JP6338206B2 - Anti-Helicobacter heilmannii - Google Patents
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Description
本発明は、Helicobacter Heilmannii（以下、H.heilmanii、又は、ヘリコバクター・ハイルマニーという場合がある。）に対し、胃内菌数減少作用あるいは除菌作用を有することを特徴とするラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又は乳酸菌培養物を有効成分とする抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤に関する。
さらに詳しくは、前記ラクトバチルス属に属する乳酸菌がLactobacillus gasseri（以下、L.gasseri、又は、ラクトバチルス・ガセリという場合がある）である抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤に関する。
The present invention relates to a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus characterized by having an action of reducing the number of bacteria in the stomach or a sterilizing action against Helicobacter Heilmannii (hereinafter sometimes referred to as H. heilmanii or Helicobacter heilmannii) And / or an anti-Helicobacter heilmannii agent comprising a lactic acid bacteria culture as an active ingredient.
More specifically, the present invention relates to an anti-Helicobacter heilmanii agent in which the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus is Lactobacillus gasseri (hereinafter sometimes referred to as L. gasseri or Lactobacillus gasseri ).
従来、胃潰瘍は精神的ストレス等が引き金となって発生すると言われていたが、1983年にマーシャル(Marshall B,J,)らによって初めて慢性胃炎患者よりHelicobacter pyroli（以下、H.pyroli、又は、ヘリコバクター・ピロリという場合がある。）が分離培養され、本発見以降、胃炎、胃潰瘍の一部はヘリコバクター・ピロリの感染によって起こることが明らかとなった（非特許文献１参照）。ヘリコバクター・ピロリはヒトで経口により感染すると考えられている。開発途上国では小児期に既に70−80％以上の高い感染率を示す。一方、先進国では途上国よりは感染率は低い。我が国のヘリコバクター・ピロリ感染率は若年者では先進国型で10−40％程であるが、40歳以上の成人では開発途上国型であり高い感染率（80％以上）を示す。これらは昭和30年までの良好でない衛生状況の中で育ったことが理由のひとつであろうと言われている。 Traditionally, gastric ulcers were said to be triggered by mental stress, etc., but in 1983, for the first time by Marshall (Marshall B, J,) et al., Helicobacter pyroli (hereinafter referred to as H.pyroli or Helicobacter pylori is sometimes isolated and cultured, and since this discovery, it has become clear that some gastritis and gastric ulcers are caused by Helicobacter pylori infection (see Non-Patent Document 1). Helicobacter pylori is thought to be orally transmitted in humans. In developing countries, high infection rates of over 70-80% are already present in childhood. On the other hand, infection rates are lower in developed countries than in developing countries. The infection rate of Helicobacter pylori in Japan is about 10-40% in the developed countries for young people, but it is a developing country type for adults over 40 years of age and shows a high infection rate (over 80%). It is said that one of the reasons is that they grew up in the poor hygiene situation until 1955.
1995年に、日本消化器学会よりヘリコバクター・ピロリ除菌ガイドラインが出され、2000年には、日本ヘリコバクター学会より「ヘリコバクター・ピロリ感染の診断と治療ガイドライン」が発表されている。ヘリコバクター・ピロリ感染の診断及び治療については、2000年11月に、胃潰瘍と十二指腸潰瘍の治療で国内保険適用となり、2010年には、胃MALTリンパ腫、特発性血小板減少性紫斑病および早期胃がんESDが追加適応された。 Helicobacter pylori eradication guidelines were issued by the Japanese Society of Gastroenterology in 1995, and in 2000, "Diagnosis and Treatment Guidelines for Helicobacter pylori Infection" was published by the Japan Helicobacter Pylori Society. Regarding the diagnosis and treatment of Helicobacter pylori infection, in November 2000, domestic insurance was applied for the treatment of gastric and duodenal ulcers.In 2010, gastric MALT lymphoma, idiopathic thrombocytopenic purpura and early gastric cancer ESD were diagnosed. Added adaptation.
疫学的調査の結果から、1994年に世界保健機構（WHO）にてヘリコバクター・ピロリが発がん性物質であると認定され、胃癌との関係が注目されるようになった。一方、ヘリコバクター・ピロリ陰性にもかかわらず、胃炎や胃潰瘍となる症例も報告されたため、ヘリコバクター・ピロリ菌以外の類縁の感染菌の動態についても種々の検討が行なわれてきた。 As a result of epidemiological investigation, Helicobacter pylori was recognized as a carcinogen by the World Health Organization (WHO) in 1994, and its relationship with gastric cancer has attracted attention. On the other hand, although cases of gastritis and gastric ulcers were reported in spite of Helicobacter pylori negative, various studies have been conducted on the dynamics of related infectious bacteria other than Helicobacter pylori.
