JP6415804B2 - Liposome-binding peptide and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、リポソーム結合ペプチド及びその作製方法に関する。より詳細には、リポソームに安定的に結合し膜に入り込むペプチドと、該ペプチドをインビトロ進化法によって作製する方法に関する。 The present invention relates to a liposome-binding peptide and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a peptide that stably binds to a liposome and enters a membrane, and a method for producing the peptide by an in vitro evolution method.
脂質二重膜からなるリポソームは，1960年代に発見されて以来、広く注目を集めてきたが、生体成分の１つであるリン脂質を主成分としており生体適合性に優れること、毒性や抗原性が低いこと、調製が容易であること、脂溶性又は水溶性の種々の薬物を内包させられること等から、薬物送達系（以下、「DDS」ということがある。）の主要な技術の１つとなった。 Liposomes composed of lipid bilayers have attracted widespread attention since their discovery in the 1960s, but they are based on phospholipids, which are one of the biological components, and have excellent biocompatibility, toxicity and antigenicity. Is one of the main technologies of a drug delivery system (hereinafter sometimes referred to as “DDS”) because of its low viscosity, ease of preparation, and inclusion of various fat-soluble or water-soluble drugs. became.
リン脂質のみで構成される単純な組成のリポソームを静脈内投与すると、異物を貪食することにより生体防御に関与する細網内皮系（RES）に捕捉され、破壊されて速やかに排除される。このため、内包された薬物等が血中に漏れ出す等、血中での安定性や滞留性に乏しいという問題があった。
この問題を解決するために、リポソーム表面をポリエチレングリコール（PEG）で修飾する方法が開発され、そうした技術を使用したPEG表面修飾リポソームが、長期血中滞留型リポソームとして開発されている（非特許文献１参照）。
When a liposome having a simple composition composed only of phospholipids is administered intravenously, it is trapped by the reticuloendothelial system (RES) involved in biological defense by phagocytosing foreign substances, and destroyed and quickly eliminated. For this reason, there is a problem that stability and retention in blood are poor, for example, an encapsulated drug leaks into the blood.
In order to solve this problem, a method for modifying the liposome surface with polyethylene glycol (PEG) has been developed, and a PEG surface-modified liposome using such a technique has been developed as a long-term blood-retaining liposome (Non-patent Document). 1).
こうしたPEG表面修飾リポソームは、薬物輸送のキャリアとして使用することができるため、そのPEGを抗体等のリンカーと結合させ、分子識別能を付与することが試みられてきた。
また、リポソーム表面を抗体で修飾する技術が開発され、利用されている（特表2004-512345号公報参照）。この方法では、リポソーム表面を抗体で修飾するために、あらかじめ抗体と反応性のある特殊なリン脂質を混ぜておき、このような混合物を用いてリポソームを調製し、抗体を結合させる方法が記載されている。
また、Protein Aをリポソームに共有結合させることによって、リポソームに抗体結合能を付与する方法も提案されている（例えば、非特許文献２参照）。
Since such PEG surface-modified liposomes can be used as a carrier for drug transport, attempts have been made to confer molecular discrimination ability by binding the PEG with a linker such as an antibody.
In addition, a technique for modifying the liposome surface with an antibody has been developed and used (see JP-T-2004-512345). In this method, in order to modify the liposome surface with an antibody, a special phospholipid reactive with an antibody is mixed in advance, a liposome is prepared using such a mixture, and an antibody is bound. ing.
In addition, a method for imparting antibody binding ability to liposomes by covalently binding Protein A to the liposomes has also been proposed (see, for example, Non-Patent Document 2).
リポソームの血中での安定性や滞留性を改善するために、PEGでリポソームの表面を修飾してリンカーを結合させるには、高度な有機合成の技術が必要であり、かつ、実験操作も非常に高度かつ煩雑であった。そして、抗体のような生体分子を有機化学的に結合させると、こうした生体分子の機能を維持することが難しく、使用した生体分子の機能に影響が出ることもあった。すなわち、期待通りの機能を保ったまま抗体等の分子識別機能を有する分子をリポソームと結合させることは非常に難しいという問題があった。
また、上記のように、抗体と反応性のある特殊なリン脂質を使用する方法では、精製された抗体を準備しておくことが必須であり、リン脂質が結合する抗体分子の部位が予測できないという問題があった。このため、リポソームの結合部位によっては、抗体の活性が維持できないという場合も生じた。
In order to improve the stability and retention of liposomes in blood, modifying the surface of the liposomes with PEG and attaching a linker requires advanced organic synthesis technology, and the experimental procedure is also extremely difficult. It was very sophisticated and cumbersome. When biomolecules such as antibodies are combined organically, it is difficult to maintain the functions of these biomolecules, which may affect the functions of the biomolecules used. That is, there is a problem that it is very difficult to bind a molecule having a molecular identification function such as an antibody to a liposome while maintaining the expected function.
In addition, as described above, in the method using a special phospholipid reactive with an antibody, it is essential to prepare a purified antibody, and the site of the antibody molecule to which the phospholipid binds cannot be predicted. There was a problem. For this reason, the antibody activity could not be maintained depending on the binding site of the liposome.
さらにまた、プロテインAを利用する方法では、リポソームを構成するリン脂質に対して、Protein Aとの反応性をもたせる処理を施す必要があるため、そうした性質を持つリン脂質を使用せざるを得ないという問題があり、Protein Aの分子量は約57kDaと比較的大きいため、取り扱いが難しいという問題もあった。
このため、特殊なリン脂質を使用することなく、サイズを制御しながらリポソームを簡便な手法で作製する技術に対する強い社会的要請があった。また、リポソームを用いたスクリーニングを行うことにより、こうした手法で作製されたリポソームの表面修飾に使用できるペプチドを製造する技術を開発する技術についても、強い社会的要請があった。
一方で、リポソームをスクリーニング手段として使用するには、非常に多くの被験物質が必要となること、また、感度良く検出できる方法を確立することが難しいため、リポソームをスクリーニング手段とすることは、これまで行われてきていない。
Furthermore, in the method using protein A, it is necessary to apply a treatment to react with protein A on the phospholipids that make up the liposomes, so phospholipids with such properties must be used. There is also a problem that Protein A has a relatively large molecular weight of about 57 kDa and is difficult to handle.
For this reason, there has been a strong social demand for a technique for preparing liposomes by a simple technique while controlling the size without using special phospholipids. In addition, there has been a strong social demand for a technique for developing a technique for producing a peptide that can be used for surface modification of a liposome produced by such a technique by performing screening using a liposome.
On the other hand, in order to use liposomes as a screening means, it is necessary to use a very large amount of test substance, and it is difficult to establish a method capable of detecting with high sensitivity. Has not been done until.
本発明の発明者は、上記のような状況の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したものである。すなわち、本発明は、脂質二重層で形成されるリポソームを用いてリポソームと相互作用をするペプチドの作製方法、及びその方法によって得られたリポソーム結合ペプチドを提供することを目的とする。 The inventor of the present invention has completed the present invention by carrying out diligent research under the above circumstances. That is, an object of the present invention is to provide a method for producing a peptide that interacts with a liposome using a liposome formed of a lipid bilayer, and a liposome-binding peptide obtained by the method.
本発明の一の実施態様は、５’側から３’側に向かって、プライマー領域１と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域と、プライマー領域２とを含み、前記ランダム領域は、下記の配列番号１〜５のいずれかに記載のリポソーム結合ペプチドをコードする塩基配列を有する、リポソーム結合ペプチド作製用コンストラクトである。
配列表の配列番号１
Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号２
Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号３
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号４
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu
One embodiment of the present invention includes a
Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu
ここで、前記ランダム領域は、下記の配列番号7〜１２に記載のリポソーム結合ペプチドをコードする塩基配列であることが好ましい。
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号９
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
配列表の配列番号１０
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１１
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１２
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
Here, the random region is preferably a base sequence encoding a liposome-binding peptide described in SEQ ID NOs: 7 to 12 below.
