JP6384048B2 - Cell culture method - Google Patents
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Description
本発明は、再生医療において有用な細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a cell culture method useful in regenerative medicine.
近年、細胞を用いた再生医療が注目を集めている。細胞を用いた再生医療は、患者の組織から採取した細胞を生体外において大量に培養し、それを患者の体内に戻すことによって治療効果を得るものである。これまでは臓器移植でしか治療できなかったような疾患も細胞移植によって治療可能なことが近年示されるようになっている。詳細な治療のメカニズムは現在も研究されているところであるが、細胞移植によって心臓、肝臓、角膜などの疾患が治癒したという報告がなされている。 In recent years, regenerative medicine using cells has attracted attention. Regenerative medicine using cells obtains a therapeutic effect by culturing a large amount of cells collected from a patient's tissue in vitro and returning it to the patient's body. In recent years, it has been shown that diseases that could only be treated by organ transplantation can be treated by cell transplantation. Although a detailed therapeutic mechanism is still being studied, it has been reported that cell transplantation has cured diseases such as the heart, liver, and cornea.
人間の身体には約２６０種類の細胞が存在すると言われており、それぞれの組織は複数種類の細胞から構成されている。例えば、心臓には心筋細胞、洞結節細胞、特殊心筋細胞、線維芽細胞の少なくとも４種類の細胞が存在し、肝臓には肝実質細胞、胆管上皮細胞、星細胞、クッパー細胞、類道内皮細胞の少なくとも５種類の細胞が存在する。そのため、組織から目的とする細胞を１００％の純度で回収することは難しい。このような細胞群の中から目的の細胞を選別するために、従来は蛍光色素で標識された抗体を用いる方法（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）や、磁気微粒子で標識された抗体を用いる方法（ＭＡＣＳ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）が用いられてきた（非特許文献１）。これらは抗体を用いて、目的とする細胞を高純度で分離する方法である。しかし、分離された細胞膜の表面には選別に用いた抗体が残存することが問題となっており、これらの方法で選別された細胞を治療目的で生体内に戻すことは難しい。そこで、抗体を用いずに細胞の純度を上げる方法が求められていた。 It is said that there are about 260 types of cells in the human body, and each tissue is composed of a plurality of types of cells. For example, there are at least four types of cells in the heart: cardiomyocytes, sinus node cells, special cardiomyocytes and fibroblasts, and liver parenchymal cells, bile duct epithelial cells, stellate cells, Kupffer cells, and epithelial endothelial cells. There are at least five types of cells. Therefore, it is difficult to recover the target cells from the tissue with 100% purity. In order to select a target cell from such a cell group, conventionally, a method using an antibody labeled with a fluorescent dye (FACS: Fluorescence activated cell sorting), or a method using an antibody labeled with magnetic microparticles ( MACS: Magnetic activated cell sorting (Non-Patent Document 1) has been used. These are methods for separating desired cells with high purity using antibodies. However, there is a problem that the antibody used for the selection remains on the surface of the separated cell membrane, and it is difficult to return the cells selected by these methods into the living body for therapeutic purposes. Therefore, a method for increasing the purity of cells without using an antibody has been demanded.
患者の組織から細胞を採取する場合、目的とする細胞だけでなく他の種類の細胞が混入するという課題があった。細胞を用いた再生医療を実現するためには、目的とする細胞のみを回収する、または目的とする細胞の純度をなるべく高めるための技術が求められていた。 When cells are collected from a patient's tissue, there is a problem that not only target cells but also other types of cells are mixed. In order to realize regenerative medicine using cells, a technique for recovering only target cells or increasing the purity of target cells as much as possible has been demanded.
したがって、本発明は、２種以上の細胞を含む細胞群の培養において、簡便に特定の細胞種の純度を高める手段を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a means for easily increasing the purity of a specific cell type in culturing a cell group containing two or more types of cells.
本発明者らは、細胞群の培養時に電圧を印加することにより、細胞種によって増殖能力が抑制され、特定の細胞の純度を高めることが可能であることを見出した。 The present inventors have found that by applying a voltage during the cultivation of a cell group, the proliferation ability is suppressed depending on the cell type, and the purity of a specific cell can be increased.
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）細胞の培養方法であって、
ａ）電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程、
ｂ）細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程、および
ｃ）電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程、
を含む、前記方法。
（２）細胞群への電圧の印加により、電気刺激に鈍感な細胞の増殖能力は実質的に低下しない、（１）に記載の方法。
（３）工程ａ）が、第１電極を備える細胞培養基材上で細胞群を培養することを含み、工程ｂ）が第１電極に対向して第２電極を配置し、第１電極を正極とし第２電極を負極として細胞群に電圧を印加することを含む、（１）または（２）に記載の方法。
（４）電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞を形態変化させる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程ｃ）が、電圧の印加により形態変化した細胞を除去することを含む、（４）に記載の方法。
（６）電気刺激に敏感な細胞が、線維芽細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）電気刺激に鈍感な細胞が、筋細胞および血管内皮細胞から選択される、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention includes the following.
