JP6347477B2 - Method for predicting efficacy of anti-IL-6 receptor antibody treatment for rheumatoid arthritis patients - Google Patents
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本発明は、関節リウマチ患者に対する抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性予測方法に関する。詳しくは本発明は、４つの遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに当該測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む、関節リウマチ患者に対する抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性予測方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment for rheumatoid arthritis patients. Specifically, the present invention measures the expression level of at least one gene selected from the group consisting of four genes, and the measured expression level of the gene and the anti-human IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis The present invention relates to a method for predicting the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment for rheumatoid arthritis patients, including correlating the effectiveness of treatment.
関節リウマチ（以下、ＲＡと略称することがある）は全身性の慢性炎症性疾患であり、関節の腫脹、関節の疼痛、滑膜関節の破壊を特徴とし、障害や早期死亡をもたらす（非特許文献１、２）。ＲＡ患者数は日本全国で約７０万人と推定され、さらに毎年１．５万人が新規に発病している。 Rheumatoid arthritis (hereinafter sometimes abbreviated as RA) is a systemic chronic inflammatory disease characterized by joint swelling, joint pain, and synovial joint destruction, leading to disability and premature death (non-patented) References 1, 2). The number of RA patients is estimated to be about 700,000 nationwide, and 15,000 people are newly diagnosed every year.
ＲＡの病因には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージなどの免疫細胞やこれら細胞から産生される腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症性サイトカインが本質的役割を果たしていることが、それらの証拠の蓄積により証明されてきた（非特許文献３−５）。 The pathogenesis of RA includes immune cells such as T cells, B cells, dendritic cells, and macrophages, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) produced from these cells. It has been proved by the accumulation of such evidence that non-inflammatory cytokines play an essential role (Non-patent Documents 3-5).
近年、これら炎症性サイトカインや細胞間相互作用を標的に多くの生物学的製剤が開発され、その使用により、ＲＡの臨床的、構造的、および機能的な転帰が実質的に改善されている（非特許文献２、４、６）。さらに、ＲＡにおける非可逆的な関節破壊は従来予測されていたより早期から始まることが明らかになり、既存の疾患修飾抗リウマチ薬（Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ Ａｎｔｉ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ：ＤＭＡＲＤｓ）より高い関節破壊抑制作用を示す生物学的製剤を早期から積極的に使用することが推奨されている。しかしながら、ＲＡの病因を成す分子・細胞メカニズムが不均一であることを反映して、生物学的製剤治療は全ての患者に普遍的に有効なものではない（非特許文献４、５）。 In recent years, many biologicals have been developed targeting these inflammatory cytokines and cell-cell interactions, and their use has substantially improved the clinical, structural and functional outcomes of RA ( Non-patent documents 2, 4, 6). Furthermore, it has been clarified that irreversible joint destruction in RA starts earlier than previously predicted, and organisms exhibiting a higher joint destruction-inhibiting action than existing disease modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs). It is recommended that pharmacological preparations be used aggressively from an early stage. However, reflecting the heterogeneous molecular and cellular mechanisms that cause the pathogenesis of RA, biologic treatment is not universally effective for all patients (Non-Patent Documents 4 and 5).
生物学的製剤は、一方で、薬剤費が高く、無効例も一定の割合で存在し、肺炎や結核などの感染症などの重篤な副作用も比較的高頻度に認められる（非特許文献７）。したがって、この様なリスクを考慮すると、生物学的製剤は、該製剤の有効性を見込める患者に限定して適用すべきであろう。各生物学的製剤の有効性を予測するバイオマーカーの確立とそれを利用したテーラーメイド医療の達成が、非可逆的な関節破壊を最小限にするとともに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく寄与すると期待される。 Biological products, on the other hand, have a high drug cost, there are a certain proportion of ineffective cases, and serious side effects such as infections such as pneumonia and tuberculosis are observed relatively frequently (Non-patent Document 7). ). Therefore, in view of such risks, the biological product should be applied only to patients who can expect the effectiveness of the product. Establishing biomarkers that predict the effectiveness of each biologic and the achievement of tailor-made medicine using it minimizes irreversible joint destruction and reduces the use of useless drugs. Is also expected to contribute significantly.
これまでに、生物学的製剤の効果予測法の開発を目的として、患者背景、臨床所見、血清所見、あるいは遺伝子多型解析を用いた研究が多数行われてきたが、いずれも一致した結果が得られず、実用化されていない。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト治療に対する反応性に関して臨床情報および検査情報の予測値を評価した研究では、一貫性のある結果も臨床応用が可能な方法も得ることはできなかった。また、ＴＮＦアンタゴニスト治療に対する反応性を予測するマーカーとして、いくつかの遺伝的素因が見込みがあると認められた。しかし、最も有望な候補と考えられていた２つの遺伝子マーカーであるＴＮＦ−３０８多型（非特許文献８）または共有エピトープモチーフ（非特許文献９）は、ＴＮＦアンタゴニスト治療に対する反応性との間に何ら関連がないことが、メタ解析および大規模レジストリーからのデータにより示された。これら従来の研究結果は、生物学的製剤治療に対する治療応答を臨床情報および遺伝子マーカーにより正確に予測できないことを示唆する。 To date, many studies using patient background, clinical findings, serum findings, or genetic polymorphism analysis have been conducted with the aim of developing methods for predicting the effects of biological products. It cannot be obtained and has not been put to practical use. For example, studies that evaluated the predictive value of clinical and laboratory information regarding responsiveness to tumor necrosis factor (TNF) antagonist treatment failed to provide consistent results and methods that could be applied clinically. In addition, several genetic predispositions have been identified as promising markers for predicting responsiveness to TNF antagonist treatment. However, the two genetic markers that were considered the most promising candidates, the TNF-308 polymorphism (Non-Patent Document 8) or the shared epitope motif (Non-Patent Document 9), are not responsive to TNF antagonist treatment. No association was shown by meta-analysis and data from a large registry. These previous research results suggest that the therapeutic response to biologic therapy cannot be accurately predicted by clinical information and genetic markers.
近年、ＤＮＡマイクロアレイ解析により末梢血全血の網羅的遺伝子発現を解析することにより効果予測バイオマーカーを同定する手法が注目されている。ＤＮＡマイクロアレイ解析では、標的の細胞や組織における複数遺伝子のｍＲＮＡ発現の評価が可能である。従前の研究では、マイクロアレイ技術を使用して同定された一組の遺伝子のｍＲＮＡ発現解析により、ＲＡにおけるインフリキシマブ（非特許文献１０−１３、特許文献１）またはリツキシマブ（非特許文献１４）に対する治療反応性を予測したことが示されている。抗ヒトＴＮＦ−αモノクローナル抗体製剤であるインフリキシマブについては、その投与１４週後の治療の効果を、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を用いて予測する診断支援サービスが自由診療として開始されている。このように、ＤＮＡマイクロアレイは、ある抗リウマチ治療に対するＲＡ患者の臨床応答を予測するバイオマーカーとなる遺伝子を同定するために見込みのある手段である。 In recent years, attention has been focused on a technique for identifying an effect prediction biomarker by analyzing comprehensive gene expression in peripheral blood whole blood by DNA microarray analysis. In DNA microarray analysis, it is possible to evaluate mRNA expression of multiple genes in target cells and tissues. In previous studies, the therapeutic response to infliximab (Non-patent Documents 10-13, 1) or Rituximab (Non-patent Document 14) in RA by analyzing the mRNA expression of a set of genes identified using microarray technology. It is shown to have predicted gender. For infliximab, an anti-human TNF-α monoclonal antibody preparation, a diagnostic support service for predicting the effect of treatment 14 weeks after administration using gene expression analysis by microarray has been started as a free practice. Thus, DNA microarrays are a promising tool for identifying genes that are biomarkers that predict the clinical response of RA patients to certain anti-rheumatic treatments.
ＲＡ治療に生物学的製剤として使用されているトシリズマブ（ＴＣＺ）は、ヒト化抗インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）モノクローナル抗体であり、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を遮断することによりＩＬ−６シグナル伝達を阻害する。ＴＣＺ治療に対するＲＡ患者の全体的な奏功率は高い（非特許文献７、１５−１６）が、関節腫脹などの臨床的兆候の改善効果の発現は、ＴＮＦアンタゴニストで治療した患者と比較するとより遅い。また、ＴＣＺは、発熱を抑制したり、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの炎症マーカーの発現を強く抑制するため、肺炎などの重篤な感染症に罹患しても、それに伴う生体変化をマスクしてしまい、感染症の発見が遅れ、重篤化する場合がある。したがって、ＴＣＺで治療した患者で有効性がないことを確認するには何ヶ月もかかり、損傷の進行や副作用に関する不必要なリスク、および不要な費用が患者に生じる可能性がある。このように、ＴＣＺ治療に対する反応性を予測することはＲＡ患者にとって特に有益であり、そのような方法の開発が期待されている。 Tocilizumab (TCZ), used as a biologic for the treatment of RA, is a humanized anti-interleukin-6 receptor (IL-6R) monoclonal antibody that blocks IL-6 binding to IL-6R. Thereby inhibiting IL-6 signaling. Although the overall response rate of RA patients to TCZ treatment is high (Non-Patent Documents 7 and 15-16), the onset of the improvement effect of clinical signs such as joint swelling is slower compared to patients treated with TNF antagonist . In addition, TCZ suppresses fever and strongly suppresses the expression of inflammatory markers such as C-reactive protein (CRP). Masking may lead to delays in finding infectious diseases and may make them serious. Thus, confirmation of ineffectiveness in patients treated with TCZ can take months and can create unnecessary risk and unnecessary costs for injury progression and side effects. Thus, predicting responsiveness to TCZ treatment is particularly beneficial for RA patients and the development of such methods is expected.
抗ＩＬ−６受容体阻害抗体であるＴＣＺの治療効果を予測するのに有用なバイオマーカーとして、１９６のマーカー遺伝子を抽出したことが報告されている（特許文献２）。また、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、対象関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球における、８７の薬効マーカー遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む方法が報告されている（特許文献３）。 It has been reported that 196 marker genes have been extracted as biomarkers useful for predicting the therapeutic effect of TCZ, which is an anti-IL-6 receptor inhibitory antibody (Patent Document 2). Also, a method for predicting the effectiveness of treatment with an anti-human IL-6 receptor-inhibiting antibody, which is selected from 87 drug marker gene groups in peripheral blood mononuclear cells isolated from a subject rheumatoid arthritis patient A method including measuring the expression level of at least one gene is reported (Patent Document 3).
従前、ＲＡ患者におけるインフリキシマブまたはリツキシマブへの臨床応答を予測するために、マーカーとなる遺伝子の抽出を、末梢血全血を試料としてＤＮＡマイクロアレイ解析により実施したことが報告されている（非特許文献１０−１４、特許文献１）。しかしながら、自己免疫疾患である関節リウマチのバイオマーカー検索では、リンパ球および単球系細胞、例えば単球やマクロファージなどにおける遺伝子発現が重要であり、全血中に存在する顆粒球が遺伝子発現解析の妨げとなっている可能性がある。 Previously, in order to predict clinical response to infliximab or rituximab in RA patients, it has been reported that extraction of a gene serving as a marker was performed by DNA microarray analysis using peripheral whole blood as a sample (Non-patent Document 10). -14, Patent Document 1). However, in biomarker searches for rheumatoid arthritis, which is an autoimmune disease, gene expression in lymphocytes and monocyte cells such as monocytes and macrophages is important, and granulocytes present in whole blood are used for gene expression analysis. It may be a hindrance.