ヘリコバクター属細菌は30種類以上にも分類されるが、1994年には、それらのうちヘリコバクター・ハイルマニーが動物の胃内から感染菌として検出されたと報告されている（非特許文献２参照）。その後、モルグナー（Morgner A.）らにより、胃MALTリンパ腫とヘリコバクター・ハイルマニーの関連を示す研究結果（非特許文献３参照）が発表され、ヘリコバクター・ピロリ以外にも胃がんの原因菌が存在することが明らかとなった。 Helicobacter bacteria are classified into more than 30 types. In 1994, it was reported that Helicobacter heilmannii was detected as an infectious bacterium in the stomach of animals (see Non-Patent Document 2). Later, Morgner A. et al. Published a study result (see Non-Patent Document 3) showing the relationship between gastric MALT lymphoma and Helicobacter heilmannii, and that there are other causes of gastric cancer besides Helicobacter pylori. It became clear.
ヘリコバクター・ハイルマニーは、グラム陰性螺旋型桿菌であり、５〜７巻の螺旋を有する。両極に、10〜20本の鞭毛を有し、運動性があり、ウレアーゼ活性を有する。ヘリコバクター・ピロリ感染者の0.66％、ヘリコバクター・ハイルマニー感染者の1.47％に胃MALTリンパ腫が発生することが報告されている。（非特許文献４，５参照）。このような経過から、今後はヘリコバクター・ピロリとともに、ヘリコバクター・ハイルマニーの感染予防や除菌効果に関する研究の重要性が高まると考えられている。
Helicobacter heilmannii is a Gram-negative spiral gonococcus and has 5 to 7 spirals. Bipolar has 10-20 flagella, motility, and has urease activity. Gastric MALT lymphoma has been reported to occur in 0.66% of Helicobacter pylori-infected persons and 1.47% of Helicobacter heilmani-infected persons. (Refer
分類学的には、ヘリコバクター・ハイルマニーは、タイプ１から４に分類され、このうち、ヘリコバクター・ハイルマニー タイプ１が、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、サルにも感染する人畜共通感染症菌であることが明らかにされた（非特許文献６参照）。2008年には、ヒトから分離されたヘリコバクター・ハイルマニーとブタから分離された菌種をまとめて、新種ヘリコバクター・スイス（Helicobacter suis）としてInt J Syst Evol Microbiolに提案され（非特許文献７参照）、これらの菌がヒトの上部消化器感染や胃MALTリンパ腫発症原因菌となることが報告された（非特許文献８参照）。
ヘリコバクター・ハイルマニーとヘリコバクター・スイスは分類学的にも、疾病発症の原因菌としても、将来整理統合される可能性があるが、現時点では同種の菌と考えられるので、これらの菌種をヘリコバクター・ハイルマニーとして取り扱うのが妥当である。
Taxonomically, Helicobacter heilmannii is classified into
Helicobacter Heilmani and Helicobacter switzerland may be rearranged and integrated in the future, both taxonomically and as causative organisms for the onset of disease. It is reasonable to treat it as Hailmany.
