JP6385999B2 - Lactic acid bacteria producing ethanol - Google Patents
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Description
本発明は、エタノールを産生する乳酸菌に関する。 The present invention relates to a lactic acid bacterium that produces ethanol.
パルミジャーノ・レッジャーノは、パルメザンチーズの一種であり、濃厚な旨みとフルーティーな香りを特徴とする超硬質チーズである。パルミジャーノ・レッジャーノを特徴づけるパイナップル様のフルーティーな香りの本体は、パイナップル様の香りを呈するエステル（以下、「パイン臭エステル」と称することがある。）である酪酸エチル（ethyl butyrate）とヘキサン酸エチル（ethyl hexanoate）である。パイン臭エステルは、遊離脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドなどの低分子脂肪酸と、エタノールを原料として合成されるものであり、チーズの熟成中に乳酸菌の酵素によって生成される。 Parmigiano Reggiano is a kind of Parmesan cheese, an ultra-hard cheese characterized by a rich umami and fruity aroma. The main body of pineapple-like fruity scent that characterizes Parmigiano Reggiano is ethyl butyrate and ethyl hexanoate, which are esters that exhibit a pineapple-like scent (hereinafter sometimes referred to as “pine odor ester”). (Ethyl hexanoate). Pine odor esters are synthesized using low-molecular-weight fatty acids such as free fatty acids, monoglycerides, diglycerides, and triglycerides and ethanol as raw materials, and are produced by lactic acid bacteria enzymes during cheese ripening.
チーズの熟成中の乳酸菌は、エステラーゼによってエステルを生成している。乳酸菌のエステラーゼは、カルボン酸（遊離脂肪酸）とアルコール（エタノール）から、エステルと水を生成する反応（esterification）、または、あるエステル（グリセリド）と、あるアルコール（エタノール）から、別のエステルと、別のアルコールを生成する反応（加アルコール分解）を触媒することが知られている。（非特許文献１）。 Lactic acid bacteria during cheese ripening produce esters by esterases. Esterase of lactic acid bacteria is a reaction (esterification) that produces ester and water from carboxylic acid (free fatty acid) and alcohol (ethanol), or one ester (glyceride) and one alcohol (ethanol), another ester, It is known to catalyze a reaction (alcohololysis) that produces another alcohol. (Non-Patent Document 1).
特許文献１では、エステル交換活性の高い乳酸菌や微生物由来の酵素を用いて、チーズ風味が良好となるエステルを増強する方法が開示されている。エステル化反応の基質となるアルコールについては、エタノールをチーズに直接添加する方法に加え、微生物によってチーズ中でエタノールを産生させて、エタノール含有量を高める方法が開示されている。エタノールを直接添加してエタノール含有量を高めたチーズでは、フルーティーな香りがするが、若干の苦味とせっけん様の風味が認められている。これに対し、エタノールを産生する微生物によってエタノール含有量を高めたチーズでは、フルーティーな香りがする上に、エタノールを直接添加したチーズで認められた苦味やせっけん様の風味が認められていない。 Patent Document 1 discloses a method for enhancing an ester having a good cheese flavor by using a lactic acid bacterium or a microorganism-derived enzyme having high transesterification activity. Regarding alcohol as a substrate for esterification reaction, in addition to a method of adding ethanol directly to cheese, a method of increasing ethanol content by producing ethanol in cheese by microorganisms is disclosed. Cheese with a direct addition of ethanol to increase the ethanol content has a fruity aroma, but some bitterness and soap-like flavor are recognized. On the other hand, in a cheese whose ethanol content is increased by a microorganism that produces ethanol, it has a fruity scent, and the bitterness and soap-like flavor recognized in cheese directly added with ethanol are not recognized.
このような知見から、チーズ中のエタノール含有量を高めることは、パイナップル様のフルーティーな香りを増大するためには有益であること、および、エタノールを直接添加してエタノール含有量を高めたチーズよりも、エタノールを産生する微生物によってエタノール含有量を高めたチーズにおいて、苦味やせっけん様の風味のない、より好ましい風味が得られることが示唆される。 From these findings, increasing the ethanol content in cheese is beneficial to increase the pineapple-like fruity aroma, and more than adding cheese directly to increase the ethanol content. However, it is suggested that a cheese having a higher ethanol content by ethanol-producing microorganisms can have a more favorable flavor without a bitter or soapy flavor.
本発明者らは、後述する試験例のように、特許文献１に開示されている方法を参考にして、パイン臭エステルを増大させた、パイナップル様のフルーティーな香りの高いナチュラルチーズを試作した。しかしながら、ナチュラルチーズを製造するために使用する微生物（チーズ製造用スターター）と、エタノールを産生する微生物（アジャンクトスターター）との相性によっては、パイナップル様のフルーティーな香りの高いナチュラルチーズを安定して製造できないなどの問題が発生した。つまり、従来技術では、パイナップル様のフルーティーな香りの高いナチュラルチーズについて、その品質を担保しながら、商業規模で安定して生産することが困難であることが判明した。 The present inventors made a trial production of a pineapple-like fruity natural fragrant natural cheese with an increased pine odor ester by referring to the method disclosed in Patent Document 1 as in the test examples described later. However, depending on the compatibility of microorganisms used to manufacture natural cheese (starter for cheese manufacture) and microorganisms that produce ethanol (adjunct starter), pineapple-like fruity natural scented natural cheese can be stabilized. Problems such as inability to manufacture occurred. In other words, with the conventional technology, it has been found that it is difficult to stably produce a pineapple-like fruity fragrant natural cheese on a commercial scale while ensuring its quality.
本発明は、パイナップル様のフルーティーな香りが増強されたナチュラルチーズであって、苦味やせっけん様の風味がなく、商業規模で安定して製造することのできるナチュラルチーズの製造に用いられる乳酸菌を提供することにある。 The present invention provides a lactic acid bacterium used for the production of natural cheese, which is a natural cheese with an enhanced pineapple-like fruity fragrance, which has no bitter or soapy flavor and can be produced stably on a commercial scale There is to do.
