JP6430972B2 - 構造に基づくプローブ切断による核酸標的の同定 - Google Patents
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Classifications
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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-
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Description
(a)標的核酸を含む試料を、以下の(i)及び(ii):
(i)一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1つの鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1の伸長産物の合成を開始し、そして第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始する、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(ii)少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内でアニーリングし、そして前記第1の部分は、3’末端でブロックされて、核酸ポリメラーゼによる伸長を妨害し、3’→5’エキソヌクレアーゼによる切断を阻止し、
第1の部分の5’末端に結合される前記第2の部分は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、
前記オリゴヌクレオチドプローブ
と接触させることによって反応混合物を調製する工程;
(b)5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸配列へアニーリングすることができ、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーからプライマー伸長産物を合成することができる条件下で、一方で前記核酸ポリメラーゼの5’→3’ヌクレアーゼ活性が、前記アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分から、追加のヌクレオチドを有する又は有さない前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する断片を切断しかつ放出することができる条件下で、前記標的核酸配列を増幅する工程;
(c)オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する前記断片を、エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで前記断片を切断する3’→5’エキソヌクレアーゼを用いて処理し、それにより、固有の質量識別可能なサイズを有する単一の断片を生成する工程;並びに、
(d)質量分析法により単一の前記断片の存在又は非存在を検出し、それにより、試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する工程、
を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、質量分析法の汚染物質を除去するために前記反応混合物を精製する工程が、前記検出工程(d)の前に行われる。
試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法であって:
(a)標的核酸を含む試料を、以下の(i)及び(ii):
(i)一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1つの鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1の伸長産物の合成を開始し、そして第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始する、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(ii)少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内でアニーリングし、前記第1の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第1の部分を耐性とする修飾を5’末端に含み、
第1の部分の3’末端に結合される前記第2の部分は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第2の部分を耐性とする修飾を含む、
前記オリゴヌクレオチドプローブ
と接触させることによって反応混合物を調製する工程;
(b)5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸配列へアニーリングすることができ、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーからプライマー伸長産物を合成することができる条件下で、一方で前記核酸ポリメラーゼの5’→3’ヌクレアーゼ活性が、前記アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分から、追加のヌクレオチドを有する又は有さない前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する断片を切断しかつ放出することができる条件下で、前記標的核酸配列を増幅する工程;
(c)オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する前記断片を、エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで前記断片を切断する一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼを用いて処理し、それにより、固有の質量識別可能なサイズを有する単一の断片を生成する工程;並びに、
(d)質量分析法により単一の前記断片の存在又は非存在を検出し、それにより、試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する工程、
を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、質量分析法の汚染物質を除去するために前記反応混合物を精製する工程が、前記検出工程(d)の前に行われる。
本明細書で使用される用語「試料」は、核酸を含む試料又は培養物(例えば、微生物学的培養物)を含む。用語「試料」はまた、生物学的及び環境試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の検体を含むことができる。生物学的試料は、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液(例えば、気管支、胃、腹膜、乳管、耳、関節鏡)、生検試料、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳房流体、胚細胞及び胎児細胞を含んでよい。好適な実施態様において、生物学的試料は、血液、より好ましくは血漿である。本明細書において用語「血液」は、従来から定義されているように、全血、又は血清及び血漿などの血液の任意の画分を包含する。血漿は、抗凝固剤で処理された血液の遠心分離により得られる全血の画分を指す。血清は、血液試料が凝固した後に残っている液体の水の部分を指す。環境試料は、表面物質、土壌、水、及び産業試料などの環境材料、ならびに食品及び乳製品加工機器、装置、設備、用具、使い捨て及び非使い捨ての物質から得られる試料を含む。これらの例は、本発明に適用できる試料の種類を限定するものとして解釈すべきではない。