また、抗ＩＬ−６受容体阻害抗体であるＴＣＺの治療効果を予測するのに有用なバイオマーカーとして１９６遺伝子が報告されている（特許文献２）。これら遺伝子の抽出の指標として用いた治療効果判定基準には、血液中の炎症反応に対する治療効果が含まれている。一方、ＴＣＺ投与患者では治療効果の有無に関わらず高率に炎症反応が著明に低下するため、これら１９６遺伝子の中には、ＴＣＺの治療効果を予測するバイオマーカーとして有用でない遺伝子が含まれている可能性がある。 In addition, the 196 gene has been reported as a biomarker useful for predicting the therapeutic effect of TCZ, which is an anti-IL-6 receptor-inhibiting antibody (Patent Document 2). The therapeutic effect criterion used as an index for extracting these genes includes the therapeutic effect on the inflammatory reaction in blood. On the other hand, in TCZ-administered patients, the inflammatory reaction is significantly reduced at a high rate regardless of whether or not there is a therapeutic effect. Therefore, these 196 genes include genes that are not useful as biomarkers for predicting the therapeutic effect of TCZ. There is a possibility.
さらに、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、ＲＡ患者から単離された末梢血単核球における、８７の遺伝子群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することを含む方法が報告されている（特許文献３）。しかし、これら遺伝子と比較してマーカーとしてより好ましい遺伝子を見出すことにより、より高い感度で抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測することができる。 Furthermore, a method for predicting the effectiveness of treatment with an anti-human IL-6 receptor-inhibiting antibody, comprising at least one selected from 87 genes in peripheral blood mononuclear cells isolated from RA patients A method including measuring the expression level of one gene has been reported (Patent Document 3). However, the efficacy of anti-IL-6 receptor antibody treatment can be predicted with higher sensitivity by finding genes that are more favorable as markers than these genes.
本発明の課題は、従来報告されている方法より高い感度で、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を、該治療を開始する前に予測するためのバイオマーカーを提供し、該バイオマーカーを使用して、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a biomarker for predicting the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment in RA patients before starting the treatment with higher sensitivity than previously reported methods, It is to provide a method for predicting the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment in RA patients using the biomarker.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行う中で、ＲＡ患者の末梢血単核球の遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ解析により測定し、ＴＣＺ治療に対する反応例（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と無反応例（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）との間で遺伝子発現に著しい差異のある４遺伝子を見出した。さらに、これら４遺伝子について、ＴＣＺ治療に対する臨床反応の予測を受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により行い、これら遺伝子を用いることによりＴＣＺ治療に対する中等度から良好な反応を予測できることを見出し、本発明を完成した。ここで、反応例とはＴＣＺ治療により有効以上の効果を示した症例であり、無反応例とはＴＣＺ治療により無効または増悪した症例を意味する。 The present inventor has conducted intensive studies to solve the above problems, and measured the gene expression of peripheral blood mononuclear cells of RA patients by DNA microarray analysis, and responded to TCZ treatment (responder) and non-responding ( We found 4 genes with significant differences in gene expression from non-responders. Furthermore, for these four genes, clinical response to TCZ treatment is predicted by receiver operating characteristic (ROC) analysis, and it is found that moderate to good response to TCZ treatment can be predicted by using these genes. completed. Here, a response example is a case showing an effect that is more than effective by TCZ treatment, and a non-response example means a case that is ineffective or worsened by TCZ treatment.
すなわち、本発明は、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法であって、（１）関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに（２）前記（１）において測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む、方法に関する。 That is, the present invention is a method for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, and (1) in a peripheral blood mononuclear cell sample isolated from a patient with rheumatoid arthritis, Measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of MT1G, IFI6, MX2 and OASL drug efficacy marker genes; and (2) the expression level of the gene measured in (1) above, and rheumatoid arthritis Correlating with the efficacy of treatment with anti-human IL-6 receptor antibody against.
また本発明は、前記（２）における、測定した遺伝子の発現レベルと関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることが、測定した遺伝子の発現レベルと該遺伝子の発現レベルのカットオフ値との比較により行われる、前記方法に関する。 In the present invention, the correlation between the measured gene expression level in (2) and the effectiveness of treatment with an anti-human IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis is based on the measured gene expression level and the gene. It is related with the said method performed by the comparison with the cut-off value of the expression level.
さらに本発明は、前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、前記いずれかの方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to any of the aforementioned methods, wherein the anti-IL-6 receptor antibody is tocilizumab.
さらにまた本発明は、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物またはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または、当該薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断薬に関する。 Furthermore, the present invention provides a nucleic acid probe or nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of at least one gene selected from the group consisting of MT1G, IFI6, MX2 and OASL medicinal marker genes or a complementary nucleic acid thereof, Alternatively, for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, comprising an antibody that specifically binds to a translation product of at least one gene selected from the group consisting of the drug efficacy marker genes Related to diagnostics.
また本発明は、前記抗ＩＬ−６受容体抗体がトシリズマブである、前記診断薬に関する。 The present invention also relates to the diagnostic agent, wherein the anti-IL-6 receptor antibody is tocilizumab.
さらに本発明は、前記いずれかの診断薬に加え、前記核酸プローブ若しくは核酸プライマー、または前記抗体を検出するための試薬をさらに含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キットに関する。 Furthermore, the present invention relates to the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, which further comprises the nucleic acid probe or nucleic acid primer, or a reagent for detecting the antibody, in addition to any of the diagnostic agents. The present invention relates to a diagnostic reagent kit for prediction.
さらにまた本発明は、下記プライマーセットから選択される少なくとも１のプライマーセットを含む、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断用試薬キットに関する：
（ｉ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉｉ）配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、並びに
（ｉｖ）配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット。
Furthermore, the present invention relates to a diagnostic reagent kit for predicting the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, comprising at least one primer set selected from the following primer sets:
(I) a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 32;
(Ii) a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 26;
(Iii) a primer set consisting of a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 38, and (iv) represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 And a primer set comprising the nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
本発明に係る方法を用いれば、従来報告されている方法より高い感度で、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性を予測することができ、そのため、該治療の有効性を予め確認した上で該治療を実施することができる。その結果、例えば、当該治療の有効性が見込める患者に対して該治療を適用し、有効性が見込めない患者に対しては治療方針を変更するなど、治療方針の選択判断が可能になる。したがって、本発明に係る方法は、抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性が見込めない患者にとって、該治療を受けることによる損傷の進行や副作用に関する不必要なリスクを避けることができると共に、不要な費用の発生を防止することができる。さらに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく寄与すると期待される。 With the method according to the present invention, it is possible to predict the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment in RA patients with higher sensitivity than previously reported methods. Once confirmed, the treatment can be performed. As a result, for example, the treatment policy can be selected and judged by applying the treatment to a patient who can expect the effectiveness of the treatment and changing the treatment policy for a patient who cannot expect the effectiveness. Therefore, the method according to the present invention can avoid unnecessary risks related to progression of damage and side effects caused by receiving the treatment for patients who cannot expect the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment, and is unnecessary. Cost can be prevented. Furthermore, it is expected that the use of useless drugs will be suppressed and that it will greatly contribute to the medical economy.
本発明は、関節リウマチに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための方法に関する。本発明に係る方法は、（１）関節リウマチ患者から単離された末梢血単核球試料において、後述する４つの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定すること、並びに（２）前記（１）において測定した遺伝子の発現レベルと、関節リウマチに対する抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることを含む。 The present invention relates to a method for predicting the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibodies against rheumatoid arthritis. In the method according to the present invention, (1) in a peripheral blood mononuclear cell sample isolated from a rheumatoid arthritis patient, the expression level of at least one gene selected from the group consisting of the following four drug marker genes is measured. And (2) correlating the expression level of the gene measured in (1) with the effectiveness of treatment with anti-human IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis.
抗ＩＬ−６受容体抗体は、好ましくは抗ＩＬ−６受容体阻害抗体である。抗ＩＬ−６受容体阻害抗体とは、ＩＬ−６受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＩＬ−６の当該受容体への結合を阻止することにより、ＩＬ−６刺激による当該受容体を介した生体反応を阻害する抗体をいう。 The anti-IL-6 receptor antibody is preferably an anti-IL-6 receptor inhibitory antibody. An anti-IL-6 receptor-inhibiting antibody specifically binds to the extracellular domain of IL-6 receptor and blocks the binding of IL-6 to the receptor, thereby causing the receptor to be stimulated by IL-6. An antibody that inhibits a biological reaction through the body.
本明細書において、抗体の抗原への「特異的な結合」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原に対する親和性が、抗原以外の抗原に対する親和性よりも強いことを意味する。 In the present specification, “specific binding” of an antibody to an antigen means that the affinity of the antibody for the antigen in the antigen-antibody reaction is stronger than the affinity for the antigen other than the antigen.
抗ＩＬ−６受容体阻害抗体は、より好ましくは抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体である。抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体とは、ヒト−６受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＩＬ−６の当該受容体への結合を阻止することにより、ＩＬ−６刺激による当該受容体を介した生体反応を阻害する抗体をいう。 The anti-IL-6 receptor inhibitory antibody is more preferably an anti-human IL-6 receptor inhibitory antibody. An anti-human IL-6 receptor-inhibiting antibody specifically binds to the extracellular domain of human-6 receptor and blocks the binding of IL-6 to the receptor. An antibody that inhibits a biological reaction mediated by a receptor.
ヒトＩＬ−６受容体は公知の受容体であり、そのアミノ酸配列も公知である。ヒトＩＬ−６受容体の代表的なアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にＮＰ＿０００５５６．１として登録されている。ヒトＩＬ−６は公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。ヒトＩＬ−６の代表的なアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号にＮＰ＿０００５９１．１として登録されている。 Human IL-6 receptor is a known receptor, and its amino acid sequence is also known. A representative amino acid sequence of the human IL-6 receptor is registered as GenBank accession number as NP_000556.1. Human IL-6 is a known cytokine, and its amino acid sequence is also known. A representative amino acid sequence of human IL-6 is registered under the GenBank accession number as NP_000591.1.
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などの天然型抗体、および遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体や一本鎖抗体などが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどのいずれのアイソタイプの抗体をも包含する。 In this specification, antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and single chain antibodies that can be produced using gene recombination techniques. However, it is not limited to these. Preferably, the antibody is a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody. The class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies of any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE.
抗ＩＬ−６受容体抗体は、最も好ましくはトシリズマブである。トシリズマブは、マウスで作成された抗ヒトＩＬ−６受容体モノクローナル抗体をもとに、遺伝子組換え技術により産生されたヒト化モノクローナル抗体である。 The anti-IL-6 receptor antibody is most preferably tocilizumab. Tocilizumab is a humanized monoclonal antibody produced by gene recombination technology based on an anti-human IL-6 receptor monoclonal antibody produced in mice.
