JP6323940B2 - Method for producing alkylpolyglycoside - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
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Description
本発明はアルキルポリグリコシドの製造方法に関する。また、本発明は新規アルキルポリグリコシドに関する。 The present invention relates to a method for producing an alkyl polyglycoside. The present invention also relates to a novel alkyl polyglycoside.
アルキルポリグリコシドは、界面活性剤として各種の洗剤等に配合されている。アルキルポリグリコシドの工業的生産は、主に糖とアルコールを原料とした化学合成により行われているが、原料アルコールを多量に必要とし、高温・高圧下での反応を行うために原料グルコースが変性してしまう等の問題がある。
このような実情から、より効率のよい生産方法を求めて、微生物を用いたアルキルポリグリコシドの製造技術が検討されている。例えば、酵母の１種であるカンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola）を、糖とアルコールを含有する培地で培養すると、生産物としてアルキルポリグリコシドの一種であるアルキルソホロシドが得られることが知られている（特許文献１及び非特許文献１参照）。
Alkyl polyglycosides are blended in various detergents and the like as surfactants. Industrial production of alkylpolyglycosides is mainly carried out by chemical synthesis using sugar and alcohol as raw materials, but it requires a large amount of raw material alcohol, and the raw material glucose is denatured to carry out reactions at high temperatures and high pressures. There are problems such as.
In view of such a situation, a technique for producing an alkylpolyglycoside using a microorganism has been studied in search of a more efficient production method. For example, when Candida bombicola , a kind of yeast, is cultured in a medium containing sugar and alcohol, alkyl sophoroside , a kind of alkyl polyglycoside, is obtained as a product. (See Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
しかしながら、上述の微生物を用いた製造方法は、常温・常圧下でのアルキルポリグリコシド製造を可能とするものの、原料アルコールに対するアルキルポリグリコシドの収率が低いという問題がある。
そこで、本発明は、アルキルポリグリコシドを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
However, although the above-described production method using microorganisms enables production of alkylpolyglycoside at normal temperature and normal pressure, there is a problem that the yield of alkylpolyglycoside relative to the raw material alcohol is low.
Then, this invention makes it a subject to provide the method of manufacturing an alkyl polyglycoside efficiently.
本発明者らは、微生物を用いたアルキルポリグリコシドの製造技術について鋭意検討したところ、カンジダ・ボンビコーラ由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子の機能を低下させた形質転換体で、特定のアルキルポリグリコシドの産生率が有意に向上することを見出した。さらに、当該形質転換体により製造されたアルキルポリグリコシドの中に、新規のアルキルポリグリコシドを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。 The present inventors diligently studied about the production technology of alkyl polyglycoside using microorganisms. As a result, the transformant has a reduced function of the alcohol oxidase gene derived from Candida bonbicola, and the production rate of a specific alkyl polyglycoside is low. It was found to improve significantly. Furthermore, the novel alkyl polyglycoside was discovered in the alkyl polyglycoside manufactured by the said transformant. The present invention has been completed based on these findings.
すなわち、本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含む、下記一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から下記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
That is, this invention relates to the manufacturing method (henceforth "the manufacturing method of this invention") of the compound represented by the following general formula (I) including the process of following (1) and (2).
(1) Transformation in which a gene having a gene encoding any one of the following proteins (a) to (c) is deleted, mutated or suppressed, and alcohol oxidase activity is reduced compared to the host A step of culturing a body in a medium containing a secondary alcohol or ketone and sugar (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 50% Protein (c) consisting of amino acid sequences having the above identity and having alcohol oxidase activity (c) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or added A protein comprising an amino acid sequence and having alcohol oxidase activity (2) From a culture obtained, it is represented by the following general formula (I) Comprising the steps of: obtaining a compound
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。） (In general formula (I), R1 represents a hydrogen atom or an alkyl group represented by C x H 2x + 1 , x represents an integer of 1 or more and 3 or less. R2 is represented by a hydrogen atom or C y H 2y + 1. Represents an alkyl group, and y represents an integer of 1 or more and 3 or less, provided that R1 and R2 are not hydrogen atoms at the same time, n represents an integer of 7 or more and 19 or less, and R3 and R4 each independently Represents a hydrogen atom or an acetyl group.)
また、本発明は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物に関する。 The present invention also relates to a compound represented by the following general formula (II).
（一般式（ＩＩ）中、ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。） (In general formula (II), n represents an integer of 7 or more and 19 or less. R3 and R4 each independently represents a hydrogen atom or an acetyl group.)
本発明によれば、前記一般式（Ｉ）で表される化合物を高収率で製造する方法を提供することができる。また、本発明によれば、新規のアルキルポリグリコシドを提供することができる。 According to this invention, the method of manufacturing the compound represented by the said general formula (I) with a high yield can be provided. Moreover, according to this invention, the novel alkyl polyglycoside can be provided.
１．一般式（Ｉ）で表される化合物
本発明の製造方法によれば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を高い収率で得ることができる。
1. Compound Represented by General Formula (I) According to the production method of the present invention, a compound represented by the following general formula (I) can be obtained in high yield.
一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。
一般式（Ｉ）において、ｘは好ましくは１以上２以下、より好ましくは１である。Ｒ１は水素原子又はメチル基が好ましい。
ｙは好ましくは１以上２以下、より好ましくは１である。Ｒ２は水素原子又はメチル基が好ましい。
ｎは好ましくは９以上１５以下、より好ましくは９以上１３以下である。
Ｒ１及びＲ２で置換されたアルキレン鎖中の総炭素原子数（Ｒ１及びＲ２がアルキル基の場合はその炭素原子を含む）は１０以上２２以下であることが好ましく、１０以上１８以下であることがより好ましく、１２以上１８以下であることがさらに好ましく、１２以上１６以下であることがよりさらに好ましい。
Ｒ３及びＲ４は、水素原子が好ましい。
In general formula (I), R1 represents a hydrogen atom or an alkyl group represented by C x H 2x + 1 , and x represents an integer of 1 or more and 3 or less. R2 represents a hydrogen atom or an alkyl group represented by C y H 2y + 1 , and y represents an integer of 1 or more and 3 or less. However, R1 and R2 are not simultaneously hydrogen atoms. n represents an integer of 7 or more and 19 or less. R3 and R4 each independently represent a hydrogen atom or an acetyl group.
In general formula (I), x is preferably 1 or more and 2 or less, more preferably 1. R1 is preferably a hydrogen atom or a methyl group.
y is preferably 1 or more and 2 or less, more preferably 1. R2 is preferably a hydrogen atom or a methyl group.
n is preferably 9 or more and 15 or less, more preferably 9 or more and 13 or less.
The total number of carbon atoms in the alkylene chain substituted with R1 and R2 (including those carbon atoms when R1 and R2 are alkyl groups) is preferably 10 or more and 22 or less, and preferably 10 or more and 18 or less. More preferably, they are 12 or more and 18 or less, More preferably, they are 12 or more and 16 or less.
R3 and R4 are preferably a hydrogen atom.
前記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｒ１が水素原子でありＲ２がメチル基である化合物、すなわち下記一般式（ＩＩ）で表される化合物は新規化合物である。 Among the compounds represented by the general formula (I), a compound in which R1 is a hydrogen atom and R2 is a methyl group, that is, a compound represented by the following general formula (II) is a novel compound.
一般式（ＩＩ）中、ｎ、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ、前記一般式（Ｉ）のｎ、Ｒ３、Ｒ４と同義であり、好ましい範囲も同様である。 In general formula (II), n, R3, and R4 have the same meanings as n, R3, and R4 in general formula (I), respectively, and the preferred ranges are also the same.
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、アルキル鎖に水酸基を有するアルキルポリグリコシドである。当該化合物は、界面活性剤として洗浄剤に、乳化剤や抗菌剤として香粧品等に用いることができる。特に、一般式（ＩＩ）で表される化合物は直鎖アルキル基に水酸基が付加した構造を有し、このような構造を有する非イオン性界面活性剤は、乳化、分散、湿潤性に優れ、高い起泡性を示す。
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、後述する本発明の製造方法により得ることができ、形質転換体の宿主、培地に含有させる糖、第２級アルコール、ケトンの種類を適宜選択することにより、種々の化合物を製造することができる。
The compounds represented by the general formulas (I) and (II) are alkyl polyglycosides having a hydroxyl group in the alkyl chain. The compound can be used in detergents as surfactants and in cosmetics as emulsifiers and antibacterial agents. In particular, the compound represented by the general formula (II) has a structure in which a hydroxyl group is added to a linear alkyl group, and the nonionic surfactant having such a structure is excellent in emulsification, dispersion, and wettability, High foaming property.
The compounds represented by the general formulas (I) and (II) can be obtained by the production method of the present invention to be described later, and are the host of the transformant, the sugar to be contained in the medium, the secondary alcohol, and the type of ketone. Various compounds can be produced by appropriately selecting.
２．製造方法
本発明の製造方法では、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を用いる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
2. Production method In the production method of the present invention, in a host having a gene encoding a protein of any one of the following (a) to (c), the gene is deleted, mutated or suppressed in expression, and compared with the host, alcohol oxidase A transformant with reduced activity is used.
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) a protein comprising an amino acid sequence having 50% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having alcohol oxidase activity (c ) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having alcohol oxidase activity
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、カンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola（別称：Starmerella bombicola又はTorulopsis bombicola））NBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼである。アルコールオキシダーゼ（以下、「ＡＯＸ」とも略記する）は、アルコール酸化酵素の１種で、アルコールをアルデヒドに酸化する反応を触媒する。後述の実施例で示すように、当該タンパク質を欠失した形質転換体は、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下する。 The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is alcohol oxidase derived from Candida bombicola ( Candida bombicola (also known as Starmerella bombicola or Torulopsis bombicola )) NBRC10243 strain. Alcohol oxidase (hereinafter also abbreviated as “AOX”) is a kind of alcohol oxidase and catalyzes a reaction of oxidizing alcohol into an aldehyde. As shown in Examples described later, the transformant lacking the protein has a significantly reduced alcohol oxidase activity.
本発明の製造方法では、前記（ａ）のタンパク質と機能的に均等な前記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子も用いることができる
前記（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の同一性とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
In the production method of the present invention, a gene encoding the protein (b) and (c) functionally equivalent to the protein (a) can also be used. In (b), the amino acid sequence identity is From the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I), it is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
In the present invention, the identity of amino acid sequences means the identity (%) of the maximum amino acid sequences obtained by aligning two amino acid sequences to be compared with a gap as necessary. The identity of the amino acid sequence can be analyzed by a usual method, but the identity of the present invention is calculated by the Lippmann-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)). Using a homology analysis (Search homology) program of software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) is set to 2 and the measurement is performed.
また、前記（ｃ）において、「１又は数個のアミノ酸」は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、１〜１０個のアミノ酸であることが好ましく、１〜５個のアミノ酸であることがより好ましく、１〜３個のアミノ酸であることがさらに好ましい。 In the above (c), “1 or several amino acids” is preferably 1 to 10 amino acids from the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I). More preferably, it is ˜5 amino acids, and further more preferably 1-3 amino acids.
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号２は、カンジダ・ボンビコーラNBRC10243株由来のアルコールオキシダーゼ遺伝子の塩基配列である。
Specific examples of the gene encoding any one of the proteins (a) to (c) include a gene comprising any one of the following DNAs (d) to (f).
(D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
(E) DNA encoding a protein comprising a base sequence having 55% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having alcohol oxidase activity
(F) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that encodes a protein having alcohol oxidase activity
SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the alcohol oxidase gene derived from Candida bonbicola NBRC10243 strain.
前記（ｅ）において、塩基配列の同一性は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
本発明において塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性は通常の方法により解析することができるが、本発明の同一性はリップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより測定する。
In the above (e), the identity of the base sequence is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, from the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I). And more preferably 95% or more.
In the present invention, the identity of the base sequences refers to the identity (%) of the maximum base sequences obtained by aligning the two base sequences to be compared by introducing a gap as necessary. The identity of the base sequence can be analyzed by a usual method, but the identity of the present invention is calculated by the Lippmann-Pearson method (Lipman-Pearson method; Science, 227, 1435, (1985)) Using a homology analysis (Search homology) program of software Genetyx-Win (Ver. 5.1.1; software development), the unit size to compare (ktup) is set to 2 and the measurement is performed.
また、前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件」としては、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載のサザンハイブリダイゼーション法等が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。 In (f) above, “stringent conditions” include Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W., et al. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), Examples include conditions in which a solution containing 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA is incubated with a probe at 42 ° C. for 8 to 16 hours and hybridized.
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、カンジダ・ボンビコーラ等の微生物からクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W. Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に変異を導入する場合、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）PCR反応（Horton et al.，Gene 77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。具体的には、ランダムにクローニングしたDNA断片を用いて相同組換えを起こさせる方法や、γ線等を照射することによりランダムな遺伝子の変異が可能である。
The method for obtaining a gene encoding any of the proteins (a) to (c) is not particularly limited, and can be obtained by a normal genetic engineering technique. For example, it can be obtained by artificial synthesis based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. For the artificial synthesis of genes, for example, services such as Invitrogen can be used. It can also be obtained by cloning from microorganisms such as Candida bombibicola, for example, by the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]. It can be carried out.
When introducing a mutation into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, for example, site-specific mutagenesis can be mentioned. As a specific method for introducing site-specific mutation, a method using a Splicing overlap extension (SOE) PCR reaction (Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989), an ODA method (Hashimoto-Gotoh et al. , Gene, 152, 271-276, 1995), Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 488). Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method. Specifically, random gene mutation is possible by a method of causing homologous recombination using a randomly cloned DNA fragment, or by irradiation with γ rays or the like.
本発明の方法に用いる形質転換体は、宿主中の前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。
形質転換体の宿主としては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有するものであればよい。前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、宿主として好ましくは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。
当該微生物としては、取り扱い性の向上、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、酵母が好ましい。当該酵母としては、カンジダ（Candida）属に属する菌類、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類等が挙げられる。
前記カンジダ（Candida）属に属する菌類としては、Candida bombicola（別名:Starmerella bombicola)、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellata等が挙げられる。
ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する菌類、ピチア（Pichia）属に属する菌類、ウィケルハミエラ（Wickerhamiella）属に属する菌類、又はスターメレラ（Starmerella）属に属する菌類としては、Rhodotorula bogoriensis、Pichia anomala PY1、又はWickerhamiella domericqiae等が挙げられる。
これらのなかでも、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、カンジダ（Candida）属に属する菌類が好ましく、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellataがより好ましく、Candida bombicolaがさらに好ましい。
なお、上記宿主微生物は、ATCC（American Type Culture Collection）、NBRC (Biological Resource Center, NITE)等の生物遺伝資源ストックセンター等から入手することができる。
The transformant used in the method of the present invention can be obtained by deleting, mutating, or suppressing expression of the gene encoding any of the proteins (a) to (c) in the host.
As a host of the transformant, any host having a gene encoding any one of the proteins (a) to (c) may be used. From the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I), the host is preferably a microorganism having a gene encoding any one of the proteins (a) to (c).
As the microorganism, yeast is preferable from the viewpoint of improvement in handleability and improvement in productivity of the compound represented by the general formula (I). As the yeast, Candida (Candida) fungi belonging to the genus Rhodotorula (Rhodotorula) fungi belonging to the genus Pichia (Pichia) fungi belonging to the genus Wikeruhamiera (Wickerhamiella) fungi belonging to the genus or Sutamerera (Starmerella) fungi belonging to the genus Etc.
The fungi belonging to the Candida (Candida) spp, Candida bombicola (aka: Starmerella bombicola), Candida apicola, Candida batistae, Candida floricola, Candida riodocensis, or Candida stellata, and the like.
Rhodotorula (Rhodotorula) fungi belonging to the genus Pichia (Pichia) fungi belonging to the genus, the fungi belonging to the fungi, or Sutamerera (Starmerella) genus belonging to Wikeruhamiera (Wickerhamiella) genus, Rhodotorula bogoriensis, Pichia anomala PY1, or Wickerhamiella Domericqiae etc. Is mentioned.
Among these, from the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I), fungi belonging to the genus Candida are preferable, and Candida bombicola , Candida apicola , Candida batistae , Candida floricola , Candida riodocensis , Or Candida stellata is more preferable, and Candida bombicola is more preferable.
The host microorganism can be obtained from biological genetic resource stock centers such as ATCC (American Type Culture Collection) and NBRC (Biological Resource Center, NITE).
宿主ゲノムから前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。なかでも、本発明においては、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を宿主ゲノムから物理的に欠失させた形質転換体であることが好ましい。 As a method for deleting, mutating or suppressing expression of the gene encoding any of the proteins (a) to (c) from the host genome, a part or all of the target gene is removed from the genome or other genes Or by inserting another DNA fragment into the gene, or mutating the transcription / translation initiation region of the gene. Among these, in the present invention, a transformant obtained by physically deleting the gene encoding any of the proteins (a) to (c) from the host genome is preferable.
上記の欠失・変異・発現抑制方法は、相同組換えを用いて行うことができる。例えば、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。
このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher et al., Methods in molecular biology 47，p.291-302, 1995等の文献を参考に行うことができる。
The above deletion / mutation / expression suppression method can be performed using homologous recombination. For example, a linear DNA fragment containing the upstream and downstream regions of the target gene but not containing the target gene is constructed by a method such as PCR, and this is incorporated into a host cell to be upstream or downstream of the target gene in the host genome. The target gene on the genome can be deleted or replaced with another gene fragment by causing crossover homologous recombination twice. In addition, a target gene into which a mutation such as base substitution or base insertion has been introduced is constructed by a method such as PCR, and this is incorporated into a host cell, and twice at two locations outside the mutation site in the target gene of the host genome. By causing crossover homologous recombination, the function of the target gene on the genome can be reduced or eliminated. In addition, a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is incorporated into the host cell, and the host genome is obtained by homologous recombination in a part of the target gene. The target gene above can be disrupted to reduce or eliminate its function.
Such target gene deletion / mutation / expression suppression method by homologous recombination can be performed with reference to documents such as Besher et al., Methods in molecular biology 47, p.291-302, 1995. .
宿主に相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドを導入する方法については、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びそれらの改変法等、酵母の形質転換に通常用いられている方法が挙げられる。
例えば電気パルス法により行う場合、対数増殖期まで増殖させた宿主細胞と、相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドとをソルビトール溶液等に懸濁して、電気パルスを加えればよい。相同組換え用のＤＮＡ断片やプラスミドと宿主細胞とを接触させる際に、サーモンスパームＤＮＡ等のキャリアＤＮＡや、ポリエチレングリコール等を添加することにより、形質転換頻度を高めることも好ましい。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値（電圧が最大値の約３７％にまで減衰するまでの時間）が約１０から２０ミリ秒で、パルス後の生菌率が約１０〜４０％となる条件とすることが好ましい。電気パルスを加えた後、菌液をソルビトール溶液を含む培地にまいて形質転換体を選択する。
目的遺伝子が欠失した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
Methods for introducing DNA fragments or plasmids for homologous recombination into the host include methods commonly used for yeast transformation, such as the electric pulse method, protoplast method, lithium acetate method, and modifications thereof. .
For example, in the case of the electric pulse method, the host cell grown to the logarithmic growth phase and the DNA fragment or plasmid for homologous recombination may be suspended in a sorbitol solution and the electric pulse may be applied. When the DNA fragment or plasmid for homologous recombination is brought into contact with the host cell, it is also preferable to increase the transformation frequency by adding carrier DNA such as salmon palm DNA, polyethylene glycol or the like. The electrical pulse condition is that the time constant value (time until the voltage decays to about 37% of the maximum value) is about 10 to 20 milliseconds, and the viable cell rate after the pulse is about 10 to 40%. It is preferable that After applying an electric pulse, the bacterial solution is spread on a medium containing a sorbitol solution to select a transformant.
Selection of a transformant lacking the target gene was performed by extracting genomic DNA from the transformant and performing PCR on the region containing the target gene site, or using a DNA probe that binds to the target gene region. It can be performed by Southern blotting or the like.
得られた形質転換体では、宿主（すなわち形質転換前の状態）に比べて、アルコールオキシダーゼ活性が低下している。なお、形質転換体でアルコールオキシダーゼ活性が低下することは、後述の実施例で用いた方法により確認できる。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の生産性向上の観点から、形質転換体のアルコールオキシダーゼ活性を宿主のアルコールオキシダーゼ活性に対し７０％以下に低下させることが好ましく、５０％以下に低下させることがより好ましく、３０％以下に低下させることがさらに好ましく、２０％以下に低下させることがよりさらに好ましく、１０％以下に低下させることが特に好ましい。
In the obtained transformant, the alcohol oxidase activity is reduced as compared with the host (that is, the state before transformation). In addition, it can confirm by the method used in the below-mentioned Example that alcohol oxidase activity falls by a transformant.
From the viewpoint of improving the productivity of the compound represented by the general formula (I), it is preferable to reduce the alcohol oxidase activity of the transformant to 70% or less, and to 50% or less of the alcohol oxidase activity of the host. More preferably, it is more preferably reduced to 30% or less, still more preferably to 20% or less, and particularly preferably to 10% or less.
前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子の欠失等によりアルコールオキシダーゼ活性が低下すると、形質転換体内のアルコール代謝経路（アルコールの酸化による脂肪酸合成経路）が阻害され、前記一般式（１）で表される化合物合成の原料となる第２級アルコールやケトンがアルコール代謝経路で消費されることなく有効利用されるため、前記一般式（１）で表される化合物の生産性が向上すると推測される。これまでカンジダ・ボンビコーラの第２級アルコール酸化経路についてはわかっておらず、前記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子が第２級アルコールの酸化に関与することは、本発明者らにより今回新たに示された知見である。 When the alcohol oxidase activity decreases due to deletion of the gene encoding the protein of (a) to (c) or the like, the alcohol metabolic pathway (fatty acid synthesis pathway by oxidation of alcohol) in the transformant is inhibited, and the general formula ( Since the secondary alcohol or ketone used as a raw material for synthesizing the compound represented by 1) is effectively used without being consumed in the alcohol metabolic pathway, the productivity of the compound represented by the general formula (1) is improved. I guess that. Until now, it has not been known about the secondary alcohol oxidation pathway of Candida bonbicola, and the present inventors are concerned that the genes encoding the proteins (a) to (c) are involved in the oxidation of secondary alcohols. This is a newly discovered finding.
本発明の製造方法は、前記形質転換体を用いて下記（１）及び（２）の工程により行われる。
（１）前記形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（２）得られた培養物から前記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
なお、本発明において形質転換体を培地で培養するとは、微生物や動植物あるいはその細胞・組織の培養はもちろん、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養・栽培等した培地及び形質転換体が含まれる。
The production method of the present invention is performed by the following steps (1) and (2) using the transformant.
(1) A step of culturing the transformant in a medium containing a secondary alcohol or ketone and sugar (2) A step of collecting the compound represented by the general formula (I) from the obtained culture In the present invention, culturing a transformant in a medium includes culturing a plant body on soil as well as culturing microorganisms, animals and plants, or cells / tissues thereof. In addition, the culture includes a culture medium and a transformant that have been cultured and cultivated.
形質転換体を培養する培地は、前記一般式（Ｉ）で表される化合物合成の原料として、第２級アルコール及びケトンの少なくとも一方、及び糖を含有する。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物の直接の合成原料は第２級アルコールであるが、その前駆体であるケトンも同様に原料として利用することができる。例えば、文献：A. Brakemeierら Biotechnology Letters (1998) 20, 215-218には、カンジダ・ボンビコーラが第２級アルコールの前駆体であるケトンを利用し、当該第２級アルコールを含むアルキルポリグリコシドを合成することが報告されている。
第２級アルコール及びケトンは、得られた化合物を界面活性剤として用いる観点から、炭素原子数１０以上が好ましく、１２以上が好ましい。また、炭素原子数２２以下が好ましく、１８以下がより好ましく、１６以下がさらに好ましく、１４以下がよりさらに好ましい。さらに、炭素原子数１０以上２２以下が好ましく、１０以上１８以下がより好ましく、１２以上１８以下がさらに好ましく、１２以上１６以下がよりさらに好ましく、１２以上１４以下が特に好ましい。
好ましい第２級アルコールの具体例としては、２−デカノール、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノール、２−ヘプタデカノール、２−オクタデカノール、３−デカノール、３−ウンデカノール、３−ドデカノール、３−トリデカノール、３−テトラデカノール、３−ペンタデカノール、３−ヘキサデカノール、３−ヘプタデカノール、３−オクタデカノール、４−デカノール、４−ウンデカノール、４−ドデカノール、４−トリデカノール、４−テトラデカノール、４−ペンタデカノール、４−ヘキサデカノール、４−ヘプタデカノール、４−オクタデカノール等の２級飽和又は不飽和アルコール等が挙げられる。
好ましいケトンの具体例としては、２−デカノン、２−ウンデカノン、２−ドデカノン、２−トリデカノン、２−テトラデカノン、２−ペンタデカノン、２−ヘキサデカノン、２−ヘプタデカノン、２−オクタデカノン、３−デカノン、３−ウンデカノン、３−ドデカノン、３−トリデカノン、３−テトラデカノン、３−ペンタデカノン、３−ヘキサデカノン、３−ヘプタデカノン、３−オクタデカノン、４−デカノン、４−ウンデカノン、４−ドデカノン、４−トリデカノン、４−テトラデカノン、４−ペンタデカノン、４−ヘキサデカノン、４−ヘプタデカノン、４−オクタデカノンなどの飽和または不飽和ケトンが挙げられる。
なかでも炭素原子数１０以上１８以下の直鎖アルキル基の第２級アルコールを用いることが好ましく、２−ウンデカノール、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノール、２−ヘキサデカノールがより好ましく、２−ドデカノール、２−トリデカノール、２−テトラデカノール、２−ペンタデカノールがさらに好ましく、２−テトラデカノールがよりさらに好ましい。
前記糖は、入手性及び取り扱い性の向上の観点から、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物（水あめ）、セルロース加水分解物、又は廃糖蜜（モラセス）が好ましい。なかでも、得られた化合物を界面活性剤として用いる観点から、グルコース、マルトース、又は廃糖蜜がより好ましく、グルコースがさらに好ましい。
The medium for culturing the transformant contains at least one of a secondary alcohol and a ketone, and a sugar as a raw material for synthesizing the compound represented by the general formula (I).
The raw material for directly synthesizing the compound represented by the general formula (I) is a secondary alcohol, but a ketone that is a precursor thereof can be used as a raw material as well. For example, in literature: A. Brakemeier et al. Biotechnology Letters (1998) 20, 215-218, Candida Bonbicola uses a ketone that is a precursor of a secondary alcohol, and an alkylpolyglycoside containing the secondary alcohol is described. It has been reported to synthesize.
From the viewpoint of using the obtained compound as a surfactant, the secondary alcohol and ketone preferably have 10 or more carbon atoms, and more preferably 12 or more. Moreover, 22 or less carbon atoms are preferable, 18 or less are more preferable, 16 or less are more preferable, and 14 or less are more preferable. Furthermore, 10 or more and 22 or less carbon atoms are preferable, 10 or more and 18 or less are more preferable, 12 or more and 18 or less are more preferable, 12 or more and 16 or less are more preferable, and 12 or more and 14 or less are especially preferable.
Specific examples of preferable secondary alcohol include 2-decanol, 2-undecanol, 2-dodecanol, 2-tridecanol, 2-tetradecanol, 2-pentadecanol, 2-hexadecanol, 2-heptadecanol. 2-octadecanol, 3-decanol, 3-undecanol, 3-dodecanol, 3-tridecanol, 3-tetradecanol, 3-pentadecanol, 3-hexadecanol, 3-heptadecanol, 3-octa Decanol, 4-decanol, 4-undecanol, 4-dodecanol, 4-tridecanol, 4-tetradecanol, 4-pentadecanol, 4-hexadecanol, 4-heptadecanol, 4-octadecanol, etc. Secondary saturated or unsaturated alcohol, etc. are mentioned.
Specific examples of preferred ketones include 2-decanone, 2-undecanone, 2-dodecanone, 2-tridecanone, 2-tetradecanone, 2-pentadecanone, 2-hexadecanone, 2-heptadecanone, 2-octadecanone, 3-decanone, 3- Undecanone, 3-dodecanone, 3-tridecanone, 3-tetradecanone, 3-pentadecanone, 3-hexadecanone, 3-heptadecanone, 3-octadecanone, 4-decanone, 4-undecanone, 4-dodecanone, 4-tridecanone, 4-tetradecanone, Examples thereof include saturated or unsaturated ketones such as 4-pentadecanone, 4-hexadecanone, 4-heptadecanone, and 4-octadecanone.
Among them, it is preferable to use a secondary alcohol having a linear alkyl group having 10 to 18 carbon atoms, such as 2-undecanol, 2-dodecanol, 2-tridecanol, 2-tetradecanol, 2-pentadecanol, 2 -Hexadecanol is more preferable, 2-dodecanol, 2-tridecanol, 2-tetradecanol and 2-pentadecanol are more preferable, and 2-tetradecanol is further more preferable.
The sugar is preferably glucose, sucrose, fructose, maltose, starch hydrolyzate (water starch), cellulose hydrolyzate, or molasses (molasses) from the viewpoints of availability and handling. Among these, from the viewpoint of using the obtained compound as a surfactant, glucose, maltose, or molasses is more preferable, and glucose is more preferable.
第２級アルコール、ケトン及び糖以外の培地成分は、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合、炭素源としてソルビトールやグリセリン等の糖アルコール類、クエン酸などの有機酸類等、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア水、尿素、大豆タンパク質、麦芽エキス、アミノ酸、ペプトン、コーンスティーブリカー等、無機塩類としてマンガン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄イオン、銅イオン、硫酸塩、リン酸塩等、ビタミン類としてビオチン、イノシトール等を用いることができる。
特に、宿主が酵母の場合には、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、尿素等、無機塩類として硫酸マグネシウム・７水和物、塩化ナトリウム、塩化カルシウム・２水和物、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等を用いることが好ましい。場合によっては消泡剤などを添加してもよい。
Medium components other than the secondary alcohol, ketone, and sugar can be appropriately selected depending on the type of the host.
For example, when the host is a microorganism, sugar sources such as sorbitol and glycerin as the carbon source, organic acids such as citric acid, etc., yeast extract, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium phosphate, aqueous ammonia, urea, soybean protein as the nitrogen source , Malt extract, amino acid, peptone, corn steep liquor, etc., inorganic salts such as manganese salt, magnesium salt, calcium salt, sodium salt, iron ion, copper ion, sulfate, phosphate etc., vitamins such as biotin, inositol, etc. Can be used.
In particular, when the host is yeast, yeast extract, ammonium chloride, urea and the like as nitrogen sources, magnesium sulfate heptahydrate, sodium chloride, calcium chloride dihydrate, potassium dihydrogen phosphate as inorganic salts, It is preferable to use dipotassium hydrogen phosphate or the like. In some cases, an antifoaming agent or the like may be added.
形質転換体の培養条件も、宿主の種類に応じて適宜好ましい培養条件を選択することができる。
例えば、宿主が微生物の場合には、培地のｐＨは２．５〜９．０程度に調節することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は６〜２００時間程度が好ましく、２４〜１４８時間程度がより好ましい。必要により通気や攪拌を加えてもよい。
特に、宿主が酵母の場合には、培地のｐＨは用いる酵母が生育し得る範囲、例えば、ｐＨ３．０〜８．０程度に調節することが好ましい。培養温度は１５〜３５℃程度が好ましく、２８〜３２℃程度がより好ましい。培養時間は４８〜１４８時間程度が好ましく、振盪又は通気撹拌培養することが好ましい。
As for the culture conditions of the transformant, preferable culture conditions can be appropriately selected according to the type of host.
For example, when the host is a microorganism, the pH of the medium is preferably adjusted to about 2.5 to 9.0. The pH may be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. The culture temperature is preferably about 15 to 35 ° C, more preferably about 25 to 32 ° C. The culture time is preferably about 6 to 200 hours, more preferably about 24 to 148 hours. If necessary, aeration or stirring may be added.
In particular, when the host is yeast, it is preferable to adjust the pH of the medium to a range where the yeast to be used can grow, for example, about pH 3.0 to 8.0. The culture temperature is preferably about 15 to 35 ° C, more preferably about 28 to 32 ° C. The culture time is preferably about 48 to 148 hours, preferably cultured with shaking or aeration and stirring.
形質転換体を培養し前記一般式（Ｉ）で表される化合物を産生させた後、培養物（培養体や培養液等）から当該化合物を単離、精製等して回収する。
前記一般式（Ｉ）で表される化合物を単離、回収する方法としては特に限定されず、通常微生物の培養上清からアルキルポリグリコシド成分を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、疎水やイオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理等の方法を用いることができる。
After the transformant is cultured to produce the compound represented by the general formula (I), the compound is isolated and purified from the culture (cultured body, culture solution, etc.) and recovered.
The method for isolating and recovering the compound represented by the general formula (I) is not particularly limited, and can be carried out by a method usually used for isolating an alkylpolyglycoside component from a culture supernatant of a microorganism. . For example, methods such as adsorption / desorption with hydrophobic or ion exchange resins, solid-liquid separation by crystallization, membrane treatment, and the like can be used.
本発明の製造方法は、アルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を用いることで、原料の第２級アルコールやケトンに対し、高い収率でアルキルポリグリコシドを生産することができる。さらに、本発明の方法は、微生物等を用いた方法であり、常温・常圧下で行うことができる。そのため、原料である糖の変性が抑えられ、より効率的にアルキルポリグリコシドを生産することができる。 The production method of the present invention can produce an alkylpolyglycoside in a high yield with respect to the raw material secondary alcohol or ketone by using a transformant having reduced alcohol oxidase activity. Furthermore, the method of the present invention is a method using a microorganism or the like, and can be performed at normal temperature and normal pressure. Therefore, denaturation of sugar as a raw material is suppressed, and alkylpolyglycoside can be produced more efficiently.
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、化合物を開示する。 This invention discloses the following methods and compounds further regarding embodiment mentioned above.
＜１＞ 下記（１）及び（２）の工程を含む、前記一般式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１又は数個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から前記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
<1> A method for producing a compound represented by the general formula (I), comprising the following steps (1) and (2).
(1) Transformation in which a gene having a gene encoding any one of the following proteins (a) to (c) is deleted, mutated or suppressed, and alcohol oxidase activity is reduced compared to the host A step of culturing a body in a medium containing a secondary alcohol or ketone and sugar (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 50% Or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more of the amino acid sequence having the alcohol oxidase activity (c) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 In which one or several, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3 amino acids are deleted. Comprising the steps of: obtaining substitution, insertion, or addition of one amino acid sequence, and a compound represented by the general formula from the culture obtained protein (2) having alcohol oxidase activity (I)
＜２＞ 前記宿主が微生物である、＜１＞項記載の方法。
＜３＞ 前記微生物が酵母である、＜２＞項記載の方法。
＜４＞ 前記酵母がカンジダ（Candida）属に属する菌類である、＜３＞項記載の方法。
＜５＞ 前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、＜４＞項記載の方法。
＜６＞ 前記カンジダ（Candida）属に属する菌類が、Candida bombicolaである、＜５＞項記載の方法。
＜７＞ 前記第２級アルコール又はケトンの炭素原子数が１０以上、好ましくは１２以上であり、２２以下、好ましくは１８以下、より好ましくは１６以下、さらに好ましくは１４以下である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞ 前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子又はメチル基である、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞ 前記一般式（Ｉ）において、Ｒ２が水素原子又はメチル基である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞ 前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と５５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
<2> The method according to <1>, wherein the host is a microorganism.
<3> The method according to <2>, wherein the microorganism is yeast.
<4> The method according to <3>, wherein the yeast is a fungus belonging to the genus Candida .
<5> The Candida (Candida) belonging to the genus fungi, Candida bombicola, Candida apicola, Candida batistae, Candida floricola, Candida riodocensis, and selected from the group consisting of Candida stellata, <4> The method according to claim.
<6> The method according to <5>, wherein the fungus belonging to the genus Candida is Candida bombicola .
<7> The number of carbon atoms of the secondary alcohol or ketone is 10 or more, preferably 12 or more, 22 or less, preferably 18 or less, more preferably 16 or less, and even more preferably 14 or less. <1> The method of any one of-<6>.
<8> The method according to any one of <1> to <7>, wherein in general formula (I), R1 is a hydrogen atom or a methyl group.
<9> The method according to any one of <1> to <8>, wherein in general formula (I), R2 is a hydrogen atom or a methyl group.
<10> Any of <1> to <9>, wherein the gene encoding the protein of any one of (a) to (c) is a gene comprising any of the following DNAs (d) to (f): The method according to claim 1.
(D) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
(E) consisting of a base sequence having the identity of 55% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and alcohol oxidase activity DNA encoding a protein having
(F) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that encodes a protein having alcohol oxidase activity
＜１１＞ 前記一般式（ＩＩ）で表される化合物。 <11> A compound represented by the general formula (II).
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
［培地、培養条件］
カンジダ（Candida）属酵母の培養には、以下の培地を使用した。各培地は、121℃、20分のオートクレーブ後に混ぜ合わせて使用した。
また、前培養はφ24mm×200mm大型試験管（YPD培地5mL仕込み）にて30℃、250rpmで48時間振盪培養した種培養液を、φ24mm×200mm大型試験管（AG生産培地5mL仕込み）に2％（v/v）植菌し、30℃、250rpmで振盪培養した。
YPD培地： 1% (D)-グルコース、1% BactoTM Yeast Extract（日本BD社製）、1% BactoTM Tryptone（日本BD社製）
AG生産培地： 15% (D)-グルコース、0.41% クエン酸3ナトリウム（無水）、0.4% BactoTM Yeast Extract、0.154% 塩化アンモニウム、0.07% 硫酸マグネシウム・７水和物、0.05% 塩化ナトリウム、0.027% 塩化カルシウム・2水和物、0.1% リン酸2水素カリウム、0.012% リン酸水素2カリウム （1M HClにてpH 5.8に調整）
最小培地： 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids（日本BD社製）、2％(D)-グルコース
アルコール資化培地： 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids（日本BD社製）、0.05% BactoTM Yeast Extract、2％炭素源
[Medium, culture conditions]
The following media were used for culturing Candida yeast. Each medium was mixed and used after autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes.
Pre-culture is 2% in a 24 mm x 200 mm large test tube (5 mL of AG production medium) with a seed culture solution that has been shaken for 48 hours at 30 ° C and 250 rpm in a large 24 mm x 200 mm test tube (5 mL YPD medium). (V / v) Inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. and 250 rpm.
YPD medium: 1% (D) -glucose, 1% Bacto ™ Yeast Extract (made by BD Japan), 1% Bacto ™ Tryptone (made by BD Japan)
AG production medium: 15% (D) -glucose, 0.41% trisodium citrate (anhydrous), 0.4% Bacto TM Yeast Extract, 0.154% ammonium chloride, 0.07% magnesium sulfate heptahydrate, 0.05% sodium chloride, 0.027 % Calcium chloride dihydrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.012% dipotassium hydrogen phosphate (adjusted to pH 5.8 with 1M HCl)
Minimum medium: 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids (Japan BD), 2% (D) -glucose alcohol assimilation medium: 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids (Japan BD), 0.05% Bacto TM Yeast Extract, 2% carbon source
［ゲノムＤＮＡ抽出］
カンジダ・ボンビコーラのゲノムＤＮＡは、φ24mm×200mm大型試験管（YPD培地、5mL仕込み）にて30℃、250rpmにて48時間振盪培養した培養液を、4℃、15000rpmにて1分遠心分離し集めた菌体から、Genとるくん(酵母用)High Recovery（タカラバイオ社製）によって抽出した。
［ＰＣＲ］
ＰＣＲ反応にはPrimeStar Max DNA Polymelase（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従い操作した。
[Genomic DNA extraction]
Candida bon cola genomic DNA was collected by centrifuging for 1 hour at 4 ° C and 15000 rpm after culturing for 48 hours at 30 ° C and 250 rpm in a φ24 mm × 200 mm large test tube (YPD medium, 5 mL). The cells were extracted with Gen Toru-kun (for yeast) High Recovery (Takara Bio).
[PCR]
For the PCR reaction, PrimeStar Max DNA Polymelase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used and operated according to the attached protocol.
実施例
１．ＡＯＸ１遺伝子欠損株の構築
（１）AOX1遺伝子欠失用プラスミドの構築
配列番号２に示すカンジダ・ボンビコーラのアルコールオキシダーゼ遺伝子（以下、AOX1遺伝子）欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを、下記の手法で構築した。
pUC-ΔAOXは、AOX1遺伝子の上流約1000bp、及び下流約1000bpの領域と相補する配列を有し、当該領域間にura3遺伝子が挿入されるよう設計した。
カンジダ・ボンビコーラ KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すＰＣＲプライマーAOX1 US in F1（配列番号３）及びAOX1 US-ura R（配列番号４）、Pura3 F（配列番号５）及びura3 R（配列番号６）、ura-AOX1 LS F（配列番号７）、AOX1 LS in R1（配列番号８）を用い、AOX1遺伝子の上流約1000bpの領域、ura3遺伝子、AOX1遺伝子の下流約1000bpの領域のＤＮＡ断片を増幅した。
次に、プラスミドpUC118を鋳型とし、表１に示すＰＣＲプライマーpUC in F2（配列番号９）及びpUC in R2（配列番号１０）を用いてプラスミド領域を増幅し、これをInfusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて、上記のＤＮＡ断片と結合した。得られたプラスミドを、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上にて培養し、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的のAOX1遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを得た。
Example 1. Construction of AOX1 gene deficient strain (1) Construction of plasmid for deletion of AOX1 gene The plasmid pUC-ΔAOX for deletion of Candida bonbicola alcohol oxidase gene (hereinafter referred to as AOX1 gene) shown in SEQ ID NO: 2 was constructed by the following method. .
pUC-ΔAOX has a sequence complementary to a region of about 1000 bp upstream and about 1000 bp downstream of the AOX1 gene, and was designed so that the ura3 gene is inserted between the regions.
Using the genomic DNA extracted from Candida bonbicola KSM36 as a template, PCR primers AOX1 US in F1 (SEQ ID NO: 3), AOX1 US-ura R (SEQ ID NO: 4), Pura3 F (SEQ ID NO: 5) and ura3 shown in Table 1 Using R (SEQ ID NO: 6), ura-AOX1 LS F (SEQ ID NO: 7), and AOX1 LS in R1 (SEQ ID NO: 8), a region of about 1000 bp upstream of the AOX1 gene, a region of about 1000 bp downstream of the ura3 gene and the AOX1 gene The DNA fragment was amplified.
Next, using the plasmid pUC118 as a template, the plasmid region was amplified using the PCR primers pUC in F2 (SEQ ID NO: 9) and pUC in R2 (SEQ ID NO: 10) shown in Table 1, and this was amplified into an Infusion HD Cloning Kit (Clontech). Was used to bind to the above DNA fragment. The obtained plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α and cultured on an LB agar medium containing 100 ppm of ampicillin sodium salt, and the grown colonies were isolated as transformants. A plasmid was extracted from the obtained transformant to obtain a desired plasmid pUC-ΔAOX for AOX1 gene deletion.
（２）カンジダ・ボンビコーラ AOX1遺伝子欠失株の構築
M. D. DE. Backerら， Yeast（1999）， 15，p.1609-1618.の手法に従い、pUC-ΔAOXを用いてKSMΔura3株を形質転換した。
I. V. Bogaertら， Yeast（2008），25，p.273−278.に記載の手法により、カンジダ・ボンビコーラ KSM36株より、ウラシル要求性株を選抜した。さらに、ウラシル要求性株の中から、ura3遺伝子領域に変異が挿入された株を選抜し、KSMΔura3株とした。
KSM36株とKSMΔura3株のura3遺伝子領域の配列を解析したところ、KSMΔura3株では、一塩基変異により、54位のシステイン（Cys）がチロシン（Tyr）に変化していた。KSMΔura3株は最小培地では生育できず、5-フルオロオロチン酸添加YPD培地、及びウラシル添加最小培地にて生育可能であった。また、KSMΔura3株に、カンジダ・ボンビコーラ NBRC10243株由来の野生型ura3遺伝子を、上記IAN Van Bogaertらの手法にて導入したところ、最小培地にて生育可能となった。また、本菌株は、培地にウラシルを添加した場合、ソホロリピッド生産能は親株であるKSM36株と同等であった。
KSMΔura3株を300ppmのウラシルを添加したYPD培地5mLに植菌し、30℃、250rpm、48時間前培養した。培養液0.5mLを300ppmのウラシルを添加したYPD培地50mLに接種し、30℃、120rpmで約6時間培養した。生育した菌体を集菌した後、氷冷した滅菌水20mLで菌体を2回洗浄した。菌体を、氷冷した1mLの1M ソルビトール溶液に懸濁し、5000rpmで5分間遠心し、上清を捨てた後、400μLの1M ソルビトールを加えて懸濁した。菌体懸濁液を50μLずつ分注し、pUC-ΔAOXを2.5μg加えた。菌体懸濁液を、BIO-RAD GENE PULSER II（バイオラッド社製）を用いてエレクトロポレーションした後、1M ソルビトールを含む最小培地にまいて、30℃で1週間培養した。
得られた形質転換体から、ＰＣＲ法により、AOX1遺伝子の上流及び下流領域での二重交叉による相同組換えが生じた株を選抜した。得られた形質転換体よりゲノムDNAを抽出し、表１に示すプライマーAOX1 US in F1（配列番号３）及びAOX1 LS in R1（配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。この結果、得られた形質転換体あたり７０％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔAOX株とした。
(2) Candida bonbicola AOX1 gene deletion strain construction
According to the method of MD DE. Backer et al., Yeast (1999), 15, p.1609-1618., KUCΔura3 strain was transformed with pUC-ΔAOX.
A uracil-requiring strain was selected from Candida bonbicola KSM36 strain by the method described in IV Bogaert et al., Yeast (2008), 25, p.273-278. Furthermore, a strain in which a mutation was inserted into the ura3 gene region was selected from uracil-requiring strains and designated as KSMΔura3 strain.
When the sequences of the ura3 gene region of KSM36 and KSMΔura3 strains were analyzed, cysteine (Cys) at position 54 was changed to tyrosine (Tyr) due to a single base mutation in KSMΔura3 strain. The KSMΔura3 strain could not grow on the minimal medium, but could grow on the YPD medium supplemented with 5-fluoroorotic acid and the minimal medium supplemented with uracil. Further, when the wild type ura3 gene derived from Candida bonbicola NBRC10243 strain was introduced into the KSMΔura3 strain by the method of IAN Van Bogaert et al., It became possible to grow on the minimum medium. In addition, when uracil was added to the medium, this strain had the same ability to produce sophorolipid as the parent strain KSM36.
KSMΔura3 strain was inoculated into 5 mL of YPD medium supplemented with 300 ppm of uracil and pre-cultured at 30 ° C., 250 rpm for 48 hours. 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of YPD medium supplemented with 300 ppm of uracil, and cultured at 30 ° C. and 120 rpm for about 6 hours. After the grown cells were collected, the cells were washed twice with 20 mL of ice-cooled sterilized water. The cells were suspended in ice-cold 1 mL of 1 M sorbitol solution, centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and 400 μL of 1 M sorbitol was added to suspend. 50 μL of the cell suspension was dispensed and 2.5 μg of pUC-ΔAOX was added. The cell suspension was electroporated using BIO-RAD GENE PULSER II (manufactured by Bio-Rad), then spread on a minimal medium containing 1M sorbitol and cultured at 30 ° C. for 1 week.
From the obtained transformant, a strain in which homologous recombination occurred by double crossover in the upstream and downstream regions of the AOX1 gene was selected by PCR. Genomic DNA was extracted from the obtained transformant, and PCR was performed using primers AOX1 US in F1 (SEQ ID NO: 3) and AOX1 LS in R1 (SEQ ID NO: 8) shown in Table 1. As a result, a homologous recombination strain by double crossover was obtained with a probability of 70% per obtained transformant, and this was designated as KSMΔAOX strain.
（３）カンジダ・ボンビコーラ ウラシル遺伝子導入株の構築
AOX1遺伝子欠失株の対照菌株として、KSMΔura株に、AOX1遺伝子が欠失しないように、野生型ura3遺伝子をKSMΔura株の変異ura3領域に導入した株を作製した。
カンジダ・ボンビコーラ KSM36株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すプライマーPura3 F（配列番号５）、及びura3 R2（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ法にてura3領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Mighty Cloning Reagent Set Blunt End（タカラバイオ社製）を用いて、pUC118DNA HincII/BAP（タカラバイオ社製）へ挿入し、プラスミドpUC-ura3を得た。
プラスミドpUC-ura3を用い、上記（２）と同様の手法にてKSMΔura株に導入した。得られた形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、プラスミド領域に設計したプライマーpUC seq 1（配列番号１２）及びpUC seq 2（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲによる組換えの確認を行った。この結果、得られた形質転換体あたり１１％の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔura-ura株とした。
(3) Construction of Candida bonvicola uracil transgenic strain
As a control strain for the AOX1 gene deletion strain, a strain was prepared by introducing the wild type ura3 gene into the mutant ura3 region of the KSMΔura strain so that the AOX1 gene was not deleted in the KSMΔura strain.
Using the genomic DNA extracted from Candida bonbicola KSM36 as a template, using the primers Pura3 F (SEQ ID NO: 5) and ura3 R2 (SEQ ID NO: 11) shown in Table 1, the DNA fragment in the ura3 region is amplified by PCR. did. The obtained DNA fragment was inserted into pUC118DNA HincII / BAP (Takara Bio Inc.) using Mighty Cloning Reagent Set Blunt End (Takara Bio Inc.) to obtain a plasmid pUC-ura3.
The plasmid pUC-ura3 was used and introduced into the KSMΔura strain in the same manner as in (2) above. Genomic DNA was extracted from the obtained transformant, and recombination was confirmed by PCR using primers pUC seq 1 (SEQ ID NO: 12) and pUC seq 2 (SEQ ID NO: 13) designed in the plasmid region. As a result, a homologous recombination strain by double crossover was obtained with a probability of 11% per transformant obtained, and this was designated as a KSMΔura-ura strain.
２．アルコールオキシダーゼ活性の測定
カンジダ・ボンビコーラ KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて30℃、250rpm、48時間、前培養した。前培養液を、炭素源として(Ｄ)-グルコース、及び１-ヘキサデカノールを10g/Lずつ添加したアルコール資化培地に1％植菌し、30℃、250rpmにて48時間培養した。培養後の菌体からミクロソーム膜タンパク質画分を調製し、アルコールオキシダーゼ活性（AOX活性）を測定した。なお、微生物のアルコールオキシダーゼは膜タンパク質画分に局在することが知られている。
2. Measurement of alcohol oxidase activity Candida bonbicola strains KSMΔura-ura and KSMΔAOX were pre-cultured in YPD medium at 30 ° C., 250 rpm for 48 hours. 1% of the preculture was inoculated into an alcohol assimilation medium supplemented with 10 g / L each of (D) -glucose and 1-hexadecanol as a carbon source, and cultured at 30 ° C. and 250 rpm for 48 hours. A microsomal membrane protein fraction was prepared from the cultured cells and the alcohol oxidase activity (AOX activity) was measured. Microbial alcohol oxidase is known to be localized in the membrane protein fraction.
ミクロソーム膜タンパク質画分の調製、及びアルコールオキシダーゼ活性の測定は、G. D. Kempら，Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988)， 29，p．370-374記載の方法に従い行った。
［ミクロソーム膜タンパク質画分の調製］
培養後の菌体20mLを、8000rpm、4℃にて10min遠心して集菌した後、菌体を10mLの生理食塩水で2回洗浄した。菌体を1/15M リン酸バッファー（pH7.4） 500μLを加え懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械製）、及び媒体に0.5mmグラスビーズを用いて破砕した。500μLの1/15M リン酸バッファー（pH7.4）を添加、混合し、破砕液を4℃、3000gで5分遠心し、破砕されなかった菌体を除去した。上清を4℃、20000gで60分遠心し、ミトコンドリアとペルオキシソーム画分を除去した。残った上清を回収し、4℃、100000gで90分遠心し、沈殿を回収し200μLの1/15M リン酸バッファー（pH7.4）を添加し懸濁した。この懸濁液を、ミクロソーム膜タンパク質画分として、以下のアルコールオキシダーゼ活性の測定に用いた。
Preparation of microsomal membrane protein fractions and measurement of alcohol oxidase activity are described in GD Kemp et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988), 29, p. This was performed according to the method described in 370-374.
[Preparation of microsomal membrane protein fraction]
20 mL of the cultured cells were collected by centrifugation at 8000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and then the cells were washed twice with 10 mL of physiological saline. The cells were suspended by adding 500 μL of 1/15 M phosphate buffer (pH 7.4), and disrupted using a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai) and 0.5 mm glass beads as the medium. 500 μL of 1/15 M phosphate buffer (pH 7.4) was added and mixed, and the disrupted solution was centrifuged at 3000 g for 5 minutes at 4 ° C. to remove unbroken cells. The supernatant was centrifuged at 20000 g for 60 minutes at 4 ° C. to remove mitochondria and peroxisome fraction. The remaining supernatant was recovered and centrifuged at 100 ° C. for 90 minutes at 4 ° C., and the precipitate was recovered and suspended by adding 200 μL of 1/15 M phosphate buffer (pH 7.4). This suspension was used as a microsomal membrane protein fraction for the following measurement of alcohol oxidase activity.
［アルコールオキシダーゼ活性の測定］
0.1M リン酸バッファー（pH7.4） 100μL、2.8g/L 2,2’-azino-di [3-ethylbenzothiazoline-(6)-sulfonic acid]（ABTS）溶液 50μL、horseradish peroxidase 47units/mL溶液 30μL、及びミクロソーム膜タンパク質画分 10μLを混合し、30℃で5分インキュベートした。その後、5mM 1-ドデカノール DMSO溶液 10μLを添加し、0分、及び5分後の405nmにおける吸光度を測定した。アルコールオキシダーゼは、1μmolのアルコールを酸化し、2μmolのラジカルカチオンを産生する。1mMのラジカルカチオン型ABTSは405nmで18.4の吸光度を示すが、これは0.5mMの酸化された基質と同義である。そこで、1分間に0.0368の吸光度変化を、アルコールオキシダーゼ活性の1Uと定義した。
ミクロソーム膜タンパク質１ｇあたりのアルコールオキシダーゼ活性を図１に示す。
[Measurement of alcohol oxidase activity]
0.1M phosphate buffer (pH7.4) 100μL, 2.8g / L 2,2'-azino-di [3-ethylbenzothiazoline- (6) -sulfonic acid] (ABTS) solution 50μL, horseradish peroxidase 47units / mL solution 30μL, And 10 μL of the microsomal membrane protein fraction were mixed and incubated at 30 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 10 μL of 5 mM 1-dodecanol DMSO solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured after 0 and 5 minutes. Alcohol oxidase oxidizes 1 μmol of alcohol to produce 2 μmol of radical cation. 1 mM radical cation ABTS has an absorbance of 18.4 at 405 nm, which is synonymous with 0.5 mM oxidized substrate. Therefore, an absorbance change of 0.0368 per minute was defined as 1 U of alcohol oxidase activity.
The alcohol oxidase activity per gram of microsomal membrane protein is shown in FIG.
図１から明らかなように、AOX1遺伝子が欠失したKSMΔAOX株は、KSMΔura-ura株と比べて、アルコールオキシダーゼ活性が大幅に低下した。 As apparent from FIG. 1, the alcohol oxidase activity of the KSMΔAOX strain lacking the AOX1 gene was significantly reduced compared to the KSMΔura-ura strain.
３．KSMΔAOX株のジオール型アルキルポリグリコシド生産性
KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて、30℃、250rpmで48時間前培養した。前培養液を、AG生産培地30mL仕込み500mL坂口フラスコに2%植菌し、30℃、120rpmにて48時間培養した後、基質として２-テトラデカノールを10g/Lとなるよう添加した。
基質添加から72時間培養後の培養液を、下記のLC-MS分析及びGC分析に供した。
3. Productivity of diol type alkyl polyglycoside of KSMΔAOX strain
KSMΔura-ura strain and KSMΔAOX strain were pre-cultured in YPD medium at 30 ° C. and 250 rpm for 48 hours. The preculture solution was inoculated with 30% of AG production medium and 2% inoculated into a 500 mL Sakaguchi flask. After culturing at 30 ° C. and 120 rpm for 48 hours, 2-tetradecanol as a substrate was added to 10 g / L.
The culture solution after 72 hours of culture from the addition of the substrate was subjected to the following LC-MS analysis and GC analysis.
［LC-MS分析］
装置はUFLC 20A-LCMS 2020（島津製作所社製）を用い、カラムとしてL-column ODS 4.6 x 150mm, 5μm（化学物質評価研究機構）を用いた。溶離液Aに0.01M 酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Bに0.01M酢酸アンモニウムメタノール溶液を用い、流量1mL/分、カラムオーブン温度40℃、50%（5分）→20%/min→90%→95%（5分）→100%（30分）のタイムプログラムにて行った。検出はネガティブイオンモードにて行った。
[LC-MS analysis]
The apparatus used was UFLC 20A-LCMS 2020 (manufactured by Shimadzu Corporation), and L-column ODS 4.6 x 150 mm, 5 μm (Chemicals Evaluation and Research Institute) was used as the column. Using 0.01M ammonium acetate aqueous solution as eluent A and 0.01M ammonium acetate methanol solution as eluent B, flow rate 1mL / min, column oven temperature 40 ° C, 50% (5 min) → 20% / min → 90% → 95 The time program was set from% (5 minutes) to 100% (30 minutes). Detection was performed in negative ion mode.
LC-MS分析の結果、KSMΔura-ura株の培養液では、10.5分に[M-H−]：579.5、11分に[M-H−]：621.5のピークが確認された。KSMΔAOX株の培養液では、上記の2ピークに加え、9分に[M-H−]：637.5のピークが確認された。文献：S. Fleurackers., et. al., (2010) Eur. J. Lipid Sci. Technol., 112, 655-662によれば、ジアセチルドデシルソホロシドがカンジダ・ボンビコーラにより生成し、その分子量が594であると報告されている。これらのことから、11分のピークはジアセチル-2-テトラデシルソホロシド、10.5分のピークはアセチル-2-テトラデシルソホロシドと考えられた。一方、KSMΔAOX株でのみ認められた9分の[M-H−]：637.5のピークは、ジアセチル-2-テトラデシルソホロシドに分子量16が付加され、かつピークの溶出位置が高極性側にシフトしていることから、ジアセチル-2-テトラデシルソホロシドのいずれかの位置に水酸基が付加されたものと考えられた。そこで次に、水酸基の付加位置をGC-MS分析により解析した。 As a result of LC-MS analysis, in the culture solution of KSMΔura-ura strain, a peak of [MH − ]: 579.5 at 10.5 minutes and [MH − ]: 621.5 at 11 minutes was confirmed. In the culture solution of KSMΔAOX strain, in addition to the above two peaks, a peak of [MH − ]: 637.5 was confirmed at 9 minutes. Literature: S. Fleurackers., Et. Al., (2010) According to Eur. J. Lipid Sci. Technol., 112, 655-662, diacetyldodecylsophoroside is produced by Candida bonbicola and its molecular weight is It is reported to be 594. From these facts, the peak at 11 minutes was considered to be diacetyl-2-tetradecylsophoroside and the peak at 10.5 minutes was considered to be acetyl-2-tetradecylsophoroside. On the other hand, the [MH-]: 637.5 peak, which was only observed in the KSMΔAOX strain, had a molecular weight of 16 added to diacetyl-2-tetradecylsophoroside, and the peak elution position shifted to the high polarity side. Therefore, it was considered that a hydroxyl group was added to any position of diacetyl-2-tetradecylsophoroside. Therefore, the position of hydroxyl group addition was analyzed by GC-MS analysis.
［GC-MS分析］
培養液5mLより内部標準として１-オクタデカノールを0.05%添加した１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った。次に、遠心エヴァポレーターにて乾固し、１M NaOH水溶液を添加し、100℃で4時間処理した。続いて、１-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った後、遠心エヴァポレーターにて乾固し、トリメチルシリル（TMS）化試薬を用いて誘導体化した。TMS化したサンプルを以下のGC-FID、及びGC-MS法にて解析し、アルキルポリグリコシド生産量、及び残存基質量を得た。
GCは、装置として7890A（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1 ms 25m×0.20mm×330μm（J&W scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1分）→10℃/分→300℃（10分）にて行った。標準物質としてｎ−ドデシルマルトシド（CALBIOCHEM社製）を用い、18分から22分に検出されるアルキルポリグルコシド由来のピークを積算し、アルキルポリグルコシド量として算出した。
GC-MSは、装置として7890A-5975C（アジレント・テクノロジー社製）、カラムとしてDB-1 ms 25m×0.20mm×330μm（J&W scientific社製）、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃（1min）→10℃/min→300℃（20min）にて行った。
[GC-MS analysis]
Extraction was performed twice from 5 mL of the culture solution with 2.5 mL of 1-butanol to which 0.05% of 1-octadecanol was added as an internal standard. Next, it was dried with a centrifugal evaporator, 1M NaOH aqueous solution was added, and the mixture was treated at 100 ° C. for 4 hours. Subsequently, the mixture was extracted twice with 2.5 mL of 1-butanol, then dried to dryness with a centrifugal evaporator, and derivatized with a trimethylsilyl (TMS) reagent. The TMS sample was analyzed by the following GC-FID and GC-MS methods to obtain alkyl polyglycoside production and residual group mass.
GC is 7890A (manufactured by Agilent Technologies) as the instrument, DB-1 ms 25m × 0.20mm × 330μm (manufactured by J & W scientific) as the column, high purity helium as the mobile phase, flow rate 1mL / min, temperature rising program It was performed at 100 ° C. (1 minute) → 10 ° C./minute→300° C. (10 minutes). Using n-dodecyl maltoside (manufactured by CALBIOCHEM) as a standard substance, peaks derived from alkylpolyglucoside detected from 18 minutes to 22 minutes were integrated and calculated as the amount of alkylpolyglucoside.
GC-MS is 7890A-5975C (manufactured by Agilent Technologies) as the instrument, DB-1 ms 25m x 0.20mm x 330μm (manufactured by J & W scientific) as the column, high-purity helium as the mobile phase, and a flow rate of 1mL / min. The temperature rising program was 100 ° C. (1 min) → 10 ° C./min→300° C. (20 min).
GC分析の結果を図２に示す。なお、図２において、2-C14olは２−テトラデカノール、ISは内部標準として用いた１−オクタデカノール、2-C14ol由来AGは２−テトラデカノールにソホロシドが付加した下記構造式Ａで表される化合物由来のピークをそれぞれ示す。 The results of GC analysis are shown in FIG. In FIG. 2, 2-C14ol is 2-tetradecanol, IS is 1-octadecanol used as an internal standard, and 2-C14ol-derived AG is the following structural formula A in which sophoroside is added to 2-tetradecanol. Each peak derived from the represented compound is shown.
図２に示すように、第２級アルコールである２-テトラデカノールを原料とした場合、KSMΔura-ura株では、2-C14ol由来AGのメインピーク以外に、高沸点側に副産物ピーク３が確認された。３のピークは野生株であるKSM36株の培養時にも観察された（図示せず）。一方、KSMΔAOX株では、KSMΔura-ura株と同様に３のピークが確認された他、KSMΔura-ura株にはないピーク４及び５が高沸点側に確認された。さらに、２-テトラデカノールと内部標準である１-オクタデカノールの間に、ピーク１及び２が確認された。 As shown in Fig. 2, when 2-tetradecanol, a secondary alcohol, is used as a raw material, in the KSMΔura-ura strain, in addition to the main peak of 2-C14ol-derived AG, a byproduct peak 3 is confirmed on the high boiling point side. It was done. The peak 3 was also observed during the cultivation of the wild strain KSM36 (not shown). On the other hand, in the KSMΔAOX strain, 3 peaks were confirmed as in the KSMΔura-ura strain, and peaks 4 and 5 not found in the KSMΔura-ura strain were confirmed on the high boiling point side. Furthermore, peaks 1 and 2 were confirmed between 2-tetradecanol and 1-octadecanol which is an internal standard.
次に、GC-MS解析により、上記ピーク１〜５の各化合物（以下、ピーク１化合物等という）の水酸基の位置を決定した。
水酸基を有する脂肪酸類をTMS化した後にGC-MS解析を行った場合、水酸基の位置に寄らず常に水酸基を含むアルキル末端側のフラグメントイオンが得られる。フラグメントイオンの例を表２に示した。
Next, the position of the hydroxyl group of each compound of the above peaks 1 to 5 (hereinafter referred to as peak 1 compound or the like) was determined by GC-MS analysis.
When GC-MS analysis is performed after the fatty acid having a hydroxyl group is converted to TMS, a fragment ion on the alkyl terminal side always containing the hydroxyl group is obtained regardless of the position of the hydroxyl group. Examples of fragment ions are shown in Table 2.
GC-MS解析の結果、ピーク１化合物ではフラグメントイオンとして73及び117が、ピーク２化合物は73、103及び117が認められた。また、ピーク１及び２化合物は、2-テトラデカノールのTMS化物と内標である1-オクタデカノールのTMS化物の間に検出されるため、沸点もこの両者の中間と推定される。これらのことから、ピーク１化合物は2-テトラデカノールのω-1位が水酸化された2,13-テトラデカンジオールであり、ピーク２化合物は2-テトラデカノールのω末端が水酸化された1,13-テトラデカンジオールであると考えられた。
また、ピーク３化合物では73、117及び271.1、ピーク４化合物では73及び103、ピーク５化合物では73、117及び271.1がフラグメントイオンとして確認された。
ピーク４化合物では103のフラグメントイオンが認められることから、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールに糖転移したジオール型アルキルポリグリコシドと考えられた。さらに、117のピークが検出されないため、1,13-テトラデカンジオールの13位の水酸基に糖が転移されていると考えられた。これらの結果から、ピーク４化合物は、下記構造式４で示されるジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)）のTMS化体であると考えられた。
As a result of GC-MS analysis, 73 and 117 were observed as fragment ions in the peak 1 compound, and 73, 103 and 117 were observed in the peak 2 compound. Further, since the peak 1 and 2 compounds are detected between the TMS product of 2-tetradecanol and the TMS product of 1-octadecanol, which is the internal standard, the boiling point is estimated to be intermediate between the two. From these facts, peak 1 compound is 2,13-tetradecanediol hydroxylated at the ω-1 position of 2-tetradecanol, and peak 2 compound is hydroxylated at the ω end of 2-tetradecanol. It was thought to be 1,13-tetradecanediol.
In addition, 73, 117 and 271.1 were confirmed as fragment ions for the peak 3 compound, 73 and 103 for the peak 4 compound, and 73, 117 and 271.1 for the peak 5 compound.
Since 103 fragment ions were observed in the peak 4 compound, it was considered to be a diol-type alkylpolyglycoside that was transferred to 1,13-tetradecanediol, which is the peak 2 compound. Furthermore, since 117 peaks were not detected, it was considered that sugar was transferred to the 13th hydroxyl group of 1,13-tetradecanediol. From these results, the peak 4 compound is a diol type alkyl polyglycoside (13-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl- (2′-O-β-D-glucopyranosyl-β) represented by the following structural formula 4. -D-glucopyranoside)).
ピーク３化合物とピーク５化合物は同じフラグメントイオンパターンを示した。ピーク５化合物はKSMΔAOX株培養時にのみ認められた。また、KSMΔAOX株ではAOX1遺伝子欠損により、１級アルコールを含むジオールが蓄積すると考えられる。これらのことから、KSMΔAOX株のみで認められたピーク５化合物は、ピーク２化合物である1,13-テトラデカンジオールの１位の水酸基に糖付加したジオール型アルキルポリグリコシド（13-hydroxy-1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、下記構造式５）のTMS化体であり、他方、ピーク３化合物は、ピーク１化合物である2,13-テトラデカンジオールのどちらかの水酸基に糖転移したジオール型アルキルポリグリコシド（12-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)、下記構造式３）のTMS化体であると考えられた。
上記考察は、カンジダ・ボンビコーラ野生株を用いて第２級アルコールと糖を反応させると、構造式３に示す化合物が生産されるとの報告（文献：EP0745608参照）とも一致するものであった。また、構造式５の化合物は新規化合物であった。
The peak 3 compound and the peak 5 compound showed the same fragment ion pattern. Peak 5 compounds were observed only when the KSMΔAOX strain was cultured. In the KSMΔAOX strain, it is considered that diols containing primary alcohol accumulate due to AOX1 gene deficiency. From these results, the peak 5 compound observed only in the KSMΔAOX strain is a diol-type alkylpolyglycoside (13-hydroxy-1-O) in which a sugar is added to the hydroxyl group at the 1-position of 1,13-tetradecanediol, which is the peak 2 compound. -tetradecyl- (2'-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside), a TMS compound of the following structural formula 5), while the peak 3 compound is the peak 1 compound 2,13- Diol-type alkyl polyglycoside (12-hydroxy-1-methyl-1-O-tridecyl- (2'-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside), which is sugar-transferred to either hydroxyl group of tetradecanediol, It was considered to be a TMS compound of the following structural formula 3).
The above discussion was consistent with a report that a compound represented by Structural Formula 3 was produced when a secondary alcohol and sugar were reacted using a wild strain of Candida bonbicola (see: EP0745608). Moreover, the compound of Structural formula 5 was a novel compound.
以上の結果から、KSMΔAOX株では、アルキル鎖のω末端又はω-1末端に水酸基を有するジオール型アルキルポリグリコシドが複数種類生産されることがわかった（ピーク３、４及び５化合物）。さらに、KSMΔAOX株は、KSMΔura-ura株では生産されないジオール型アルキルポリグリコシド（ピーク４及び５化合物）を生産できることがわかった。 From the above results, it was found that in the KSMΔAOX strain, plural types of diol-type alkyl polyglycosides having a hydroxyl group at the ω terminal or ω-1 terminal of the alkyl chain were produced (peaks 3, 4 and 5 compounds). Furthermore, it was found that the KSMΔAOX strain can produce diol-type alkyl polyglycosides (peak 4 and 5 compounds) that are not produced by the KSMΔura-ura strain.
GC−FID分析の結果、各ジオール型アルキルポリグリコシド量の合計は、KSMΔura-ura株で0.57g/L、KSMΔAOX株では7.65g/Lであった。 As a result of GC-FID analysis, the total amount of each diol type alkyl polyglycoside was 0.57 g / L for the KSMΔura-ura strain and 7.65 g / L for the KSMΔAOX strain.
以上の結果から、KSMΔAOX株は、糖及び第２級アルコールを基質として、ω末端又はω-1末端に水酸基を有するジオール型アルキルポリグリコシドを高い収率で生産できることがわかった。 From the above results, it was found that the KSMΔAOX strain can produce a diol-type alkylpolyglycoside having a hydroxyl group at the ω-terminal or ω-1 terminal in high yield using sugar and secondary alcohol as a substrate.
Claims (5)
（１）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有するカンジダ・ボンビコーラ（Candida bombicola）を宿主とする微生物において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下したカンジダ・ボンビコーラの形質転換体を、第２級アルコール又はケトン、及び糖を含有する培地で培養する工程
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた培養物から下記一般式（Ｉ）で表される化合物を採取する工程
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はＣｘＨ２ｘ＋１で表されるアルキル基を表し、ｘは１以上３以下の整数を表す。Ｒ２は水素原子又はＣｙＨ２ｙ＋１で表されるアルキル基を表し、ｙは１以上３以下の整数を表す。但し、Ｒ１とＲ２とが同時に水素原子であることはない。ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。） The manufacturing method of the compound represented by the following general formula (I) including the process of following (1) and (2).
(1) In a microorganism having Candida bombicola having a gene encoding a protein encoding any one of the following (a) to (c) as a host , the gene is deleted, mutated or suppressed, and the host A step of culturing a transformant of Candida bon cola with reduced alcohol oxidase activity in comparison with a medium containing secondary alcohol or ketone and sugar (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (B) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having alcohol oxidase activity (c) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 1 to 10 number of amino acids are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence, and alcohols oxy da Comprising the steps of: obtaining a compound represented by the protein (2) the following formula from the resulting culture (I) having a peptidase activity
(In general formula (I), R1 represents a hydrogen atom or an alkyl group represented by C x H 2x + 1 , x represents an integer of 1 or more and 3 or less. R2 is represented by a hydrogen atom or C y H 2y + 1. Represents an alkyl group, and y represents an integer of 1 or more and 3 or less, provided that R1 and R2 are not hydrogen atoms at the same time, n represents an integer of 7 or more and 19 or less, and R3 and R4 each independently Represents a hydrogen atom or an acetyl group.)
（一般式（ＩＩ）中、ｎは７以上１９以下の整数を表す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はアセチル基を表す。） The compound represented by the following general formula (II).
(In general formula (II), n represents an integer of 7 or more and 19 or less. R3 and R4 each independently represents a hydrogen atom or an acetyl group.)
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