(1) A cell culture method,
a) culturing a cell group including cells sensitive to electrical stimulation and cells insensitive to electrical stimulation;
b) reducing the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation by applying a voltage to a group of cells; and c) selectively expanding cells insensitive to electrical stimulation,
Said method.
(2) The method according to (1), wherein application of a voltage to the cell group does not substantially reduce the proliferation ability of cells insensitive to electrical stimulation.
(3) Step a) includes culturing a cell group on a cell culture substrate provided with the first electrode, Step b) disposes the second electrode facing the first electrode, The method according to (1) or (2), comprising applying a voltage to a cell group using a second electrode as a positive electrode and a negative electrode.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein a cell sensitive to electrical stimulation is changed in shape by applying a voltage.
(5) The method according to (4), wherein step c) comprises removing cells whose shape has been changed by application of a voltage.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the cells sensitive to electrical stimulation are fibroblasts.
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the cells insensitive to electrical stimulation are selected from muscle cells and vascular endothelial cells.
本発明によれば、２種以上の細胞を含む細胞群の培養において、簡便に特定の細胞の純度を高めることが可能となり、再生医療に有用な細胞を得ることができる。 According to the present invention, in the cultivation of a cell group containing two or more types of cells, the purity of specific cells can be easily increased, and cells useful for regenerative medicine can be obtained.
本発明の細胞培養方法は、電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程を含む。電気刺激に敏感な細胞は、電圧を印加することにより増殖能力が低下する細胞であり、例えば、電圧を印加することにより形態変化を生じる細胞である。電圧を印加することにより増殖能力が低下するとは、例えば、電圧を印加して３日間培養した後の細胞密度が、電圧を印加せずに３日間培養した後の細胞密度に対して、９０％以下である場合をいう。電気刺激に鈍感な細胞は、電圧を印加しても増殖能力が実質的に低下しない細胞であり、例えば、電圧を印加しても形態変化を生じない細胞である。増殖能力が実質的に低下しないとは、例えば、電圧を印加して３日間培養した後の細胞密度が、電圧を印加せずに３日間培養した後の細胞密度に対して、９７％以上である場合をいう。 The cell culture method of the present invention includes a step of culturing a cell group including cells sensitive to electrical stimulation and cells insensitive to electrical stimulation. A cell that is sensitive to electrical stimulation is a cell whose proliferation ability is reduced by applying a voltage, for example, a cell that undergoes a morphological change by applying a voltage. When the voltage is applied, the proliferation ability is reduced. For example, the cell density after culturing for 3 days without applying voltage is 90% of the cell density after culturing for 3 days without applying voltage. This is the case when: A cell insensitive to electrical stimulation is a cell whose proliferation ability does not substantially decrease even when a voltage is applied, for example, a cell that does not undergo morphological change even when a voltage is applied. The proliferation ability does not substantially decrease. For example, the cell density after culturing for 3 days without applying voltage is 97% or more of the cell density after culturing for 3 days without applying voltage. I say a case.
細胞の形態変化には、顕微鏡で観察可能な細胞の外観の変化が包含され、細胞の輪郭の変化、細胞質の外観の変化、および核の外観の変化等が挙げられる。細胞の輪郭の変化としては、例えば図１ａおよび図１ｃの電圧印加後の写真に見られるような形態変化が挙げられる。すなわち、細胞の仮足が通常培養時よりも多く、例えば３本以上となるような輪郭の変化である。細胞質の変化としては、例えば、図１ｂの電圧印加後の写真に見られるような形態変化が挙げられる。すなわち、複数の顆粒が見られるようになることが挙げられる。電気刺激に敏感な細胞に対し、電圧を印加して細胞を形態変化させることにより、細胞の増殖能力を選択的に低下させることが可能になる。 Changes in cell morphology include changes in cell appearance that can be observed with a microscope, such as changes in cell contour, cytoplasmic appearance, and nuclear appearance. Examples of the change in the cell outline include morphological changes as seen in photographs after voltage application in FIGS. 1a and 1c. That is, the contour changes such that the number of temporary limbs of the cell is larger than that during normal culture, for example, three or more. Examples of changes in cytoplasm include morphological changes as seen in the photograph after voltage application in FIG. 1b. That is, it can be mentioned that a plurality of granules can be seen. By applying a voltage to a cell sensitive to electrical stimulation to change the shape of the cell, it becomes possible to selectively reduce the proliferation ability of the cell.