本発明に係る方法の適用対象となるＲＡ患者は、ヒトＲＡ患者である。ＲＡの診断は、１９８７年米国リウマチ学会（ＡＣＲ）分類基準（非特許文献１７）、および２０１０年ＡＣＲ／欧州リウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）分類基準（非特許文献１８）に基づき実施することができる。本発明に係る方法は、ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ分類基準を満たし、且つ臨床疾患活動性指標（ＣＤＡＩ、非特許文献１９）が１０以上であるＲＡ患者に好ましく適用することができる。 The RA patient to which the method according to the present invention is applied is a human RA patient. The diagnosis of RA can be performed based on the 1987 American College of Rheumatology (ACR) classification criteria (Non-Patent Document 17) and the 2010 ACR / European Rheumatology Society (EULAR) Classification Criteria (Non-Patent Literature 18). The method according to the present invention can be preferably applied to RA patients who satisfy the ACR / EULAR classification criteria and have a clinical disease activity index (CDAI, Non-Patent Document 19) of 10 or more.
ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とは、当該治療によるＲＡの寛解の程度または有無をいう。ＲＡの寛解の程度または有無は、骨の変形や破壊、関節の腫脹、疼痛、こわばりなどの症状の改善の程度を、ＥＵＬＡＲ改善基準および／またはＣＤＡＩ、好ましくはＣＤＡＩ、に基づき評価することにより判断することができる。好ましくは、治療の有効性は、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の開始から、遅くとも６ヶ月以内にＲＡが部分的または完全に寛解するか否かで判断される。なお、関節の腫脹、疼痛、こわばりなどの症状の改善を伴わず、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの炎症性マーカーの低下のみが認められる症例は、ＲＡの寛解例や改善例には含まない。 The effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against RA refers to the extent or presence of RA remission by the treatment. The degree or presence of RA remission is determined by evaluating the degree of improvement of symptoms such as bone deformation and destruction, joint swelling, pain, stiffness, etc. based on the EULAR improvement criteria and / or CDAI, preferably CDAI. can do. Preferably, the effectiveness of treatment is determined by whether RA partially or completely ameliorates at the latest within 6 months from the start of treatment with anti-IL-6 receptor antibody. Cases in which only a decrease in inflammatory markers such as C-reactive protein (CRP) is observed without any improvement in symptoms such as joint swelling, pain, stiffness, etc. are included in cases of RA remission or improvement Absent.
本明細書において、抗ＩＬ−６受容体抗体治療により有効以上の効果を示した症例を反応例と称し、抗ＩＬ−６受容体抗体治療により無効または増悪した症例を無反応例と称することがある。 In the present specification, a case showing an effect more than effective by anti-IL-6 receptor antibody treatment is referred to as a reaction example, and a case ineffective or worsened by anti-IL-6 receptor antibody treatment is referred to as a non-response example. is there.
本発明に係る方法においては、ＲＡ患者から単離された末梢血単核球における、４つの薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定する。これらの遺伝子のうちの複数、例えば２以上、好ましく３以上、より好ましくは４遺伝子の発現レベルを測定し、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性と相関付けることにより、より高い精度で、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することが期待できる。 In the method according to the present invention, the expression level of at least one gene selected from the group consisting of four drug efficacy marker genes in peripheral blood mononuclear cells isolated from RA patients is measured. By measuring the expression level of a plurality of these genes, for example, 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 genes, and correlating with the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody with higher accuracy It can be expected to predict the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibodies.
本明細書において、「薬効マーカー遺伝子」とは、患者から単離された細胞などの試料中に検出される遺伝子であって、その発現や消失、および発現の変化などにより、該患者に投与した薬剤の効果を判定することのできる指標となる遺伝子を意味する。 In the present specification, the “medicinal efficacy marker gene” is a gene detected in a sample such as a cell isolated from a patient, and is administered to the patient by its expression, disappearance, expression change or the like. It means a gene that serves as an index for determining the effect of a drug.
本発明に係る方法で使用される薬効マーカー遺伝子は、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの４遺伝子である。 The drug efficacy marker genes used in the method according to the present invention are the four genes MT1G, IFI6, MX2, and OASL.
ＭＴ１Ｇは、メタロチオネイン（ＭＴｓ）のアイソタイプの１つであるメタロチオネイン−１のサブタイプであるメタロチオネイン−１Ｇをコードする遺伝子である。ＭＴｓは、金属結合ドメインを有し、それにより毒性金属解毒および酸化ストレスに対する防御を含むさまざまな役割に関与している（非特許文献２０−２２）。ＭＴｓの遺伝子発現はＩＬ−６などの炎症性サイトカインにより上方制御され（非特許文献２２−２４）、そしてＭＴｓはその詳細なメカニズムは不明ではあるが免疫反応および炎症反応に関与することが報告されている（非特許文献２２、２５−２８）。ＭＴ１Ｇの代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＢＣ０２０７５７．１として登録されている。ＭＴ１Ｇ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号１および２に記載する。 MT1G is a gene encoding metallothionein-1G, which is a subtype of metallothionein-1 which is one of the isotypes of metallothionein (MTs). MTs have metal binding domains and are thus involved in various roles including toxic metal detoxification and protection against oxidative stress (Non-Patent Documents 20-22). Gene expression of MTs is up-regulated by inflammatory cytokines such as IL-6 (Non-Patent Documents 22-24), and MTs are reported to be involved in immune and inflammatory responses, although the detailed mechanism is unknown. (Non-Patent Documents 22, 25-28). A representative nucleotide sequence of MT1G is registered as GenBank accession number BC020577.1. Representative nucleotide sequences of MT1G cDNA and amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
ＩＦＩ６は、インターフェロンα−誘導性タンパク質６をコードする遺伝子である。ＩＦＩ６の代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１１６０１．２およびＢＣ０１５６０３．２として登録されている。これらアクセッション番号で登録されているＩＦＩ６ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列を配列表の配列番号３および５に記載する。また、これらヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４および６に記載する。 IFI6 is a gene encoding interferon α-inducible protein 6. Representative nucleotide sequences of IFI6 are registered as GenBank accession numbers BC011601.2 and BC0155603.2. Representative nucleotide sequences of IFI6 cDNA registered under these accession numbers are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5 in the sequence listing. In addition, amino acid sequences encoded by these nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 4 and 6, respectively.
ＭＸ２は、ミクソウイルス耐性２をコードする遺伝子である。ＭＸ２の代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＢＣ０３５２９３．１として登録されている。ＭＸ２ ｃＤＮＡの代表的なヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号７および８に記載する。 MX2 is a gene encoding myxovirus resistance 2. A representative nucleotide sequence of MX2 is registered as GenBank accession number BC03593.1. Representative nucleotide sequences of MX2 cDNA and amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
ＯＡＳＬは２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ様遺伝子である。ＯＡＳＬの代表的なヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ１１７４０８．１およびＢＣ１１７４１０．１として登録されている。これらアクセッション番号で登録されているヌクレオチド配列は同一であり、その配列を配列表の配列番号９に記載する。また、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に記載する。 OASL is a 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like gene. Representative nucleotide sequences of OASL are registered as GenBank accession numbers BC117408.1 and BC117410.1. The nucleotide sequences registered with these accession numbers are identical, and the sequence is described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. The amino acid sequence encoded by this nucleotide sequence is set forth in SEQ ID NO: 10.
ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬはＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答遺伝子（ＩＲＧｓ）であり、これら遺伝子の発現はＩ型ＩＦＮシグナル伝達により誘導される。Ｉ型ＩＦＮｓは、ＩＦＮαｓとＩＦＮβであり、ウイルスに対する内因性免疫応答の媒介にとって不可欠の機能を有し、リンパ球分化、恒常性維持、寛容性、および記憶などのいくつかの免疫学的過程に決定的な役割をもつ（非特許文献２９）。末梢血液試料中のＩ型ＩＦＮ活性またはＩＲＧｓ発現がＲＡ患者で増加しているという報告がなされている（非特許文献３０−３５）。また、血漿中のＩＦＮｓ活性の増加がＴＮＦアンタゴニストにより治療したＲＡ患者の良好な臨床反応の予測となったこと（非特許文献３１）、そしていくつかのＩＲＧｓの発現もまた、良好な反応を示したＲＡ患者で増加したことが認められたことが報告されている（非特許文献３６）。対照的に、末梢血細胞や関節組織中でのＩＲＧｓおよびＩＦＮαの発現レベルの増加が、Ｂ細胞上に発現したＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体であるリツキシマブに対する治療無反応に関連することが報告されている（非特許文献１４、３２、３７）。これらデータは、Ｉ型ＩＦＮシグネチャーが、ある種の生物学的薬剤の恩恵を優先的に受けるだろう患者の特定に使用できるかもしれないが、有効な抗リウマチ薬に対するＲＡ患者の治療反応を普遍的に予測する予知マーカーではないことを示すものである。 IFI6, MX2, and OASL are type I interferon (IFN) responsive genes (IRGs) whose expression is induced by type I IFN signaling. Type I IFNs are IFNαs and IFNβ, have functions essential for mediating the endogenous immune response against the virus and are involved in several immunological processes such as lymphocyte differentiation, homeostasis, tolerance, and memory It has a decisive role (Non Patent Literature 29). It has been reported that type I IFN activity or IRGs expression in peripheral blood samples is increased in RA patients (Non-patent Documents 30-35). Also, an increase in plasma IFNs activity was a predictive of a good clinical response in RA patients treated with TNF antagonists (Non-patent Document 31), and the expression of some IRGs also showed a good response It has been reported that an increase was observed in RA patients (Non-patent Document 36). In contrast, increased levels of IRGs and IFNα expression in peripheral blood cells and joint tissues have been reported to be associated with no treatment response to rituximab, a monoclonal antibody targeting CD20 expressed on B cells. (Non-Patent Documents 14, 32, and 37). These data show that the type I IFN signature may be used to identify patients who will preferentially benefit from certain biological agents, but universally treat RA patients' response to effective antirheumatic drugs. This indicates that it is not a predictive marker to predict automatically.
本明細書において、上記４つの遺伝子のヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、本明細書の配列表に例示されたものに限定されず、例示された配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上、の配列同一性を有しており、且つ当該遺伝子または該遺伝子によりコードされるタンパク質の機能が維持されている限りにおいて、いずれの配列であってもよい。 In the present specification, the nucleotide sequences of the four genes and the amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences are not limited to those exemplified in the sequence listing of the present specification, and preferably 70% or more of the exemplified sequences. Has a sequence identity of 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more, and the function of the gene or the protein encoded by the gene is Any sequence may be used as long as it is maintained.
末梢血からの単核球の単離は、従来公知の単離方法を使用して実施することができる。具体的には、ヘパリンやクエン酸などの抗凝固剤で処理した末梢血を、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップ、に積層するか、または該分離剤と混合し、遠心分離操作を行い、単核球を単核球以外の血球成分から分離することにより実施することができる。 Isolation of mononuclear cells from peripheral blood can be performed using a conventionally known isolation method. Specifically, peripheral blood treated with an anticoagulant such as heparin or citric acid is layered on a separation agent having a specific gravity adjusted appropriately for mononuclear cell separation, such as Ficoll or lymphoprep. It can be carried out by mixing with an agent and performing a centrifugation operation to separate mononuclear cells from blood cell components other than mononuclear cells.