本発明者らは、ナチュラルチーズ中のエタノール含有量が0.01 w/w%以上であれば、パイン臭エステル産生量が顕著に高くなることを見出した。つまり、ナチュラルチーズ中のエタノール含有量が所定値よりも高いと、パイナップル様のフルーティーな香りを安定して強く感じられることを見出した。
さらに、本発明者らは、ナチュラルチーズを製造するために使用する微生物（チーズ製造用スターター）と、エタノールを産生する微生物（アジャンクトスターター）との相性（相乗効果）について検討した結果、エタノール産生量を相乗的に高める作用によってパイナップル様のフルーティーな香りが増強され、かつ、苦味やせっけん様の風味を有しない高品質のナチュラルチーズを、商業規模で安定して製造することのできる、チーズ製造用スターターとアジャンクトスターターの組み合わせとして、微生物の特定の種を見出した。具体的には、本発明者は、チーズ製造用スターターとして、L. casei、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、L. helveticus、L. plantarum、L. rhamnosus、L. zeae、Lc. lactis subsp. cremoris、Lc. lactis subsp. lactis、および、S. thermophilusから選ばれる１種以上の乳酸菌を用い、かつ、アジャンクトスターターとして、L. fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）、および、L. fermentum OLL203731（受託番号 FERM BP-11434）から選ばれる１種以上の菌株からなる、エタノールを産生する乳酸菌を用いれば、上述の高品質のナチュラルチーズを、商業規模で安定して製造することができることを見出した。
The present inventors have found that when the ethanol content in natural cheese is 0.01 w / w% or more, the amount of pine odor ester produced is significantly increased. That is, when the ethanol content in natural cheese is higher than a predetermined value, it has been found that a pineapple-like fruity fragrance can be stably and strongly felt.
Furthermore, as a result of examining the compatibility (synergistic effect) between microorganisms used for producing natural cheese (starter for cheese production) and microorganisms producing ethanol (adjunct starter), the present inventors have produced ethanol. Cheese production that can produce high-quality natural cheese stably on a commercial scale, with a pineapple-like fruity fragrance enhanced by synergistically increasing the amount, and having no bitter or soapy flavor As a combination of starter and adjunct starter, a specific species of microorganism was found. Specifically, the present inventor used L. casei, L. delbrueckii subsp.bulgaricus, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. zeae, Lc. Lactis subsp. Cremoris, L. fermentum OLL203697 (accession number FERM BP-11433) and L. fermentum OLL203731 (one of the lactic acid bacteria selected from Lc. Lactis subsp. Lactis and S. thermophilus and as an adjunct starter) It has been found that the above-mentioned high-quality natural cheese can be stably produced on a commercial scale by using ethanol-producing lactic acid bacteria comprising one or more strains selected from Accession Number FERM BP-11434) .
すなわち、本発明は、下記［１］〜［２］に係るものである。
［１］L. fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）、および、L. fermentum OLL203731（受託番号 FERM BP-11434）から選ばれる１種以上の菌株からなることを特徴とする乳酸菌。
［２］（ａ）前記［１］に記載の乳酸菌、および、（ｂ）L. casei、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、L. helveticus、L. plantarum、L. rhamnosus、L. zeae、Lc. lactis subsp. cremoris、Lc. lactis subsp. lactis、および、S. thermophilusから選ばれる１種以上の乳酸菌、を含む乳酸菌。
また、本発明は、下記［３］〜［９］に係るものである。
［３］エタノール含有量が0.01 w/w%以上、および／または、パイン臭エステル含有量が0.3ppm以上であるナチュラルチーズ。
［４］（ａ）エタノールを産生する少なくとも１種以上の微生物、を含有する前記［３］に記載のナチュラルチーズ。
［５］（ｂ）L. casei、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、L. fermentum、L. helveticus、L. plantarum、L. rhamnosus、L. zeae、Lc. lactis subsp. cremoris、Lc. lactis subsp. lactis、および、S. thermophilusから選ばれる１種以上の乳酸菌、を含有する前記［４］に記載のナチュラルチーズ。
［６］上記（ａ）の微生物が、乳酸菌および／または酵母である前記［４］または［５］に記載のナチュラルチーズ。
［７］上記（ａ）の微生物が、乳酸菌であるL. fermentumである前記［６］に記載のナチュラルチーズ。
［８］上記（ａ）の微生物であるL. fermentumが、L. fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）および／またはL. fermentum OLL203731（受託番号 FERM BP-11434）である前記［７］に記載のナチュラルチーズ。
［９］前記［３］〜［８］のいずれかに記載のナチュラルチーズを製造するための方法であって、（Ａ）原料乳にスターターを添加した後に、該原料乳を凝固させ、次いで、得られた凝固物を圧搾して、上記スターターの作用によってエタノール含有量が増大した、熟成前のナチュラルチーズを得る工程と、（Ｂ）上記熟成前のナチュラルチーズを熟成させて、エタノールからパイン臭エステルを生成させ、パイン臭エステル含有量が増大したナチュラルチーズを得る工程、を含むナチュラルチーズの製造方法。
That is, the present invention relates to the following [1] to [2].
[1] A lactic acid bacterium comprising one or more strains selected from L. fermentum OLL203697 (accession number FERM BP-11433) and L. fermentum OLL203731 (accession number FERM BP-11434).
[2] (a) Lactic acid bacteria according to [1], and (b) L. casei, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. zeae, Lc. Lactis Lactobacillus comprising subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis, and one or more lactic acid bacteria selected from S. thermophilus.
The present invention also relates to the following [3] to [9].
[3] Natural cheese having an ethanol content of 0.01 w / w% or more and / or a pine odor ester content of 0.3 ppm or more.