電気刺激に鈍感な細胞としては、生体内で電気的活動を行う細胞が挙げられる。電気的活動を行う細胞とは、その活動に伴って活動電位という電気信号を発生する細胞をさす。活動電位は、主としてナトリウムイオン、カリウムイオンが、細胞内外の濃度差に従い、イオンチャネルを通じて受動的拡散を起こすことにより起きるものである。このような細胞は、常に電気刺激にさらされているため、電気刺激に鈍感であり、電圧を印加しても形態変化等を生じることがなく、またその増殖能力が実質的に変化することはないと考えられる。電気刺激に鈍感な細胞の具体例としては、筋細胞、神経細胞および血管内皮細胞等が挙げられる。 Examples of cells that are insensitive to electrical stimulation include cells that perform electrical activities in vivo. A cell that performs electrical activity refers to a cell that generates an electrical signal called an action potential in accordance with the activity. The action potential is mainly caused by the passive diffusion of sodium ions and potassium ions through ion channels according to the concentration difference inside and outside the cell. Since such cells are constantly exposed to electrical stimulation, they are insensitive to electrical stimulation, do not cause morphological changes, etc. even when a voltage is applied, and their proliferative ability does not change substantially. It is not considered. Specific examples of cells insensitive to electrical stimulation include muscle cells, nerve cells, and vascular endothelial cells.
筋細胞には、筋収縮能に関し成熟した細胞のほか、未熟ではあっても、成熟した同種の細胞が備える収縮能と同質の収縮能を備える細胞が包含される。したがって、筋細胞には、成熟した筋細胞への分化途中の細胞や、成熟した筋細胞の幼弱細胞などの未成熟細胞が含まれる。筋収縮能に関し成熟した細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞および平滑筋細胞等が挙げられる。骨格筋細胞の未成熟細胞としては、筋管細胞、筋芽細胞、骨格筋サテライト細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。心筋細胞の未成熟細胞としては、心筋細胞の幼若細胞または分化途中にある細胞が挙げられ、例えば、心筋前駆細胞、心筋幹細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。平滑筋細胞の未成熟細胞としては、平滑筋細胞の幼若細胞または分化途中にある細胞が挙げられ、例えば、平滑筋前駆細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。 The muscle cells include cells that have matured in terms of muscle contractility, and cells that have immature contractility even if they are immature, even if they are immature. Accordingly, the myocytes include immature cells such as cells undergoing differentiation into mature myocytes and immature cells of mature myocytes. Examples of mature cells with respect to muscle contractility include skeletal muscle cells, cardiomyocytes, and smooth muscle cells. Examples of immature cells of skeletal muscle cells include myotube cells, myoblasts, skeletal muscle satellite cells, and mesenchymal stem cells. Examples of immature cells of cardiomyocytes include immature cells of myocardial cells or cells in the middle of differentiation, such as myocardial progenitor cells, myocardial stem cells, mesenchymal stem cells, and the like. Examples of immature cells of smooth muscle cells include immature cells of smooth muscle cells or cells in the middle of differentiation, such as smooth muscle progenitor cells and mesenchymal stem cells.
神経細胞としては、例えば、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。神経細胞とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類でき、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドーパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。別の観点では、神経細胞は、神経細胞が存在する部位の違いにより分類できる。これらの存在部位で分類される神経細胞としては、例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞などが挙げられる。 Examples of nerve cells include nerve cells, neural tube cells, neural crest cells, and the like. A nerve cell refers to a cell having a function of transmitting a stimulus to another nerve cell, a muscle, or a gland cell upon receiving a stimulus from another nerve cell or a stimulus receptor cell. Nerve cells can be classified according to differences in neurotransmitters produced by the neurons, for example, according to differences in secreted neurotransmitters. Examples of nerve cells classified by these neurotransmitters include dopamine secreting neurons, acetylcholine secreting neurons, serotonin secreting neurons, noradrenaline secreting neurons, adrenergic secreting neurons, glutamate secreting neurons, and the like. In another aspect, nerve cells can be classified according to the difference in site where the nerve cells are present. Examples of the nerve cells classified at these sites include forebrain neurons, midbrain neurons, cerebellar neurons, hindbrain neurons, spinal cord neurons, and the like.
上記の電気刺激に鈍感な細胞以外の細胞は、電気刺激に敏感な細胞であると考えられる。具体的には、線維芽細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、乳腺細胞、ペリサイト、膵ランゲルハンス島細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。 Cells other than the cells insensitive to the electrical stimulation are considered to be sensitive to electrical stimulation. Specific examples include fibroblasts, Kupffer cells, osteoblasts, osteoclasts, periodontal ligament-derived cells, mammary cells, pericytes, pancreatic islets of Langerhans, chondrocytes, bone cells and the like.