ヒトから分離されるヘリコバクター・ハイルマニーは、in vitroでの培養方法は確立されておらず、in vivo（感染させたマウスの胃内）で菌の継代が行なわれているのみである（非特許文献３）。特許文献１では、基礎培地にカタラーゼ含む栄養培地を用いることにより、in vitroで、ヘリコバクター・ハイルマニーを培養可能にできるとされている。しかし、これらの方法でも、ヘリコバクター・ハイルマニーを長期に継代培養・維持することは依然として困難であり、本菌の検出および感染診断には、遺伝子レベルでの技術開発が急がれている。
In vitro culture methods have not been established for Helicobacter heilmannii isolated from humans, and only the passage of bacteria is performed in vivo (in the stomach of infected mice) (non-patented) Reference 3). In
ヘリコバクター・ハイルマニーはヘリコバクター・ピロリと異なり、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、サルにも感染する人畜共通感染症であり、ペットなどからヒトに感染する可能性がある。ヘリコバクター・ハイルマニー感染による、ペットからヒトへの感染予防ならびにヒトや動物における胃疾患消化器潰瘍やMALTリンパ種発症の予防および治療に用いるためにも、ヘリコバクター・ハイルマニー除菌活性を有する医薬や乳酸菌などの開発研究が必要となっている。
治療方法として、ヒトで胃潰瘍や胃MALTリンパ腫の原因となることが確認されているヘリコバクター・ピロリに対しては、クラリスロマイシン、アモキシシリン等の複数の抗生物質及びプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）の1週間投与による除菌方法が成果を上げている。しかし、ヘリコバクター・ハイルマニーに関しては、その感染経路およびヒトや動物における疾病との関連が明らかにされてきたが、培養や検出が困難な細菌であるため、詳細が調べられず、現在までに確立された抗菌物質や除菌方法は存在しない。また、マウスを用いた感染実験においてもヘリコバクター・ピロリの除菌法では、ヘリコバクター・ハイルマニーの完全な除菌は不可能であった（非特許文献９）。
なお、ヘリコバクター・ピロリに対しては、乳酸菌などの投与によって消化管内の菌数低減について開示されている（特許文献２、３参照）。しかし、ヘリコバクター・ピロリとヘリコバクター・ハイルマニーは上記のとおり、感染経路も異なる病原菌であり、前記乳酸菌がヘリコバクター・ピロリ以外の病原菌に対して効果を示すのかどうかについては一切不明である。
Unlike Helicobacter pylori, Helicobacter heilmannii is a zoonotic disease that infects humans, dogs, cats, pigs, and monkeys, and may infect humans from pets. Helicobacter heilmanii infection prevention drugs from pets to humans, gastrointestinal ulcers in humans and animals, and the prevention and treatment of MALT lymphoid onset and medicines with Helicobacter heilmanii eradication activity, lactic acid bacteria, etc. Development research is needed.
As a treatment method, for Helicobacter pylori, which has been confirmed to cause gastric ulcers and gastric MALT lymphomas in humans, 1 of several antibiotics such as clarithromycin and amoxicillin and a proton pump inhibitor (PPI) Weekly sterilization methods have been successful. However, for Helicobacter heilmannii, its infection route and its association with diseases in humans and animals have been clarified, but since it is a difficult culturing and detection bacterium, the details have not been investigated and established to date. There are no antibacterial substances or sterilization methods. In addition, even in infection experiments using mice, complete sterilization of Helicobacter pylori was not possible with the Helicobacter pylori eradication method (Non-patent Document 9).
For Helicobacter pylori, it has been disclosed to reduce the number of bacteria in the digestive tract by administration of lactic acid bacteria or the like (see
このように、特許文献２、３では、ヘリコバクター・ピロリ菌について、除菌活性を有する抗菌剤や除菌方法が開示されているが、ヒトやペット等の動物等に共通感染して、消化管潰瘍および胃MALTリンパ腫を発症させるとされるヘリコバクター・ハイルマニーに対して有効な抗菌剤や除菌方法はいまだに開発されていない。
したがって、ヘリコバクター・ハイルマニー除菌活性を有する抗菌剤、医薬および飲食品などの開発研究が必要となっている。特に、ヘリコバクター・ピロリ除菌治療において問題となった、複数の抗菌剤の使用による耐性菌出現や下痢の副作用等（非特許文献１０）を回避することが可能で、より安全で効果が期待できる除菌素材（化合物や乳酸菌などの生物素材）およびこれらを用いた飲食品や医薬の開発が求められている。
As described above,
Therefore, development research on antibacterial agents, pharmaceuticals and foods and drinks having Helicobacter heilmanii sanitization activity is required. In particular, it is possible to avoid the emergence of resistant bacteria due to the use of a plurality of antibacterial agents and the side effects of diarrhea (Non-Patent Document 10), which has been a problem in Helicobacter pylori eradication treatment, and can be expected to be safer and more effective. Development of sanitizing materials (biological materials such as compounds and lactic acid bacteria) and foods and beverages and pharmaceuticals using these materials is required.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヘリコバクター・ハイルマニーに対し、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に胃内菌数減少効果あるいは除菌作用を有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の内容を含む。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus have an effect of reducing the number of bacteria in the stomach or a sterilization action against Helicobacter heilmannii, Was completed. That is, the present invention includes the following contents.
