管障害誘導剤の注入により生じた血管障害の部分は、Ｔ２強調画像において、Ｔ２高信号として検出することができる。また、Ｔ２強調画像を三次元再構築させることにより、浮腫や梗塞等の血管障害が生じている部分の体積を測定することが可能である。これにより、経時的に血管障害が生じている部分の体積の変化を評価することが可能となる。
In the stroke model animal created as described above, it can be confirmed, for example, by nuclear magnetic resonance imaging whether or not the vascular disorder inducer has been correctly injected into the target region of the inclusion region. Immediately after the injection of the vascular disorder inducer, it is possible to confirm a puncture trace such as a microsyringe in a T1-weighted image obtained by nuclear magnetic resonance imaging. Confirmation of the injection position of the vascular disorder inducer by nuclear magnetic resonance imaging can be confirmed, for example, until several days have elapsed since the injection of the vascular disorder inducer.
Further, changes over time in brain damage caused by injection of a vascular disorder inducer can be evaluated by, for example, nuclear magnetic resonance imaging. The portion of the vascular injury caused by the injection of the vascular injury inducer can be detected as a T2 high signal in the T2-weighted image. In addition, by reconstructing a T2-weighted image three-dimensionally, it is possible to measure the volume of a portion where a vascular disorder such as edema or infarction has occurred. As a result, it is possible to evaluate the change in the volume of the portion where the vascular injury has occurred over time.
また、本発明の脳卒中モデル動物は、公知の方法により、内包領域の損傷に由来する身体の機能およびその回復について評価することができる。
上肢に機能障害を有する脳卒中モデル動物において、特に手掌部の機能を評価する方法としては、例えば、把握動作の課題を与え、その成功率を評価することができる。このような課題は、評価をしたい機能ごとに公知の方法を利用する、または、当業者により適宜設定して行うことができる。なお、評価の方法は、高度な機能についても評価できることが好ましい。例えば、上肢に機能障害を有する脳卒中モデル動物に対しては、把握動作の中でも高度な機能である、つまみ動作についても評価できる課題が与えられることが好ましい。
Moreover, the stroke model animal of this invention can evaluate the function of the body derived from the damage of an inclusion area | region, and its recovery | restoration by a well-known method.
In a stroke model animal having a functional disorder in the upper limb, for example, as a method for evaluating the function of the palm part, for example, a task of grasping motion can be given and the success rate can be evaluated. Such a problem can be performed using a known method for each function to be evaluated, or appropriately set by a person skilled in the art. In addition, it is preferable that the evaluation method can also evaluate an advanced function. For example, it is preferable that a stroke model animal having a dysfunction in the upper limb is given a problem that can be evaluated for a pinch operation, which is an advanced function among grasping operations.
また、本発明の別の態様によれば、上記の方法で作成される脳卒中モデル動物に対して被験物質を投与することにより、脳卒中に由来する機能障害(後遺症)の機能回復促進のための治療薬のスクリーニング方法を提供する。すなわち、本発明の脳卒中モデル動物は、内包領域に血管障害を有する脳卒中患者と同一または類似の病態を示すので、当該脳卒中モデル動物に被験物質を投与してその機能障害に及ぼす当該被験物質の効果を測定することによって、脳卒中に由来する機能障害の回復促進のために使用できる物質をスクリーニングすることが可能である。
上記被験物質は、脳卒中に由来する機能障害の回復促進に有効な効果を示す候補物質となり得る化合物であれば特に限定されない。また、上記被験物質は、動物、植物、または微生物等由来の天然化合物であってもよく、合成化合物であってもよい。
被験物質を脳卒中モデル動物へ投与する方法は、静脈内、皮下内、腹腔内、筋肉内等への注射もしくは点滴、経口投与、または経皮投与等、公知の方法から適宜選択することができる。
Further, according to another aspect of the present invention, by administering a test substance to a stroke model animal prepared by the above method, treatment for promoting functional recovery of a dysfunction (sequelae) derived from stroke A method for screening drugs is provided. That is, since the stroke model animal of the present invention exhibits the same or similar pathological condition as a stroke patient having a vascular disorder in the inclusion region, the test substance is administered to the stroke model animal and the effect of the test substance on the functional disorder It is possible to screen for substances that can be used to promote the recovery of dysfunction resulting from stroke.
The test substance is not particularly limited as long as it is a compound that can be a candidate substance that exhibits an effective effect in promoting the recovery of dysfunction derived from stroke. The test substance may be a natural compound derived from animals, plants, microorganisms, or the like, or may be a synthetic compound.
The method of administering the test substance to a stroke model animal can be appropriately selected from known methods such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular injection or infusion, oral administration, or transdermal administration.