[4] The natural cheese according to [3], which contains (a) at least one microorganism that produces ethanol.
[5] (b) L. casei, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, L. zeae, Lc. Lactis subsp. Cremoris, Lc. Lactis subsp. Lactis And natural cheese according to [4] above, which contains at least one lactic acid bacterium selected from S. thermophilus.
[6] The natural cheese according to [4] or [5], wherein the microorganism (a) is a lactic acid bacterium and / or a yeast.
[7] The natural cheese according to [6], wherein the microorganism of (a) is L. fermentum which is a lactic acid bacterium.
[8] In the above [7], L. fermentum which is the microorganism of the above (a) is L. fermentum OLL203697 (accession number FERM BP-11433) and / or L. fermentum OLL203731 (accession number FERM BP-11434) Natural cheese as described.
[9] A method for producing the natural cheese according to any one of [3] to [8], wherein (A) after adding a starter to raw milk, the raw milk is coagulated, Squeezing the obtained coagulum to obtain natural cheese before ripening, in which the ethanol content is increased by the action of the starter, and (B) ripening the natural cheese before ripening to pine odor from ethanol The manufacturing method of the natural cheese containing the process of producing | generating the natural cheese which produced | generated ester and the pine odor ester content increased.
本発明により、ナチュラルチーズの成分として添加物を使用することなく、パイナップル様のフルーティーな香りが増強され、かつ、苦味やせっけん様の風味を有しないナチュラルチーズを、商業規模で安定して提供することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, natural cheese having a pineapple-like fruity fragrance and having no bitterness or soap-like flavor is stably provided on a commercial scale without using any additive as a component of natural cheese. It is possible.
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited to the individual forms described below.
本発明のナチュラルチーズは、（ｉ）エタノール含有量が0.01 w/w%以上であること、（ｉｉ）パイン臭エステル含有量が0.3ppm以上であること、のいずれか一方または両方を満たすものである。なお、（ｉ）、（ｉｉ）のいずれか一方または両方を満たすことを、「（ｉ）、および／または、（ｉｉ）」のように記載することがある。
本発明のナチュラルチーズ中のエタノール含有量は、ナチュラルチーズの熟成前の状態において、好ましくは0.01 w/w%以上、より好ましくは0.02 w/w%以上、さらに好ましくは0.05 w/w%以上である。
本発明のナチュラルチーズ中のエタノールは、ナチュラルチーズ中に直接添加されたものではなく、ナチュラルチーズの原料である生乳から、乳酸菌等の微生物の作用によって産生されたものである。つまり、本発明のナチュラルチーズは、微生物によってエタノール含有量が好ましくは0.01 w/w%以上に高められている。
ナチュラルチーズ中のエタノール含有量が0.01 w/w%以上であると、通常の熟成によって、エステル生成量を十分に高めることができ、パイナップル様のフルーティーな香りを十分に増強することができる。
一方、ナチュラルチーズ中のエタノール含有量が高いほど、微生物の作用によって、熟成中などにおけるエステル産生量が多くなる。このため、エタノール含有量は、特に制限されない。しかし、チーズ本来の風味を損なわない観点からは、ナチュラルチーズ中のエタノール含有量の上限値は、好ましくは10 w/w%、より好ましくは5 w/w%、さらに好ましくは2 w/w%である。
The natural cheese of the present invention satisfies either or both of (i) that the ethanol content is 0.01 w / w% or more and (ii) that the pine odor ester content is 0.3 ppm or more. is there. Satisfying one or both of (i) and (ii) may be described as “(i) and / or (ii)”.
The ethanol content in the natural cheese of the present invention is preferably 0.01 w / w% or more, more preferably 0.02 w / w% or more, further preferably 0.05 w / w% or more, in a state before ripening the natural cheese. is there.
Ethanol in the natural cheese of the present invention is not directly added to the natural cheese, but is produced from the raw milk that is the raw material of the natural cheese by the action of microorganisms such as lactic acid bacteria. That is, the natural cheese of the present invention has an ethanol content preferably increased to 0.01 w / w% or more by microorganisms.
When the ethanol content in natural cheese is 0.01 w / w% or more, the amount of ester produced can be sufficiently increased by normal ripening, and the pineapple-like fruity aroma can be sufficiently enhanced.
On the other hand, the higher the ethanol content in natural cheese, the greater the amount of ester produced during ripening due to the action of microorganisms. For this reason, the ethanol content is not particularly limited. However, from the viewpoint of not impairing the original flavor of cheese, the upper limit of the ethanol content in natural cheese is preferably 10 w / w%, more preferably 5 w / w%, and even more preferably 2 w / w%. It is.
本発明のナチュラルチーズ中のパイン臭エステル含有量は、ナチュラルチーズの熟成が進んだ状態において、好ましくは0.3 ppm以上、より好ましくは0.5 ppm以上、さらに好ましくは1.0 ppm以上である。
より詳しく説明すると、本発明のナチュラルチーズ中のパイン臭エステル含有量は、ナチュラルチーズの製造時（圧搾の終了時）から４週間経過後の時点で、好ましくは0.3 ppm以上、より好ましくは0.5 ppm以上であり、ナチュラルチーズの製造時から８週間経過後の時点で、好ましくは0.6 ppm以上、より好ましくは1.0 ppm以上である。
本発明において、パイン臭エステル含有量とは、ナチュラルチーズ中の酪酸エチル（ethyl butyrate）とヘキサン酸エチル（ethyl hexanoate）の含有量の合計を意味する。本発明のナチュラルチーズ中のパイン臭エステルは、ナチュラルチーズ中に直接添加されたものではなく、ナチュラルチーズに含まれるエタノールから、乳酸菌等の微生物の作用によって産生されたものである。つまり、本発明のナチュラルチーズは、微生物によってパイン臭エステル含有量が好ましくは0.3 ppm以上に高められたものである。
本発明では、ナチュラルチーズ中のパイン臭エステル含有量が0.3 ppm以上であると、パイナップル様のフルーティーな香りを十分に感じることができる。
一方、ナチュラルチーズ中のパイン臭エステル含有量が高いほど、パイナップル様のフルーティーな香りが強くなる。このため、パイン臭エステル含有量は、特に制限されず、消費者の好みなどに応じて、熟成条件などを適宜調整し、実際に目的とする香りの強さが得られるように加減すれば良い。なお、例えば、パルミジャーノ・レッジャーノにおける、酪酸エチル（ethyl butyrate）とヘキサン酸エチル（ethyl hexanoate）の含有量の合計は、4 ppmであると報告されている（M. Qian and G. A. Reineccius, J. Dairy Sci. , 86(3) ,770-776, 2005）。
The pine odor ester content in the natural cheese of the present invention is preferably 0.3 ppm or more, more preferably 0.5 ppm or more, and even more preferably 1.0 ppm or more in a state where the ripening of natural cheese has progressed.