（１）ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又は乳酸菌培養物を有効成分とする抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤。
（２）前記ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラムノーサスまたはラクトバチルス・ロイテリである前記（１）に記載の抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤。
（３）前記ラクトバチルス・ガセリがSBT2055（FERM BP-10953）である前記（２）に記載の抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤。
（４）抗ヘリコバクター・ハイルマニー効果を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又は乳酸菌培養物を含有してなる抗ヘリコバクター・ハイルマニー飲食品、動物用飼料又は医薬組成物。
（５）さらに生理的に許容可能な担体を含む前記（４）に記載の飲食品、動物用飼料又は医薬組成物。
（６）前記ラクトバチルス属に属する乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラムノーサスまたはラクトバチルス・ロイテリである前記（４）又は（５）に記載の飲食品、動物用飼料又は医薬組成物。
（７）前記ラクトバチルス・ガセリがラクトバチルス・ガセリSBT2055（FERM BP-10953）である前記（６）に記載の飲食品、動物用飼料又は医薬組成物。
(1) An anti-Helicobacter heilmannii agent comprising a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus and / or a lactic acid bacterium culture as an active ingredient.
(2) The anti-Helicobacter heilmanii agent according to (1), wherein the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus is Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus reuteri.
(3) The anti-Helicobacter heilmanii agent according to (2), wherein the Lactobacillus gasseri is SBT2055 (FERM BP-10953).
(4) Anti-Helicobacter heilmanii food and drink, animal feed or pharmaceutical composition comprising a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having an anti-helicobacter heilmany effect and / or a lactic acid bacterium culture.
(5) The food / beverage product, animal feed or pharmaceutical composition according to (4), further comprising a physiologically acceptable carrier.
(6) Food / beverage products, animal feed as described in said (4) or (5) whose lactic acid bacteria which belong to the said Lactobacillus genus are Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus reuteri Or a pharmaceutical composition.
(7) The food or drink, animal feed or pharmaceutical composition according to (6), wherein the Lactobacillus gasseri is Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953).
本発明の、抗ヘリコバクター・ハイルマニー活性を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌を摂取する事により、上部消化管内感染により、胃炎、胃潰瘍、MALTリンパ腫疾患の発症原因となる、ヘリコバクター・ハイルマニーの有意な菌数減少又は除菌に、有効な効果が期待できる。
同時に、食経験のある材料から分離された乳酸菌を使用するため、いわゆる抗生物質のような副作用がなく安全性が高いという特徴を有する。
By ingesting a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having anti-Helicobacter heilmanii activity of the present invention, the significant number of Helicobacter heilmannii causing gastritis, gastric ulcer, MALT lymphoma disease due to upper gastrointestinal infection An effective effect can be expected for reduction or sterilization.
At the same time, since lactic acid bacteria isolated from materials with experience of eating are used, there are no side effects like so-called antibiotics and high safety.
本発明の抗ヘリコバクター・ハイルマニー剤の有効成分である乳酸菌としてはラクトバチルス属に属する乳酸菌であって、ヘリコバクター・ハイルマニーに対して菌数減少、増殖抑制、感染防御又は除菌効果を有するものであればいずれも利用することができる。
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラムノーサスまたはラクトバチルス・ロイテリが挙げられ、そのうちでも、ラクトバチルス・ガセリに属する乳酸菌が好ましい。ラクトバチルス・ガセリに属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・ガセリSBT2055を用いることが好ましい。なお、ラクトバチルス・ガセリSBT2055株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成8年3月27日に国内寄託され（受託番号FERM P-15535）、その後国際寄託に移管され、受託番号BP-10953が付与されている。
ラクトバチルス属乳酸菌、ラクトバチルス・ガセリSBT2055株を培養する培地には、乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂粉乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地を例示することができるが特に限定されるものではない。
The lactic acid bacterium that is an active ingredient of the anti-Helicobacter heilmani agent of the present invention is a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, which has a bacterial count reduction, growth suppression, infection protection or sterilization effect against Helicobacter heilmani. Any of them can be used.
Examples of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus include Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus reuteri, and among them, lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus gasseri are preferred. As the lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus gasseri, it is preferable to use Lactobacillus gasseri SBT2055. The Lactobacillus gasseri strain SBT2055 was deposited domestically on March 27, 1996 at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Accession Number FERM P-15535), and then transferred to an international deposit. Accession number BP-10953 is assigned.
As a medium for culturing Lactobacillus lactic acid bacteria and Lactobacillus gasseri strain SBT2055, various media such as a milk medium or a medium containing a milk component and a semi-synthetic medium not containing this can be used. Examples of such a medium include, but are not particularly limited to, a reduced skim milk medium obtained by reducing skim milk powder and heat sterilization.