また、本発明の別の態様によれば、上記の方法で作成される脳卒中モデル動物に対して機能回復訓練を行うことにより、脳卒中に由来する機能障害(後遺症)の機能回復のための機能回復訓練を評価することができる。これにより、脳卒中に由来する機能障害(後遺症)の機能回復を促進させることのできる、より好ましい機能回復訓練を見出すことが可能となる。
なお、機能回復訓練は、機能障害の回復促進のための薬剤の投与と併用して行うこともできる。
Further, according to another aspect of the present invention, functional recovery for functional recovery of dysfunction (sequelae) derived from stroke is performed by performing functional recovery training on a stroke model animal created by the above method. Training can be evaluated. Thereby, it becomes possible to find a more preferable function recovery training that can promote the function recovery of the dysfunction (sequelae) derived from the stroke.
The function recovery training can also be performed in combination with administration of a drug for promoting recovery of dysfunction.
上記のスクリーニング方法および機能回復訓練における評価の方法は、核磁気共鳴画像法による脳内の画像化による評価や、内包領域の物理的な摘出による解析、課題の成功率による評価等、適宜好ましい方法を用いることができる。 The screening method and the evaluation method in the function recovery training are appropriately preferable methods such as evaluation by imaging in the brain by nuclear magnetic resonance imaging, analysis by physical extraction of the inclusion region, evaluation by success rate of the task, etc. Can be used.
なお、本明細書に用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、本発明を限定する意図で用いられてはいない。 The terms used in the present specification are used to describe specific embodiments, and are not used with the intention of limiting the present invention.
また、本明細書における「含む」の用語は、本明細書の記載から明らかに異なる解釈をすべき場合を除き、記述された事項(工程、要素など)が存在することを意図し、かつ、それ以外の事項(工程、要素など)が存在することを排除するものではない。 In addition, the term “comprising” in the present specification intends that there are items (steps, elements, etc.) described unless there is a case where interpretation should be clearly different from the description in this specification, and It does not exclude the presence of other matters (processes, elements, etc.).
また、本明細書に用いられる用語は、異なる定義が無い限り、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。 Moreover, unless otherwise defined, terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Terms used herein should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in this specification and the related technical field, unless otherwise defined, idealized, or overly formal. It should not be interpreted in a general sense.
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により実施することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。 In the following, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the invention can be implemented in various ways and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.
（実施例１−１．脳梗塞モデルの作成）
マカクザルの一種であるニホンザルを対象として、内包後脚に局所的な脳梗塞を作成し、一方の上肢の運動機能を中心とした麻痺したモデル動物を作成した。
脳梗塞モデル動物の作成方法は、下記のようにして行った。まず、被験動物であるニホンザルに対して、ケタミン、メデトミジン、およびミダゾラムを筋肉注射することにより麻酔を導入したのちステレオタキシックフレームに頭部を固定した。ニホンザルの脳内における内包後脚領域の位置を特定するために核磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)を用いてＴ１およびＴ２強調画像撮影を行うことにより麻酔下にあるニホンザルの頭部の画像を撮影した。頭部の画像は前額断面で撮影し、画像解析装置(Stereo Investigater；MBF Bioscience)を用いて三次元再構成を行った。三次元再構成後の画像より内包後脚領域の位置を同定した。内包後脚領域の、特に上肢の運動出力経路の同定には、過去の文献(Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain)を参考にして決定した。より具体的には、前後軸としては中心溝の前端から３ｍｍ後方、内外側としては（ｉ）被殻または淡蒼球と（ｉｉ）尾状核または視床との間に存在する白質領域を上肢の運動出力にかかわる内包後脚領域として同定した。後述するように、個体によってはテトロドトキシンを用いた一時的不活性化を行うことにより上肢の運動出力経路を同定した。上肢の運動出力にかかわる内包後脚領域を同定した後、ケタミンの筋肉注射およびペントバルビタールの静脈注射による麻酔下にあるニホンザルの頭皮を切開および頭蓋骨を除去し、目的とする内包後脚の背側に位置する大脳領域を覆う硬膜を露出させた。露出した硬膜の背側から右脳または左脳(あらかじめ利き手を同定しておき、利き手側の支配半球に注入した)の内包後脚領域に向けてマイクロシリンジ(イトーマイクロシリンジＭＳ−Ｎ２５、外径０.５２ｍｍ、内径０.１８ｍｍ、伊藤製作所)を刺入し、血管収縮作用を持つペプチドであるエンドセリン-１(Endothelin-1)(Ｈｕｍａｎ)、４１９８−Ｖ、(株)ペプチド研究所、濃度１.５μｇ/μｌ)を注入した。エンドセリン-１の内包後脚への注入は、計１５箇所に各８μl、投与量合計１２０μlとなるように行った。より詳細には、内包後脚領域が脳の前後および背腹側に拡がっているため、前後方向に１.５ｍｍの間隔で５箇所にマイクロシリンジを刺入し、それぞれの刺入箇所において、刺入深度方向(背腹側方向)に１.５ｍｍ間隔を空けて３箇所に投与した(すなわち、計１５箇所に投与)。このように投与することで、内包後脚領域の上肢に関わる神経線維が走行する領域全体に広く薬剤が分布するように工夫した。
(Example 1-1. Creation of a cerebral infarction model)
In the Japanese macaque, which is a kind of macaque monkey, a local cerebral infarction was created in the hind leg, and a paralyzed model animal centered on the motor function of one upper limb was created.