More specifically, the pine odor ester content in the natural cheese of the present invention is preferably 0.3 ppm or more, more preferably 0.5 ppm at the time after 4 weeks from the production of natural cheese (at the end of pressing). It is above, and it is preferably 0.6 ppm or more, more preferably 1.0 ppm or more, when 8 weeks have passed since the production of natural cheese.
In the present invention, the pine odor ester content means the total content of ethyl butyrate and ethyl hexanoate in natural cheese. The pine odor ester in the natural cheese of the present invention is not directly added to the natural cheese, but is produced from the ethanol contained in the natural cheese by the action of microorganisms such as lactic acid bacteria. That is, the natural cheese of the present invention has a pine odor ester content preferably increased to 0.3 ppm or more by microorganisms.
In the present invention, a pineapple-like fruity fragrance can be sufficiently felt when the content of pine odor in natural cheese is 0.3 ppm or more.
On the other hand, the higher the pine odor ester content in natural cheese, the stronger the pineapple-like fruity scent. For this reason, the pine odor ester content is not particularly limited, and may be adjusted appropriately so as to obtain the desired target scent strength by appropriately adjusting the aging conditions according to the consumer's preference and the like. . For example, the total content of ethyl butyrate and ethyl hexanoate in Parmigiano Reggiano has been reported to be 4 ppm (M. Qian and GA Reineccius, J. Dairy Sci., 86 (3), 770-776, 2005).
本発明のナチュラルチーズでは、エタノールを産生する少なくとも１種以上の微生物を含有する。本発明において、エタノールを産生する微生物には、絶対へテロ発酵型または通性ヘテロ発酵型の乳酸菌や酵母などを挙げることができる。中でも、絶対ヘテロ発酵型のラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌が、好ましい。 The natural cheese of the present invention contains at least one microorganism that produces ethanol. In the present invention, ethanol producing microorganisms include absolute heterofermentation type or facultative heterofermentation type lactic acid bacteria and yeast. Of these, lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus of the absolute heterofermentation type are preferable.
通性ヘテロ発酵型のラクトバチルス属に含まれる種の例として、Lactobacillus agilis、L. alimentarius、L. bavaricus、L. casei、L. paracasei、L. rhamnosus、L. zeae、L. coriniformis、L. curvatus、L. homohiochii、L. maltaromicus、L. murinus、L. plantarum、L. sakeなどを挙げることができる。 Examples of species contained in the facultative heterofermenting Lactobacillus genus Lactobacillus agilis, L. alimentarius, L. bavaricus, L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. zeae, L. coriniformis, L. curvatus, L. homohiochii, L. maltaromicus, L. murinus, L. plantarum, L. sake and the like.
絶対ヘテロ発酵型のラクトバチルス属に含まれる種の例として、Lactobacillus bifermentans、L. brevis、L. buchneri、L. collinoides、L. confuses、L. divergens、L. fermentum、L. fructosus、L. halotolerans、L. hilgardii、L. kandleri、L. kefir、L. minor、L. reuteri、L. sanfrancisco、L. vaccinostercus、L. viridescensなどを挙げることができる。 Examples of species in the genus Lactobacillus of the absolute heterofermentation type include Lactobacillus bifermentans, L. brevis, L. buchneri, L. collinoides, L. confuses, L. divergens, L. fermentum, L. fructosus, L. halotolerans , L. hilgardii, L. kandleri, L. kefir, L. minor, L. reuteri, L. sanfrancisco, L. vaccinostercus, L. viridescens, and the like.
絶対ヘテロ発酵型の乳酸菌に含まれる、ラクトバチルス属以外の属の例として、Lueconostoc属、Weisella属などを挙げることができる。 Examples of genera other than the genus Lactobacillus included in the lactic acid bacteria of the absolute heterofermentation type include the genus Lueconostoc and the genus Weisella.
本発明において、絶対ヘテロ発酵型のラクトバチルス属の乳酸菌の好ましい例として、L. fermentum種の乳酸菌などを挙げることができる。L. fermentum種の乳酸菌の菌株の例としては、特に制限されないが、例えば、L. fermentum ATCC 14931T、受託番号 FERM BP-11433で特定されるL. fermentum OLL203697、受託番号 FERM BP-11434で特定されるL. fermentum OLL203731などを挙げることができる。 In the present invention, L. fermentum species lactic acid bacteria and the like can be mentioned as preferred examples of the absolute heterofermentative Lactobacillus lactic acid bacteria. Examples of strains of L. fermentum lactic acid bacteria are not particularly limited. For example, L. fermentum OLCC20931 specified by L. fermentum ATCC 14931 T , accession number FERM BP-11433, specified by accession number FERM BP-11434 L. fermentum OLL203731 etc. can be mentioned.