「細胞の単離」とは、目的とする細胞以外の細胞を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された単核球」における単核球の純度は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは実質的に１００％である。尚、本発明に係る方法において使用する単核球からは、顆粒球ができる限り除かれていることが好ましい。本発明に係る方法において使用する単離された単核球中に混入する顆粒球の頻度は、通常１％以下、好ましくは０．１％以下、より好ましくは０．０１％以下である。最も好ましくは、単離された単核球は、顆粒球の混入を実質的に含まない。 “Isolation of cells” means that an operation for removing cells other than the target cells has been performed. The purity of the mononuclear sphere in the “isolated mononuclear cell” is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably substantially 100%. In addition, it is preferable that granulocytes are removed as much as possible from the mononuclear cells used in the method according to the present invention. The frequency of granulocytes mixed in the isolated mononuclear cells used in the method according to the present invention is usually 1% or less, preferably 0.1% or less, more preferably 0.01% or less. Most preferably, the isolated mononuclear cells are substantially free of granulocyte contamination.
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、各薬効マーカー遺伝子の転写産物、すなわち、各遺伝子をコードするｍＲＮＡやその相補的核酸であるｃＲＮＡまたはｃＤＮＡ、を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを用いて、自体公知の方法により実施することができる。このような測定方法としては、例えば、ｃＤＮＡアレイ、リアルタイム−ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと略称することがある）、ノザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を例示できる。 The expression level of each medicinal marker gene is determined by measuring the transcription product of each medicinal marker gene, that is, a nucleic acid probe or a nucleic acid primer capable of specifically detecting mRNA encoding each gene and its complementary nucleic acid cRNA or cDNA. Can be carried out by a method known per se. Examples of such a measuring method include methods such as cDNA array, real-time polymerase chain reaction (hereinafter sometimes abbreviated as RT-PCR), northern blotting, in situ hybridization, and the like.
各遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、各遺伝子のｃＤＮＡ配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約５００塩基、より好ましくは約１８〜約２０塩基、さらに好ましくは約１８〜約５０塩基の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。 The nucleic acid probe capable of specifically detecting the transcription product of each gene and its complementary nucleic acid is about 15 bases or more, preferably about 18 to about 500 bases, more preferably about 18 contained in the cDNA sequence of each gene. A polynucleotide comprising a continuous nucleotide sequence of about 20 bases, more preferably about 18 to about 50 bases, or a complementary sequence thereof can be mentioned.
各薬効マーカー遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プライマーは、各薬効マーカー遺伝子のｃＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドの一部または全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、各薬効マーカー遺伝子のｃＤＮＡ配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より３´末端側の当該ｃＤＮＡ配列の一部にハイブリダイズする、約１５〜約５０塩基、好ましくは約１８〜約３０塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約５０〜約１，０００塩基、好ましくは約５０〜約５００塩基、より好ましくは約５０〜約２００塩基である、一組のポリヌクレオチドが挙げられる。 Nucleic acid primers that can specifically detect the transcription product of each drug marker gene and its complementary nucleic acid can specifically amplify a part or all of the polynucleotide consisting of the cDNA sequence of each drug marker gene. Any design may be used. For example, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence of about 15 to about 50 bases, preferably about 18 to about 30 bases, which hybridizes to a part of the complementary sequence of the cDNA sequence of each drug marker, and 3 from the hybridization site. A combination of a polynucleotide containing a nucleotide sequence of about 15 to about 50 bases, preferably about 18 to about 30 bases, which hybridizes to a part of the cDNA sequence on the 'terminal side, A set of polynucleotides having a fragment length of about 50 to about 1,000 bases, preferably about 50 to about 500 bases, more preferably about 50 to about 200 bases.
核酸プローブおよび核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列、すなわち検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列、を含んでいてもよい。 The nucleic acid probe and the nucleic acid primer may contain an additional sequence, that is, a nucleotide sequence that is not complementary to the polynucleotide to be detected as long as specific detection is not hindered.
また、核酸プローブおよび核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどで標識されていてもよい。好ましい放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなどを例示できる。好ましい酵素として、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などを例示できる。好ましい蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどを例示できる。好ましい発光物質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを例示できる。あるいは、ＦＡＭ商標やＶＩＣ登録商標などのレポーター蛍光色素の近傍に該蛍光色素の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光色素とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。 The nucleic acid probe and the nucleic acid primer may be labeled with an appropriate labeling agent, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin, and the like. Examples of preferable radioisotopes include 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 32 P, 33 P, and 35 S. Preferable enzymes include β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like. Preferred fluorescent materials include fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like. Examples of preferable luminescent substances include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin. Alternatively, a quencher (quenching substance) that absorbs fluorescence energy emitted from the fluorescent dye may be further bound in the vicinity of a reporter fluorescent dye such as FAM trademark or VIC registered trademark . In such an embodiment, the fluorescence is detected by separating the fluorescent dye and the quencher during the detection reaction.
核酸プローブおよび核酸プライマーは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。したがって、本明細書においてあるヌクレオチド配列を有する核酸について記載する場合、該記載は、特に断らない限り、該ヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、該ヌクレオチド配列と相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、それらのハイブリッドである二本鎖ポリヌクレオチドをすべて包含する意味で用いられている。 The nucleic acid probe and the nucleic acid primer may be DNA or RNA, and may be single-stranded or double-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA, or a DNA / RNA hybrid. Therefore, in the present specification, when a nucleic acid having a nucleotide sequence is described, the description includes a single-stranded polynucleotide having the nucleotide sequence and a single-stranded strand having a sequence complementary to the nucleotide sequence, unless otherwise specified. It is used to include all polynucleotides and double-stranded polynucleotides that are hybrids thereof.
上記核酸プローブおよび核酸プライマーは、例えば、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。 The nucleic acid probe and the nucleic acid primer can be synthesized in accordance with a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer, for example, based on the nucleotide sequence information described in the present specification.
また、各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物、すなわちタンパク質、に特異的に結合する抗体を用いて、免疫学的手法により、該翻訳産物量を定量することにより実施できる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色などを例示できる。所望の抗体は、各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物であるタンパク質、または該タンパク質の抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。あるいは、市販されている所望の抗体を使用することもできる。 The expression level of each drug marker gene is measured by quantifying the translation product amount by an immunological technique using an antibody that specifically binds to the translation product of each drug marker gene, that is, a protein. Can be implemented. Examples of immunological techniques include flow cytometry analysis, radioisotope immunoassay (RIA method), enzyme immunosolid phase method (ELISA method), Western blotting, and immunohistochemical staining. A desired antibody can be produced by an existing general production method using a protein which is a translation product of each drug marker or a partial peptide having the antigenicity of the protein as an immunogen. Alternatively, a desired antibody that is commercially available can be used.
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定において使用される核酸や抗体は、適切な支持体の上に結合させて核酸アレイや抗体アレイとして提供されたものであってもよい。支持体としては、ポリヌクレオチドを固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。具体的には、ガラス、シリコンウエハウ、ビーズ、樹脂、金属などの無機素材の支持体、またニトロセルロースなどの天然高分子材料やナイロンなどの合成高分子材料の支持体を例示できる。 The nucleic acid or antibody used in the measurement of the expression level of each drug efficacy marker gene may be provided as a nucleic acid array or antibody array by binding on an appropriate support. The support is not particularly limited as long as the polynucleotide can be immobilized, and may have any shape or material. Specifically, a support of an inorganic material such as glass, silicon wafer, bead, resin, or metal, a support of a natural polymer material such as nitrocellulose, or a synthetic polymer material such as nylon can be exemplified.
ＭＴ１Ｇの発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。 As a nucleic acid primer preferably used for the measurement of the expression level of MT1G, a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32 can be exemplified.
ＩＦＩ６の発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。 As a nucleic acid primer preferably used for the measurement of the expression level of IFI6, a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 can be exemplified.
ＭＸ２の発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。 As a nucleic acid primer preferably used for measuring the expression level of MX2, a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 37 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38 can be exemplified.
ＯＡＳＬの発現レベルの測定に好ましく使用される核酸プライマーとして、配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセットを例示できる。 As a nucleic acid primer preferably used for the measurement of the expression level of OASL, a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40 can be exemplified.
各薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定した後に、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付ける。例えば、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルを、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベル、および抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルと比較する。あるいは、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルを、あらかじめ求めておいた評価基準と比較してもよい。かかる評価基準として、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの平均値を例示できる。また、別の評価基準として、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの平均値を例示できる。あるいは、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効／無効であった多数のＲＡ患者の当該治療開始前の末梢血単核球における当該薬効マーカー遺伝子の発現レベルの分布図などと比較することにより、測定した薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性とを相関付けることができる。遺伝子発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。 After measuring the expression level of each drug marker gene, the measured expression level of the drug marker gene is correlated with the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against RA. For example, the measured expression level of the medicinal marker gene is determined based on the expression level of the medicinal marker gene in peripheral blood mononuclear cells before the start of the treatment of RA patients who have been effectively treated with anti-IL-6 receptor antibody, and Comparison is made with the expression level of the drug marker gene in peripheral blood mononuclear cells before the start of the treatment of RA patients who have failed treatment with IL-6 receptor antibody. Alternatively, the measured expression level of the drug efficacy marker gene may be compared with an evaluation criterion obtained in advance. An example of such evaluation criteria is the average value of the expression level of the drug marker gene in peripheral blood mononuclear cells before the start of the treatment of RA patients who have been effectively treated with anti-IL-6 receptor antibody. Further, as another evaluation criterion, an average value of the expression level of the drug marker gene in peripheral blood mononuclear cells before the start of the treatment of RA patients in whom the treatment with the anti-IL-6 receptor antibody is ineffective can be exemplified. Alternatively, by comparing with the distribution map of the expression level of the efficacy marker gene in peripheral blood mononuclear cells before the start of the treatment of a large number of RA patients for whom the treatment with the anti-IL-6 receptor antibody was effective / ineffective The measured expression level of the medicinal marker gene can be correlated with the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against RA. The comparison of gene expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
後述する実施例に示すように、抗ヒトＩＬ−６受容体阻害抗体による治療が有効なＲＡ患者においては、本発明に係る４つの薬効マーカー遺伝子、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの末梢血単核球における発現レベルが、当該治療が無効なＲＡ患者と比較して高かった。したがって、末梢血単核球におけるこれら薬効マーカー遺伝子の発現レベルと、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性との間の正の相関に基づき、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。例えば、末梢血単核球において、これら薬効マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの薬効マーカー遺伝子の発現レベルが相対的に高いと評価された場合には、当該ＲＡ患者は抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。さらに、これらの遺伝子のうちの複数、例えば２以上、好ましく３以上、より好ましくは４遺伝子、の発現レベルが相対的に高いと評価された場合には、より高い精度で、当該ＲＡは抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。 As shown in the examples described below, in RA patients who are effectively treated with an anti-human IL-6 receptor-inhibiting antibody, peripheral blood units of four medicinal marker genes according to the present invention, MT1G, IFI6, MX2, and OASL are used. The expression level in nuclei cells was higher compared to RA patients for whom the treatment was ineffective. Therefore, based on the positive correlation between the expression level of these drug efficacy marker genes in peripheral blood mononuclear cells and the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody, the effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody is effective. Gender can be predicted. For example, in peripheral blood mononuclear cells, when it is evaluated that the expression level of at least one drug marker gene selected from the group consisting of these drug marker genes is relatively high, the RA patient is treated with anti-IL-6. It can be determined that treatment with a receptor antibody is likely to be effective. Furthermore, when it is evaluated that the expression level of a plurality of these genes, for example, 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 genes, is relatively high, the RA is anti-IL with higher accuracy. It can be determined that treatment with the −6 receptor antibody is likely to be effective.