The method for preparing a cerebral infarction model animal was performed as follows. First, anesthesia was introduced into a test monkey Japanese monkey by intramuscular injection of ketamine, medetomidine, and midazolam, and then the head was fixed to a stereotaxic frame. An image of the head of a Japanese monkey under anesthesia was taken by performing T1- and T2-weighted imaging using nuclear magnetic resonance imaging (MRI) to identify the position of the internal hind leg region in the brain of the Japanese monkey . The image of the head was taken with a forehead cross section, and three-dimensional reconstruction was performed using an image analyzer (Stereo Investigater; MBF Bioscience). The position of the hind leg region was identified from the image after 3D reconstruction. The identification of the motor output pathway in the hind leg region, especially the upper limb, was determined with reference to previous literature (Schmahmann and Pandya, 2006; Fiber Pathways of the Brain). More specifically, the front and rear axes are 3 mm behind the front end of the central groove, and the inner and outer sides are (i) the white matter region existing between the putamen or pallidus and (ii) the caudate nucleus or thalamus. It was identified as the hind limb area involved in motor output. As will be described later, depending on the individual, the motor output pathway of the upper limb was identified by performing temporary inactivation using tetrodotoxin. After identifying the internal hind leg area related to the motor output of the upper limb, incision of the scalp of Japanese monkey under anesthesia by intramuscular injection of ketamine and intravenous injection of pentobarbital and removal of the skull, the dorsal side of the desired hind leg The dura mater covering the cerebral area located in the A microsyringe (ITO Microsyringe MS-N25, outer diameter 0) from the dorsal side of the exposed dura toward the inner hind leg region of the right or left brain (predominantly identified and injected into the dominant hemisphere on the dominant hand) .52 mm, inner diameter 0.18 mm, Ito Seisakusho), endothelin-1 (Human), 4198-V, a peptide having a vasoconstrictive action, Peptide Institute, Inc., concentration 1. 5 μg / μl) was injected. Endothelin-1 was injected into the hind legs with 15 μl in total at a total of 15 sites so that the total dose was 120 μl. More specifically, since the inner hind leg region extends to the front and back of the brain and to the dorsoventral side, the microsyringe is inserted at five locations at an interval of 1.5 mm in the front and rear direction. The administration was carried out at 3 sites at intervals of 1.5 mm in the depth direction (dorsal ventral direction) (that is, administered at a total of 15 sites). By administering in this way, it was devised so that the drug is widely distributed over the entire region where nerve fibers related to the upper limbs of the inner hind leg region run.
エンドセリン-１の投与から１日経過後、被験体のサルの脳を核磁気共鳴画像法により撮影しＴ１強調画像として画像化した(図１)。図１ｂおよび図１ｃにおける矢印が示すように、被験体であるサルの脳内における内包後脚領域に、マイクロシリンジの刺入跡が確認することができた。なお、図１ａにおける白線は、右の前額断面の前後位置を示す。 One day after the administration of endothelin-1, the monkey brain of the subject was photographed by nuclear magnetic resonance imaging and imaged as a T1-weighted image (FIG. 1). As indicated by the arrows in FIGS. 1 b and 1 c, the microsyringe puncture trace could be confirmed in the hind leg region of the capsule in the brain of the subject monkey. In addition, the white line in FIG. 1a shows the front-back position of the right forehead cross section.
（実施例１−２．可逆的神経路不活性化法を用いた脳梗塞モデルの作成）
上肢の運動出力にかかわる神経線維が走行する内包後脚領域をより正確に同定するために可逆的神経路不活性化法を用いて脳梗塞モデルを作成した。この方法で神経細胞に存在する電位依存性ナトリウムチャネルを試薬により一時的かつ可逆的に抑制することで、目的の領域を同定する方法である。本試験では、試薬を目的とする部位へ投与することにより上肢の運動機能のみが麻痺した際に、当該試薬を投与した部位を、内包後脚領域であると特定した。仮に上肢の運動麻痺以外の障害が確認された場合には、テトロドトキシンが１〜２週間で代謝され除去されることから、例えば２週間以上待ってテトロドトキシンが完全に代謝され除去されたことを確認してから、再度テトロドトキシンの投与試験を行うことができる。なお、本試験では、試薬としてテトロドトキシン(Ｓｉｇｍａ)を用いた。テトロドトキシンは、活動電位を一時的かつ可逆的に抑制することが知られている神経毒である。
より具体的には、実施例１−１と同様にして核磁気共鳴画像法により内包後脚領域の位置を同定した後に、続けて可逆的神経路不活性化法を下記のように行った。まず、被験動物であるニホンザルに対して、ケタミンの筋肉注射およびペントバルビタールの静脈注射を用いて麻酔を導入した。麻酔下にあるニホンザルの頭皮を切開および頭蓋骨を除去し、目的とする内包後脚の背側に位置する大脳領域を覆う硬膜を露出させた。露出した硬膜の背側から内包後脚領域に向けてマイクロシリンジ(イトーマイクロシリンジＭＳ−Ｎ０５、外径０.５２ｍｍ、内径０.１８ｍｍ、伊藤製作所)を刺入し、テトロドトキシン(０.３μｇ/μｌ、２μｌ)を投与した。テトロドトキシン投与後に、上肢の運動麻痺のみが生じた場合には上肢の運動出力にかかわる神経線維が走行する内包後脚領域へテトロドトキシンが投与されたと判断した。
テトロドトキシンの投与により内包後脚領域を特定した後、上記実施例１−１．に記載のエンドセリンの注入方法と同様にして、エンドセリン-１を内包後脚領域へ注入した。
(Example 1-2. Creation of cerebral infarction model using reversible nerve tract inactivation method)