本発明のラクトバチルス属乳酸菌の培養法は、静置培養あるいはpHを一定にコントロールした中和培養を用いることができるが、菌が良好に生育する条件であれば特に培養法に制限はない。ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、培養物をそのまま用いても良いし、培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離された菌体をそのまま用いることもできる。なお、菌体は、死菌体を用いることもできるが、生菌体を用いることが好ましい。
また、前記菌体や培養物を濃縮したり、乾燥（凍結、噴霧、真空等）したり、懸濁したり、希釈したり、一定の加工処理を施したものを用いることもできる。
As a method for cultivating Lactobacillus lactic acid bacteria of the present invention, static culture or neutralized culture with a constant pH can be used. However, the culture method is not particularly limited as long as the bacteria grow well. As the lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, the culture may be used as it is, or the cells isolated from the culture by means of collection such as centrifugation may be used as they are. In addition, although dead cells can be used as the cells, it is preferable to use live cells.
In addition, the cells or culture can be concentrated, dried (freezing, spraying, vacuum, etc.), suspended, diluted, or subjected to certain processing.
本発明のラクトバチルス属乳酸菌はどのような飲食品に含有させても良く、飲食品の製造工程中の原料に添加しても良い。飲食品の例として、乳飲料、発酵乳、乳製品、果汁飲料、清涼飲料、炭酸飲料、菓子、ゼリー等の飲食品を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The Lactobacillus lactic acid bacteria of the present invention may be contained in any food or drink, and may be added to a raw material in the production process of the food or drink. Examples of foods and drinks include, but are not particularly limited to, foods and drinks such as milk drinks, fermented milk, dairy products, fruit juice drinks, soft drinks, carbonated drinks, confectionery, and jelly.
食品添加剤として用いる場合には、その添加量については、特に限定的ではなく、食品の種類に応じ適宜決めればよい。例えば、清涼飲料、炭酸飲料などの液体食品や菓子類やその他の各種食品等の固形食品に添加して用いることができるが、これらの場合の添加量については、食品の種類に応じて適宜決めればよく、一例としては、乳酸菌乾燥重量として、含有量が0.005重量％〜5重量％の範囲内となるように添加すればよい。 When used as a food additive, the amount added is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the type of food. For example, it can be used by adding to liquid foods such as soft drinks and carbonated drinks and solid foods such as confectionery and other various foods, but the amount added in these cases is appropriately determined according to the type of food. What is necessary is just to add so that content may become in the range of 0.005 weight%-5 weight% as an example as dry weight of lactic acid bacteria.
また、本発明のラクトバチルス属乳酸菌は動物用飼料としてどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。動物用飼料として用いる場合には、その添加量については、特に限定的ではなく、動物用飼料の種類に応じ適宜決めればよい。一例としては、乳酸菌乾燥重量として、含有量が0.005重量％〜５重量％の範囲内となるように添加すれば良い。 In addition, the Lactobacillus lactic acid bacteria of the present invention may be added to any feed as animal feed, and may be added to the raw material during the feed production process. When used as animal feed, the amount added is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the type of animal feed. For example, the dry weight of lactic acid bacteria may be added so that the content is in the range of 0.005 wt% to 5 wt%.
本発明の乳酸菌を、健康食品や医薬組成物として人体に投与する場合には、次のような投与方法及び投与量が例示される。投与は、種々の方法で行うことができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等の剤型による経口投与とすることができる。投与量については、経口投与の場合には、通常、成人において、有効成分量として体重１ｋｇあたり0.01〜1000mg/kg程度が適当であり、これを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。乳酸菌の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良い。
経口投与剤は、通常の製造方法に従って製造することができる。例えば、デンプン、乳糖、マンニット等の賦形剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、軽質無水ケイ酸等の流動性向上剤等の生理的に許容可能な担体と適宜組み合わせて処方することにより、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等として製造することができる。本発明の乳酸菌を有効成分として含有する抗ヘリコバクター・ハイルマニーの製剤は、いずれも公知の方法により製造することができる。
When the lactic acid bacteria of the present invention are administered to the human body as a health food or a pharmaceutical composition, the following administration methods and dosages are exemplified. Administration can be carried out by various methods, for example, oral administration in the form of tablets, capsules, granules, syrups and the like. As for the dosage, in the case of oral administration, usually 0.01 to 1000 mg / kg body weight per kg body weight is appropriate as the amount of active ingredient in adults, and if this is administered once to several times a day, Good. The content ratio of lactic acid bacteria is not particularly limited, and may be appropriately adjusted in accordance with ease of production, a preferable daily dose, and the like.