また、末梢血単核球中の各薬効マーカー遺伝子の発現レベルのカットオフ値をあらかじめ設定しておき、ＲＡ患者の末梢血単核球中の測定した各薬効マーカー遺伝子の発現レベルとこのカットオフ値とを比較してもよい。例えば、本発明に係る４つの薬効マーカー遺伝子、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬの末梢血単核球における発現レベルが、前記カットオフ値以上である場合には、当該ＲＡ患者は抗ヒトＩＬ−６受容体阻害性抗体による治療が有効である可能性が高いと判定することができる。 In addition, a cut-off value of the expression level of each drug marker gene in peripheral blood mononuclear cells is set in advance, and the expression level of each drug marker gene measured in peripheral blood mononuclear cells of RA patients and this cut-off value are set. The value may be compared. For example, when the expression level of peripheral drug mononuclear cells of the four drug marker genes according to the present invention, MT1G, IFI6, MX2, and OASL is equal to or higher than the cut-off value, the RA patient has anti-human IL- It can be determined that treatment with a 6-receptor inhibitory antibody is likely to be effective.
「カットオフ値」とは、閾値ともいい、その値を基準として治療の有効性の判定をした場合に、高い診断感度および高い診断特異度の両方を満足できる値をいう。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であるＲＡ患者で高い陽性率を示し、かつ、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であるＲＡ患者で高い陰性率を示す、末梢血単核球中の薬効マーカー遺伝子の発現レベルをカットオフ値として設定することができる。 The “cut-off value” is also referred to as a threshold value, and refers to a value that can satisfy both high diagnostic sensitivity and high diagnostic specificity when the effectiveness of treatment is determined based on the threshold value. Here, sensitivity means a true positive rate. Specificity means a true negative rate. For example, peripheral blood showing a high positive rate in RA patients who are effective with anti-IL-6 receptor antibody treatment and a high negative rate in RA patients where treatment with anti-IL-6 receptor antibody is ineffective The expression level of a drug efficacy marker gene in mononuclear cells can be set as a cut-off value.
カットオフ値の設定は、自体公知の方法により実施できる。例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）により、カットオフ値の設定を行うことができる。ＲＯＣ解析では、閾値を変化させていった場合に、それぞれの閾値における感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を縦軸に、ＦＰＦ（Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ、偽陽性率：１−特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線では、全く診断能のない検査は、対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、対角線が左上方に弧を描くような曲線となり、診断能１００％の検査は、左辺−上辺上を通る曲線となる。カットオフ値の設定としては、例えば、感度と特異度の優れた独立変数のＲＯＣ曲線は、左上隅に近づいていくという事実から、この左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値にする方法がある。また、ＲＯＣ曲線における曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣと略称される）が０．５００となる斜点線から最も離れたポイントをカットオフ値にする方法、つまり、（感度＋特異度−１）を計算して、その最大値となるポイントであるヨーデン指標（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値に設定することもできる。 The cut-off value can be set by a method known per se. For example, the cutoff value can be set by a ROC analysis (receiver operating characteristic analysis) that is generally used as a method for examining the usefulness of a diagnostic test. In the ROC analysis, when the threshold value is changed, the sensitivity (Sensitivity) at each threshold value is plotted on the vertical axis, and the FPF (False Positive Fraction, false positive rate: 1-specificity (Specificity)) is plotted on the horizontal axis. An ROC curve is created. In the ROC curve, a test having no diagnostic ability becomes a straight line on the diagonal line, but as the diagnostic ability is improved, the diagonal line becomes a curve that draws an arc in the upper left. It becomes a curve that passes on the upper side. As the setting of the cut-off value, for example, the ROC curve, which is an independent variable with excellent sensitivity and specificity, approaches the upper left corner, so that the point at which the distance from the upper left corner is the minimum is set as the cut-off value. There is a way to do it. In addition, a method of setting a cut-off value at a point farthest from a diagonal line where the area under the curve (abbreviated as AUC) in the ROC curve is 0.500, namely, (sensitivity + specificity−1 ) Can be calculated, and the Yoden index that is the maximum value can be set as the cutoff value.
具体的には、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が有効であったＲＡ患者、すなわち反応例、および抗ＩＬ−６受容体抗体による治療が無効であったＲＡ患者、すなわち無反応例の、当該治療開始前に採取した末梢血単核球中の各薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば、検出された値における診断効率、すなわち治療が有効であった患者を「有効」と正しく診断した症例と、治療が無効であった患者を「無効」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合、を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とすることができる。 Specifically, RA patients in which treatment with anti-IL-6 receptor antibody was effective, ie, response cases, and RA patients in which treatment with anti-IL-6 receptor antibody was ineffective, ie, non-response cases, Measure the expression level of each drug marker gene in peripheral blood mononuclear cells collected before the start of the treatment, determine the diagnostic sensitivity and specificity of the measured values, and use commercially available analysis software based on these values. Use to create ROC curve. Then, a value when the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity are as close to 100% as possible is obtained, and the value can be used as a cutoff value. In addition, for example, the diagnostic efficiency at the detected value, that is, the total of the cases in which the patient who was successfully treated was correctly diagnosed as “effective” and the cases in which the patient who was invalid in treatment was correctly diagnosed as “invalid” The ratio of the number to the total number of cases is obtained, and the value at which the highest diagnostic efficiency is calculated can be used as the cutoff value.
本発明はまた、ＭＴ１Ｇ、ＩＦＩ６、ＭＸ２、およびＯＡＳＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物若しくはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマー、あるいはこれら遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の翻訳産物に特異的に結合し得る抗体を含む、ＲＡに対する抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測するための診断薬に関する。本発明に係る診断薬は、上記本発明に係る方法に使用される。 The present invention also comprises a nucleic acid probe or nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of at least one gene selected from the group consisting of MT1G, IFI6, MX2 and OASL or a complementary nucleic acid thereof, or these genes The present invention relates to a diagnostic agent for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against RA, comprising an antibody capable of specifically binding to a translation product of at least one gene selected from the group. The diagnostic agent according to the present invention is used in the method according to the present invention.
測定対象の各薬効マーカー遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体や、各薬効マーカー遺伝子の転写産物やその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブは、適切な支持体の上に結合して、核酸アレイや、抗体アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などを挙げることができる。 An antibody that specifically binds to the translation product of each medicinal marker gene to be measured, or a nucleic acid probe that can specifically detect the transcription product of each medicinal marker gene or its complementary nucleic acid is bound on an appropriate support. Then, it may be provided as a nucleic acid array or an antibody array. The support is not particularly limited as long as it is a support usually used in the art, and examples thereof include membranes such as nylon membranes, beads, glass, plastics, and metals.
本発明に係る診断薬は、単核球分離用に適切に比重が調整された分離剤、例えばフィコールやリンホプレップ、をさらに含んでいてもよい。 The diagnostic agent according to the present invention may further contain a separating agent whose specific gravity is appropriately adjusted for mononuclear cell separation, such as Ficoll and lymphoprep.
本発明に係る診断薬に含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水若しくは適当な緩衝液、例えばＴＥバッファーやリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、中に適当な濃度となるように溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。 Each component contained in the diagnostic agent according to the present invention is water or a suitable buffer solution, for example, TE buffer or phosphate buffered saline (PBS), in a mixed state, separately or if possible. Or dissolved in a lyophilized state and stored in a suitable container.
本発明に係る診断薬は、薬効マーカー遺伝子の発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分や試薬をさらに含む診断用試薬キットとして提供することができる。例えば、本発明に係る診断薬が、薬効マーカー遺伝子の転写産物またはその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブまたは核酸プライマーを含むものであれば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイなどにより薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。ＲＴ−ＰＣＲを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、ＰＣＲ反応緩衝液、反応に必要な各種塩溶液、ｄＮＴＰｓ水溶液、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素などをさらに含む試薬キットとして提供することができる。ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜などをさらに含むことができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明に係る診断薬は、標識化試薬、発色基質などをさらに含むことができる。 The diagnostic agent according to the present invention can be provided as a diagnostic reagent kit further containing other components and reagents necessary for the implementation of the method depending on the method for measuring the expression level of the drug efficacy marker gene. For example, if the diagnostic agent according to the present invention includes a nucleic acid probe or a nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of a drug efficacy marker gene or a complementary nucleic acid thereof, RT-PCR, Northern blotting, in situ high The effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody can be predicted by measuring the expression level of a drug efficacy marker gene by hybridization, cDNA array, or the like. When RT-PCR is used for the measurement, the diagnostic agent according to the present invention is a reagent kit further comprising a PCR reaction buffer, various salt solutions necessary for the reaction, an aqueous dNTPs solution, Taq DNA polymerase, and reverse transcriptase. Can be provided. When Northern blotting or a nucleic acid array is used for measurement, the diagnostic agent according to the present invention can further include a blotting buffer, a labeling reagent, a blotting membrane, and the like. When in situ hybridization is used for the measurement, the diagnostic agent according to the present invention can further contain a labeling reagent, a chromogenic substrate, and the like.
本発明に係る診断薬が、薬効マーカー遺伝子の翻訳産物に特異的に結合する抗体を含むものであれば、免疫学的手法により薬効マーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより、抗ＩＬ−６受容体抗体による治療の有効性を予測することができる。この場合、本発明に係る診断薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ＥＬＩＳＡプレート、ブロッティング膜などをさらに含む診断用試薬キットとして提供することができる。 If the diagnostic agent according to the present invention contains an antibody that specifically binds to a translation product of a drug marker gene, anti-IL-6 receptor is obtained by measuring the expression level of the drug marker gene by an immunological technique. The effectiveness of treatment with body antibodies can be predicted. In this case, the diagnostic agent according to the present invention can be provided as a diagnostic reagent kit further comprising a labeled secondary antibody, a chromogenic substrate, a blocking solution, a washing buffer, an ELISA plate, a blotting membrane and the like.
以下、実施例にて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to this Example. Various modifications can be made without departing from the technical idea of the present invention.
ＲＡ患者におけるトシリズマブ（以下、ＴＣＺと略称する）治療への反応性を予測するためのバイオマーカーを、末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣｓと略称することがある）における網羅的遺伝子発現解析により同定することを試みた。 Biomarkers for predicting responsiveness to tocilizumab (hereinafter abbreviated as TCZ) treatment in RA patients are identified by comprehensive gene expression analysis in peripheral blood mononuclear cells (hereinafter sometimes abbreviated as PBMCs) Tried to do.
具体的には、ＴＣＺ治療を初めて受けるＲＡ患者の末梢血単核球を試料として用い、網羅的遺伝子発現解析を次のよう行った。 Specifically, using a peripheral blood mononuclear cell of an RA patient receiving TCZ treatment for the first time as a sample, a comprehensive gene expression analysis was performed as follows.