A cerebral infarction model was created using a reversible nerve tract inactivation method in order to more accurately identify the inner hind leg region where nerve fibers involved in the motor output of the upper limb run. In this method, a target region is identified by temporarily and reversibly suppressing a voltage-dependent sodium channel present in a nerve cell with a reagent. In this study, when only the motor function of the upper limb was paralyzed by administering the reagent to the target site, the site where the reagent was administered was identified as the internal hind leg region. If a disorder other than motor paralysis of the upper limb is confirmed, tetrodotoxin is metabolized and removed in 1 to 2 weeks. For example, wait for 2 weeks or more to confirm that tetrodotoxin is completely metabolized and removed. Then, a tetrodotoxin administration test can be performed again. In this test, tetrodotoxin (Sigma) was used as a reagent. Tetrodotoxin is a neurotoxin that is known to temporarily and reversibly suppress action potentials.
More specifically, after recognizing the position of the inner hindlimb region by nuclear magnetic resonance imaging in the same manner as in Example 1-1, the reversible nerve tract inactivation method was subsequently performed as follows. First, anesthesia was introduced into a Japanese monkey, which is a test animal, by intramuscular injection of ketamine and intravenous injection of pentobarbital. The scalp of a Japanese monkey under anesthesia was dissected and the skull was removed, and the dura mater covering the cerebral region located on the dorsal side of the desired hind leg was exposed. A microsyringe (ITO Microsyringe MS-N05, outer diameter 0.52 mm, inner diameter 0.18 mm, Ito Seisakusho) was inserted from the exposed back of the dura mater to the inner hind leg region, and tetrodotoxin (0.3 μg / μl, 2 μl). When only motor paralysis of the upper limbs occurred after administration of tetrodotoxin, it was judged that tetrodotoxin was administered to the inner hind leg region where nerve fibers involved in motor output of the upper limbs run.
After the internal hind leg region was identified by administration of tetrodotoxin, Example 1-1. In the same manner as in the endothelin injection method described in 1., endothelin-1 was injected into the inner hind leg region.
（実施例１−３．脳梗塞モデルにおける脳損傷の経時的変化）
エンドセリン-１注入後の脳梗塞モデルの脳内の状態を経時的に観察するために、エンドセリン-１の注入時より１日目、３日目、１週間後、２週間後、１ヶ月後、２ヵ月後、および３ヵ月後の脳の状態を核磁気共鳴画像法により画像化した(図２)。なお、図２中に示される被験体ＭＫ-ＫおよびＭＫ-Ｍｕは、実施例１−１に記載の方法(可逆的神経路不活性化法を使用していない方法)によって作成された脳梗塞モデルを示す。また、図２に示すように、エンドセリン-１注入後に内包後脚領域(矢印)に浮腫とみられるＴ２信号が高い部分(損傷部分)が認められた。このように、内包後脚領域の損傷部位はＴ２強調画像の高信号領域として検出できる。よって、得られたＴ２強調画像の高信号領域を同定し、画像解析装置(Stereo Investigater;MBF Bioscience)を用いて当該高信号領域の体積を定量することにより、浮腫の体積の経時的変化を観察した。その結果を図３に示す。図３に示すように、浮腫の体積の増加はエンドセリン-１注入後３日目から１週間後にピークを迎えた。また、その後、ほとんどの被験体における浮腫の体積は、エンドセリン注入直後に生じた浮腫の体積よりも減少した(図３)。なお、図３中に示される被験体Ｍｋ-Ｓは、実施例１−２に記載の方法(可逆的神経路不活性化法を使用する方法)によって作成された脳梗塞モデルであり、それ以外の被験体は、全て実施例１−１に記載の方法によって作成された脳梗塞モデルである。
(Example 1-3. Change in brain damage over time in a cerebral infarction model)
In order to observe the state of the cerebral infarction model after endothelin-1 injection in the brain over time, the first day, the third day, the first week, the second week, the second week, the first month from the time of the endothelin-1 injection, The brain state after 2 months and 3 months was imaged by nuclear magnetic resonance imaging (FIG. 2). The subjects MK-K and MK-Mu shown in FIG. 2 are cerebral infarcts prepared by the method described in Example 1-1 (method not using the reversible nerve tract inactivation method). The model is shown. Further, as shown in FIG. 2, a portion (damaged portion) having a high T2 signal, which is considered to be edema, was observed in the inner hind leg region (arrow) after endothelin-1 injection. Thus, the damaged part of the inner hind leg region can be detected as a high signal region of the T2-weighted image. Therefore, by identifying the high-signal area of the obtained T2-weighted image and quantifying the volume of the high-signal area using an image analyzer (Stereo Investigater; MBF Bioscience), we observe the change in the volume of the edema over time did. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, the increase in edema volume peaked one week after the third day after endothelin-1 injection. Also, thereafter, the volume of edema in most subjects decreased more than the volume of edema that occurred immediately after endothelin injection (FIG. 3). The subject Mk-S shown in FIG. 3 is a cerebral infarction model created by the method described in Example 1-2 (a method using the reversible nerve tract inactivation method). All of the subjects are cerebral infarction models created by the method described in Example 1-1.