本発明の培養方法は、線維芽細胞を含む細胞群の培養において、線維芽細胞の増殖能力を低下させる場合に特に好適に使用される。骨、軟骨、靭帯、腱、脂肪組織、筋膜、内臓の間を埋める結合組織には線維芽細胞が含まれている。結合組織とは上皮組織、神経組織、筋組織に含まれない組織全てをさし、生体組織から細胞を採取する場合に結合組織を完全に除くことは非常に難しく、目的とする細胞だけではなく線維芽細胞が混入してしまうため、線維芽細胞の増殖能力を低下させることは非常に重要である。 The culture method of the present invention is particularly preferably used in the case of reducing the proliferation ability of fibroblasts in the culture of a cell group containing fibroblasts. The connective tissue that fills the space between bones, cartilage, ligaments, tendons, adipose tissue, fascia, and internal organs contains fibroblasts. Connective tissue refers to all tissues that are not included in epithelial tissue, nerve tissue, and muscle tissue, and it is very difficult to completely remove connective tissue when collecting cells from living tissue. Since fibroblasts are contaminated, it is very important to reduce the proliferation ability of fibroblasts.
電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群は、電気刺激に敏感な細胞の１種以上と、電気刺激に鈍感な細胞の１種以上を含むものであればよく、それぞれ複数種を含んでいてもよい。生体組織から採取した細胞は、通常、複数種の細胞を含む細胞群であるが、本発明により、このような細胞混合物としての細胞群から、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることができる。例えば、筋肉組織から採取した試料には、通常、筋細胞と繊維芽細胞が含まれるが、この筋細胞と繊維芽細胞を含む細胞群を、本発明の方法で培養することにより、電気刺激に鈍感な筋細胞を選択的に増殖させることができる。また、心臓から採取した試料には、通常、心筋細胞、洞結節細胞、特殊心筋細胞および線維芽細胞が含まれるが、この試料から得た細胞群を本発明の方法で培養することにより、電気刺激に鈍感な心筋細胞および特殊心筋細胞を選択的に増殖させることができる。 The cell group including cells sensitive to electrical stimulation and cells insensitive to electrical stimulation may be any cell group that includes one or more types of cells sensitive to electrical stimulation and one or more types of cells insensitive to electrical stimulation. Each may contain a plurality of species. Cells collected from biological tissues are usually a group of cells containing a plurality of types of cells. According to the present invention, cells that are insensitive to electrical stimulation can be selectively proliferated from the group of cells as a cell mixture. Can do. For example, a sample collected from muscle tissue usually contains myocytes and fibroblasts. By culturing a cell group containing these myocytes and fibroblasts by the method of the present invention, electrical stimulation can be performed. Insensitive muscle cells can be selectively proliferated. Samples collected from the heart usually include cardiomyocytes, sinus node cells, special cardiomyocytes, and fibroblasts. By culturing a cell group obtained from these samples by the method of the present invention, Cardiomyocytes and special cardiomyocytes that are insensitive to stimulation can be selectively proliferated.
細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウスまたはヒトである。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。 The origin of the cell may be any of mammals, birds, fishes, reptiles and amphibians, and is not particularly limited, but is preferably a mammal (for example, a rodent such as a mouse, or a primate such as a human), particularly preferably. Is mouse or human. These cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or may be passaged from one generation to another.
電気刺激に敏感な細胞と電気刺激に鈍感な細胞とを含む試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、細胞破片等の不純物質を除去する分離処理等を行っておくことが好ましい。細胞群の播種に先だって、予め、各種の培養方法で予備培養して、細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養等の通常の培養方法が採用できる。 Samples containing cells that are sensitive to electrical stimulation and cells that are insensitive to electrical stimulation are preliminarily subjected to dispersion treatment to dissect biological tissue and disperse it in liquid, or separation treatment to remove impurities such as cell debris. It is preferable to keep it. Prior to seeding of the cell group, it is preferable to increase the number of cells by preliminarily culturing in advance by various culture methods. For the preculture, a normal culture method such as monolayer culture, coat dish culture, or gel culture can be employed.
予備培養した細胞を、細胞培養基材上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術」に記載されている方法が使用できる。通常、１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。 Pre-cultured cells are seeded on a cell culture substrate. There are no particular limitations on the seeding method and seeding amount of cells, and for example, the method described in “Technology of tissue culture edited by the Japanese Tissue Culture Society” published by Asakura Shoten can be used. Usually, it is preferable to seed so that cells are contained in the order of 10 3 cells / cm 2 to 10 6 cells / cm 2 .
細胞の培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等の基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。 Any cell culture medium can be used without particular limitation as long as it is a cell culture medium usually used in the art. For example, basal media such as MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, and RPMI1640 medium are used depending on the type of cells used. be able to. Furthermore, serum (such as fetal bovine serum), various growth factors, antibiotics, amino acids and the like may be added to the basal medium. A commercially available serum-free medium such as Gibco serum-free medium (Invitrogen) can also be used. The culture temperature is usually 37 ° C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like.