１．患者および健常人
２０１０年ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ ＲＡ分類基準（非特許文献１８）を満たし、且つＣＤＡＩ（非特許文献１９）が１０以上であるＲＡ患者であって、ＴＣＺ治療を初めて受ける患者を継続的に募った。４０症例のＲＡ患者を候補遺伝子の同定のためのトレーニングコホートとし、一方、別の２０症例のＲＡ患者をそれら遺伝子の予測値を確認するためのバリデーションコホートとして採用した。患者は、日常的臨床ケアを受け、そして、治療開始前（以下、ベースライン時と称する）、並びにＴＣＺ治療の開始後３ヶ月目および６ヶ月目に臨床的および検査的な評価を受けた。関節炎症状のない健常人を対照として採用した。研究デザインは千葉大学倫理委員会により承認されたものであり、ヘルシンキ宣言に則って解析対象者から書面による同意書を得ている。
1. Patients and healthy individuals Continuously receiving patients with RA who satisfy the 2010 ACR / EULAR RA classification standard (Non-patent Document 18) and have a CDAI (Non-patent Document 19) of 10 or more and receive TCZ treatment for the first time Recruited. Forty RA patients were employed as a training cohort for identification of candidate genes, while another 20 RA patients were employed as a validation cohort for confirming the predicted values of those genes. Patients received routine clinical care and received clinical and laboratory evaluations before treatment initiation (hereinafter referred to as baseline) and at 3 and 6 months after initiation of TCZ treatment. A healthy person without joint inflammation was used as a control. The research design was approved by the Chiba University Ethics Committee, and written consent was obtained from the analysts in accordance with the Declaration of Helsinki.
２．臨床的および検査的な評価
臨床的および検査的な評価は、２８関節の腫脹関節数および疼痛関節数、医師および患者の総合的評価のための視覚的評価スケール（ＶＡＳ）、健康度評価質問票障害指数（ＨＡＱ−ＤＩ）、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）、およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）について行った。リウマトイド因子（ＲＦ）および抗環状シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は、ベースライン時にのみ検討した。
2. Clinical and laboratory evaluations Clinical and laboratory evaluations consisted of 28 joints and painful joints, a visual assessment scale (VAS) for comprehensive assessment of physicians and patients, health assessment questionnaire Disorder index (HAQ-DI), erythrocyte sedimentation rate (ESR), and C-reactive protein (CRP) were performed. Rheumatoid factor (RF) and anti-cyclic citrullinated protein antibody (ACPA) were considered only at baseline.
３．ＴＣＺ治療に対する反応の評価
ＴＣＺによるＩＬ−６遮断療法は、治療反応に関わらず、ＥＳＲや血清ＣＲＰなどの急性炎症マーカーを実質的に低減するため、ＡＣＲ反応判定基準やＥＵＬＡＲ反応判定基準などのこれらマーカーを含む反応判定基準は本研究では採用しなかった。その代わりに、ＴＣＺ治療に対する臨床反応は、主として医師の６ヶ月目の総合評価（良好／中等度／無反応）により決定した。この評価の決定は、１１名の医師および２名のリウマチ学者の間で、網羅的臨床情報を概観することにより得られた合意によって行った。６ヶ月目のＣＤＡＩカテゴリー（高度／中等度／低度の疾病活動度または緩解）も、医師の総合評価を補足するために使用した。
3. Evaluation of response to TCZ treatment IL-6 blocking therapy with TCZ substantially reduces acute inflammatory markers such as ESR and serum CRP regardless of treatment response, so these criteria such as ACR response criteria and EULAR response criteria Response criteria including markers were not adopted in this study. Instead, the clinical response to TCZ treatment was determined primarily by the physician's comprehensive assessment at 6 months (good / moderate / no response). This assessment decision was made by agreement between 11 physicians and 2 rheumatologists gained by reviewing comprehensive clinical information. The 6 month CDAI category (high / moderate / low disease activity or remission) was also used to supplement the physician's overall assessment.
４．ＤＮＡマイクロアレイ解析
ヘパリン採血試料より末梢血中の単核球を分離し、その遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。ＤＮＡアレイ解析用試料を採取後、速やかにＴＣＺ８ｍｇ／ｋｇ／４週間の加療を開始し、６ヶ月後に医師総合評価により治療効果判定を行った。
4). DNA microarray analysis Mononuclear cells in peripheral blood were separated from heparin blood samples, and gene expression was comprehensively analyzed using DNA microarrays. After collecting a sample for DNA array analysis, treatment of TCZ 8 mg / kg / 4 weeks was started promptly, and after 6 months, the therapeutic effect was judged by comprehensive evaluation by a doctor.
具体的には、ＰＢＭＣｓの分離は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＭＩＵＭ １．０７３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。ＰＢＭＣｓの分離は、ベースライン時には、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの両方、並びに健常対照について実施し、また、３ヶ月目にはトレーニングコホートについて実施した。ＰＢＭＣから細胞総ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ溶液（Ｎｉｐｐｏｎ ＧＥＮＥ Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。トレーニングコホートおよび健常対照において、ＤＮＡマイクロアレイ解析を、Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＷｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ４×４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して製造説明書に従って実施した。マイクロアレイデータは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ１１．５．１ソフトウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して分析した。シグナル強度は、各データを７５パーセンタイルベースラインに調整することにより正規化した。 Specifically, PBMCs were separated using Ficoll-Paque PRMIUM 1.073 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden). Separation of PBMCs was performed at baseline for both the training and validation cohorts and healthy controls, and at month 3 for the training cohort. Cell total RNA was extracted from PBMC using ISOGEN solution (Nippon GENE Co., LTD, Tokyo, Japan). In training cohorts and healthy controls, DNA microarray analysis was performed using Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Calif.) And Whole Human Genome DNA Microarray 4 × 44K (Agilent Inc., Agilent Technologies). Carried out. Microarray data was analyzed using GeneSpring GX11.5.1 software (Agilent Technologies Inc.). Signal intensity was normalized by adjusting each data to the 75th percentile baseline.
５．リアルタイム定量的ＰＣＲ解析
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応解析（以下、ｑＰＣＲと略称する）を、ベースライン時に、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの両方について実施した。本解析は、ＴＣＺ治療に対する無反応例と反応例との間で、上記ＤＮＡマイクロアレイ解析における発現レベルに有意な差異が認められた１８遺伝子について実施した。プライマーは、表１に記載のプライマーセットを使用した。抽出ＲＮＡの逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して行った。発現レベルはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により標準手順書を使用して測定した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルを内因性コントロールとして用い、データを正規化した。
5. Real-time quantitative PCR analysis Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis (hereinafter abbreviated as qPCR) was performed at baseline for both the training and validation cohorts. This analysis was performed on 18 genes in which a significant difference was observed in the expression level in the DNA microarray analysis between the non-responsive case and the reactive case with respect to TCZ treatment. The primer set shown in Table 1 was used as the primer. Reverse transcription of the extracted RNA was performed using iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Expression levels were measured using standard procedures with an ABI PRISM 7300 instrument (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). The expression level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an endogenous control to normalize the data.
６．統計解析
統計解析は、ＳＰＳＳ バージョン２１．０（ＩＢＭ Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。正規分布の連続型データは平均値および標準偏差（ＳＤｓ）を用いてまとめ、パラメトリック検定、具体的には二標本ｔ検定（２つの変数が等しいと考えられないときはウエルチのｔ検定）または対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して解析した。非正規分布データは中央値および四分位数範囲（ＩＱＲｓ）を用いてまとめ、非パラメトリック検定（マン・ホイットニーのＵ検定）を使用して解析した。多変量解析はロジスティック回帰モデルを使用して実施した。０．０５より小さいＰ値を有意差があると看做した。
6). Statistical analysis Statistical analysis was performed using SPSS version 21.0 (IBM Japan, Tokyo, Japan). Continuous data of normal distribution are summarized using mean values and standard deviations (SDs), parametric test, specifically two-sample t-test (Welch t-test when two variables are not considered equal) or corresponding Analysis was performed using a paired t-test. Non-normal distribution data were summarized using median and quartile ranges (IQRs) and analyzed using non-parametric tests (Mann-Whitney U test). Multivariate analysis was performed using a logistic regression model. P values less than 0.05 were considered significant.
７．結果
７．１ 患者および疾患の特徴
トレーニングコホートおよびバリデーションコホートの患者の特徴および疾患の特徴を表２に示す。患者は全て日本人であり、それぞれ、平均年齢が５８．４歳および６０．９歳、女性が７７．５％および８８．０％、疾患期間の中央値が５７．５ヶ月および４４．５ヶ月である。７２．５％および７５．０％がメトトレキサート（ＭＴＸ）を服用し（投与量中央値は毎週８ｍｇおよび６．７５ｍｇ）、そして５７．５％および５５．０％がコルチコステロイドを服用していた（プレドニソロンの投与量中央値が毎日３．８７５ｍｇおよび１ｍｇ）。ＴＮＦアンタゴニストは患者の３７．５％および３３．３％に投与されていた。トレーニングコホートの患者の１人は、ＴＣＺ治療を開始する以前に、リツキシマブの投与を悪性リンパ腫の治療処方計画の一環として４年前に受けていた。その他の生物学的薬剤は従前には使用されていなかった。
7). Results 7.1 Patient and Disease Characteristics Table 2 shows the patient and disease characteristics of the training and validation cohorts. Patients are all Japanese, with average ages of 58.4 and 60.9 years, females of 77.5% and 88.0%, and median duration of disease of 57.5 and 44.5 months, respectively. It is. 72.5% and 75.0% were taking methotrexate (MTX) (median doses 8 mg and 6.75 mg weekly) and 57.5% and 55.0% were taking corticosteroids (The median dose of prednisolone is 3.875 mg and 1 mg daily). TNF antagonists were administered to 37.5% and 33.3% of patients. One patient in the training cohort had received rituximab four years ago as part of a treatment regimen for malignant lymphoma before starting TCZ treatment. Other biological agents have not been used before.
表２に示すＰ値は、無反応例と反応例との差異を二標本ｔ検定、マン・ホイットニー−Ｕ検定、カイ二乗検定、またはフィッシャーの正確確率検定を使用して算出した。表１中、ＳＤは標準偏差、ＩＱＲは四分位数範囲、ＡＣＰＡは抗シトルリン化タンパク質抗体、ＣＤＡＩは臨床疾患活動度指数、ＥＳＲは赤血球沈降速度、ＣＲＰはＣ反応性タンパク質、ＤＡＳ２８は疾患活動性スコア２８、ＭＭＰ−３はマトリックスメタロプロテイナーゼ−３、ＭＴＸはメトトレキサートを意味する。 The P values shown in Table 2 were calculated by using a two-sample t-test, Mann-Whitney-U test, Chi-square test, or Fisher exact test for the difference between the non-responding example and the responding example. In Table 1, SD is standard deviation, IQR is quartile range, ACPA is anti-citrullinated protein antibody, CDAI is clinical disease activity index, ESR is erythrocyte sedimentation rate, CRP is C-reactive protein, DAS28 is disease activity Sex score 28, MMP-3 means matrix metalloproteinase-3, MTX means methotrexate.
本研究に登録された１３人の健常提供者は、年齢の平均±ＳＤが４７．５±８．３歳であり、１０人（７６．９％）が女性であった。 The 13 healthy donors enrolled in the study had an average age ± SD of 47.5 ± 8.3 years and 10 (76.9%) were female.
７．２ ＴＣＺ治療に対する反応
トレーニングコホートでは、医師の総合評価に基づくと、２９症例で６ヶ月間のＴＣＺ治療により良好または中等度の反応を認めたが、８症例では反応は認められなかった。１症例が頸椎症の急性増悪により外科手術を要したことから脱落し、２症例がＴＣＺ投与のための来院予定を遵守しなかったことから脱落した。
7.2 Response to TCZ treatment In the training cohort, 29 cases showed a good or moderate response to TCZ treatment for 6 months, but no response was seen in 8 cases. One case dropped out because it required surgery due to an acute exacerbation of cervical spondylosis, and two cases dropped out because they did not comply with the visit schedule for TCZ administration.