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Sequence number 8 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
Sequence number 10 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
Sequence number 11 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
Sequence number 12 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
本発明の別の実施態様は、25〜40個のアミノ酸から構成され、N末端から1〜5アミノ酸領域に任意のアミノ酸を含むＮ末端側配列、C末端から10アミノ酸領域にアルギニン及びリシンを合計で4個以上含むC末端側配列、及び前記Ｎ末端側配列及び前記Ｃ末端側配列の間のアミノ酸領域に位置する中央部配列で構成されるリポソーム結合ペプチドであって、前記中央部配列は、上述した配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列で表されるリポソーム結合ペプチドである。 Another embodiment of the present invention comprises 25 to 40 amino acids, an N-terminal sequence containing any amino acid in the 1 to 5 amino acid region from the N terminus, and a total of arginine and lysine in the 10 amino acid region from the C terminus. A liposome-binding peptide composed of a C-terminal sequence comprising 4 or more and a central sequence located in an amino acid region between the N-terminal sequence and the C-terminal sequence, wherein the central sequence is: It is a liposome-binding peptide represented by the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 7 to 12.
本発明の更に別の実施態様は、リポソーム結合ペプチドの作製方法であって、前記コンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法である。 Still another embodiment of the present invention is a method for producing a liposome-binding peptide, comprising: a construct producing step for producing the construct; and a peptide display using a cDNA display method using the construct produced in the construct producing step. A cDNA display production step for producing linker-mRNA / cDNA in vitro; a liposome production step for producing liposomes having a desired diameter; a cDNA display obtained in the cDNA display production step is mixed with the liposomes; And a selection step of collecting the bound cDNA display and screening the liposome-bound cDNA display.
ここで、前記cDNAディスプレイ法は、IVV（mRNAディスプレイ）法のmRNAを逆転写したcDNA及びmRNAハイブリッドと新生タンパクとの結合体による、遺伝子型表現型対応付け技術をいう。具体的には、（ａ１）前記コンストラクトから転写によってmRNAを調製するmRNA調製工程と；（ａ２）得られたmRNAをピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体である、リンカー−mRNA複合体を形成させる第１複合体形成工程と；（ａ３）翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させて、第２複合体である、ペプチド−リンカー−mRNA複合体を形成させる第２複合体形成工程と；（ａ４）前記第２複合体を磁性粒子に結合させる粒子結合工程と；（ａ５）前記磁性粒子に結合した第２複合体のmRNAを逆転写してcDNAを形成させ、第３複合体である、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAを形成させる第３複合体形成工程と；（ａ６）前記第３複合体形成工程で得られた第３複合体である、cDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させる第３複合体遊離工程と；（ａ７）前記遊離された第３複合体を、リポソームを結合させて選択する選択工程と、を備えることが好ましい。 Here, the cDNA display method refers to a genotype phenotype association technique using a conjugate of a cDNA and mRNA hybrid obtained by reverse transcription of mRNA of the IVV (mRNA display) method and a nascent protein. Specifically, (a1) an mRNA preparation step of preparing mRNA from the construct by transcription; (a2) a linker that is a first complex by binding the obtained mRNA to a puromycin-bound linker. A first complex forming step for forming an mRNA complex; (a3) a peptide having an amino acid sequence corresponding to the mRNA sequence synthesized by translation and bound to puromycin to form a second complex; A second complex forming step for forming a linker-mRNA complex; (a4) a particle binding step for binding the second complex to magnetic particles; (a5) a second complex bound to the magnetic particles; a third complex forming step of reversely transcribing mRNA to form cDNA and forming the peptide-linker-mRNA / cDNA as a third complex; (a6) obtained in the third complex forming step; A third complex releasing step of releasing a cDNA display, which is a third complex, from the magnetic particles; and (a7) a selection step of selecting the released third complex by binding liposomes. It is preferable.
さらに、前記リポソーム作製工程は、（ｂ１）脂質の有機溶媒溶液を調製する脂質溶液調製工程と；（ｂ２）前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる脂質膜形成工程と；（ｂ３）前記脂質膜にグッド緩衝剤を加えてリポソーム溶液を作製するリポソーム溶液作製工程と；（ｂ４）前記リポソーム溶液に糖を含有するグッド緩衝剤を加えてリポソームを回収するリポソーム回収工程と；を備えることが好ましい。 Further, the liposome preparation step includes (b1) a lipid solution preparation step for preparing a lipid organic solvent solution; and (b2) drying the lipid solution prepared in the lipid solution preparation step on a solid phase to form a lipid membrane. (B3) a liposome solution preparation step in which a good buffer is added to the lipid membrane to prepare a liposome solution; and (b4) a liposome containing a good buffer containing a saccharide in the liposome solution. And a liposome recovery step for recovery.
前記リポソーム結合cDNAディスプレイ回収工程は、（ｃ１）前記リポソームを含有するリポソーム溶液に、cDNAディスプレイ含有溶液を添加する添加工程と；（ｃ２）前記リポソームと前記cDNAディスプレイ溶液との混合液を遠心分離する遠心工程と；（ｃ３）前記リポソームに結合したcDNAディスプレイをリポソームごと回収する回収工程と、を備えることが好ましい。 The liposome-bound cDNA display recovery step includes (c1) an addition step of adding a cDNA display-containing solution to the liposome solution containing the liposome; and (c2) centrifuging the mixture of the liposome and the cDNA display solution. It is preferable to comprise a centrifugation step; and (c3) a recovery step of recovering the cDNA display bound to the liposome together with the liposome.
本発明によれば、リポソームと結合するリポソーム結合ペプチドが提供される。また、上記リポソーム結合ペプチドを、効率よく製造する方法を提供することができる。さらに、これらのリポソーム結合ペプチドを高い内包率で内包するリポソームを提供することができる。 According to the present invention, a liposome-binding peptide that binds to liposomes is provided. Moreover, the method of manufacturing the said liposome binding peptide efficiently can be provided. Furthermore, a liposome that encapsulates these liposome-binding peptides at a high encapsulation rate can be provided.
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の第１の形態は、特定の配列を有するリポソーム結合ペプチドである。リポソームの一般的な構造を図１に示す。これらの中でも、Ｃ末端に４個以上の塩基性アミノ酸配列を有し、Ｎ末端から1〜5アミノ酸領域に任意のアミノ酸を含むＮ末端側配列、Ｃ末端から10アミノ酸領域にアルギニン及びリシンを合計で４個以上含むＣ末端側配列、及び前記Ｎ末端側配列及び前記Ｃ末端側配列の間のアミノ酸領域に位置する中央部配列で構成されるリポソーム結合ペプチドであって、前記中央部配列は、下記の配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。このリポソーム結合ペプチドを構成するアミノ酸配列の数は、10〜100であることが好ましく、25〜40であることが、操作性の点からさらに好ましい。塩基性アミノ酸は、アルギニン又はリシンであることが好ましい。
The present invention is described in further detail below.
The first aspect of the present invention is a liposome-binding peptide having a specific sequence. The general structure of a liposome is shown in FIG. Among these, it has 4 or more basic amino acid sequences at the C-terminal , N-terminal sequence containing any amino acid in the 1-5 amino acid region from the N-terminal , and arginine and lysine in the 10-amino acid region from the C-terminal. A liposome-binding peptide composed of a C-terminal sequence comprising 4 or more and a central sequence located in an amino acid region between the N-terminal sequence and the C-terminal sequence, wherein the central sequence is It preferably has an amino acid sequence described in any one of the following SEQ ID NOs: 7 to 12 . The number of amino acid sequences constituting the liposome-binding peptide is preferably 10 to 100, and more preferably 25 to 40 from the viewpoint of operability. The basic amino acid is preferably arginine or lysine .
また、前記リポソーム結合ペプチドが、配列番号７〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むものであることが、リポソームとの結合活性の高さの点で好ましい。
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号９
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
In addition, the liposome-binding peptide preferably includes the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 7 to 12 in terms of high binding activity with the liposome .