本発明においては、先に述べた通り、微生物の作用によって、熟成中においてエタノールからパイン臭エステルが多量に産生されることが好ましい。そのため、ナチュラルチーズを製造するために使用する微生物と、エタノールを産生する微生物との相性が良く、それらの微生物の共生作用（相乗効果）によって、熟成前のナチュラルチーズ中のエタノール含有量が好ましくは0.01w/w%以上になるように、それらの微生物の組み合わせを定めることが好ましい。 In the present invention, as described above, it is preferable that a large amount of pine odor ester is produced from ethanol during aging by the action of microorganisms. Therefore, the compatibility between the microorganisms used to produce natural cheese and the microorganisms that produce ethanol is good, and the symbiotic action (synergistic effect) of these microorganisms preferably results in the ethanol content in the natural cheese before ripening. It is preferable to determine the combination of these microorganisms so that it becomes 0.01 w / w% or more.
それらの微生物の組み合わせとして、例えば、エタノールを産生する微生物として、L. fermentum種の乳酸菌（特に、ナチュラルチーズを製造するために使用する下記の微生物との組み合わせによって、エタノールを多量に産生する菌株）を使用した場合を想定すると、ナチュラルチーズを製造するために使用する微生物として、L. casei種、L. delbrueckii subsp. bulgaricus種、L. fermentum種（例えば、前記のエタノールを産生する菌株以外の菌株）、L. helveticus種、L. plantarum種、L. rhamnosus種、L. zeae種、Lc. lactis subsp. cremoris種、Lc. lactis subsp. lactis種、およびS. thermophilus種から選ばれる１種以上を使用することが好ましく、L. casei種、L. delbrueckii subsp. bulgaricus種、L. helveticus種、Lc. lactis subsp. cremoris種、Lc. lactis subsp. lactis種、S. thermophilus種から選ばれる１種以上を使用することがより好ましく、L. casei種、L. delbrueckii subsp. bulgaricus種、L. helveticus種、S. thermophilus種から選ばれる１種以上を使用することがさらに好ましい。これらの組み合わせにより、ナチュラルチーズ中のエタノール含有量を安定して高く維持できる。次いで、ナチュラルチーズの熟成によるエタノール含有量の減少およびそれに伴うパイン臭エステル含有量の増大によって、ナチュラルチーズ中のエステル含有量を安定して高く維持できて、パイナップル様のフルーティーな香りの高いナチュラルチーズを商業規模で安定して製造（生産）することが可能となる。 As a combination of these microorganisms, for example, as a microorganism that produces ethanol, L. fermentum species lactic acid bacteria (particularly, a strain that produces a large amount of ethanol in combination with the following microorganisms used for producing natural cheese) As a microorganism used for producing natural cheese, L. casei species, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus species, L. fermentum species (for example, strains other than the above-mentioned strain producing ethanol) ), L. helveticus species, L. plantarum species, L. rhamnosus species, L. zeae species, Lc. Lactis subsp. Cremoris species, Lc. Lactis subsp. Lactis species, and S. thermophilus species One or more selected from L. casei species, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus species, L. helveticus species, Lc. Lactis subsp. Cremoris species, Lc. Lactis subsp. Lactis species, S. thermophilus species use It is more preferable to, L. Casei species, L. Delbrueckii subsp. Bulgaricus species, L. Helveticus species, S. It is further preferred to use at least one member selected from thermophilus species. By these combinations, the ethanol content in natural cheese can be stably maintained high. Next, by reducing the ethanol content due to the ripening of the natural cheese and the accompanying increase in the pine odor ester content, the ester content in the natural cheese can be kept stable and high, and a pineapple-like fruity natural fragrant cheese Can be stably produced (produced) on a commercial scale.
本発明では、エタノールを産生する微生物として、L. fermentumを使用した場合、ナチュラルチーズ中の、エタノールを産生するL. fermentumの生菌数は、好ましくは1×105 cfu/g（チーズの単位重量）以上、より好ましくは1×106 cfu/g（チーズの単位重量）以上、さらに好ましくは1×107 cfu/g（チーズの単位重量）以上である。これらの菌数でL. fermentumの菌体がチーズに含まれるように、菌体（スターター）培養液、菌体濃縮液、菌体乾燥物などを調製して添加した後、所定の条件で熟成するなどして、ナチュラルチーズに好ましいパイナップル様のフルーティーな香りを与えることができる。 In the present invention, when L. fermentum is used as a microorganism that produces ethanol, the viable count of L. fermentum that produces ethanol in natural cheese is preferably 1 × 10 5 cfu / g (unit of cheese). Weight) or more, more preferably 1 × 10 6 cfu / g (unit weight of cheese) or more, and further preferably 1 × 10 7 cfu / g (unit weight of cheese) or more. Prepare and add bacterial body (starter) culture liquid, concentrated bacterial body, dried bacterial body, etc. so that L. fermentum cells are contained in cheese with these numbers of bacteria, and then mature under specified conditions By doing so, a fruity scent like pineapple like natural cheese can be given.
本発明のナチュラルチーズを製造するための原料乳としては、特に制限されず、獣乳（牛乳、羊乳、山羊乳、水牛乳などの哺乳類由来の乳）などを一般的に使用することが可能である。なお、この原料乳は、必ずしも、生乳や殺菌乳のみから構成されるものではなく、還元乳原料（バター、クリーム、脱脂乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、練乳など）や、必要に応じて、その他の食品や食品添加物も配合（添加）することが可能である。 The raw milk for producing the natural cheese of the present invention is not particularly limited, and animal milk (milk derived from mammals such as milk, sheep milk, goat milk, buffalo milk) and the like can be generally used. It is. This raw material milk is not necessarily composed only of raw milk or pasteurized milk, but reduced milk raw materials (butter, cream, skim milk, full fat concentrated milk, skim concentrated milk, full fat powdered milk, skimmed milk powder, condensed milk Etc.) and other foods and food additives can be blended (added) as required.