バリデーションコホートでは、全症例について解析適格性を認めた。１５症例で良好または中等度の反応を認めたが、５症例では反応を認めなかった。 In the validation cohort, all cases were eligible for analysis. 15 cases had a good or moderate response, but 5 cases had no response.
医師の総合評価により反応例であると決定された症例では、無反応例と比較して、ＣＤＡＩ測定において顕著または数値的に大きな改善を認めた。その差異はバリデーションコホートにおける有意差よりは小さかったが、これは症例数が少なかったことに起因する（表３）。ＣＤＡＩ分類は、トレーニングコホートの２９症例の反応例のうち２８症例、ならびにバリデーションコホートの１５症例の反応例の全てにおいて改善し、例えば、ＣＤＡＩの中等度から低度への改善が認められた。 In cases determined to be a response example by a comprehensive evaluation by a doctor, a marked or numerically significant improvement was observed in CDAI measurement compared to a non-response case. The difference was smaller than the significant difference in the validation cohort, but this is due to the small number of cases (Table 3). CDAI classification improved in 28 of 29 response cases in the training cohort, and in all 15 response cases in the validation cohort, for example, an improvement from moderate to low in CDAI.
表３は、トレーニングコホートおよびバリデーションコホートにおける、ベースラインおよび６ヶ月間のＴＣＺ治療後のＣＤＡＩの変動を示す。変動の値は平均±標準偏差で示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、二標本ｔ検定で有意差があることを示す。 Table 3 shows the variation in CDAI after TCZ treatment at baseline and 6 months in the training and validation cohorts. The value of variation is shown as mean ± standard deviation. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 indicates that there is a significant difference in the two-sample t-test.
７．３ 無反応例と反応例との間の、患者特性および疾患特性の差異
表１に示したように、ベースライン時の患者特性および疾患特性についての、無反応例と反応例との間の差異は、トレーニングコホートでもバリデーションコホートでも認められなかった。
7.3 Differences in patient and disease characteristics between non-responders and responders, as shown in Table 1, between non-responders and responders for baseline patient and disease characteristics This difference was not observed in the training or validation cohorts.
７．４ 候補遺伝子の同定
８症例の無反応例および２９症例の反応例において、１９，４１６遺伝子に対する４１，０００プローブのシグナル強度の値を取得した。まず、全ての検体でバックグランドレベルのシグナル強度（＜１００ 相対蛍光単位）であった５，７５５遺伝子に対する１５，５６４プローブを除外した。次に、次の２条件を満たす４０９プローブを同定した：正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異に関する二標本ｔ検定のＰ値が０．０５より小さい（＜０．０５）；正規化されたシグナル強度の、無反応例と反応例との間の差異が１．５倍より大きい（＞１．５倍）。
7.4 Identification of Candidate Genes Signal intensity values of 41,000 probes for 19,416 genes were obtained in 8 cases of no response and 29 cases of response. First, 15,564 probes for 5,755 genes that had background level signal intensity (<100 relative fluorescence units) in all samples were excluded. Next, a 409 probe that satisfies the following two conditions was identified: the P-value of the two-sample t-test for the difference between normalized and non-responding cases was less than 0.05 (<0.05); the difference in normalized signal intensity between non-responders and responders is greater than 1.5 times (> 1.5 times).
図１は、これら４０９プローブの正規化されたシグナル強度のヒートマップおよび階層的クラスター解析を示す。無反応例の遺伝子発現パターンが同じブランチにクラスター化されたことから、これら一組の遺伝子は、ＴＣＺ治療により改善すると予想されない患者を同定するための高感度のバイオマーカーになり得ることが示唆される。 FIG. 1 shows a normalized signal intensity heat map and hierarchical cluster analysis of these 409 probes. The gene expression pattern of non-responsive cases was clustered in the same branch, suggesting that these sets of genes could be sensitive biomarkers for identifying patients who are not expected to improve with TCZ treatment. The
次に、候補遺伝子を、次の３条件を適用することにより、６８プローブに絞った：ＣＤＡＩ分類の変化により測定された、無反応例と反応例との間の差異に関する二標本ｔ検定のＰ値が０．０５より小さい（＜０．０５）；ＣＤＡＩ分類の変化により測定された、無反応例と反応例との間の差異が１．５倍より大きい（＞１．５倍）；正規化されたシグナル強度の平均（ｌｏｇ２スケール）が無反応例と反応例のどちらかで０より大きい（＞０）。 Next, the candidate genes were narrowed down to 68 probes by applying the following three conditions: P of the two-sample t-test for the difference between unresponsive and reactive cases as measured by changes in the CDAI classification Values less than 0.05 (<0.05); the difference between non-responders and responders is greater than 1.5 times (> 1.5 times) as measured by changes in CDAI classification; normal The average of the normalized signal intensity (log 2 scale) is greater than 0 (> 0) in either the unresponsive case or the reactive case.
続いて、１９遺伝子を代表する２３プローブを選択した（表４）。これら遺伝子は、次のいずれかの判定基準により選択した：複数プローブが確認された遺伝子、例えば、ＲＡＢＧＥＦ１；同じファミリーに属する複数遺伝子、例えば、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｌ、およびＭＴ１Ａ；免疫／炎症反応に直接的に関与する遺伝子、例えば、ＩＬ−２７。 Subsequently, 23 probes representing 19 genes were selected (Table 4). These genes were selected according to any of the following criteria: genes with multiple probes identified, eg, RABGEF1; multiple genes belonging to the same family, eg, MT1G, MT1L, and MT1A; direct to immune / inflammatory response A gene involved in IL-27, such as IL-27.
表４は、トレーニングコホートにおける無反応例と反応例の比較により同定された候補ＤＮＡマイクロアレイプローブを示す。候補遺伝子はアルファベット順に列記した。†は二標本ｔ検定を、‡はピアソンの相関計数を示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、有意差があることを示す。ＳＤは標準偏差、ｑＰＣＲはリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＤは未測定、Ｕｐは上方制御、Ｄｏｗｎは下方制御を意味する。 Table 4 shows candidate DNA microarray probes identified by comparison of non-responding and responding examples in the training cohort. Candidate genes are listed in alphabetical order. † indicates a two-sample t-test, ‡ indicates a Pearson correlation count, and * P <0.05, ** P <0.01, and *** P <0.001 indicate that there is a significant difference. SD means standard deviation, qPCR means real-time quantitative polymerase chain reaction, ND means unmeasured, Up means up-regulation, Down means down-regulation.
７．５ ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度とｑＰＣＲ解析により測定された相対的発現との相関
１９遺伝子の相対的発現を、ランダムに選択した１０検体のｃＤＮＡ試料を使用して、ｑＰＣＲ解析により評価し、そしてＤＮＡマイクロアレイシグナル強度と比較した。ＭＴ１Ｂについては、いかなる別個のプライマーセットを使用しても、意味のある増幅曲線は得られなかった。残りの１８遺伝子のうち、ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度とｑＰＣＲ解析により測定された相対的発現との間で統計的有意差異のある相関が確認されたのは１５遺伝子であった（表２、右の２列）。
7.5 Correlation between DNA microarray signal intensity and relative expression measured by qPCR analysis The relative expression of 19 genes was evaluated by qPCR analysis using 10 randomly selected cDNA samples and DNA Comparison with microarray signal intensity. For MT1B, no meaningful amplification curve was obtained using any separate primer set. Of the remaining 18 genes, 15 genes were confirmed to have a statistically significant correlation between the DNA microarray signal intensity and the relative expression measured by qPCR analysis (Table 2, 2 on the right). Column).
７．６ 独立のコホートにおける無反応例と反応例との間で差異のある遺伝子発現の検証
これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現レベルの差異を、バリデーションコホートにおける無反応例と反応例との間で比較した。図２は、相対的発現レベルのヒートマップとそれらパターンの階層化を示している。無反応例の遺伝子発現パターンが同じブランチにクラスター化されたことから、これら遺伝子がＴＣＺ治療により改善すると予想されない患者を同定するための高感度のバイオマーカーになり得ることが再度示唆される。これら１５遺伝子のうち、バリデーションコホートの反応例において顕著に高い発現レベルが再現されたのは次の４遺伝子であった：ＩＦＩ６、ＭＴ１Ｇ、ＭＸ２、およびＯＡＳＬ（表５）。
7.6 Verification of differential gene expression between non-responders and responders in an independent cohort Comparison of the expression levels of these genes in PBMCs between non-responders and responders in the validation cohort did. FIG. 2 shows a heat map of relative expression levels and a hierarchization of those patterns. The gene expression patterns of the non-responsive cases were clustered in the same branch, again suggesting that these genes could be sensitive biomarkers for identifying patients who are not expected to improve with TCZ treatment. Of these 15 genes, the following 4 genes were reproduced with significantly higher expression levels in the validation cohort reaction examples: IFI6, MT1G, MX2, and OASL (Table 5).
表５は、バリデーションコホートにおける無反応例と反応例の間の、候補遺伝子のベースライン時の相対発現の差異を示す。候補遺伝子はアルファベット順に列記した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、有意差があることを示す。ＳＤは標準偏差を意味する。 Table 5 shows the differences in the relative expression of candidate genes at baseline between non-responding and responding examples in the validation cohort. Candidate genes are listed in alphabetical order. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 indicates that there is a significant difference. SD means standard deviation.
７．７ 健常対照とＲＡ患者との間、および、ＴＣＺ治療の前後での比較
同定された４遺伝子の正規化ＤＮＡマイクロアレイシグナル強度は、ＴＣＺ治療に対して反応したＲＡ患者で健常患者と比較して顕著に高かった（図３）。さらに、正規化シグナル強度は、反応例において３ヶ月間のＴＣＺ治療後に減少する傾向が認められたが、無反応例では認められなかった（図３）。これらデータは、これら遺伝子のＰＢＭＣｓでの発現がＴＣＺ治療に反応すると予想されるＲＡ患者で概ね増加していることを示すものである。
7.7 Comparison between healthy controls and RA patients and before and after TCZ treatment The identified 4 gene normalized DNA microarray signal intensity was compared with RA patients who responded to TCZ treatment compared to healthy patients. Was significantly higher (FIG. 3). Furthermore, the normalized signal intensity tended to decrease after 3 months of TCZ treatment in response cases, but not in non-response cases (FIG. 3). These data indicate that the expression of these genes in PBMCs is generally increased in RA patients expected to respond to TCZ treatment.
７．８ ＴＣＺ治療に対する臨床反応の予測モデル
予測値の評価および最適カットオフレベルの設定を行うために、ＲＯＣ解析を、同定した４遺伝子のそれぞれについて実施した。バリデーションコホートにおいてＴＣＺ治療に中等度から良好な反応を予測するためのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣｓ）は、それぞれ、ＩＦＩ６については０．６９３、ＭＴ１Ｇについては０．９２０、ＭＸ２については０．８１３、そしてＯＡＳＬについては０．６２７であった（表６）。
7.8 Predictive model of clinical response to TCZ treatment In order to evaluate the predictive value and set the optimal cut-off level, ROC analysis was performed for each of the four genes identified. The area under the ROC curve (AUCs) to predict a moderate to good response to TCZ treatment in the validation cohort is 0.693 for IFI6, 0.920 for MT1G, 0.813 for MX2, and The OASL was 0.627 (Table 6).