本発明の培養方法は、細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させる工程を含む。印加する電圧は、培養液の種類や電極を構成する材料等によって、適切な値が変わるが、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力を低下させることができる電圧以上、および／または電気刺激に敏感な細胞に形態変化を生じさせることができる電圧以上で、電気刺激に鈍感な細胞の増殖能力を実質的に低下させない、および／または電気刺激に鈍感な細胞に形態変化を生じさせない程度の低い電圧を加えるのがよい。 The culture method of the present invention includes a step of reducing the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation by applying a voltage to the cell group. The voltage to be applied varies depending on the type of culture medium and the materials that make up the electrode, but it is more than the voltage that can reduce the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation and / or is sensitive to electrical stimulation. Voltage that can cause morphological changes in normal cells, and does not substantially reduce the proliferation ability of cells insensitive to electrical stimulation and / or does not cause morphological changes in cells insensitive to electrical stimulation It is good to add.
印加電圧は、好ましくは０．５Ｖ以上、より好ましくは１Ｖ以上、さらに好ましくは１．５Ｖ以上であり、好ましくは１０Ｖ以下、より好ましくは５Ｖ以下、さらに好ましくは３Ｖ以下であるが、これに限定されるものではない。電圧を印加する時間は、好ましくは１０秒以上、より好ましくは２０秒以上、さらに好ましくは４０秒以上で、好ましくは６０分間以下、より好ましくは１０分間以下、さらに好ましくは２分以下であるが、これに限定されるものではない。例えば、１．５〜３Ｖの電圧を、４０秒〜２分間印加することが好ましい。電圧の印加は、複数回にわたって実施してもよい。 The applied voltage is preferably 0.5 V or more, more preferably 1 V or more, further preferably 1.5 V or more, preferably 10 V or less, more preferably 5 V or less, and even more preferably 3 V or less. Is not to be done. The voltage application time is preferably 10 seconds or more, more preferably 20 seconds or more, further preferably 40 seconds or more, preferably 60 minutes or less, more preferably 10 minutes or less, and even more preferably 2 minutes or less. However, the present invention is not limited to this. For example, it is preferable to apply a voltage of 1.5 to 3 V for 40 seconds to 2 minutes. The voltage application may be performed a plurality of times.
一実施形態においては、第１電極を備える細胞培養基材上で細胞群を培養し、第１電極に対向して第２電極を配置し、第１電極を正極とし第２電極を負極として細胞群に電圧を印加する。 In one embodiment, a cell group is cultured on a cell culture substrate having a first electrode, a second electrode is disposed opposite to the first electrode, the first electrode is a positive electrode, and the second electrode is a negative electrode. Apply voltage to the group.
第１電極を備える細胞培養基材としては、導電性材料からなる基材を用いてもよいし、絶縁性材料からなる基材上に導電性材料からなる電極を形成したものを用いてもよい。後者の場合、絶縁性材料からなる基材として、具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を使用できる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、並びに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。 As the cell culture substrate provided with the first electrode, a substrate made of a conductive material may be used, or a substrate in which an electrode made of a conductive material is formed on a substrate made of an insulating material may be used. . In the latter case, as a base material made of an insulating material, specifically, glass, quartz glass, borosilicate glass, alumina, sapphire, forsterite, photosensitive glass, ceramic, silicon, elastomer, plastic (for example, polyester resin) , Polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin) can be used. . The shape is not limited, for example, a flat shape such as a flat plate, a flat membrane, a film, a porous membrane, a three-dimensional shape such as a cylinder, a stamp, a multiwell plate, a microchannel, and irregularities are formed on the surface. Shape. When using a film, the thickness in particular is not restrict | limited, However, Usually, it is 0.1-1000 micrometers, Preferably it is 1-500 micrometers, More preferably, it is 10-200 micrometers.
絶縁性材料からなる基材上に導電性材料からなる電極を形成する場合、公知の成膜技術を利用できる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、電極材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜することにより、第１電極を備える細胞培養基材を製造することができる。 When an electrode made of a conductive material is formed on a base material made of an insulating material, a known film forming technique can be used. Specifically, a cell culture substrate having the first electrode is produced by forming an electrode material, such as a metal film or a metal oxide film, on a substrate made of an insulating material, such as a glass substrate. Can do.
基材上への導電性材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。成膜は、上記の真空成膜法に限らず、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。 Film formation of the conductive material on the substrate can be performed by a known method. For example, microwave plasma CVD (Chemical Vapor deposition) method, ECRCVD (Electrical Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposition) method, ICP (Inductive Coupling Plasma) method, ICP (Inductive Coupling Plasma) method, sputtering method, ICP method Examples thereof include a vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method. The film formation is not limited to the vacuum film formation method described above, and may be performed by coating. Spin coating and various printing methods can also be used.
導電性材料として、金属または金属酸化物、金属微粒子や導電性ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料等が挙げられる。金属としては、銀、金、銅、白金等が挙げられ、金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）、ＳｎＯ２(酸化スズ)等が挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅、白金等の微粒子、導電性ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等が挙げられる。 Examples of the conductive material include a metal or metal oxide, a film in which metal fine particles or conductive nanofibers are dispersed in an insulator, and a conductive organic material. Examples of the metal include silver, gold, copper, and platinum. Examples of the metal oxide include ITO (indium tin oxide), IZO (indium zinc oxide), and SnO 2 (tin oxide). These include fine particles such as silver, gold, copper, and platinum, carbon nanotubes as conductive nanofibers, and polyethylenedioxythiophene (PEDOT) as conductive organic materials.