（実施例１−４．脳梗塞モデルにおける把握動作の経時的評価）
上記実施例１−１および実施例１−２で作成した脳梗塞モデルであるサルの把握動作に関する経時的な評価を行った。把握動作の評価は、下記のようにして行った。直径２０ｍｍのアクリルパイプ内にくぎを配置し、そのくぎの先に７ｍｍ角のサツマイモを刺すことにより固定した。アクリルパイプの直径はサルの母指と示指が入る程度の大きさであるため、脳損傷を加えていない健常サルは母指と示指とを用いてサツマイモをつまみ取る。これを把握運動課題として被験体のサルに試験したところ、内包後脚領域の損傷前はスムーズにサツマイモを摘み取ることができたが、エンドセリン-１投与による内包後脚領域の損傷直後は上肢、特に手掌部に運動麻痺が生じ、サツマイモを把握することが困難となった。把握運動課題の成功率は損傷後２週間かけて上昇し、多くの個体では損傷前と同程度にまで回復した(図４および図５)。ただし、つまみ動作(母指と示指の先端で物等を把持する動作)の成功率はエンドセリン-１投与による内包後脚領域の損傷後１週間頃にやや増加するが、その後、つまみ動作の成功率は再び減少し０−５０％の間で推移した(図６)。なお、図４の２週間後の写真は母指の近位関節付近でサツマイモを把持している状態を示し、また、図４の３カ月後の写真では示指と中指の間で把持している状態を示す。これらはいずれもつまみ動作ではない代償的な動作が用いられていることを示す。このように、脳梗塞モデルは多くの場合粗大な動作を用いて把握を行っており、つまみ動作を含む器用な動作の回復は不充分であることを示している。
(Example 1-4. Evaluation of grasping action over time in cerebral infarction model)
Evaluation over time was performed on the grasping operation of monkeys which are cerebral infarction models created in Example 1-1 and Example 1-2. The evaluation of the grasping action was performed as follows. A nail was placed in an acrylic pipe having a diameter of 20 mm, and a 7 mm square sweet potato was inserted into the end of the nail and fixed. Since the diameter of the acrylic pipe is large enough to accommodate the monkey's thumb and index finger, healthy monkeys with no brain damage pick up the sweet potato using the thumb and index finger. When this was tested on the subject's monkeys as a grasping exercise task, sweet potatoes could be picked up smoothly before the damage to the internal hind leg area, but the upper limb, especially immediately after the damage to the hind leg area after endothelin-1 administration Motor paralysis occurred in the palm of the hand, making it difficult to grasp sweet potatoes. The success rate of the grasping motor task increased over 2 weeks after the injury, and many individuals recovered to the same level as before the injury (FIGS. 4 and 5). However, the success rate of the knob operation (the operation of grasping an object etc. with the tip of the thumb and index finger) slightly increases around one week after the damage of the inner leg region by endothelin-1 administration. The rate decreased again and remained between 0-50% (Figure 6). 4 shows a state where the sweet potato is gripped near the proximal joint of the thumb, and in the photograph after three months in FIG. 4, it is gripped between the index finger and the middle finger. Indicates the state. These indicate that a compensatory operation that is not a knob operation is used. Thus, in many cases, the cerebral infarction model is grasped by using a coarse motion, which indicates that recovery of a dexterous motion including a knob motion is insufficient.
また、内包後脚領域の損傷部位の大きさとつまみ動作の遂行の成功率との関係を調べるため、内包後脚領域の損傷早期(エンドセリン-１注入による内包後脚領域損傷から３日目〜１週間後)における被験体の脳を核磁気共鳴画像法により画像化した。得られたＴ２強調画像の高信号領域を同定し、画像解析装置(Stereo Investigater；MBF Bioscience) を用いて当該高信号領域の体積の定量を行った。その結果、内包後脚領域の損傷部位の体積とつまみ動作の成功率には優位な負の相関が見られた(図７)。このことは内包後脚領域の梗塞が上肢の運動麻痺の直接的な原因になっていることを示している。 In addition, in order to investigate the relationship between the size of the damaged part of the internal hind leg region and the success rate of performing the pinch movement, early damage of the internal hind leg area (from the 3rd day to the 1st day after the internal hind leg area injury due to endothelin-1 injection) The brain of the subject (after week) was imaged by nuclear magnetic resonance imaging. The high signal region of the obtained T2-weighted image was identified, and the volume of the high signal region was quantified using an image analyzer (Stereo Investigater; MBF Bioscience). As a result, a significant negative correlation was found between the volume of the damaged part in the inner hind leg region and the success rate of the knob operation (FIG. 7). This indicates that an infarct in the hind leg region directly causes motor paralysis of the upper limb.