表６は、バリデーションコホートにおいてＴＣＺ治療に中等度から良好な反応を予測するための、各遺伝子および合計スコアに関するＲＯＣ解析および診断値を示す。†ＲＯＣ解析は各遺伝子の相対発現レベルについて実施した。‡ＲＯＣ解析は含まれる遺伝子の合計スコアについて実施した。ＲＯＣは反応受信者動作特性、ＡＵＣは曲線下面積、ＰＰＶは陽性予測値、ＮＰＶは陰性予測値を意味する。 Table 6 shows the ROC analysis and diagnostic values for each gene and total score to predict a moderate to good response to TCZ treatment in the validation cohort. † ROC analysis was performed on the relative expression level of each gene. ‡ ROC analysis was performed on the total score of the included genes. ROC means response receiver operating characteristics, AUC means area under the curve, PPV means positive predictive value, and NPV means negative predictive value.
次に、バリデーションコホートにおけるＴＣＺ治療に対する中等度から良好な反応について、同定した遺伝子の独立の予測値を設定するために、多変量ロジスティック回帰解析を実施した。しかしながら、連続変数も二分変数も、おそらく試料数が少ないことに起因して、有意な予測変数として確認されなかった。 Next, multivariate logistic regression analysis was performed to establish independent predictors of the identified genes for moderate to good response to TCZ treatment in the validation cohort. However, neither continuous nor dichotomous variables were identified as significant predictors, probably due to the small number of samples.
そこで、それぞれの遺伝子に対して、カットオフ値より上の高い相対的発現を示した場合に１ポイントを等しく割り当て、これらポイントを合計することにより総合スコアを算出した。４遺伝子の可能性ある組み合わせの全てについての総合スコアの予測値を表４に示す。ＭＴ１ＧおよびＭＴＸ２を含む総合スコアまたはＭＴ１Ｇ、ＭＸ２およびＯＡＳＬを含む総合スコアが、最も大きいＡＵＣ０．９４７を、２以上のカットオフ値で与えた。バリデーションコホートにおけるＴＣＺ治療への中等度から良好な反応について、これらモデルの陽性予測値および陰性予測値はそれぞれ１００％および５５．６％であった。 Therefore, for each gene, 1 point was equally assigned when high relative expression above the cut-off value was shown, and the total score was calculated by summing these points. Table 4 shows the predicted value of the total score for all possible combinations of 4 genes. The overall score including MT1G and MTX2 or the total score including MT1G, MX2 and OASL gave the largest AUC 0.947 with a cutoff value of 2 or more. For moderate to good response to TCZ treatment in the validation cohort, the positive and negative predictive values for these models were 100% and 55.6%, respectively.
本発明に係る方法を用いれば、ＲＡ患者における抗ＩＬ−６受容体抗体治療の有効性をその開始前に確認した上で、該治療を実施することができる。その結果、例えば、当該治療の有効性が見込める患者に対しては、該治療を適用し、有効性が見込めない患者に対しては治療方針を変更するなど、治療方針の選択判断が可能となる。したがって、本発明に係る方法は、当該治療の有効性が見込めない患者にとって、該治療を受けることによる損傷の進行や副作用に関する不必要なリスクを避けることができると共に、不要な費用の発生を防止することができる。さらに、無駄な薬剤の使用を抑え、医療経済にも大きく貢献する。 By using the method according to the present invention, the effectiveness of anti-IL-6 receptor antibody treatment in RA patients can be confirmed before the start thereof, and then the treatment can be carried out. As a result, for example, the treatment policy can be selected and judged by applying the treatment to a patient who can expect the effectiveness of the treatment and changing the treatment policy for a patient who cannot expect the effectiveness. . Therefore, the method according to the present invention can avoid unnecessary risks related to the progression of damage and side effects caused by receiving the treatment for patients who cannot expect the effectiveness of the treatment, and prevents the generation of unnecessary costs. can do. In addition, it reduces the use of useless drugs and greatly contributes to the medical economy.
配列番号１：メタロチオネイン １Ｇ（ＭＴ１Ｇ）遺伝子
配列番号３：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号５：インターフェロンα−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）遺伝子
配列番号７：ミクソウイルス耐性２（ＭＸ２）遺伝子
配列番号９：２´−５´−オリゴアデニレートシンテターゼ様（ＯＡＳｌ）遺伝子
配列番号１１：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１２：ＣＣＬ３Ｌ３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１３：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１４：ＣＣＬ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１５：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１６：ＣＤ８３遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１７：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１８：ＣＸＣＲ４遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号１９：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２０：ＦＯＳＬ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２１：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２２：ＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２３：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２４：ＨＰＲ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２５：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２６：ＩＦＩ６遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２７：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２８：ＩＬ２７遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号２９：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３０：ＬＹ６Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３１：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３２：ＭＴ１Ｇ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３３：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３４：ＭＴ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３５：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３６：ＭＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３７：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３８：ＭＸ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号３９：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４０：ＯＡＳＬ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ＲＡＢＧＥＦ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ＴＨＢＳ１遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
配列番号４６：ＷＡＲＳ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマー用オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 1: Metallothionein 1G (MT1G) gene SEQ ID NO: 3: Interferon α-inducible protein 6 (IFI6) gene SEQ ID NO: 5: Interferon α-inducible protein 6 (IFI6) gene SEQ ID NO: 7: Myxovirus resistance 2 (MX2) ) Gene SEQ ID NO: 9: 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like (OASl) gene SEQ ID NO: 11: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of CCL3L3 gene SEQ ID NO: 12: nucleotide sequence of CCL3L3 gene Primer oligonucleotide designed based on SEQ ID NO: 13: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of CCL4 gene SEQ ID NO: 14: Designed based on nucleotide sequence of CCL4 gene Primer oligonucleotide SEQ ID NO: 15: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of CD83 gene SEQ ID NO: 16: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of CD83 gene SEQ ID NO: 17: nucleotide of CXCR4 gene Primer oligonucleotide designed based on sequence SEQ ID NO: 18: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of CXCR4 gene SEQ ID NO: 19: Primer oligonucleotide sequence designed based on nucleotide sequence of FOSL2 gene No. 20: oligonucleotide for primer designed based on nucleotide sequence of FOSL2 gene SEQ ID NO: 21 based on nucleotide sequence of HP gene Designed oligonucleotide for primer SEQ ID NO: 22: Designed for oligonucleotide based on nucleotide sequence of HP gene SEQ ID NO: 23: Designed oligonucleotide for primer based on nucleotide sequence of HPR gene SEQ ID NO: 24: HPR Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of gene SEQ ID NO: 25: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of IFI6 gene SEQ ID NO: 26: Primer designed based on nucleotide sequence of IFI6 gene Oligonucleotide SEQ ID NO: 27: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of IL27 gene SEQ ID NO: 28: Set based on nucleotide sequence of IL27 gene Primer oligonucleotide SEQ ID NO: 29: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of LY6E gene SEQ ID NO: 30: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of LY6E gene SEQ ID NO: 31: MT1G Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of gene SEQ ID NO: 32: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of MT1G gene SEQ ID NO: 33: Primer designed based on nucleotide sequence of MT1L gene Oligonucleotide SEQ ID NO: 34: Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of MT1L gene SEQ ID NO: 35: Based on the nucleotide sequence of MT2A gene Oligonucleotide designed for primer SEQ ID NO: 36: Oligonucleotide for primer designed based on nucleotide sequence of MT2A gene SEQ ID NO: 37: Oligonucleotide for primer designed based on nucleotide sequence of MX2 gene SEQ ID NO: 38 Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of MX2 gene SEQ ID NO: 39: Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of OASL gene SEQ ID NO: 40: Primer designed based on the nucleotide sequence of OASL gene Oligonucleotide SEQ ID NO: 41: Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of RABGEF1 gene SEQ ID NO: 42: Nucleotide of RABGEF1 gene Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence SEQ ID NO: 43: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of THBS1 gene SEQ ID NO: 44: Primer oligonucleotide designed based on nucleotide sequence of THBS1 gene SEQ ID NO: 45: Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of the WARS gene SEQ ID NO: 46: Primer oligonucleotide designed based on the nucleotide sequence of the WARS gene
Claims (7)
（Ａ）ＭＴ１Ｇ
（Ｂ）ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２
（Ｃ）ＩＦ１６＋ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２
（Ｄ）ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２＋ＯＡＳＬ
（Ｅ）ＩＦ１６＋ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２＋ＯＡＳＬ
A method for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, comprising: (1) in a peripheral blood mononuclear cell sample isolated from a patient with rheumatoid arthritis, from the following drug efficacy marker genes: Measuring the expression level of the gene according to at least one group selected from the groups (A) to (E) , and (2) the expression level of the gene measured in the above (1) and the resistance against rheumatoid arthritis Correlating the efficacy of treatment with a human IL-6 receptor antibody.
(A) MT1G
(B) MT1G + MX2
(C) IF16 + MT1G + MX2
(D) MT1G + MX2 + OASL
(E) IF16 + MT1G + MX2 + OASL
In (2), correlating the measured gene expression level with the effectiveness of treatment with an anti-human IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis is to cut the measured gene expression level and the expression level of the gene The method of claim 1, wherein the method is performed by comparison with an off value.
The method for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis according to claim 1 or 2, wherein the anti-IL-6 receptor antibody is tocilizumab.
（Ａ）ＭＴ１Ｇ
（Ｂ）ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２
（Ｃ）ＩＦ１６＋ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２
（Ｄ）ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２＋ＯＡＳＬ
（Ｅ）ＩＦ１６＋ＭＴ１Ｇ＋ＭＸ２＋ＯＡＳＬ
A nucleic acid probe or nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of a gene described in at least one group selected from the group (A) to (E) consisting of the following drug efficacy marker genes or a complementary nucleic acid thereof; or In order to predict the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, comprising an antibody that specifically binds to a translation product of at least one set or one gene selected from the group consisting of the drug efficacy marker genes Diagnostics.
(A) MT1G
(B) MT1G + MX2
(C) IF16 + MT1G + MX2
(D) MT1G + MX2 + OASL
(E) IF16 + MT1G + MX2 + OASL
The diagnostic agent of Claim 4 whose said anti- IL-6 receptor antibody is tocilizumab.
Effectiveness of treatment with anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis further comprising the nucleic acid probe or nucleic acid primer, or the reagent for detecting the antibody, in addition to the diagnostic agent according to claim 4 or claim 5. Diagnostic reagent kit for predicting
（ｉ）配列番号３１に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３２に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号２６に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、
（ｉｉｉ）配列番号３７に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号３８に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット、並びに
（ｉｖ）配列番号３９に記載のヌクレオチド配列で表される核酸および配列番号４０に記載のヌクレオチド配列で表される核酸からなるプライマーセット。
A diagnostic reagent kit for predicting the effectiveness of treatment with an anti-IL-6 receptor antibody against rheumatoid arthritis, comprising at least one primer set selected from the following primer sets:
(I) a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 32;
(Ii) a primer set comprising a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 26;
(Iii) a primer set consisting of a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 37 and a nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 38, and (iv) represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39 And a primer set comprising the nucleic acid represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 40.
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