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Sequence number 8 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
配列表の配列番号１０Sequence number 10 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１１Sequence number 11 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１２Sequence number 12 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
本発明の第２の形態は、５’側から３’側に向かって、プライマー領域１と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域と、プライマー領域２とを含み、前記ランダム領域は、下記の配列番号１〜５のいずれかに記載のリポソーム結合ペプチドをコードする塩基配列を有する、リポソーム結合ペプチドの作製用コンストラクトである。このコンストラクトは、上記ペプチドを後述するインビトロ進化法によって得るために使用するものである。プライマー領域１及び２として使用するアミノ酸配列は、市販されている一般的なものを使用することができる。また、プロモーター領域としては、T7、SP6当業者を使用することができる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる（図２参照）。The second aspect of the present invention includes a
配列表の配列番号１
Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys ThrLeu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号２
Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys ThrLeu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号３
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr LeuThr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号４
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr LeuThr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg LeuPro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu
ここで、前記ランダム領域は、上記の配列番号7〜１２に記載のリポソーム結合ペプチドをコードする塩基配列であることが好ましい。Here, the random region is preferably a base sequence encoding the liposome-binding peptide described in SEQ ID NOs: 7 to 12.
ここで、前記ランダム領域は、10〜100アミノ酸残基で構成される。リポソームの厚みは、リポソームを構成する脂肪酸中の炭素鎖数で定まるため、このアミノ酸残基の数を、リポソームを構成する脂質二重層の厚み（図１参照）によって、適宜増減させることが好ましい。ペプチドの長さを脂質二重層の厚みとマッチする長さとすることで、リポソームとの結合をより安定したものとすることができるからである。
そのアミノ酸組成は、極性かつ塩基性のアミノ酸がペプチドを構成するアミノ酸数の50〜70％、極性かつ無電荷のアミノ酸が15〜29％、疎水性アミノ酸が10〜20％、及び極性かつ酸性アミノ酸が１〜５％であることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上で好ましい。前記ランダム領域が、30〜40アミノ酸残基で構成され、そのアミノ酸組成が、極性かつ塩基性のアミノ酸が60％、極性かつ無電荷のアミノ酸が23.2％、疎水性アミノ酸が15％、及び極性かつ酸性アミノ酸が1.8％であることが好ましい（図２参照）。
Here, the random region is composed of 10 to 100 amino acid residues. Since the thickness of the liposome is determined by the number of carbon chains in the fatty acid constituting the liposome, the number of amino acid residues is preferably increased or decreased as appropriate depending on the thickness of the lipid bilayer constituting the liposome (see FIG. 1). This is because the binding to the liposome can be made more stable by setting the length of the peptide to a length that matches the thickness of the lipid bilayer.
Its amino acid composition is 50 to 70% of the number of amino acids comprising polar and basic amino acids, 15 to 29% of polar and uncharged amino acids, 10 to 20% of hydrophobic amino acids, and polar and acidic amino acids Is preferably 1 to 5% when obtaining a peptide having high liposome-binding activity by in vitro screening described later. The random region is composed of 30 to 40 amino acid residues, the amino acid composition of which is 60% of polar and basic amino acids, 23.2% of polar and uncharged amino acids, 15% of hydrophobic amino acids, and polar and It is preferred that the acidic amino acid is 1.8% (see FIG. 2).
また、前記極性かつ無電荷のアミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン（Asn）及びグルタミン（Gln）であり、グリシン、セリン及びトレオニンが15％以上かつ、グリシンとセリンとが同量であることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上でさらに好ましい。
また、前記疎水性ペプチドは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びプロリンであり、プロリンとロイシン、及びアラニンとバリンとがそれぞれ、等量で含まれることが、リポソーム結合活性の高いペプチドを、後述するインビトロスクリーニングによって取得する上で好ましい。
The polar and uncharged amino acids are glycine, serine, threonine, asparagine (Asn) and glutamine (Gln), glycine, serine and threonine are 15% or more, and glycine and serine are the same amount. Furthermore, it is more preferable to obtain a peptide having high liposome-binding activity by in vitro screening described later.
Further, the hydrophobic peptide is alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine and proline, and that proline and leucine, and alanine and valine are contained in equal amounts, respectively, a peptide having high liposome-binding activity, It is preferable when acquiring by the in vitro screening mentioned later.
本発明の第３の実施態様は、リポソーム結合ペプチドの作製方法であって、前記のコンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法である。 A third embodiment of the present invention is a method for producing a liposome-binding peptide, comprising a construct producing step for producing the construct, and a peptide using a cDNA display method using the construct produced in the construct producing step. -Linker-CDNA display production step for producing mRNA / cDNA in vitro; Liposome production step for producing liposomes having a desired diameter; The cDNA display obtained in the cDNA display production step is mixed with the liposomes to obtain liposomes And a selection step of screening the liposome-bound cDNA display. The method comprises the steps of:
このリポソーム結合ペプチドの作製方法を簡単に述べると、上記のコンストラクト作製工程で作製したコンストラクトを用いて106オーダーのcDNAを包含するcDNAライブラリ（ペプチド−リンカー−mRNA/cDNA複合体のライブラリ）を作製し、これをcDNAディスプレイ法を用いて、インビトロで選択する、というものである。
ここで、前記cDNAディスプレイ法は、図２に示すように、（ａ１）mRNA調製工程と；（ａ２）第１複合体形成工程と；（ａ３）第２複合体形成工程と；（ａ４）粒子結合工程と；（ａ５）第３複合体形成工程と；（ａ６）第３複合体遊離工程と；（ａ７）選択工程と、を備えている。
To describe a method for manufacturing the liposome binding peptide simply by using a construct prepared above constructs manufacturing process 106 orders cDNA cDNA library encompassing a - Preparation (peptide linker-mRNA / cDNA complex libraries) This is selected in vitro using the cDNA display method.
Here, as shown in FIG. 2, the cDNA display method comprises: (a1) mRNA preparation step; (a2) first complex formation step; (a3) second complex formation step; (a4) particles A binding step; (a5) a third complex formation step; (a6) a third complex release step; and (a7) a selection step.
まず、（ａ１）mRNA調製工程では、前記のコンストラクトから転写によってmRNAを調製する。そして、（ａ２）第１複合体形成工程において、前記mRNA調製工程で得られたmRNAを、ピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、第１複合体を形成させる。ここで形成される第１複合体は、上記の通り、リンカー−mRNA複合体である。次に、（ａ３）第２複合体形成工程において、翻訳によって合成された前記mRNA配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させる。すなわち、この工程で形成される第２複合体は、ペプチド−リンカー−mRNA複合体である。 First, in the (a1) mRNA preparation step, mRNA is prepared from the above construct by transcription. (A2) In the first complex formation step, the mRNA obtained in the mRNA preparation step is bound to a linker to which puromycin is bound to form a first complex. The first complex formed here is a linker-mRNA complex as described above. Next, (a3) in the second complex formation step, a peptide having an amino acid sequence corresponding to the mRNA sequence synthesized by translation is bound to puromycin. That is, the second complex formed in this step is a peptide-linker-mRNA complex.
次いで、（ａ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られた第２複合体を、磁性粒子に結合させる。引き続き、（ａ５）第３複合体形成工程において、前記磁性粒子と結合した第２複合体のmRNAを逆転写し、cDNAを形成させる。このため、ここで形成される第３複合体は、前記ペプチド−リンカー−mRNA/cDNAとなる（以下、「cDNAディスプレイ」ということがある）。次に、（ａ６）複合体遊離工程において、前記第３複合体形成工程で得られたcDNAディスプレイを前記磁性粒子から遊離させ、引き続き、（ａ７）選択工程において、前記遊離された第３複合体をリポソームと結合させて選択する。 Next, in the (a4) particle bonding step, the second composite obtained as described above is bonded to the magnetic particles. Subsequently, (a5) in the third complex formation step, the mRNA of the second complex bound to the magnetic particles is reverse-transcribed to form cDNA. For this reason, the third complex formed here is the peptide-linker-mRNA / cDNA (hereinafter also referred to as “cDNA display”). Next, (a6) in the complex releasing step, the cDNA display obtained in the third complex forming step is released from the magnetic particles, and subsequently (a7) in the selecting step, the released third complex is released. Are selected by binding to liposomes.