The oral preparation can be produced according to a normal production method. For example, excipients such as starch, lactose, mannitol, binders such as sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylcellulose, disintegrants such as crystalline cellulose and carboxymethylcellulose calcium, lubricants such as talc and magnesium stearate, light anhydrous It can be produced as a tablet, capsule, granule or the like by appropriately combining with a physiologically acceptable carrier such as a fluidity improver such as silicic acid. Any of the anti-Helicobacter hailmannii preparations containing the lactic acid bacteria of the present invention as an active ingredient can be produced by a known method.
以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples. However, these are merely illustrative and the present invention is not limited thereto.
[試験例１]
1. 実験動物
C57BL/6Jマウス、雌性、6週齢以降（チャールズリバー社製）を用いた。
[Test Example 1]
1. Experimental animals
C57BL / 6J mice, female, 6 weeks old or later (made by Charles River) were used.
2．被験菌と実験群の設定
実験群は、以下の乳酸菌菌株を投与する群で構成し、1群4匹又は5匹で実験を行った（1群5匹で1回目の実験を行い、その後、1群4匹で2回実験を繰り返し、再現性を確認した）。
ラクトバチルス・ラムノーサス（L.rhamnosus）ATCC53103
ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）KZ1002
ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）KZ1201
ラクトバチルス・ロイテリ（L.reuteri）JCM1081
ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）SBT2055
コントロールとして、0.01%のゼラチンを含むPBS溶液（pH7.4）（以下，BSGということがある）を用いた。
なお、KZ1002、KZ1201は北里大学の管理番号であり、JCM1081は独立行政法人理化学研究所、ATCC53103はAmerican Type Culture Collectionに保存されている株名であり、SBT2055は前述のとおりである。
2． Test bacteria and experimental group settings The experimental group consisted of a group to which the following lactic acid bacteria strains were administered, and the experiment was performed with 4 or 5 animals per group (the first experiment was performed with 5 animals per group, The experiment was repeated twice with 4 animals per group to confirm reproducibility).
Lactobacillus rhamnosus ( L.rhamnosus ) ATCC53103
Lactobacillus johnsonii ( L.johnsonii ) KZ1002
Lactobacillus gasseri ( L.gasseri ) KZ1201
Lactobacillus reuteri (L.reuteri) JCM1081
Lactobacillus gasseri ( L.gasseri ) SBT2055
As a control, a PBS solution (pH 7.4) containing 0.01% gelatin (hereinafter sometimes referred to as BSG) was used.
Note that KZ1002 and KZ1201 are the management numbers of Kitasato University, JCM1081 is RIKEN, ATCC53103 is a stock name stored in the American Type Culture Collection, and SBT2055 is as described above.
3．乳酸菌の調製
上記2．に列挙した乳酸菌の、-85℃の凍結菌体をLactobacillus-MRS 寒天平板 (Difco Laboratories社製) に塗布し37°C、10% CO2, 6% H2, 84% N2で培養した。生じたコロニーをLactobacillus-MRS液体培地で37°C、10% CO2, 6% H2, 84% N2で1昼夜、振とう培養し、遠心分離した菌の沈殿をBSGに溶解し投与乳酸菌液とした。
マウスには経口ゾンデを用いて用時調製の前記投与乳酸菌液を1日1回0.1ml (1x108〜1x109 CFU)を実験スケジュール（図１）にしたがって投与した。
3． Preparation of
Mice were administered 0.1 ml (1 × 10 8 to 1 × 10 9 CFU) of the lactic acid bacteria solution prepared at the time of use using an oral sonde once a day according to the experimental schedule (FIG. 1).
4. 感染菌の調製、感染方法および実験スケジュール
4-1.感染菌（H.heilmannii TKY株）の調製と感染方法
Nakamuraらの方法（Nakamura, M.et.al., Infect. Immun. vol75,p1214-1222, 2007,）に基づき、H.heilmannii TKY株が感染しているC57BL/6Jマウスの胃粘膜をスライドガラスにより剥離し、BSGで懸濁し、感染菌液とした。マウスには経口ゾンデを用いて感染菌液0.1ml (約1 x 104 コピー の H.heilmannii 16S rRNA 遺伝子)を投与した。
4-2.実験スケジュール
図１に示す。感染の2日前より、乳酸菌の投与を開始し、感染菌投与後2週間乳酸菌の投与を継続した。
4. Preparation of infection bacteria, infection method and experimental schedule
4-1. Preparation of infection bacteria ( H. heilmannii TKY strain) and infection method
Based on the method of Nakamura et al. (Nakamura, M. et.al., Infect. Immun. Vol75, p1214-1222, 2007), the gastric mucosa of C57BL / 6J mice infected with H. heilmannii TKY strain was slid into a glass slide. And suspended with BSG to obtain an infectious bacterial solution. Mice were administered 0.1 ml of infected bacterial solution (about 1 x 10 4 copies of H. heilmannii 16S rRNA gene) using an oral sonde.