（実施例２−１．脳出血モデルの作成）
マカクザルの一種であるニホンザルを対象として、内包後脚領域に局所的な脳出血を作成し、一方の上肢の運動機能のみが麻痺したモデル動物を作成した。
脳出血モデル動物の作成方法は、エンドセリン-１の代わりにコラゲネースＩＶ(Ｓｉｇｍａ、Ｃ５１３８)を用いた以外は、上記実施例１−１と同様にして作成した。なお、コラゲネースＩＶの投与は、２００Ｕ／ｍｌのコラゲネースＩＶを計９箇所に各４μl、投与量合計３６μlとなるように行った。より詳細には、脳の前後方向に１.５ｍｍの間隔で３箇所にマイクロシリンジを刺入し、それぞれの刺入箇所において、刺入深度方向(背腹側方向)に１.５ｍｍ間隔を空けて３箇所に投与した(すなわち、計９箇所に投与)。
Example 2-1 Creation of Cerebral Hemorrhage Model
In a Japanese macaque, which is a kind of macaque, a local cerebral hemorrhage was created in the hind leg region, and a model animal in which only the upper limb motor function was paralyzed was created.
Cerebral hemorrhage model animals were prepared in the same manner as in Example 1-1 except that collagenase IV (Sigma, C5138) was used instead of endothelin-1. Collagenase IV was administered in a total of 9 μl of 200 U / ml of collagenase IV in a total of 4 μl each for a total dose of 36 μl. More specifically, three microsyringes are inserted at 1.5 mm intervals in the anteroposterior direction of the brain, and 1.5 mm intervals are provided in the insertion depth direction (dorsal ventral side) at each insertion location. And administered to 3 sites (ie, administered to a total of 9 sites).
（実施例２−２．脳出血モデルにおける脳損傷の評価）
コラゲネースＩＶの投与による内包後脚領域の損傷の様子を観察するため、コラゲネースＩＶの投与より１５日目の被験体の脳を核磁気共鳴画像法により画像化した(図８)。図８に示すように、被験体の脳の内包後脚領域に脳出血様の損傷領域を確認することができた。また、損傷した内包後脚領域を直接観察するため、コラゲネースＩＶの投与より１５日目の被験体を犠死させた後に被験体の脳より内包領域を摘出した(図９)。図９に示すように、摘出された内包領域のうち、内包後脚領域にのみ血腫が生じたことが観察された。なお、血腫の体積は損傷後２週間まで大きく減少することはなかった。
(Example 2-2. Evaluation of brain damage in cerebral hemorrhage model)
In order to observe the damage of the inner hind leg region due to administration of collagenase IV, the brain of the subject on the 15th day after administration of collagenase IV was imaged by nuclear magnetic resonance imaging (FIG. 8). As shown in FIG. 8, a brain hemorrhage-like damaged area could be confirmed in the hind leg area of the subject's brain. Further, in order to directly observe the damaged inner hind leg region, the subject area was extracted from the subject's brain after the subject was sacrificed on the 15th day after administration of collagenase IV (FIG. 9). As shown in FIG. 9, it was observed that hematoma was generated only in the hind leg region of the encapsulated region out of the extracted encapsulated region. The hematoma volume did not decrease significantly until 2 weeks after the injury.
（実施例２−３．脳出血モデルにおける把握動作の評価）
被験体の内包後脚領域へコラゲネースＩＶを右脳または左脳へ注入することによって、対側の上肢に重篤な麻痺が生じた。図１０は、右脳の内包後脚領域へコラゲネースＩＶを注入した被験体のサルの状態を示す。図１０ａ，ｂは、コラゲネースＩＶ注入より２日目の状態を示し、内包後脚領域の損傷後数日間は左手を挙上できない状態が続いた。一方で、コラゲネースＩＶの注入によっても右側の上肢や下肢には大きな運動異常は見られず、立ち上がり、また右手をつかってケージを握る様子が観察された(図１０ａ)。図１０ｃ，ｄは、コラゲネースＩＶ注入より２週間経過した後の被験体のサルの状態を示す。内包後脚領域の損傷から２週間後には、左側上肢運動の回復が認められ、左側上肢を用いたケージをつかむ様子(把握動作)が観察された。
(Example 2-3. Evaluation of grasping action in cerebral hemorrhage model)
Severe paralysis occurred in the contralateral upper limb by injecting collagenase IV into the right or left brain into the subject's hind leg area. FIG. 10 shows the state of a monkey in a subject who has injected collagenase IV into the hindlimb region of the right brain. FIGS. 10a and 10b show the state on the second day after the collagenase IV infusion, and the state in which the left hand could not be raised continued for several days after the injury of the inner leg region. On the other hand, no significant movement abnormality was observed in the right upper limb or lower limb even after the injection of collagenase IV, and the appearance of standing up and holding the cage with the right hand was observed (FIG. 10a). FIGS. 10c and 10d show the monkey status of the subject after 2 weeks from the collagenase IV infusion. Two weeks after the injury of the internal hind leg area, recovery of the left upper limb movement was observed, and a state of grasping the cage using the left upper limb (grasping action) was observed.