第１電極は、特に制限されないが、透明電極材料で構成されることが好ましい。透明電極材料としては、例えば、ＩＴＯ、ＩＺＯ、ＳｎＯ２、導電性高分子であるポリエチレンジオキシチオフェン等が挙げられる。また、電圧印加後も透明であることが好ましい。本発明においては、ＩＴＯをスパッタリング法により基材上に成膜することが好ましい。透明な電極材料の膜は、細胞の観察において有利であり、細胞の形態変化を容易に認識することができる。 The first electrode is not particularly limited, but is preferably composed of a transparent electrode material. Examples of the transparent electrode material include ITO, IZO, SnO 2 , and polyethylenedioxythiophene that is a conductive polymer. Moreover, it is preferable that it is transparent even after voltage application. In the present invention, ITO is preferably formed on the substrate by sputtering. A transparent electrode material film is advantageous in observing cells and can easily recognize changes in cell morphology.
導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。また、第１電極の抵抗は、好ましくは５〜５０Ω、より好ましくは５〜２０Ωである。抵抗が低いほど面内に均一に電圧を印加することができるため好ましい。 The thickness of the conductive material film is usually about a monomolecular film to about 100 μm, preferably 2 nm to 1 μm, more preferably 5 nm to 500 nm. Further, the resistance of the first electrode is preferably 5 to 50Ω, more preferably 5 to 20Ω. A lower resistance is preferable because a voltage can be uniformly applied in the plane.
第１電極に対向して配置される第２電極は、細胞培養物を覆うことができる面電極であることが好ましい。面電極とすることにより、細胞培養物全体に電圧を印加することができる。第２電極は、特に制限されないが、白金や金で構成されることが好ましい。これらの金属は化学的に安定であるため電極表面や周辺で起こる化学変化に侵されにくいからである。また、電圧の印加においては、第１電極を正極とし第２電極を負極とすることが好ましい。それにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力をより効果的に低下させることができる。 It is preferable that the 2nd electrode arrange | positioned facing a 1st electrode is a surface electrode which can cover a cell culture. By using a planar electrode, a voltage can be applied to the entire cell culture. The second electrode is not particularly limited, but is preferably composed of platinum or gold. This is because these metals are chemically stable and are not easily affected by chemical changes occurring on and around the electrode surface. In applying voltage, it is preferable that the first electrode is a positive electrode and the second electrode is a negative electrode. Thereby, the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation can be reduced more effectively.
なお、第１電極に対向して配置される第２電極は、第１電極とともに細胞培養基材に形成されていてもよい。この場合、典型的には、第１電極と第２電極とが櫛歯状に形成され、互いに噛み合うように配置されたものを挙げることができる。 In addition, the 2nd electrode arrange | positioned facing a 1st electrode may be formed in the cell culture base material with the 1st electrode. In this case, typically, the first electrode and the second electrode are formed in a comb shape and arranged so as to mesh with each other.
本発明の細胞培養方法は、電圧印加後に、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程を含む。細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞の増殖能力が低下することから、そのまま細胞培養を続けることにより、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることができる。電気刺激に鈍感な細胞の純度を高める観点から、電圧印加後、一定期間にわたり培養を続けることが好ましい。電圧印加後、好ましくは３日間以上、より好ましくは５日間以上、さらに好ましくは７日間以上にわたり培養を続けることが好ましい。時間の経過とともに電気刺激に敏感な細胞の増殖能力が回復した場合には、電圧の印加を繰り返し行ってもよい。電圧印加を繰り返す場合は、電気刺激に鈍感な細胞の増殖性に影響を与えないという観点から、１〜３日間程度のインターバルを置くことが好ましい。 The cell culture method of the present invention includes a step of selectively proliferating cells insensitive to electrical stimulation after voltage application. By applying a voltage to the cell group, the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation is reduced. Therefore, by continuing cell culture as it is, cells insensitive to electrical stimulation can be selectively proliferated. From the viewpoint of increasing the purity of cells insensitive to electrical stimulation, it is preferable to continue culturing for a certain period after voltage application. It is preferable to continue culturing for 3 days or longer, more preferably 5 days or longer, and even more preferably 7 days or longer after voltage application. When the proliferation ability of cells sensitive to electrical stimulation is restored over time, voltage application may be repeated. When voltage application is repeated, it is preferable to set an interval of about 1 to 3 days from the viewpoint of not affecting the proliferation of cells insensitive to electrical stimulation.