4-2. Experiment schedule Administration of lactic acid bacteria was started 2 days before the infection, and administration of lactic acid bacteria was continued for 2 weeks after the infection.
5. 検査項目
（1） マウス胃内の細菌の16S rRNA遺伝子のコピー数
（2） マウス胃内のH.heilmannii TKYの16S rRNA遺伝子のコピー数
5. Test item (1) Copy number of bacterial 16S rRNA gene in mouse stomach (2) Copy number of H. heilmannii TKY 16S rRNA gene in mouse stomach
6.菌数の算定方法(非特許文献９およびMukai, T., et al., FEMS Immunol Med Microbiol vol32,pp105-110,2002参照)
感染2週間後にマウスを解剖し、胃粘膜をスライドガラスにより剥離し、BSGで懸濁しDNeasy Blood & Tissue kit (No. 69506; Qiagen社製) を用いてDNA溶液を調製した(調整DNA：マウス1匹当たり100μl)。NanoDrop 1000（ナノドロップND-1000、Thermo Fisher Scientific社製）による、前記DNA溶液のDNA濃度測定後、1μl を用いてリアルタイム PCR法により、胃内の全ての細菌とH.heilmanniiの16S rRNA遺伝子のコピー数を計算した。リアルタイム PCR法による感染菌のコピー数の計算は、以下のように行った。 PCR反応により増幅するH.pyloriの16S rRNA遺伝子は、染色体上に2セット存在する。そこで、H.heilmannii及び他の細菌の16S rRNA遺伝子も同じく2セットと仮定して、H.pyloriの一定量の菌体DNA当たりの菌数(CFU)を調べ、細菌共通16S rRNA遺伝子プライマーセットを用いて、PCR反応により100, 1,000, 10,000コピーに相当するDNA量で検量線を作成した。調製したDNA溶液1μlの検査菌のコピー数を検量線より計算し、100倍してマウス1匹当たりのコピー数を求めた。
6. Method for calculating the number of bacteria (see
Two weeks after infection, the mouse was dissected, the gastric mucosa was peeled off with a glass slide, suspended in BSG, and a DNA solution was prepared using DNeasy Blood & Tissue kit (No. 69506; manufactured by Qiagen) (adjusted DNA:
7．PCRに使用したプライマーセット
（１）H.heilmannii 16S rRNA 遺伝子
HeilF (5'aagtcgaacgatgaagccta3')
HeilR (5'atttggtattaatcaccatttc3')
（２）細菌共通16S rRNA遺伝子
16S universal 341F (5'ctacgggaggcagcagtggg3')
16S universal 519R (5'attaccgcggckgctg3')
7． Primer set used for PCR (1) H. heilmannii 16S rRNA gene
HeilF (5'aagtcgaacgatgaagccta3 ')
HeilR (5'atttggtattaatcaccatttc3 ')
(2) Bacteria common 16S rRNA gene
16S universal 341F (5'ctacgggaggcagcagtggg3 ')
16S universal 519R (5'attaccgcggckgctg3 ')
8．PCR反応（非特許文献９参照）
PCR反応は以下の条件で、95℃ 15 sec、55℃ 15 secおよび72℃ 30 secの条件で50サイクル行った（TaKaRa Thermal Cycler Dice Real Time System）。
（条件）
全液量(20μl)
2xSYBR（登録商標） green PCR master mix (Bio-Rad社製) 10μl
プライマーセット 5μl (5μM)
調製DNA （100倍希釈） 1μl
dDW（double distilled water） 4μl
8． PCR reaction (see Non-Patent Document 9)
PCR reaction was performed under the following conditions for 50 cycles at 95 ° C. for 15 sec, 55 ° C. for 15 sec and 72 ° C. for 30 sec (TaKaRa Thermal Cycler Dice Real Time System).
(conditions)
Total volume (20μl)
2xSYBR (registered trademark) green PCR master mix (Bio-Rad) 10 μl
Primer set 5μl (5μM)
Prepared DNA (100-fold dilution) 1μl
dDW (double distilled water) 4μl
9. データ処理
乳酸菌投与群と非投与群（１群5匹；n=5）のH.heilmanniiの平均コピー数を求めた。その結果を図２に示す。
9. Data processing The average number of copies of H. heilmannii in the lactic acid bacteria administration group and the non-administration group (5 mice per group; n = 5) was determined. The result is shown in FIG.