エキソヌクレアーゼ耐性修飾の評価
本発明の方法を実施するために使用することができる異なるエキソヌクレアーゼ耐性修飾を評価するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した:T9JTTTGC(配列番号1)、ここで、T9は5’フラップ部を表し、Jは修飾を表す。1つの特定の実験に用いた修飾は、ホスホロチオエート、2’−アミノ−ウリジン、2’−フルオロ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン、プロパンジオールスペーサー、及びHEG(完全名)スペーサーを含んだ。各オリゴヌクレオチドの1Mを、1XエキソヌクレアーゼIバッファー(New England Biolabs)及び2単位のエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs)に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。氷上で冷却することにより反応を終了させ、エキソヌクレアーゼ消化生成物を、Agilent Q-TOF 6530装置中の液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)により分析した。修飾のうち3つ(2’−O−メチルウリジン、HEGスペーサー、及びプロパンジオールスペーサー)を含むオリゴヌクレオチドからのエキソヌクレアーゼI−消化生成物は、図2A〜Cの質量スペクトル図上に示されている。これらの結果は、これらの修飾が、修飾の結合点を越えてオリゴヌクレオチドの消化をブロックするのに有効であることを示している。
5’−フラッププローブを使用するEGFR T790M増幅の検出
PCRアッセイを行って、表皮増殖因子受容体(EGFR)遺伝子のT790M変異(ヌクレオチド変化2369C−>T)を検出した。T790M変異の位置を含むEGFR遺伝子の領域の増幅のために、以下のプライマーを使用した。
前進プライマー:5’CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA3`(配列番号2)
逆進プライマー:5’CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA3`(E=t−ブチルベンジル−dC、配列番号3)
5’−C6ECCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP−3`(配列番号4)、ここで、C6は非相補的5’フラップ部分を表し、Eは1,3−プロパンジオールを表し、及びPはリン酸塩を表す。PCR反応混合物は、96ウェルプレートに以下の最終濃度で調製した:50mMのトリス−HCl(pH8.0)、80〜100mMの塩化カリウム、各200μMのdATP、dCTP、及びdGTP、400μMのdUTP、各200nMのプライマー、200nMの5’−フラッププローブ、標的DNA(1,000〜100,000コピーのEGFRプラスミド)、20nMのDNAポリメラーゼ(5’ヌクレアーゼ活性を有する)、0.1mM EDTA、2.5mM酢酸マグネシウム。増幅と分析は、Roche LightCycler(登録商標)480 装置 (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.) を使用して行なった。以下の温度プロファイルを用いた:95℃で1分(又は、95℃(10秒)〜62℃(25秒)を2サイクル後、92℃(10秒)〜62℃(25〜30秒)のサイクリングを99回。PCR反応の終わりに、10単位のエキソヌクレアーゼI(New England Biolabs)を、試料ウェルの一部に添加し、溶液を37℃で30分間インキュベートし、次に氷上で冷却した。
Claims (16)
- 試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法であって:
(a)標的核酸を含む試料を、以下の(i)及び(ii)と接触させる工程:
(i)一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1つの鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1の伸長産物の合成を開始し、そして第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始する、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(ii)少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内でアニーリングし、そして前記第1の部分は、3’末端でブロックされて、核酸ポリメラーゼによる伸長を妨害し、3’→5’エキソヌクレアーゼによる切断を阻止し、
第1の部分の5’末端に結合される前記第2の部分は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、
前記オリゴヌクレオチドプローブ;
(b)5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸配列へアニーリングすることができ、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーからプライマー伸長産物を合成することができる条件下で、一方で前記核酸ポリメラーゼの5’→3’ヌクレアーゼ活性が、前記アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分から、追加のヌクレオチドを有する又は有さない前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する断片を切断しかつ放出することができる条件下で、前記標的核酸配列を増幅する工程;
(c)オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する前記断片を、エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで前記断片を切断する3’→5’エキソヌクレアーゼを用いて処理し、それにより、固有の質量識別可能なサイズを有する断片を生成する工程;並びに、
(d)質量分析法により単一の前記断片の存在又は非存在を検出し、それにより、試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する工程、
を含む、前記方法。 - 2つ又はそれ以上の標的核酸が単一の多重反応で検出される、請求項1に記載の方法。
- 2つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブが、単一の多重反応で2つ又はそれ以上の標的核酸を検出するために使用される、請求項2に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾が、ホスホロチオエート、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサー、HEGスペーサー、及び反転ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 質量分析法の汚染物質を除去するために反応混合物を精製する工程が、前記検出工程(d)の前に行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出工程(d)が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型(MALDI−TOF)MS、タンデムMS、電子噴霧イオン化−飛行時間型(ESI−TOF)、ESI−イオントラップ、液体クロマトグラフィー(LC)−MS、ガスクロマトグラフィー(GC)−MS、及びイオン移動度(IM)−MSからなる群から選択される質量分析計により行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法であって:
(a)標的核酸を含む試料を、以下の(i)及び(ii)と接触させる工程:
(i)一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ここで、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1つの鎖中の領域に相補的な配列を含み、かつ第1の伸長産物の合成を開始し、そして第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域に相補的な配列を含み、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成を開始する、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー;及び
(ii)少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーにより結合された標的核酸配列内でアニーリングし、前記第1の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第1の部分を耐性とする修飾を5’末端に含み、
第1の部分の3’末端に結合される前記第2の部分は、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第2の部分を耐性とする修飾を含む、
前記オリゴヌクレオチドプローブ
;
(b)5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて、前記標的核酸配列を増幅する工程であって、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸配列へアニーリングすることができ、前記一対のオリゴヌクレオチドプライマーからプライマー伸長産物を合成することができる条件下で、一方で前記核酸ポリメラーゼの5’→3’ヌクレアーゼ活性が、前記アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分から、追加のヌクレオチドを有する又は有さない前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する断片を切断しかつ放出することができる条件下で、前記標的核酸配列を増幅する工程;
(c)オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含有する前記断片を、エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで前記断片を切断する一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼを用いて処理し、それにより、固有の質量識別可能なサイズを有する断片を生成する工程;並びに、
(d)質量分析法により単一の前記断片の存在又は非存在を検出し、それにより、試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出する工程、
を含む、前記方法。 - 2つ又はそれ以上の標的核酸が単一の多重反応で検出される、請求項8に記載の方法。
- 2つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブが、単一の多重反応で2つ又はそれ以上の標的核酸を検出するために使用される、請求項9に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾が、ホスホロチオエート、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサー、HEGスペーサー、及び反転ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 質量分析法の汚染物質を除去するために反応混合物を精製する工程が、検出工程(d)
の前に行われる、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 検出工程(d)が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型(MALDI−TOF)MS、タンデムMS、電子噴霧イオン化−飛行時間型(ESI−TOF)、ESI−イオントラップ、液体クロマトグラフィー(LC)−MS、ガスクロマトグラフィー(GC)−MS、及びイオン移動度(IM)−MSからなる群から選択される質量分析計により行われる、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼである、請求項8〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において使用するための、少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、
前記第1の部分は、前記第1の部分が標的核酸の領域と結合できるように、前記標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、そして前記第1の部分は、3’末端でブロックされて、核酸ポリメラーゼによる伸長を妨害し、3’→5’エキソヌクレアーゼによる切断を阻止し、
前記第2の部分は前記第1の部分の5’末端に結合され、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、ホスホロチオエート、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサー、HEGスペーサー、及び反転ヌクレオチドからなる群から選択される、エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、
前記組成物。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法において使用するための、少なくとも2つの異なる部分である第1の部分及び第2の部分を含む、オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、
前記第1の部分は、前記第1の部分が標的核酸の領域と結合できるように、前記標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を有する、又は有しない標準的ヌクレオチドを含み、そして前記第1の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第1の部分を耐性とする修飾を5’末端に含み、
前記第2の部分は前記第1の部分の3’末端に結合され、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドのいずれか一方、又はヌクレオチド及び非ヌクレオチドの両方を含み、標的核酸配列に相補的ではない配列を含み、そして前記第2の部分は、一本鎖特異的5’→3’エキソヌクレアーゼによる切断に対して前記第2の部分を耐性とする修飾を含む、
前記組成物。
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