細胞群に電圧を印加することにより、電気刺激に敏感な細胞が形態変化することから、形態変化した細胞を細胞群から除去することにより、電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させることもできる。形態変化した細胞を細胞群から除去する方法は、当技術分野公知の方法を使用でき特に制限されないが、例えばレーザーを用いて除去する方法が挙げられる（非特許文献２参照）。レーザーは、除去する細胞の種類により適宜選択されるが、赤外線レーザー（例えば、ＹＡＧレーザー）、紫外線レーザー（例えば、窒素レーザー、エキシマレーザー）、パルスレーザー等を使用できる。レーザーを使用することにより、目的とする細胞のみを精度高く死滅・除去することができるため好ましい。 By applying a voltage to a cell group, cells that are sensitive to electrical stimulation change in shape. By removing cells that have changed shape from the cell group, cells that are insensitive to electrical stimulation can be selectively proliferated. it can. A method for removing the cells whose morphology has changed from the cell group can be a method known in the art, and is not particularly limited. For example, a method using a laser can be used (see Non-Patent Document 2). The laser is appropriately selected depending on the type of cells to be removed, and an infrared laser (for example, YAG laser), an ultraviolet laser (for example, a nitrogen laser or an excimer laser), a pulse laser, or the like can be used. Use of a laser is preferable because only the target cells can be killed and removed with high accuracy.
電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させるとは、換言すれば、電気刺激に敏感な細胞に対する電気刺激に鈍感な細胞の割合を、電圧印加前よりも高めることをさす。それにより、電気刺激に鈍感な細胞の純度を高めることができる。細胞群に含まれる細胞の種類や、播種した細胞群における当初の割合にも依存するが、電気刺激に敏感な細胞に対する電気刺激に鈍感な細胞の割合は、電圧印加前よりも好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上高めること望ましい。結果として、細胞群における電気刺激に鈍感な細胞の割合を、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上高めること望ましい。 In other words, selectively proliferating cells that are insensitive to electrical stimulation means that the ratio of cells that are insensitive to electrical stimulation to cells that are sensitive to electrical stimulation is higher than that before voltage application. Thereby, the purity of cells insensitive to electrical stimulation can be increased. Although depending on the type of cells contained in the cell group and the initial ratio in the seeded cell group, the ratio of cells insensitive to electrical stimulation to cells sensitive to electrical stimulation is preferably 10% than before voltage application. As described above, it is desirable to increase by 20% or more, more preferably by 30% or more. As a result, it is desirable to increase the proportion of cells insensitive to electrical stimulation in the cell group, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 80% or more.
再生医療において細胞を増殖させて用いる場合、複数種の細胞が混在していると培養条件の調節が難しい場合があり、制御が困難である。また、目的としない細胞が目的細胞よりも増殖してしまう場合もある。本発明の細胞培養方法を用いることにより、電圧を印加するという簡便な手段により、特定の細胞を選択的に増殖させ、純度を高めることができる。したがって、再生医療のための細胞培養を効率的に実施することが可能になる。また、本発明の細胞培養方法は抗体を用いないことから、得られた細胞培養物や細胞シートなどの細胞組織体を生体移植する際にも有利である。 When cells are proliferated and used in regenerative medicine, if a plurality of types of cells are mixed, it may be difficult to adjust the culture conditions and it is difficult to control. In addition, non-target cells may proliferate more than target cells. By using the cell culture method of the present invention, specific cells can be selectively proliferated and purity can be increased by a simple means of applying a voltage. Therefore, cell culture for regenerative medicine can be performed efficiently. In addition, since the cell culture method of the present invention does not use an antibody, it is advantageous when a cell tissue body such as the obtained cell culture or cell sheet is transplanted in vivo.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
＜実施例１＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞（ＣＣＬ１６３、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３）をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、ＩＴＯガラス基板は電源の正極と、Ｐｔ製面電極は電源の負極とつなげた。直流電源を用いて電圧を印加（２．０Ｖ、１００秒）した後に細胞の形態を確認したところ、線維芽細胞では細胞が異常な形態を示していたのに対し、筋芽細胞と血管内皮細胞では大きな形態変化は見られなかった（図１−３）。
<Example 1>
A glass bottom dish was prepared using glass on which ITO (film thickness: 150 nm, resistance: 15Ω) was formed. In this container, mouse myoblast C2C12, bovine vascular endothelial cell HH, and mouse fibroblast (CCL163, Swiss3T3) were seeded at 1.0 × 10 4 cells / cm 2 , respectively. After overnight culture, the concave portion of the glass bottom dish was covered with a Pt surface electrode from above, and the ITO glass substrate was connected to the positive electrode of the power source, and the Pt surface electrode was connected to the negative electrode of the power source. When the cell morphology was confirmed after applying voltage (2.0 V, 100 seconds) using a DC power source, the fibroblasts showed abnormal morphology, whereas myoblasts and vascular endothelial cells In Fig. 1-3, no significant morphological changes were observed.