無細胞翻訳系として、市販のキット、例えば、Retic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用してもよい。このキットのプロトコルに従って、無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心し、氷上に置く。反応液は、20〜50μLスケールとし、次のような順番で混合して調製し、反応させることができる。
上記のキットを使用する場合には、0.5〜1μLの20X Translation Mix minus-Met、0.5〜1μLの20X Translation Mix minus-Leu、及び15〜20μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングして混合する。
As a cell-free translation system, a commercially available kit such as Retic Lysate IVT Kit (Ambion) may be used. According to the protocol of this kit, all reagents used in the cell-free translation reaction are gently agitated and centrifuged and placed on ice. The reaction solution can be prepared in a 20-50 μL scale by mixing and reacting in the following order.
If using the above kit, mix by pipetting carefully 0.5-1 μL of 20X Translation Mix minus-Met, 0.5-1 μL of 20X Translation Mix minus-Leu, and 15-20 μL of Retic lysate without foaming. .
この混合液を25〜50μLのサンプル溶液中に添加し、反応液が所望の量、例えば、20〜30μLになるようにDEPC水を加える。そして、泡が立たないように再度丁寧に混合し、30℃にて20分間、翻訳反応をさせる。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に15〜25μＬの２〜４Ｍの塩化カリウム、及び４〜８μLの0.5〜２Mの塩化マグネシウムを加え37℃にて30〜50分間反応させる。
This mixed solution is added to 25 to 50 μL of the sample solution, and DEPC water is added so that the reaction solution becomes a desired amount, for example, 20 to 30 μL. Then, mix again carefully so that bubbles do not form, and carry out a translation reaction at 30 ° C. for 20 minutes.
After the translation reaction, 15-25 μL of 2-4M potassium chloride and 4-8 μL of 0.5-2M magnesium chloride are added to the reaction solution at 37 ° C. in order to promote the connection between conjugate A and synthetic protein. React for 30-50 minutes.
上記の溶液中に80〜100pmol相当のcDNAディスプレイ分子がある場合、50〜70μLの量の磁性ビーズ、例えば、ダイナル社製のDynabead MyOne C1を加え、室温で、15〜30分間インキュベートし、リンカーのピューロマイシンに合成されたペプチドが付加された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド連結体）を磁性ビーズの表面にリンカー部分で結合させる。なお、蛍光分子が結合されているリンカーを使用すると、蛍光のリポソーム表面での局在を確認することができる。 If there is a cDNA display molecule equivalent to 80-100 pmol in the above solution, add 50-70 μL of magnetic beads, for example Dynabead MyOne C1 from Dynal, and incubate at room temperature for 15-30 minutes, A linker (linker-mRNA-peptide conjugate) to which the peptide synthesized in puromycin is added is bonded to the surface of the magnetic bead with a linker moiety. In addition, when the linker with which the fluorescent molecule is couple | bonded is used, the localization on the liposome surface can be confirmed.
次いで、例えば、ReverTra Ace（東洋紡製）を用いて、40〜44℃にて、30分間反応させ、この連結体に結合しているmRNAの逆転写を行い、cDNAが連結された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド−cDNA連結体）を得る。
引き続き、適当な酵素、例えば、RNase T1、を用いて、約35〜38℃にて、10分間反応させ、cDNAが連結された連結体（cDNAディスプレイ）を磁性ビーズから遊離させる。
ここで使用する蛍光分子としては、フルオレセイン、GFP等を挙げることができる。
Next, using, for example, ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd.), the reaction is carried out at 40 to 44 ° C. for 30 minutes, the mRNA bound to this ligated body is reverse-transcribed, and the ligated body (linker) to which the cDNA is ligated. -MRNA-peptide-cDNA conjugate).
Subsequently, using a suitable enzyme such as RNase T1, the reaction is carried out at about 35 to 38 ° C. for 10 minutes to release the cDNA-linked conjugate (cDNA display) from the magnetic beads.
Examples of the fluorescent molecule used here include fluorescein and GFP.
前記リポソーム作製工程は、（ｂ１）脂質溶液調製工程と；（ｂ２）脂質膜形成工程と；（ｂ３）リポソーム溶液作製工程と；（ｂ４）リポソーム回収工程と；を備えている。
ここで、上記の（ｂ１）脂質溶液調製工程では、脂質の有機溶媒溶液を調製する。また、上記の（ｂ２）脂質膜形成工程では、前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる。上記の（ｂ３）リポソーム溶液作製工程では、前記脂質膜にグッド緩衝剤を加えてリポソーム溶液を作製する。上記の（ｂ４）リポソーム回収工程では、前記リポソーム溶液に糖を含有するグッド緩衝剤を加えてリポソームを回収する。
The liposome preparation step includes (b1) a lipid solution preparation step; (b2) a lipid film formation step; (b3) a liposome solution preparation step; and (b4) a liposome recovery step.
Here, in the (b1) lipid solution preparation step, an organic solvent solution of lipid is prepared. In the above (b2) lipid membrane formation step, the lipid solution prepared in the lipid solution preparation step is dried on a solid phase to form a lipid membrane. In the (b3) liposome solution preparation step, a good buffer is added to the lipid membrane to prepare a liposome solution. In the above (b4) liposome recovery step, a liposome is recovered by adding a good buffer containing sugar to the liposome solution.
すなわち、上記の（ｂ１）脂質溶液調製工程で使用する脂質としては、例えば、1,2-ジドデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（以下、「DOPC」ということがある。）等を挙げることができる。光学顕微鏡でも観察することがきる、一枚の脂質二重層からなる巨大なリポソーム（以下、「ベシクル」ということがある。）を作製することができるため、DOPCを使用することが好ましい。
また、有機溶媒としては、ジクロルメタン、クロロホルム、四塩化炭素等の有機溶媒を挙げることができるが、クロロホルムを使用することが、作業の簡便さの点から好ましい。
That is, examples of the lipid used in the above (b1) lipid solution preparation step include 1,2-didodecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (hereinafter sometimes referred to as “DOPC”). it can. It is preferable to use DOPC because a giant liposome composed of a single lipid bilayer (hereinafter sometimes referred to as “vesicle”) that can be observed with an optical microscope can be prepared.
Examples of the organic solvent include organic solvents such as dichloromethane, chloroform, and carbon tetrachloride, but it is preferable to use chloroform from the viewpoint of ease of work.
リポソームに包含された溶液と、リポソームの外液との比重の違いを利用してリポソームを精製するために、異なる種類の糖を同じ濃度で含有するグッドの緩衝液を調製した。こうしたバッファーとしては、例えば、0.05〜0.2Mのスクロースを含有する10〜30mのMOPSバッファーと、0.05〜0.2Mのグルコースを含有する10〜30mMのMOPSバッファーとを調製してもよい。
30〜50μLのDOPC（AVT）を900〜1,000μLの有機溶媒、例えば、クロロホルム、に溶解させて、0.5〜2mMの脂質クロロホルム溶液を所望の量、例えば、0.75〜1.5mL調製する。
In order to purify the liposomes by utilizing the difference in specific gravity between the solution contained in the liposomes and the external solution of the liposomes, Good's buffer containing different types of sugars at the same concentration was prepared. As such a buffer, for example, a 10-30 mM MOPS buffer containing 0.05-0.2 M sucrose and a 10-30 mM MOPS buffer containing 0.05-0.2 M glucose may be prepared.
30-50 μL of DOPC (AVT) is dissolved in 900-1,000 μL of an organic solvent, such as chloroform, to prepare a desired amount, for example, 0.75-1.5 mL, of a 0.5-2 mM lipid chloroform solution.
適当な大きさのガラスシャーレ、例えば、直径5cmのガラスシャーレを界面活性剤で洗浄して乾燥させる。このシャーレ中に、上記の脂質クロロホルム溶液を全量流し込み、シャーレ全体に広げる。
次いで、窒素ガスをシャーレ内に流し込み、有機溶媒を揮発させる。引き続き、真空ポンプをデシケータに接続し、この中に上記のシャーレを入れて一晩置く。
例えば、0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファーを20mL、脂質膜が撹拌されないように、このシャーレ内に静かに注ぐ。35〜39℃で２〜４時間静置して水和させ、リポソームを作製する。以下、リポソームを「ベシクル」ということがある。
A glass petri dish having an appropriate size, for example, a glass petri dish having a diameter of 5 cm, is washed with a surfactant and dried. The entire amount of the lipid chloroform solution is poured into the petri dish and spread over the whole petri dish.
Next, nitrogen gas is poured into the petri dish to volatilize the organic solvent. Subsequently, a vacuum pump is connected to the desiccator, and the above petri dish is put in the desiccator and left overnight.
For example, 20 mL of 20 mM MOPS buffer containing 0.1 M sucrose is gently poured into this petri dish so that the lipid membrane is not stirred. It is allowed to stand for 2 to 4 hours at 35 to 39 ° C. to be hydrated to prepare liposomes. Hereinafter, the liposome is sometimes referred to as a “vesicle”.
リポソーム調製の際には、上記のように、例えば、約0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファー（pH 6.8〜7.2）を使用し、このバッファーが内包されているリポソームを作製する。このリポソーム含有溶液を１〜３mLとって、所望の容量、例えば、15mLの遠心管に入れ、ここに所望の量、例えば、約12mLの約0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 6.8〜7.2）を加える。
リポソームが包含するバッファーよりも、リポソームの外液であるバッファーの比重の方が重いときは、リポソームを浮遊させて精製し、逆の場合には、遠心分離によって沈降させる。遠心によって沈降させる場合には、遠心管の底に集積したリポソームを、シリンジを用いて回収することができる。以上のようにして、光学顕微鏡で観察可能な、巨大一枚膜ベシクル(giant unilamellar vesicles、以下、「GUV」ということがある）を調製する。
In preparing the liposome, as described above, for example, a 20 mM MOPS buffer (pH 6.8 to 7.2) containing about 0.1 M sucrose is used to prepare a liposome in which this buffer is encapsulated. Take 1-3 mL of this liposome-containing solution into a desired volume, for example, a 15 mL centrifuge tube, where a desired amount, for example, about 12 mL of about 20 mM MOPS buffer containing about 0.1 M glucose (pH 6.8-7.2). ).
When the specific gravity of the buffer, which is the external liquid of the liposome, is heavier than the buffer included in the liposome, the liposome is suspended and purified, and in the opposite case, it is precipitated by centrifugation. In the case of sedimentation by centrifugation, the liposomes accumulated at the bottom of the centrifuge tube can be collected using a syringe. As described above, giant unilamellar vesicles (hereinafter sometimes referred to as “GUV”) that can be observed with an optical microscope are prepared.
次いで、（ｂ２）脂質膜形成工程では、前記脂質溶液調製工程で調製した脂質溶液を固相上で乾燥させて脂質膜を形成させる。上記のような脂質を、上記のような有機溶媒に所望の濃度、例えば、0.5〜2mMとなるように溶解させ、固相上に流して薄膜を形成させる。使用する固相としては、上記のような有機溶解を使用することからガラスシャーレが好ましい。こうした固相上に流した後に、例えば、窒素ガスを吹き付けると、形成される薄膜の厚みが一定になる。その後、薄膜を形成させた固相を終夜静置し、さらに乾燥させて、有機溶媒を完全に揮発させる。 Next, in the (b2) lipid membrane formation step, the lipid solution prepared in the lipid solution preparation step is dried on a solid phase to form a lipid membrane. The lipid as described above is dissolved in an organic solvent as described above so as to have a desired concentration, for example, 0.5 to 2 mM, and is flowed on a solid phase to form a thin film. As the solid phase to be used, a glass petri dish is preferable because organic dissolution as described above is used. After flowing on such a solid phase, for example, when nitrogen gas is blown, the thickness of the formed thin film becomes constant. Thereafter, the solid phase on which the thin film has been formed is allowed to stand overnight and further dried to completely evaporate the organic solvent.
次いで、（ｂ３）リポソーム溶液作製工程では、上記のようにして作製した脂質膜に、所望の濃度に調製した糖を含有するグッド緩衝剤を静かに加えて、所望の温度で所望の時間、静置し、リポソーム溶液を作製する。ここで、グッドの緩衝剤の中でも、モルホリノプロパンスルホン酸（以下、「MOPS」ということがある）を使用することが、調製及び保存が容易であることから好ましい。グッドの緩衝剤は、10〜50mMの濃度で使用することが、反応効率の点から好ましい。 Next, in the (b3) liposome solution preparation step, a good buffer containing a sugar prepared at a desired concentration is gently added to the lipid membrane prepared as described above, and the solution is allowed to remain at a desired temperature for a desired time. To prepare a liposome solution. Among Good's buffers, it is preferable to use morpholinopropanesulfonic acid (hereinafter sometimes referred to as “MOPS”) because it is easy to prepare and store. Good buffer is preferably used at a concentration of 10 to 50 mM from the viewpoint of reaction efficiency.
また、ここで上記の緩衝剤に添加する等としては、スクロース、グルコース等を挙げることができる。こうした糖の含有量は、例えば、0.05〜0.2mMとすることが、リポソームの精製、リポソームとペプチドとの結合、及びリポソームとペプチドとの結合体の精製が容易であるために好ましい。
例えば、0.5〜2mMのDOPCのクロロホルム溶液を調製し、この溶液をガラスシャーレにまく。その後、窒素ガスを吹き付けて、シャーレの内壁に脂質が薄い膜を作るようにクロロホルムを除去する。その後、例えば、真空ポンプに連結したデシケータ中でさらに一晩乾燥させる。
Moreover, sucrose, glucose, etc. can be mentioned as adding to said buffer agent here. The sugar content is preferably 0.05 to 0.2 mM, for example, because it is easy to purify the liposome, bind the liposome and the peptide, and purify the conjugate of the liposome and the peptide.
For example, a chloroform solution of 0.5 to 2 mM DOPC is prepared, and this solution is spread on a glass petri dish. After that, nitrogen gas is blown to remove chloroform so that a thin film of lipid is formed on the inner wall of the petri dish. Then, it is further dried overnight in a desiccator connected to a vacuum pump, for example.
次に、0.05〜0.2Mの糖を含む10〜50mMのグッドの緩衝剤に脂質膜を加えて、32〜40℃にて２〜５時間インキュベートして水和させ、リポソームを作製する。例えば、約0.05〜0.2Mのスクロースを含む約20mMのMOPSバッファー中に、上記のようにして作製した脂質膜を加えて、約35〜37℃で約２〜４時間インキュベートして水和させる。この方法で、直径0.01〜10μｍのリポソームを作製することができる。
引き続き、（ｂ４）リポソーム回収工程では、前記リポソーム溶液に糖を含有するグッドの緩衝剤を添加して、遠心によりリポソームを回収する。この工程で使用する糖としては、グルコース、スクロース等を挙げることができるが、グルコースを使用すると、リポソームを容易に沈降させることができるために好ましい。
Next, a lipid membrane is added to 10-50 mM Good's buffer containing 0.05-0.2 M sugar, and the mixture is incubated at 32-40 ° C. for 2-5 hours to be hydrated to prepare liposomes. For example, the lipid membrane prepared as described above is added to about 20 mM MOPS buffer containing about 0.05 to 0.2 M sucrose, and incubated at about 35 to 37 ° C. for about 2 to 4 hours for hydration. By this method, liposomes having a diameter of 0.01 to 10 μm can be prepared.
Subsequently, in the (b4) liposome recovery step, a good buffer containing sugar is added to the liposome solution, and the liposomes are recovered by centrifugation. Examples of the sugar used in this step include glucose and sucrose, but it is preferable to use glucose because the liposome can be easily precipitated.
リポソームの作製からこのリポソームに結合したcDNAをリポソームごと回収する工程を示した模式図を図６に示す。
上記のようにして作製したリポソーム溶液に、所望の濃度の糖を含有するグッドの緩衝剤を所望の量加えて遠心し、リポソームを回収する。例えば、0.05〜0.2mMのグルコースを含有する10〜50mMのMOPSを４〜６倍容加えて遠心する。この溶液を使用することにより、リポソーム内に封入されたスクロース含有MOPSの比重の方が、リポソーム外液であるグルコースを含有するMOPSの比重よりも大きくなるために、遠心するだけで、リポソームを沈降させることができる。沈降したリポソームについては、例えば、シリンジ等で回収することができる。
以上のようにして作製したリポソームは、再結合を起こさないように、遮光して、例えば、４℃にて使用時まで保存する。
FIG. 6 is a schematic diagram showing a process of recovering the cDNA bound to the liposome from the preparation of the liposome together with the liposome.
The liposome solution prepared as described above is added with a desired amount of Good's buffer containing a desired concentration of sugar and centrifuged to collect the liposomes. For example, 4 to 6 volumes of 10 to 50 mM MOPS containing 0.05 to 0.2 mM glucose are added and centrifuged. By using this solution, the specific gravity of sucrose-containing MOPS encapsulated in liposomes is greater than that of MOPS containing glucose, which is an external solution of liposomes. Can be made. The precipitated liposome can be collected with, for example, a syringe.
The liposome produced as described above is stored in the dark at 4 ° C. until use so as not to cause recombination.
次に、リポソーム結合cDNAディスプレイ回収工程は、（ｃ１）溶液添加工程と；（ｃ２）分離工程と；（ｃ３）回収工程とを備えている。（ｃ１）溶液添加工程では、前記リポソーム含有するリポソーム溶液に、cDNAディスプレイ含有溶液を添加する。引き続き、前記の（ｃ２）分離工程で、前記リポソームと前記cDNAディスプレイ溶液との混合液を、例えば、5,000ｘｇで５分間遠心して分離する。その後、前記の（ｃ３）回収工程で、前記リポソームに結合したcDNAディスプレイをリポソームごと回収する。
以上のようにして、リポソーム結合ペプチドを製造することができる。
Next, the liposome-bound cDNA display recovery step includes (c1) a solution addition step; (c2) a separation step; and (c3) a recovery step. (C1) In the solution addition step, a cDNA display-containing solution is added to the liposome-containing liposome solution. Subsequently, in the (c2) separation step, the mixed solution of the liposome and the cDNA display solution is separated by, for example, centrifuging at 5,000 × g for 5 minutes. Thereafter, in the (c3) recovery step, the cDNA display bound to the liposome is recovered together with the liposome.
A liposome-binding peptide can be produced as described above.
（実施例１）リポソーム結合ペプチド選択用コンストラクトの構築
図３に示す構造を有するコンストラクトの構築には、以下のものを使用した。
ランダム領域については、アルギニン含有量が多くかつストップコドンの出現確率が小さくなるように塩基のバランスを調整した配列に基づいて設計し、製造をジーンワールド（株）に委託した。
ランダム領域の5'側上流に、プライマー領域１、T7プロモーター配列、及びUTRを、また、3'側下流にヒスチジンタグ（HNtag）及びプライマー領域２を付加したDNAを常法によって合成し、PCRによって増幅させ、DNA精製カラムによって精製した。
(Example 1) Construction of liposome-binding peptide selection construct The following was used to construct a construct having the structure shown in FIG.
The random region was designed based on a sequence in which the balance of the base was adjusted so that the arginine content was high and the appearance probability of the stop codon was small, and the production was outsourced to Gene World Co., Ltd.
Synthesize DNA by adding the
（実施例２）cDNAディスプレイ法によるインビトロでの選択
（１）mRNAの合成
実施例１で作製したコンストラクトとT7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System（プロメガ（株）製）を用いて、添付のプロトコルに従って5〜30 pmol/μLのmRNAを合成した。
(Example 2) In vitro selection by cDNA display method (1) Synthesis of mRNA Using the construct prepared in Example 1 and T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (manufactured by Promega Corp.), according to the attached protocol 5-30 pmol / μL mRNA was synthesized.
（２）連結体の形成（T4 RNAリガーゼを用いたライゲーション酵素反応）
ライゲーション反応は、リンカー１に対して1.5倍のmRNAを加え、20μLのT4 RNAリガーゼバッファー（50mMのトリス塩酸、pH 7.5；10mMの塩化マグネシウム、10mMのDTT；1mMのATPを含む）中にて行なった。酵素を加える前にアニーリングするため、90℃で５分間アルミブロック上にて温めた、次に70℃で５分間アルミブロック上にて温め、最後に室温で10分間放置した後、氷上に置いた。
ここに、1μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（10 U/μL）及び1μLのT4 RNAリガーゼ（40 U/μL）（いずれもタカラバイオ（株）製）を加え、25℃で15分間、保持した。
(2) Formation of ligation (ligation enzyme reaction using T4 RNA ligase)
The ligation reaction is performed in 20 μL of T4 RNA ligase buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM magnesium chloride, 10 mM DTT; 1 mM ATP) containing 1.5 times as much mRNA as
To this, 1 μL of T4 polynucleotide kinase (10 U / μL) and 1 μL of T4 RNA ligase (40 U / μL) (both manufactured by Takara Bio Inc.) were added and held at 25 ° C. for 15 minutes.
（３）cDNAディスプレイ法によるスクリーニング
（３−１）無細胞翻訳系
無細胞翻訳系にはRetic Lysate IVT Kit（Ambion社製）を利用した。混合の方法等は、キットのプロトコルを参照して行った。無細胞翻訳反応に使用される全ての試薬を穏やかに撹拌して遠心した後、氷上に置いた。25μLスケールの反応液は次のような順番で混合して調製し、反応させた。
0.625μLの20X Translation Mix minus-Met、0.625μLの20X Translation Mix minus-Leu、及び17μLのRetic lysateを泡立たないよう注意深くピペッティングし、混合した。
(3) Screening by cDNA display method (3-1) Cell-free translation system Retic Lysate IVT Kit (Ambion) was used for the cell-free translation system. The mixing method and the like were performed with reference to the kit protocol. All reagents used in the cell-free translation reaction were gently agitated and centrifuged, then placed on ice. A 25 μL scale reaction solution was prepared by mixing and reacting in the following order.
0.625 μL of 20X Translation Mix minus-Met, 0.625 μL of 20X Translation Mix minus-Leu, and 17 μL of Retic lysate were carefully pipetted and mixed without foaming.
この混合液を36.5μLのサンプル溶液中に添加し、反応液が25μLになるようにDEPC水を加えた。そして、泡が立たないように再度丁寧に混合した。混合後30℃にて20分間、翻訳反応をさせた。
上記翻訳反応後に、連結体Ａと合成タンパク質の連結を促進するため、上記反応液に20μＬの3Ｍの塩化カリウム、及び6μLの1Mの塩化マグネシウムを加え37℃で40分間反応させた。
This mixed solution was added to 36.5 μL of the sample solution, and DEPC water was added so that the reaction solution became 25 μL. And it mixed carefully again so that a bubble might not be formed. After mixing, translation reaction was allowed to proceed at 30 ° C. for 20 minutes.
After the translation reaction, 20 μL of 3 M potassium chloride and 6 μL of 1 M magnesium chloride were added to the reaction solution to promote the connection between the conjugate A and the synthetic protein, and reacted at 37 ° C. for 40 minutes.
（３−２）ペプチドの精製
上記の溶液中に90pmol相当のcDNAディスプレイ分子がある場合、60μLの量の磁性ビーズ（ダイナル社製、Dynabead MyOne C1）を加え、室温で20分間インキュベートし、リンカーのピューロマイシンに合成されたペプチドが付加された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド連結体）を磁性ビーズの表面にリンカー部分で結合させた。なお、ここでは、蛍光分子（GFP）が結合されているリンカーを使用した。
次いで、ReverTra Ace（東洋紡製）を用いて、42℃、30分の条件で反応させ、この連結体に結合しているmRNAの逆転写を行い、cDNAが連結された連結体（リンカー−mRNA−ペプチド−cDNA連結体）を得た。
引き続き、RNase T1を用いて、37℃、10分の条件で反応させ、cDNAが連結された連結体（cDNAディスプレイ）を磁性ビーズから遊離させた。
(3-2) Peptide purification If there is a cDNA display molecule equivalent to 90 pmol in the above solution, add 60 μL of magnetic beads (Dynal, Dynabead MyOne C1), and incubate at room temperature for 20 minutes. A conjugate (linker-mRNA-peptide conjugate) to which the peptide synthesized with puromycin was added was bound to the surface of the magnetic bead with a linker moiety. Here, a linker to which a fluorescent molecule (GFP) is bound is used.
Next, using ReverTra Ace (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), reaction was carried out at 42 ° C. for 30 minutes, reverse transcription of mRNA bound to this ligated product was performed, and a ligated product in which cDNA was ligated (linker-mRNA- Peptide-cDNA conjugate) was obtained.
Subsequently, RNase T1 was used for the reaction at 37 ° C. for 10 minutes to release the cDNA-linked conjugate (cDNA display) from the magnetic beads.
（実施例３）巨大一枚膜リポソームの作製
（１）リポソームの作製
本実施例では、光学顕微鏡で観察可能なGUVを調製した。0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファー及び0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファーを調製した。
40μLのDOPC（AVT）を960μLのクロロホルムに溶解させて、1mMの脂質クロロホルム溶液1mLを調製した。
(Example 3) Production of giant unilamellar liposomes (1) Production of liposomes In this example, GUVs that can be observed with an optical microscope were prepared. A 20 mM MOPS buffer containing 0.1 M sucrose and a 20 mM MOPS buffer containing 0.1 M glucose were prepared.
40 μL of DOPC (AVT) was dissolved in 960 μL of chloroform to prepare 1 mL of 1 mM lipid chloroform solution.
直径5cmのガラスシャーレを界面活性剤で洗浄して乾燥させた。このシャーレ中に、上記の脂質クロロホルム溶液を全量（1mL）流し込み、シャーレ全体に広げた。
次いで、窒素ガスをシャーレ内に流し込み、クロロホルムを揮発させた。引き続き、油回転真空ポンプをデシケータに接続し、この中に上記のシャーレを入れ、一晩置いた。
0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファーを20ｍL、脂質膜が撹拌されないように、このシャーレ内に静かに注いだ。37℃で３時間静置して水和させ、リポソームを作製した。
A glass petri dish having a diameter of 5 cm was washed with a surfactant and dried. The whole amount (1 mL) of the above-mentioned lipid chloroform solution was poured into the petri dish and spread over the whole petri dish.
Subsequently, nitrogen gas was poured into the petri dish to volatilize chloroform. Subsequently, an oil rotary vacuum pump was connected to the desiccator, and the above petri dish was put in this and left overnight.
20 mL of 20 mM MOPS buffer containing 0.1 M sucrose was gently poured into the petri dish so that the lipid membrane was not stirred. The mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 3 hours to be hydrated to prepare liposomes.
（２）リポソームの回収
リポソーム調製の際に、上記のように0.1Mのスクロース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を使用し、このバッファーが内包されているリポソームを作製した。このリポソーム含有溶液を2mLとって15mLの遠心管に入れ、ここに、12mLの0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を加えた。
リポソーム作製時と異なるバッファーを使用することで、リポソームの外液であるグルコース含有MOPSバッファーに比べて、リポソーム内液のスクロース含有MOPS溶液の比重の方が重くなるため、遠心分離により沈降させた。遠心管の底に集積したリポソームを、シリンジを用いて回収した。
(2) Recovery of liposomes When preparing liposomes, a 20 mM MOPS buffer (pH 7.0) containing 0.1 M sucrose was used as described above, and liposomes containing this buffer were prepared. 2 mL of this liposome-containing solution was put into a 15 mL centrifuge tube, and 12 mL of 0.1 mM glucose-containing 20 mM MOPS buffer (pH 7.0) was added thereto.
Since the specific gravity of the sucrose-containing MOPS solution in the liposome was heavier than that in the glucose-containing MOPS buffer, which was the external solution of the liposome, by using a buffer different from that used for liposome preparation, the solution was precipitated by centrifugation. Liposomes accumulated at the bottom of the centrifuge tube were collected using a syringe.
得られたリポソームの大きさを、スケールバーとともに図８に示す。黒い矢印で示すものがリポソームである。また、ゼータサイザー（マルバーンインスタルメンツ社製、英国製）で形成されたリポソームの大きさを測定した。結果を図９に示す。
図９に示すように、このときの実験では、直径が１nm以下の非リポソームと、直径が100nmを越えるサイズのリポソームとが形成されたことが確認された。
その後の実験を繰り返し、直径が１〜10μmのリポソームが形成されることを確認した（不図示）。
The size of the obtained liposome is shown in FIG. 8 together with the scale bar. What is indicated by a black arrow is a liposome. In addition, the size of liposomes formed by Zetasizer (Malvern Instruments, UK) was measured. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 9, in the experiment at this time, it was confirmed that non-liposomes having a diameter of 1 nm or less and liposomes having a diameter exceeding 100 nm were formed.
Subsequent experiments were repeated and it was confirmed that liposomes having a diameter of 1 to 10 μm were formed (not shown).
（実施例４）結合ペプチドのスクリーニング
（１）作製したリポソームとペプチドとの結合性の確認
実施例３で作製したリポソーム溶液（0.1Mのスクロースを含有する20mMのMOPSバッファー（pH 7.0））を２mLとって15mLの遠心管に入れ、ここに実施例２で作製したcDNAディスプレイを含む溶液を0.1mL加えた。さらに、12mLの0.1Mのグルコース含有20mMのMOPSバッファー（pH 7.0）を加え、その後、5,000ｘｇで、25℃にて５分間遠心した。対照には、cDNAディスプレイを含まない溶液のみを加え、同様に遠心操作を行った。
(Example 4) Screening of bound peptide (1) Confirmation of binding between prepared liposome and
図７に、遠心管の中のリポソーム、cDNAディスプレイ、cDNAが結合した状態のリポソームを示す模式図と顕微鏡で観察された像（図７の左側）及び遠心後の模式図と顕微鏡で観察された像（図７の右側）を示した。
リポソームに結合したcDNAディスプレイは、図７の左側及び右側の顕微鏡の下側の像に示すように、蛍光が観察された。これに対し、リポソームに結合していないcDNAディスプレイのみでは蛍光は観察されなかった。
FIG. 7 is a schematic diagram showing a liposome in a centrifuge tube, a cDNA display, a liposome in which cDNA is bound, an image observed with a microscope (left side of FIG. 7), a schematic diagram after centrifugation, and a microscope. An image (right side of FIG. 7) is shown.
In the cDNA display bound to the liposome, fluorescence was observed as shown in the lower image of the left and right microscopes in FIG. In contrast, no fluorescence was observed only with the cDNA display not bound to the liposomes.
（２）リポソーム結合ペプチドのスクリーニング−１
実施例２で得られたペプチドを、上記のようにリポソーム溶液を混合して、リポソームへの結合性を調べた結果、84個のペプチドが得られた。これらのうち、共通の配列を有する17個の配列を図８にまとめて示した。これら以外のペプチドの配列には共通するものが見られず、収束しなかった。
(2) Liposome-binding peptide screening-1
The peptide obtained in Example 2 was mixed with the liposome solution as described above, and the binding property to the liposome was examined. As a result, 84 peptides were obtained. Of these, 17 sequences having a common sequence are collectively shown in FIG. No other common peptide sequences were found and did not converge.
図８に示した通り、Aグループ（11個）のペプチドのアルギニンの含有量は37％、リジンを含めると47％であった。また、Bグループ（4個）のペプチドのアルギニンの含有量は43％でリジンを含めるとAグループと同様の47％であった。Cグループ（2個）のペプチドのアルギニンの含有量は30％でリジンを含めると43％となっており、いずれのグループに属するペプチドも、コンストラクト作製時のアルギニン含有量56％（リジンを含めると60％）よりも、これらの割合は低くなっていた。 As shown in FIG. 8, the content of arginine in the peptides of Group A (11) was 37%, and 47% when lysine was included. In addition, the content of arginine in the peptides of group B (4) was 43%, and when lysine was included, it was 47%, the same as in group A. The arginine content of the peptides in Group C (2) is 30% and 43% when lysine is included, and the peptides belonging to any group have an arginine content of 56% (including lysine when constructing). These percentages were lower than (60%).
これらのペプチドとリポソームの脂質二重層の結合様式を示す模式図を図９に示す。図９中、疎水性のアミノ酸は黒丸で、また、親水性のアミノ酸は白丸で示した。また、親水性かつ塩基性のアミノ酸は網かけで示した。これらのペプチドは、その中央付近に疎水性のアミノ酸配列があるため、この部分で脂質二重層と結合し、親水性のアミノ酸配列が脂質二重層の外液である水溶液と接する位置にあると考えられた。
A-1のペプチドのアミノ酸配列を見ると、枠をつけた11個の配列中７個が疎水性のアミノ酸である。このため、疎水性のアミノ酸によって膜内に進入していくモデルと一致した（図10参照）。
A schematic diagram showing the binding mode of these peptides and the lipid bilayer of the liposome is shown in FIG. In FIG. 9, hydrophobic amino acids are indicated by black circles, and hydrophilic amino acids are indicated by white circles. The hydrophilic and basic amino acids are shown by shading. Since these peptides have a hydrophobic amino acid sequence near the center, they bind to the lipid bilayer at this part, and the hydrophilic amino acid sequence is considered to be in contact with the aqueous solution that is the outer solution of the lipid bilayer. It was.
Looking at the amino acid sequence of the A-1 peptide, 7 of the 11 sequences with a frame are hydrophobic amino acids. Therefore, it was consistent with the model that entered the membrane by hydrophobic amino acids (see FIG. 10).
（３）リポソーム結合ペプチドのスクリーニング−２
実施例３で形成されたリポソームと実施例２で作製した蛍光標識ペプチドとを、ペプチドの終濃度100nM、25℃で３時間インキュベートした場合と、リポソームのみの場合を、それぞれ、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を図11及び12に示す。図中のスケールバーは２μmである。
この大きさのリポソームであっても、ペプチドとインキュベートした場合には、蛍光含観察され、ペプチドが結合していることが確認された。これに対し、リポソームのみでは蛍光は確認されなかった。
(3) Liposome-binding peptide screening-2
The case where the liposome formed in Example 3 and the fluorescence-labeled peptide produced in Example 2 were incubated at a final peptide concentration of 100 nM at 25 ° C. for 3 hours and the case of only the liposome were examined with a confocal laser microscope. The observation results are shown in FIGS. The scale bar in the figure is 2 μm.
Even liposomes of this size were observed with fluorescence when incubated with peptides, confirming that the peptides were bound. On the other hand, fluorescence was not confirmed only with liposomes.
ペプチドの濃度を６μMに上げ、25℃で２時間インキュベートした場合でも、蛍光観察像より、ペプチドがリポソームに結合していることが示された。結果を図13に示す。
以上より、上記のコンストラクトを用いてインビトロ選択してスクリーニングを行うことにより、リポソームに結合するペプチドが得られたことが確認された。
Even when the concentration of the peptide was increased to 6 μM and incubated at 25 ° C. for 2 hours, the fluorescence observation image showed that the peptide was bound to the liposome. The results are shown in FIG.
From the above, it was confirmed that peptides that bind to liposomes were obtained by performing in vitro selection and screening using the above construct.
また、本発明は、医薬、診断薬、環境分析、食品分析、研究用バイオイメージング等の幅広い分野において有用である。 The present invention is also useful in a wide range of fields such as pharmaceuticals, diagnostics, environmental analysis, food analysis, and research bioimaging.
配列番号１：リポソーム膜結合ペプチド
配列番号２：リポソーム膜結合ペプチド
配列番号３：リポソーム膜結合ペプチド
配列番号４：リポソーム膜結合ペプチド
配列番号５：リポソーム膜結合ペプチド
配列番号６：リポソーム膜結合ペプチドＡ
配列番号７：リポソーム膜結合ペプチドＢ−１
配列番号８：リポソーム膜結合ペプチドＢ−２
配列番号９：リポソーム膜結合ペプチドＣ
配列番号１０：リポソーム膜結合ペプチドＡ−１
配列番号１１：リポソーム膜結合ペプチドＡ−２
配列番号１２：リポソーム膜結合ペプチドＡ−３
SEQ ID NO: 1: liposome membrane bound peptide <br/> SEQ ID NO: 2: liposome membrane bound peptide <br/> SEQ ID NO: 3: liposome membrane bound peptide <br/> SEQ ID NO: 4: liposome membrane bound peptide <br /> SEQ ID NO: 5: liposome membrane bound peptide <br/> SEQ ID NO: 6: liposome membrane binding peptide A
Sequence number 7: Liposome membrane bound peptide B-1
SEQ ID NO: 8: Liposome membrane- bound peptide B-2
SEQ ID NO: 9: liposome membrane-bound peptide C
SEQ ID NO: 10: liposome membrane-bound peptide A-1
SEQ ID NO: 11: liposome membrane-bound peptide A-2
SEQ ID NO: 12: liposome membrane-bound peptide A-3
Claims (7)
配列表の配列番号１
Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号２
Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
配列表の配列番号３
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号４
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
配列表の配列番号５
Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu From 5 ′ side to 3 ′ side, primer region 1, promoter region, untranslated region, random region, tag region, and primer region 2 are included. A construct for preparing a liposome-binding peptide, having a base sequence encoding the liposome-binding peptide according to any one of -5.
Sequence number 1 of a sequence table
Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
Sequence number 2 of a sequence table
Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr
Sequence number 3 of a sequence table
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
Sequence number 4 of a sequence table
Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Gln Arg Gln Arg Thr Leu
Sequence number 5 of a sequence table
Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu
配列表の配列番号７Sequence number 7 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８Sequence number 8 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu IleArg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号９Sequence number 9 of a sequence table
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His LeuGly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
配列表の配列番号１０Sequence number 10 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１１Sequence number 11 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１２Sequence number 12 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr LeuArg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号７
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号８
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
配列表の配列番号９
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
配列表の配列番号１０
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１１
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
配列表の配列番号１２
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu N-terminal sequence consisting of 25 to 40 amino acids, including any amino acid in the 1-5 amino acid region from the N-terminus, and C-terminal sequence including a total of 4 or more arginine and lysine in the 10 amino acid region from the C-terminus , And a liposome-binding peptide composed of a central sequence located in an amino acid region between the N-terminal sequence and the C-terminal sequence, wherein the central sequence is any one of the following SEQ ID NOs: 7 to 12 A liposome-binding peptide represented by the amino acid sequence described above .
Sequence number 7 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Gln Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Sequence number 8 of a sequence table
Arg Ile Ser Lys Ile Thr Arg Pro Pro Thr Arg Thr Arg Arg Glu Arg Glu Arg Thr Leu Thr Pro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Glu Ile
Sequence number 9 of a sequence table
Gly Ser Lys Lys Glu Pro Arg Pro Ser Gly Ile Arg Thr Arg Arg Ile Asn Arg Arg Leu Arg Arg Leu Arg Pro Leu Lys Lys His Leu
Sequence number 10 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
Sequence number 11 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Ser Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Thr Leu
Sequence number 12 of a sequence table
Arg His Ser Lys Ser Leu Pro Ser Arg Val Ile Pro Arg Ala Asp Pro Arg Thr Lys Thr Arg Arg Arg Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu
請求項１又は２に記載のコンストラクトを作製するコンストラクト作製工程と；
前記コンストラクト作製工程で作製されたコンストラクトを使用したcDNAディスプレイ法を用いてペプチド−リンカー−mRNA/cDNAをインビトロで作製するcDNAディスプレイ作製工程と；
所望の直径を有するリポソームを作製するリポソーム作製工程と；
前記cDNAディスプレイ作製工程で得られたcDNAディスプレイを前記リポソームと混合させ、リポソームと結合したcDNAディスプレイを回収し、リポソーム結合cDNAディスプレイをスクリーニングする選択工程と；
を備えるリポソーム結合ペプチドの作製方法。 A method for producing a liposome-binding peptide, comprising:
A construct production step of producing the construct according to claim 1 or 2 ;
A cDNA display production step of producing a peptide-linker-mRNA / cDNA in vitro using a cDNA display method using the construct produced in the construct production step;
A liposome production step of producing liposomes having a desired diameter;
A selection step of mixing the cDNA display obtained in the cDNA display production step with the liposome, collecting the cDNA display bound to the liposome, and screening the liposome-bound cDNA display;
A method for producing a liposome-binding peptide comprising:
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