10. 結果
ラクトバチルス属に属する乳酸菌を投与した結果、コントロールに比べて、H.heilmanniiに対する胃内菌数減少効果が確認された。特に、L.gasseri SBT2055 投与群において、有意な感染防御効果を示した。
10. Results As a result of administering lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, the effect of reducing the number of bacteria in the stomach against H. heilmannii was confirmed compared to the control. In particular, L.gasseri SBT2055 administration group showed a significant protective effect against infection.
（食品の製造）
ラクトバチルス・ガセリSBT2055（FERM BP-10953）をヨーグルトミックス（生乳に2％脱脂粉乳を添加し溶解した後、ホモジナイザーで均質化し、100℃で10分間加熱した後、41℃まで冷却）に5重量％接種し、100gずつカップに充填後、37℃で6時間培養し、抗ヘリコバクター・ハイルマニー効果を有する発酵乳を製造した。
(Production of food)
5 wt. Of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) in yogurt mix (2% non-fat dry milk added to raw milk, homogenized with homogenizer, heated at 100 ° C for 10 minutes, then cooled to 41 ° C) After inoculating 100% in a cup and culturing at 37 ° C. for 6 hours, fermented milk having an anti-Helicobacter high mannie effect was produced.
（医薬組成物の製造）
ラクトバチルス・ガセリSBT2055（FERM BP-10953）を食用可能な合成培地（0.5％酵母エキス、0.1％トリプチケースペプト添加）に5重量％接種し、38℃で15時間培養後、遠心分離で菌体を回収した。この菌体１gを乳糖5gと混合し、顆粒状に成型し、抗ヘリコバクター・ハイルマニー効果を有する顆粒剤を得た。
(Manufacture of pharmaceutical composition)
Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) is inoculated with 5% by weight in edible synthetic medium (0.5% yeast extract, 0.1% trypticase pept added), cultured at 38 ° C for 15 hours, then centrifuged The cells were collected. 1 g of this microbial cell was mixed with 5 g of lactose and molded into granules to obtain granules having an anti-Helicobacter high mannie effect.
（飲料の製造）
10％還元脱脂乳溶液を85℃で25分間殺菌した後、ホモゲナイズし、冷却した。これにスターターとしてラクトバチルス・ガセリSBT2055（FERM BP-10953）の培養物を3.5％加え、38℃で16時間発酵させ、乳酸含量2％の酸乳（脱脂乳培地における培養物）を得た。ついで、生じたカードを砕きながら、5℃に冷却し、これを酸乳とした。別に、ショ糖15％のほかに適量の酸味料、香料、色素を有する糖液を調合し、ホモジナイズし、80℃で25分間殺菌した後、5℃に冷却し、糖液とした。このようにして得た酸乳30部に対して糖液70部の割合で混合し、抗ヘリコバクター・ハイルマニー効果を有する酸乳飲料を製造した。
(Manufacture of beverages)
The 10% reduced skim milk solution was sterilized at 85 ° C. for 25 minutes, homogenized, and cooled. To this, 3.5% of a culture of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) was added as a starter and fermented at 38 ° C. for 16 hours to obtain acid milk (culture in skim milk medium) having a lactic acid content of 2%. Next, the resulting curd was crushed and cooled to 5 ° C., and this was used as sour milk. Separately, in addition to 15% sucrose, a sugar solution containing appropriate amounts of acidulant, flavor, and pigment was prepared, homogenized, sterilized at 80 ° C for 25 minutes, cooled to 5 ° C, and used as a sugar solution. An acid milk beverage having an anti-Helicobacter high mannie effect was produced by mixing 30 parts of acid milk thus obtained in a ratio of 70 parts of a sugar solution.
（飼料の製造）
収穫したアルファルファを軽く乾燥し、マウンドカッターで15〜25mmに切断し、ラクトバチルス・ガセリSBT2055（FERM BP-10953）の純培養物を材料となる草1gあたり105cfu以上となるように接種した。サイレージ用フィルムで包装し、30℃で10日間貯蔵して、抗ヘリコバクター・ハイルマニー効果を有するサイレージを調製した。
(Manufacture of feed)
Harvested alfalfa was lightly dried, cut to 15-25 mm with a mound cutter, and inoculated with a pure culture of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) at a rate of 10 5 cfu or more per gram of the material grass . The silage was wrapped with silage film and stored at 30 ° C. for 10 days to prepare a silage having an anti-Helicobacter heilmannii effect.
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