上記実施例で作成した脳卒中モデル動物は、脳からの主要な運動出力経路、すなわち第一次運動野の手領域からの下行路が通る内包後脚に脳梗塞または脳出血を作成することで運動障害を生じるモデルを作成した。上記実施例で作成した脳卒中モデル動物では上肢の運動出力経路に側枝を伸ばす血管のみに障害を及ぼすため、他の脳領域での神経回路再構成による機能回復を評価するために有効である。また従来のモデルでは損傷が大きいために実験動物が死亡したり、また損傷後に寝たきり状態になる危険性があったが、このモデルではその危険性が小さい。
また、上記実施例で作成した脳卒中モデル動物では、いずれにおいても損傷対側の上肢に運動麻痺が生じたものの、それ以外の身体機能には大きな障害は見られなかった。麻痺の程度は脳出血モデルのほうが大きいものの、いずれのモデルにおいても損傷後２週間程度で運動機能の回復が見られた。ただし完全に損傷前と同じ動作の回復は見られず、特につまみ動作(精密把握)を含む手先の器用な動作の回復が不十分であった。そのため、薬品やリハビリテーション訓練が上肢運動の機能回復に対して持つ促進効果を評価するために有用なモデルであると考えられる。
The stroke model animal created in the above example creates a cerebral infarction or cerebral hemorrhage by creating a cerebral infarction or cerebral hemorrhage in the inner hind leg through which the main motor output path from the brain, that is, the descending path from the hand area of the primary motor area passes. A model that produces The stroke model animal created in the above example is effective for evaluating functional recovery by neural circuit reconstruction in other brain regions because it only affects the blood vessels that extend the side branches in the motor output path of the upper limb. Further, in the conventional model, there is a risk that the experimental animal will die or become bedridden after the damage due to the large damage, but in this model, the risk is small.
Moreover, in the stroke model animals prepared in the above examples, although motor paralysis occurred in the upper limbs on the opposite side of the injury, no major obstacles were observed in other physical functions. Although the degree of paralysis was greater in the cerebral hemorrhage model, recovery of motor function was observed in about 2 weeks after injury in any model. However, the recovery of the same movement as before the damage was not observed, and the recovery of the dexterous movement of the hand including the knob movement (precision grasp) was not sufficient. Therefore, it is considered to be a useful model for evaluating the promotion effect that medicine and rehabilitation training have on functional recovery of upper limb movement.
Claims (8)
（ａ）前記脳卒中モデル動物の脳のうち内包領域を含む部分を画像化して、内包領域のうちの目的の領域を同定する工程と、
（ａ’）同定した内包領域の目的の領域に、一時的かつ可逆的に神経線維の伝達機能を阻害する薬剤を注入する工程であって、前記脳卒中モデル動物に目的とする障害が生じることを確認する工程と、
（ｂ）同定した内包領域の目的の領域に血管障害誘導剤を注入する工程とを含むことを特徴とする、作成方法。 A method for creating a non-human primate stroke model animal comprising:
(A) imaging a portion including an inclusion region of the brain of the stroke model animal, and identifying a target region of the inclusion region;
(A ′) a step of injecting a drug that temporarily and reversibly inhibits a nerve fiber transmission function into a target region of the identified inclusion region, wherein a target disorder occurs in the stroke model animal A process to check;
(B) a step of injecting a vascular disorder inducer into a target region of the identified inclusion region.
前記脳卒中モデル動物は脳の内包領域の目的の領域に血管障害を有することにより、前記内包領域の目的の領域に対応する身体の機能に回復可能な障害を有することを特徴とする作成方法。 It is the creation method as described in any one of Claims 1-4,
The creation method according to claim 1, wherein the stroke model animal has a vascular disorder in a target region of a brain inclusion region, and thereby has a disorder capable of recovering a body function corresponding to the target region of the inclusion region.
前記脳卒中モデル動物が内包領域を除く他の脳の領域に血管障害を有さないことを特徴とする作成方法。 It is the creation method as described in any one of Claims 1-5,
The creation method, wherein the stroke model animal does not have a vascular disorder in other brain regions excluding the inclusion region.
請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物の作成方法により脳卒中モデル動物を作成する工程と、
前記脳卒中モデル動物に対して被験物質を投与する工程と、
前記脳卒中モデル動物が有する機能障害に対する前記被験物質の効果を測定する工程とを含む、スクリーニング方法。 A screening method for a therapeutic drug for functional recovery of dysfunction derived from stroke,
Creating a stroke model animal by the method for producing a non-human primate stroke model animal according to any one of claims 1 to 6 ;
A step of administering a test substance to the stroke animal model,
Measuring the effect of the test substance on the dysfunction of the stroke model animal.