＜実施例２＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、直流電源を用いて電圧を印加した（２．０Ｖ、１００秒）。電圧印加直後に、ヨウ化プロピジウムで死細胞を染色して各細胞の生存率を求めたところ、Ｃ２Ｃ１２：９５±２％、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３：９５±２％、ＨＨ：９６±１％であり、細胞による生存率の違いは見られなかった。
<Example 2>
A glass bottom dish was prepared using glass on which ITO (film thickness: 150 nm, resistance: 15Ω) was formed. Mouse myoblast C2C12, bovine vascular endothelial cell HH, and mouse fibroblast Swiss3T3 were seeded at 1.0 × 10 4 cells / cm 2 , respectively. After overnight culture, the concave portion of the glass bottom dish was covered with a Pt surface electrode from the top, and a voltage was applied using a DC power supply (2.0 V, 100 seconds). Immediately after voltage application, dead cells were stained with propidium iodide to determine the survival rate of each cell. C2C12: 95 ± 2%, Swiss3T3: 95 ± 2%, HH: 96 ± 1%, depending on the cell There was no difference in survival rates.
＜実施例３＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、ウシ血管内皮細胞ＨＨ、マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３をそれぞれ１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。１晩培養後、ガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、直流電源を用いて電圧を印加した（２．０Ｖ、１００秒）。このとき、ＩＴＯガラス基板は正極と、Ｐｔ製面電極は負極とつなげた。電圧を印加して３日後に細胞増殖の様子を確認したところ、線維芽細胞では細胞増殖が大きく抑制されていたのに対し、筋芽細胞と血管内皮細胞の増殖性は、電圧を印加しないコントロールとほぼ同等であった（図４−６）。
<Example 3>
A glass bottom dish was prepared using glass on which ITO (film thickness: 150 nm, resistance: 15Ω) was formed. In this container, mouse myoblast C2C12, bovine vascular endothelial cell HH, and mouse fibroblast Swiss3T3 were seeded at 1.0 × 10 4 cells / cm 2 , respectively. After overnight culture, the concave portion of the glass bottom dish was covered with a Pt surface electrode from the top, and a voltage was applied using a DC power supply (2.0 V, 100 seconds). At this time, the ITO glass substrate was connected to the positive electrode, and the Pt-made surface electrode was connected to the negative electrode. Cell proliferation was confirmed 3 days after the voltage was applied. The cell proliferation was greatly suppressed in fibroblasts, whereas the proliferation of myoblasts and vascular endothelial cells was controlled without application of voltage. (Fig. 4-6).
＜実施例４＞
ＩＴＯ（膜厚：１５０ｎｍ、抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、緑色蛍光色素ＰＫＨ６７で標識したマウス筋芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３と、赤色蛍光色素ＰＫＨ２６で標識したマウス線維芽細胞Ｃ２Ｃ１２が合計で１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるよう種々の割合で播種した。１晩培養後にガラスボトムディッシュの凹部を上からＰｔ製面電極で覆い、ＩＴＯガラス基板は電源の正極と、Ｐｔ製面電極は電源の負極とつなげた。直流電源を用いて電圧を印加（２．０Ｖ、６０秒）した後に細胞の形態を確認したところ、線維芽細胞では細胞が異常な形態を示していたのに対し、筋芽細胞ではそのような細胞は見られなかった（図７−９）。
<Example 4>
A glass bottom dish was prepared using glass on which ITO (film thickness: 150 nm, resistance: 15Ω) was formed. In this container, mouse myoblast Swiss3T3 labeled with green fluorescent dye PKH67 and mouse fibroblast C2C12 labeled with red fluorescent dye PKH26 were seeded at various ratios so that the total amount was 1.0 × 10 4 cells / cm 2 . . After overnight culture, the concave portion of the glass bottom dish was covered with a Pt surface electrode from above, and the ITO glass substrate was connected to the positive electrode of the power source, and the Pt surface electrode was connected to the negative electrode of the power source. When the cell morphology was confirmed after applying a voltage (2.0 V, 60 seconds) using a DC power source, the cells showed abnormal morphology in fibroblasts, whereas that in myoblasts. Cells were not seen (Figures 7-9).
Claims (6)
ａ）線維芽細胞と、筋細胞、血管内皮細胞および神経細胞から選択される電気刺激に鈍感な細胞とを含む細胞群を培養する工程、
ｂ）細胞群に電圧を印加することにより、線維芽細胞の増殖能力を低下させる工程、および
ｃ）電気刺激に鈍感な細胞を選択的に増殖させる工程、
を含む、前記方法。 A cell culture method comprising:
culturing a) and fibroblasts, muscle cells, a cell group containing the insensitive cells to electrical stimulation selected from vascular endothelial cells and nerve cells,
b) reducing the proliferation ability of fibroblasts by applying a voltage to the cell group, and c) selectively growing cells insensitive to electrical stimulation,
Said method.
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