本発明のナチュラルチーズは、そのもの自体をプロセスチーズやチーズフードの原料として使用することもでき、特に、熟成風味の強いプロセスチーズやチーズフードの原料として好ましく使用することができる。 The natural cheese of the present invention can itself be used as a raw material for process cheese or cheese food, and in particular, it can be preferably used as a raw material for process cheese or cheese food with a strong aging flavor.
本発明は、所定の条件で熟成することが特徴である硬質ナチュラルチーズや特別硬質ナチュラルチーズに分類されるゴーダ、チェダー、グラナ、パルメザンなどに適用されるだけでなく、これ以外にも、軟質ナチュラルチーズに分類されるモッツァレラ、カマンベール、ブリーなどや、フレッシュチーズに分類されるカッテージ、クワルク、フェタなどにも応用して、特徴的な香りを付与することが可能である。 The present invention is not only applied to gouda, cheddar, grana, parmesan, etc. classified as hard natural cheese or special hard natural cheese, which is characterized by aging under predetermined conditions. It can be applied to mozzarella, camembert, brie, etc., which are classified as cheese, and cottage, quark, feta, etc., which are classified as fresh cheese.
以下、本発明の好ましい実施例を説明するが、本発明は、前述した実施の形態や以下の実施例に限定されることなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲内において、種々に変更することが可能である。なお、実施例に記載の供試菌株のうち、菌株名にJCMと記載された菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した基準株や菌株であり、菌株名にNCIMBまたはGTCと記載された菌株は、英国NCIMB研究所（National Collection of Industrial and Marine Bacteria）から入手した基準株や菌株であり、菌株名にMEPと記載された菌株は、株式会社明治の保有菌株である。また、下記の実施例中、L.fermentum OLL203697およびL. fermentum OLL203731は、2011年10月5日付（受託日）で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第６）に、各々、受託番号FERM BP-11433、FERM BP-11434として、ブタペスト条約に基づき国際寄託されている乳酸菌である。 Hereinafter, preferred examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to the above-described embodiment and the following examples, and within the technical scope grasped from the description of the claims, Various modifications are possible. Among the test strains described in the examples, the strain described as JCM in the strain name is a reference strain or strain obtained from the Microbial Materials Development Department of RIKEN BioResource Center, The strains described as NCIMB or GTC are reference strains and strains obtained from NCIMB Laboratories (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) in the UK. It is. In the examples below, L. fermentum OLL203697 and L. fermentum OLL203731 are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center on October 5, 2011 (contract date) (1 East of Tsukuba City, Ibaraki, Japan). -1-1 Tsukuba Center Central 6), lactic acid bacteria deposited internationally under the Budapest Treaty under the accession numbers FERM BP-11433 and FERM BP-11434, respectively.
［試験例］
（方法）
チーズ用の原料乳を模擬した脱脂粉乳培地（脱脂粉乳：10 w/w%）に対し、メインスターターに加えて、アジャンクトスターターとしてL. fermentum JCM1173T株のスターター（1重量%）を接種した。メインスターターには、チーズ製造用の一般的な中温性の乳酸菌で構成されるバルクスターター（Lactococcus lactis；以下、Lc. lactisと略す。）の４種（Ａ：Lc. lactis MEP1201901、Ｂ：Lc. lactis MEP1201902、Ｃ：Lc. lactis MEP1201903、D：Lc. lactis MEP1201904）をそれぞれ用いた。アジャンクトスターターには、一般的な乳酸菌用合成培地でL. fermentum JCM1173T株を賦活した培養液を用いた。
[Test example]
(Method)
In addition to the main starter, the starter of L. fermentum JCM1173 T strain (1 wt%) was inoculated to the skim milk medium (fat dry milk: 10 w / w%) simulating raw material milk for cheese. . The main starter includes four types of bulk starters (Lactococcus lactis; hereinafter abbreviated as Lc. Lactis) composed of common mesophilic lactic acid bacteria for cheese production (A: Lc. Lactis MEP1201901, B: Lc. lactis MEP1201902, C: Lc. lactis MEP1201903, D: Lc. lactis MEP1201904), respectively. As an adjunct starter, a culture solution in which L. fermentum JCM1173 T strain was activated with a general synthetic medium for lactic acid bacteria was used.
これらのスターターをチーズ用の原料乳へ接種した後に、チーズ製造用の一般的なスターターに適した温度でpHが5.0になるまで培養した（発酵させた）。この培養が終了してから、遠心分離処理により、上清を除去した後に、食塩を2重量%になるように添加し、18℃で2週間培養し（熟成させ）、モデルチーズを製造した。この培養（熟成）の開始日と終了日のエタノール濃度をF-kitエタノール（JKインターナショナル社製）により測定し、エタノール増加量（エタノール産生量＝培養終了日のエタノール含有量−培養開始日のエタノール含有量）を算出した。 These starters were inoculated into raw milk for cheese, and then cultured (fermented) at a temperature suitable for a general starter for cheese production until the pH reached 5.0. After this culture was completed, the supernatant was removed by centrifugation, and then sodium chloride was added to a concentration of 2% by weight and cultured at 18 ° C. for 2 weeks (ripening) to produce a model cheese. The ethanol concentration of the start date and end date of this culture (aging) was measured with F-kit ethanol (manufactured by JK International), and the amount of ethanol increase (ethanol production amount = ethanol content on the culture end date-ethanol on the culture start date) Content).
（結果）
試験結果を図１に示す。ここで使用した4種類（Ａ：Lc. lactis MEP1201901、Ｂ：Lc. lactis MEP1201902、Ｃ：Lc. lactis MEP1201903、D：Lc. lactis MEP1201904）のチーズ製造用のスターターのうち、そのスターターの種類によっては、エタノールが産生される場合（スターターＡ、Ｂ）もあれば、エタノールが産生されない場合（スターターＣ、Ｄ）もあることが明らかになった。よって、L. fermentumを用いて、チーズ中におけるエタノールを効率的に産生させるためには、チーズ製造用のスターターとの相性を検討する必要があると考えられた。
(result)
The test results are shown in FIG. Of the four types of starters used here (A: Lc. Lactis MEP1201901, B: Lc. Lactis MEP1201902, C: Lc. Lactis MEP1201903, D: Lc. Lactis MEP1201904), depending on the type of starter It has been clarified that ethanol may be produced (starters A and B) and ethanol may not be produced (starters C and D). Therefore, in order to efficiently produce ethanol in cheese using L. fermentum, it was considered necessary to study compatibility with a starter for cheese production.
［実施例１］
（方法）
一般的な乳酸菌用合成培地で賦活した供試菌株の培養液を、脱脂粉乳培地（脱脂粉乳：10 w/w%）に1 w/w%で接種し、好気条件下にて、37℃、24時間で静置培養した。そして、この培養物中のエタノール濃度をF-kit エタノール（JKインターナショナル社製）により測定した。このとき、L. fermentumの各菌株と、ナチュラルチーズの製造に一般的に利用される乳酸菌（中温性の乳酸菌）を共培養した。
[Example 1]
(Method)
A culture solution of a test strain activated with a general synthetic medium for lactic acid bacteria is inoculated at 1 w / w% into skim milk powder medium (skim milk powder: 10 w / w%), and at 37 ° C under aerobic conditions The culture was stationary for 24 hours. The ethanol concentration in the culture was measured with F-kit ethanol (manufactured by JK International). At this time, each strain of L. fermentum and a lactic acid bacterium (mesophilic lactic acid bacterium) generally used for the production of natural cheese were co-cultured.
（結果）
試験結果を図２〜図５に示す。L. fermentumの供試菌株では何れにおいても、単菌で培養した場合に比べ、他菌種と共培養した場合に、エタノール産生量が増加すること、および、その産生量は菌種の組み合わせによって、差異が生じることが明らかとなった。
(result)
The test results are shown in FIGS. In any of the L. fermentum test strains, the amount of ethanol produced increased when co-cultured with other bacterial species compared to when cultured alone, and the amount produced depends on the combination of bacterial species. It became clear that there was a difference.
［実施例２］
（方法）
一般的な乳酸菌用合成培地で賦活した供試菌株の培養液を、トリブチリンを3.3 mMで含む脱脂粉乳培地（脱脂粉乳：10 w/w%）に1 w/w %で接種し、好気条件下にて、37℃、24時間で静置培養した。そして、この培養物中の酪酸エチル濃度をGC-MSにより測定した。酪酸エチルの分析方法は、次の通りである。
（酪酸エチルの分析方法）
供試液0.5mLおよび純水9.5mLを20mL容バイアル瓶に採取して密栓した後に、60℃、40分間で保持し、ヘッドスペースに揮発したエステルを固相マイクロファイバ（SUPELCO, Stable Flex (DVB/Carboxen/PDMS; 50/30μm)）に抽出した。このファイバをGC/MS分析（Scanモード）に供し、m/z88イオンのピーク面積から酪酸エチルを検出し、絶対検量線法（濃度範囲：0.1mg/L〜5mg/L）により、酪酸エチル濃度を定量した。
[Example 2]
(Method)
The culture solution of the test strain activated with a general synthetic medium for lactic acid bacteria is inoculated at 1 w / w% in skim milk medium (skim milk powder: 10 w / w%) containing 3.3 mM tributyrin and aerobic conditions Under stationary culture at 37 ° C. for 24 hours. And the ethyl butyrate density | concentration in this culture was measured by GC-MS. The analysis method of ethyl butyrate is as follows.
(Analytical method of ethyl butyrate)
Collect 0.5 mL of the test solution and 9.5 mL of pure water in a 20 mL vial, seal it tightly, hold it at 60 ° C for 40 minutes, and remove the ester volatilized in the headspace using solid-phase microfiber (SUPELCO, Stable Flex (DVB / Carboxen / PDMS; 50/30 μm)). This fiber was subjected to GC / MS analysis (Scan mode), ethyl butyrate was detected from the peak area of m / z88 ions, and the ethyl butyrate concentration was determined by the absolute calibration curve method (concentration range: 0.1 mg / L to 5 mg / L). Was quantified.
（結果）
試験結果を図６に示す。L. fermentum OLL203697（FERM BP-11433）を単菌で培養すると、酪酸エチルの産生に必要かつ十分なエタノールが産生されないため、酪酸エチルが検出されない。一方、L. fermentum OLL203697（FERM BP-11433）をL. casei MEP1106303と共培養すると、酪酸エチルの産生に必要かつ十分なエタノールが産生されるため、酪酸エチルが著量で検出された。
(result)
The test results are shown in FIG. When L. fermentum OLL203697 (FERM BP-11433) is cultured in a single cell, ethyl butyrate is not detected because ethanol necessary and sufficient for the production of ethyl butyrate is not produced. On the other hand, when L. fermentum OLL203697 (FERM BP-11433) was co-cultured with L. casei MEP1106303, ethanol necessary and sufficient for the production of ethyl butyrate was produced, so that a large amount of ethyl butyrate was detected.
[実施例３］
（方法）
アジャンクトスターターとして L. fermentum OLL203697（FERM BP-11433）を使用し、以下の方法に従ってナチュラルチーズを製造した。
すなわち、チーズの固形分中の脂肪濃度が42 w/w%となるように、原料乳を調製した。この原料乳を、63℃、30分間で加熱殺菌した後に、33℃に冷却し、次いで、塩化カルシウム（0.01 w/w%）を添加した。次に、塩化カルシウムの添加後の原料乳に、L. fermentum OLL203697（FERM BP-11433）およびチーズ製造用の市販スターターを添加した。製造番号とスターターの組み合わせは、表１の通りである。
[Example 3]
(Method)
Natural cheese was produced according to the following method using L. fermentum OLL203697 (FERM BP-11433) as an adjunct starter.
That is, raw material milk was prepared so that the fat concentration in the solid content of cheese was 42 w / w%. The raw milk was sterilized by heating at 63 ° C. for 30 minutes, cooled to 33 ° C., and then calcium chloride (0.01 w / w%) was added. Next, L. fermentum OLL203697 (FERM BP-11433) and a commercial starter for cheese manufacture were added to the raw milk after the addition of calcium chloride. Table 1 shows the combination of serial number and starter.
これらスターターを添加した後に、カーフレンネット（力価：15,000ユニット）を0.003 w/w%で添加し、原料乳を凝固させた。この凝固物をカッテングし、ホエイのpHが6.1〜6.2となるまで攪拌して、ホエイを排出し、カード粒を得た。次に、このカード粒に食塩を所定量で添加してから、型詰めして圧搾し、ナチュラルチーズを製造した。このナチュラルチーズを18℃、8週間で熟成した。
なお、製造直後（熟成前）のナチュラルチーズ中のエタノール含有量は、「製造番号４−Ｂ」の場合で、0.03 w/w%であり、「製造番号４−Ａ」および「製造番号４−Ｃ」の場合で、0.001 w/w%以下であった。
After adding these starters, calf rennet (titer: 15,000 units) was added at 0.003 w / w% to coagulate the raw milk. The coagulated product was cut and stirred until the whey had a pH of 6.1 to 6.2, and the whey was discharged to obtain curd grains. Next, after adding a predetermined amount of salt to the curd grain, it was stuffed and squeezed to produce natural cheese. This natural cheese was ripened at 18 ° C for 8 weeks.
The ethanol content in natural cheese immediately after production (before ripening) is 0.03 w / w% in the case of “Production Number 4-B”, and “Production Number 4-A” and “Production Number 4- In the case of “C”, it was 0.001 w / w% or less.
[実施例４］
（方法）
実施例３で製造したナチュラルチーズの熟成0週、熟成4週および熟成8週の各経過時点におけるパイン臭エステルの濃度を測定するとともに、熟成8週におけるナチュラルチーズの官能評価を実施した。パイン臭エステル濃度の測定方法は次の通りである。試料0.2gを細切してから、バイアル瓶に採取して密栓した。窒素ガスを用いた動的ヘッドスペース法により、試料中の酪酸エチルとヘキサン酸エチルを窒素ガスの気流中に揮発させ、捕集剤（TENAX-TA）に捕集した。この捕集剤を加熱して、酪酸エチルとヘキサン酸エチルを脱着し、GC/MS・Scanモード分析に供した。この得られたm/z88のイオンクロマトグラムから、酪酸エチルとヘキサン酸エチルのピークを検出し、その面積を基に、別途作成したマトリクス検量線により各々の濃度を求めた。
パイン臭エステル濃度は、酪酸エチル濃度とヘキサン酸エチル濃度の総和である。また、官能評価は、専門パネラーによって、チーズの香り（フルーティな香りの有無）について1〜5の5段階で評価した。
[Example 4]
(Method)
The concentration of pine odor ester at each time point of ripening 0 weeks, ripening 4 weeks and ripening 8 weeks of natural cheese produced in Example 3 was measured, and sensory evaluation of natural cheese at ripening 8 weeks was performed. The method for measuring the pine odor ester concentration is as follows. A 0.2 g sample was cut into small pieces, collected in a vial, and sealed. By the dynamic headspace method using nitrogen gas, ethyl butyrate and ethyl hexanoate in the sample were volatilized in a stream of nitrogen gas and collected in a scavenger (TENAX-TA). The collector was heated to desorb ethyl butyrate and ethyl hexanoate and subjected to GC / MS / Scan mode analysis. From the obtained ion chromatogram of m / z88, peaks of ethyl butyrate and ethyl hexanoate were detected, and based on the areas, the respective concentrations were determined by a matrix calibration curve prepared separately.
The pine odor ester concentration is the sum of the ethyl butyrate concentration and the ethyl hexanoate concentration. Moreover, sensory evaluation evaluated the cheese fragrance (presence / absence of fruity fragrance) in five stages from 1 to 5 by a specialized panelist.
（結果）
試験結果を図７に示す。4-Aのスターターで製造したナチュラルチーズや4-Cのスターターで製造したナチュラルチーズと比べ、4-Bのスターターで製造したナチュラルチーズでは、パイン臭エステル濃度が顕著に高かった。また、専門パネラーによる熟成8週におけるナチュラルチーズの官能評価の結果は、表２の通りである。4-Aのスターターで製造したナチュラルチーズや4-Cのスターターで製造したナチュラルチーズと比べ、4-Bのスターターで製造したナチュラルチーズでは、顕著に高いスコアを示した。
(result)
The test results are shown in FIG. Compared with the natural cheese manufactured with the 4-A starter and the natural cheese manufactured with the 4-C starter, the pine odor ester concentration was significantly higher in the natural cheese manufactured with the 4-B starter. In addition, Table 2 shows the results of sensory evaluation of natural cheese in 8 weeks of ripening by a specialized panelist. Compared with the natural cheese manufactured with the 4-A starter and the natural cheese manufactured with the 4-C starter, the natural cheese manufactured with the 4-B starter showed a significantly higher score.
本発明によれば、エタノール産生能を有する微生物を利用し、かつ、エタノール産生能を高めるように、他の微生物と共培養することによって、製造直後のナチュラルチーズ中のエタノール含有量を高め、その結果、熟成によって、パイナップル様のフルーティーな香りを増強したナチュラルチーズを商業規模で安定して提供することが可能である。 According to the present invention, by using a microorganism having ethanol-producing ability and co-culturing with other microorganisms so as to enhance the ethanol-producing ability, the ethanol content in natural cheese immediately after production is increased, As a result, it is possible to stably provide natural cheese with enhanced pineapple-like fruity aroma on a commercial scale by aging.
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