請求項１〜６のいずれか一項に記載の非ヒト霊長類の脳卒中モデル動物の作成方法により脳卒中モデル動物を作成する工程と、
前記脳卒中モデル動物が機能回復訓練を行う工程と、
前記脳卒中モデル動物が有する機能障害に対する前記機能回復訓練の効果を測定する工程と、
を含む、評価方法。 An evaluation method of functional recovery training for functional recovery of dysfunction derived from stroke,
Creating a stroke model animal by the method for producing a non-human primate stroke model animal according to any one of claims 1 to 6 ;
The stroke model animal performing function recovery training;
Measuring the effect of the function recovery training on the dysfunction of the stroke model animal;
Including evaluation method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014118781A JP6448922B2 (en) | 2014-06-09 | 2014-06-09 | Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2014118781A JP6448922B2 (en) | 2014-06-09 | 2014-06-09 | Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015231338A JP2015231338A (en) | 2015-12-24 |
| JP6448922B2 true JP6448922B2 (en) | 2019-01-09 |
Family
ID=54933270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014118781A Active JP6448922B2 (en) | 2014-06-09 | 2014-06-09 | Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6448922B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR129769A1 (en) * | 2022-06-30 | 2024-09-25 | Astellas Pharma Inc | METHOD FOR PRODUCING A NON-HUMAN PRIMATE ANIMAL MODEL OF CEREBRAL INFARCTION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CEREBRAL INFARCTION |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3526400A (en) * | 1999-03-12 | 2000-09-28 | Brown University Research Foundation | Methods and compositions for regulating memory consolidation |
-
2014
- 2014-06-09 JP JP2014118781A patent/JP6448922B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015231338A (en) | 2015-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Karachi et al. | Cholinergic mesencephalic neurons are involved in gait and postural disorders in Parkinson disease | |
| Yamao et al. | Intraoperative dorsal language network mapping by using single‐pulse electrical stimulation | |
| Spalletti et al. | Combining robotic training and inactivation of the healthy hemisphere restores pre-stroke motor patterns in mice | |
| Peraud et al. | Surgical resection of grade II astrocytomas in the superior frontal gyrus | |
| Herbert et al. | Evidence for a role of the reticulospinal system in recovery of skilled reaching after cortical stroke: initial results from a model of ischemic cortical injury | |
| Berger et al. | Surgery of intrinsic cerebral tumors | |
| Morishita et al. | Surgical neuroanatomy and programming in deep brain stimulation for obsessive compulsive disorder | |
| Pinto et al. | Optimizing rehabilitation for phantom limb pain using mirror therapy and transcranial direct current stimulation: A randomized, double–blind clinical trial study protocol | |
| Young et al. | Brain–computer interface training after stroke affects patterns of brain–behavior relationships in corticospinal motor fibers | |
| Molina et al. | Neurophysiological correlates of gait in the human basal ganglia and the PPN region in Parkinson’s disease | |
| Chang et al. | Deep brain stimulation of midbrain locomotor circuits in the freely moving pig | |
| Ciucci et al. | Exercise-induced rescue of tongue function without striatal dopamine sparing in a rat neurotoxin model of Parkinson disease | |
| Goñi-Erro et al. | Pedunculopontine Chx10+ neurons control global motor arrest in mice | |
| Schachter et al. | Advances in the application of technology to epilepsy: the CIMIT/NIO Epilepsy Innovation Summit | |
| JP6448922B2 (en) | Encapsulated stroke model animal using non-human primate and method for producing the same | |
| Qin et al. | Effect of sevoflurane and halothane anesthesia on cognitive function and immune function in young rats | |
| Chornyy et al. | Cellular-resolution monitoring of ischemic stroke pathologies in the rat cortex | |
| Waln et al. | Bilateral globus pallidus internus deep brain stimulation after bilateral pallidotomy in a patient with generalized early‐onset primary dystonia | |
| Li et al. | Alteration of brain functional networks induced by electroacupuncture stimulation in rats with ischemia–reperfusion: An independent component analysis | |
| KR101731625B1 (en) | A Subcortical Internal Capsular Infarct Model and The Method Preparing For The Same | |
| Afifi et al. | Benefit of multiple sessions of perilesional repetitive transcranial magnetic stimulation for an effective rehabilitation of visuospatial function | |
| Takuwa et al. | Development of a simultaneous optical/PET imaging system for awake mice | |
| Detry et al. | A modified surgical model of fulminant hepatic failure in the rat | |
| Jian-Xiong et al. | A new rat model of thalamic pain produced by administration of cobra venom to the unilateral ventral posterolateral nucleus | |
| Hanjani et al. | A history of diagnostic investigations in epilepsy surgery |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170316 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180403 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180516 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180911 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180919 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181204 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181205 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6448922 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |