JP6321305B2 - 薬物送達用ナノ粒子組成物 - Google Patents

Description

本発明はナノ粒子組成物に関する。より具体的には薬物等を送達するためのナノ粒子組成物に関する。

悪性脳腫瘍に薬剤を送達して治療することにおける障壁を克服するための挑戦がなされている。悪性脳腫瘍の複雑な性質と、悪性脳腫瘍が脳において形成されるという位置的な問題から、脳腫瘍は、世界的に高い致死率をもたらしている。

脳腫瘍の中でも、神経膠芽腫は、高度に組織化され複雑化した悪性細胞のネットワークにサポートされて、転移し、原発巣から新たな領域に広がり、脳全体に迅速に拡散していく。この神経膠芽腫の迅速な増殖能力は、外科的腫瘍切除や化学療法といった、従来の治療に対する重要な障壁の一つとして、依然として存在している。

化学療法の限られた成功率における、もう一つの主な障壁は、ほとんどすべての化学療法剤が、脳の内在的な防御機構を克服できないことである。１％未満程度の化学療法剤しか、全身投与を介して、中枢神経系腫瘍の脈管構造に到達できないことが報告されている。これは、高度に選択的な血液脳関門が存在していることによる。化学療法剤を脳の特定の領域に送達することの困難性を克服することが、脳障害の治療に対する課題として存在している。

そこで、血液脳関門を通過することができる種々の薬物送達システム（ＤＤＳ）が検討されている。例えば非特許文献１には、血液脳関門を通過する薬物送達システムとして、金粒子を利用することが記載されている。

非特許文献２には、グリオーマの標的化療法のための、トランスフェリン及びアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチドとコンジュゲートされた二重標的化リポソームが記載されている。しかし、非特許文献２には、脂肪酸を膜成分として含むリポソームについて記載されていない。

非特許文献３には、グリオブラストーマを治療するための、リボソーム不活性化タンパク質であるクルシン及びハイブリッド固体脂質ナノベクターからなるナノ製剤が記載されている。しかし、非特許文献３には、標的細胞に対する特異性を有する物質をナノ粒子の表面に結合させることについて記載されていない。

Cheng Y., et al., Blood-brain barrier permeable gold nanoparticles: an efficient delivery platform for enhanced malignant glioma therapy and imaging., Small, 10 (24), 5137-5150, 2014. Qin L., et al., A dual-targeting liposome conjugated with transferrin and arginine-glycine-aspartic acid peptide for glioma-targeting therapy, Oncology Letters, 8, 2000-2006, 2014 Mohamed MS., et al., Structurally distinct hybrid polymer/lipid nanoconstructs harboring a type-I ribotoxin as cellular imaging and glioblastoma directed therapeutic vectors. Macromolecular Bioscience, 14, 1696-1711, 2014.

このような状況のもと、血液脳関門を通過することができ、薬物送達効率が高く、より安全な薬物送達システムが求められている。
そこで、本発明は、血液脳関門を通過可能な薬物送達システムに利用することができ、細胞毒性が低い組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、標的細胞に対する特異性を有する物質を表面に結合したナノ粒子が血液脳関門を通過して、脳内（特に脳腫瘍）に効率的に送達されることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は以下の態様を含む。
［１］腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、鉄結合性タンパク質であり、
前記ナノ粒子は、外層とその外層によって包まれている小胞とを有し、かつ前記ナノ粒子は、膜成分として、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを含む、ナノ粒子組成物。
［２］前記融点が３０℃以上の脂肪酸がステアリン酸であり、前記非ＰＥＧ化リン脂質がホスファチジルコリンである、［１］に記載のナノ粒子組成物。
［３］前記ＰＥＧ化リン脂質が、ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミンである、［１］又は［２］に記載のナノ粒子組成物。
［４］前記ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＳＰＥである、［３］に記載のナノ粒子組成物。
［５］前記ＰＥＧ化リン脂質が、アミノ基で修飾されたＰＥＧを有する、［１］〜［４］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［６］前記第一の物質と前記第二の物質とを、２：８〜８：２の質量比で含む、［１］〜［５］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［７］前記ナノ粒子が薬物をさらに含む、［１］〜［６］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［８］前記薬物が抗癌剤である、［７］に記載のナノ粒子組成物。
［９］前記ナノ粒子が画像化剤をさらに含む、［１］〜［８］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［１０］腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物を製造する方法であって、
（ｉ）ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを揮発性有機溶媒中に含む溶液から揮発性有機溶媒を除去して、膜を形成させるステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた膜を緩衝液中で超音波処理し、ナノ粒子を生成するステップ、及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたナノ粒子の表面に、腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質を結合させるステップ
を含み、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、鉄結合性タンパク質である、方法。
［１１］前記ステップ（ｉｉ）において緩衝液が薬物を含み、薬物を含むナノ粒子が生成される、［１０］に記載の方法。
［１２］前記薬物が抗癌剤である、［１１］に記載の方法。
［１３］画像化剤をナノ粒子に導入することをさらに含む、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］［８］に記載のナノ粒子組成物を含む、癌の治療用の医薬組成物。
［１５］癌が脳腫瘍である、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］癌を有する被験体に［１４］又は［１５］に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
［１７］癌が脳腫瘍である、［１６］に記載の方法。
［１８］［９］に記載のナノ粒子組成物を含む、腫瘍細胞を画像化するための組成物。
［１９］脳腫瘍の検出方法であって、それを必要とする被験体に［１８］に記載の組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法。
［２０］脳腫瘍に対する治療効果をモニタリングする方法であって、それを必要とする被験体に［１８］に記載の組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法。

本発明はさらに以下の態様を含む。
［１０１］下記式（１）で表される化合物と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、リン脂質とを含む組成物。

［式（１）中、ｍ１〜ｍ２はそれぞれ独立に１０〜２５の整数であり、ｎは２０〜６０の整数であり、ｍ３は、０〜１０の整数であり、Ｒはカルボキシ基、アミノ基、又はアミド基を含む基であり、Ｘ^＋は、カチオンである。］
［１０２］更に薬物を含む、［１０１］に記載の組成物。
［１０３］前記薬物がクルシンである、［１０２］に記載の組成物。
［１０４］式（１）で表される前記化合物において、式（１）中のＲが標的細胞に対する特異性を有する第一の物質を含む、［１０１］〜［１０３］のいずれかに記載の組成物。
［１０５］式（１）で表される前記化合物において、式（１）中のＲが標的細胞に対する特異性を有する第二の物質を含む、［１０１］〜［１０４］のいずれかに記載の組成物。
［１０６］標的細胞に対する特異性を有する前記第一の物質が、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を有するペプチドである、［１０４］又は［１０５］に記載の組成物。
［１０７］標的細胞に対する特異性を有する前記第二の物質がトランスフェリンである、［１０５］又は［１０６］に記載の組成物。
［１０８］直径５００ｎｍ以下の粒子状である、［１０１］〜［１０７］のいずれかに記載の組成物。
［１０９］脳腫瘍治療用である、［１０２］〜［１０８］のいずれかに記載の組成物。

本発明はさらに以下の態様を含む。
［１００１］腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、鉄結合性タンパク質であり、
前記ナノ粒子は、外層とその外層によって包まれている小胞とを有し、かつ前記ナノ粒子は、膜成分として、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを含む、ナノ粒子組成物。
［１００２］前記ＰＥＧ化リン脂質がＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミンであり、前記脂肪酸がステアリン酸であり、前記非ＰＥＧ化リン脂質がホスファチジルコリンである、［１００１］に記載のナノ粒子組成物。
［１００３］前記第一の物質と前記第二の物質とを、２：８〜８：２の質量比で含む、［１００１］又は［１００２］に記載のナノ粒子組成物。
［１００４］前記ナノ粒子が薬物をさらに含む、［１００１］〜［１００３］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［１００５］前記ナノ粒子が画像化剤をさらに含む、［１００４］に記載のナノ粒子組成物。
［１００６］前記ナノ粒子が画像化剤をさらに含む、［１００１］〜［１００３］のいずれかに記載のナノ粒子組成物。
［１００７］前記薬物が抗癌剤である、［１００４］に記載のナノ粒子組成物。
［１００８］腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物を製造する方法であって、
（ｉ）ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを揮発性有機溶媒中に含む溶液から揮発性有機溶媒を除去して、膜を形成させるステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた膜を緩衝液中で超音波処理し、ナノ粒子を生成するステップ、及び
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたナノ粒子の表面に、腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質を結合させるステップ
を含み、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、鉄結合性タンパク質である、方法。
［１００９］前記ステップ（ｉｉ）において緩衝液が薬物を含み、薬物を含むナノ粒子が生成される、［１００８］に記載の方法。
［１０１０］画像化剤をナノ粒子に導入することをさらに含む、［１００９］に記載の方法。
［１０１１］［１００９］又は［１０１０］に記載の方法によって製造される、ナノ粒子組成物。
［１０１２］前記薬物が抗癌剤である、［１００９］に記載の方法。
［１０１３］［１０１２］に記載の方法によって製造される、ナノ粒子組成物。
［１０１４］画像化剤をナノ粒子に導入することをさらに含む、［１００８］に記載の方法。
［１０１５］［１０１４］に記載の方法によって製造される、ナノ粒子組成物。
［１０１６］［１００７］又は［１０１３］に記載のナノ粒子組成物を含む、癌の治療用の医薬組成物。
［１０１７］癌が脳腫瘍である、［１０１６］に記載の医薬組成物。
［１０１８］癌を有する被験体に［１０１６］又は［１０１７］に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
［１０１９］癌が脳腫瘍である、［１０１８］に記載の方法。
［１０２０］［１００６］又は［１０１５］に記載のナノ粒子組成物を含む、腫瘍細胞を画像化するための組成物。
［１０２１］脳腫瘍の検出方法であって、それを必要とする被験体に［１０２０］に記載の組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法。
［１０２２］脳腫瘍に対する治療効果をモニタリングする方法であって、それを必要とする被験体に［１０２０］に記載の組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-060520号の開示内容を包含する。

本発明によれば、血液脳関門を通過可能な薬物送達システムに利用することができ、細胞毒性が低い組成物を提供することができる。

一実施形態に係るナノ粒子の代表的な透過型電子顕微鏡画像の写真である。 実施例３の細胞の生存率を測定した結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例５のマウスの体重の変化を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例６の各群のマウスの代表的な脳試料の写真である（（ａ）〜（ｆ））。 実施例７の各群の脳試料における、腫瘍の中央部の切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す写真である（（ａ）〜（ｆ））。 実施例７の各群の脳試料における腫瘍の体積の測定結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例９に記載される、ナノ粒子へのクルシン又はトランスフェリンの取り込み（結合）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥによるゲルの写真である（（Ａ）及び（Ｂ））。 実施例９に記載される、ナノ粒子へのＲＧＤトリペプチドの結合を示すＭＡＬＤＩによる測定結果を示すグラフである。 実施例１０に記載される各群のマウスの生存率を示すグラフである。 実施例１２に記載される各群の脳におけるＱＤ（量子ドット）ナノ粒子の脳における蓄積を示す写真である。 実施例１２に記載される、各群におけるナノ粒子の腫瘍への蓄積を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｃ））。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１３に記載される各群の各臓器における平均蛍光強度を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｄ））。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１３に記載される各群の各臓器、血液及び腫瘍における平均蛍光強度を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｄ））。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１４のインビトロＢＢＢモデルを示す模式図である。 実施例１５に記載される、インビトロＢＢＢモデルを評価した結果を示すグラフである（（Ａ）及び（Ｂ））。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１６に記載される、各ナノ粒子の頂端側から基底側への透過性分析の結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１７に記載される、各ナノ粒子の頂端側から基底側への透過性分析の結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１８に記載される、各ナノ粒子の頂端側から基底側への透過性分析の結果を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例１９に記載される各ナノ粒子の膠芽腫細胞への標的化をＦＡＣＳ装置で解析した結果を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｅ））。 実施例１９に記載される各ナノ粒子の膠芽腫細胞への標的化をＦＡＣＳ装置で解析した結果を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｄ））。 実施例１９に記載される各ナノ粒子の膠芽腫細胞への標的化をＦＡＣＳ装置で解析した結果を示すグラフである（（Ａ）〜（Ｇ））。 実施例２０に記載される、さらなる薬物の担持効率を示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。 実施例２０に記載される、さらなる薬物の放出プロファイルを示すグラフである。エラーバーは標準偏差を表す（Ｎ＝３）。

［ナノ粒子組成物］
本発明は、ナノ粒子組成物に関する。本明細書において、ナノ粒子とは、直径が概ね１μｍ以下（好ましくは１ｎｍ以上かつ１μｍ未満）である粒子を意味する。本発明において、ナノ粒子は、脂質を主成分として含む膜で形成され、外層とその外層に包まれている小胞とを有し得る。

一実施形態では、ナノ粒子は、膜成分（外層と小胞の膜成分）として、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを含んでよい。ナノ粒子は、他の成分を含んでもよい。本発明において、ナノ粒子は、膜成分として、コレステロールを含まなくてもよい。

本明細書において、「ＰＥＧ化リン脂質」とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合したリン脂質を指す。ＰＥＧ化リン脂質としては、以下に限定するものではないが、ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミン（１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）が挙げられる。ＰＥＧは、ホスファチジルエタノールアミン中のアミノ基に結合してよい。ホスファチジルエタノールアミン中の２つの脂肪酸は、それぞれ独立して、炭素数１０〜２５又は１６〜２０の飽和脂肪酸であってよい。ＰＥＧは、ｍＰＥＧ（メトキシＰＥＧ）であってもよい。ホスファチジルエタノールアミンは、例えば、ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）又はＤＭＰＥ（１，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）であってもよい。

ＰＥＧ化リン脂質中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の平均分子量（Ｍｗ）は、５００〜１００００、好ましくは１０００〜５０００又は１０００〜３０００、例えば２０００であってもよい。

ＰＥＧ化リン脂質は、特にＰＥＧ鎖の遊離末端において、官能基で修飾されていてもよい。官能基は、例えば、アミノ基、カルボキシ基、又はアミド基であってもよい。アミノ基で修飾されたＰＥＧ化リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］であってもよく、これは、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミンとしてアバンティ ポーラ リピッド社から入手できる。カルボキシ基で修飾されたＰＥＧ化リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［カルボキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］であってよく、これは、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）カルボン酸としてアバンティ ポーラ リピッド社から入手できる。

一実施形態では、ナノ粒子組成物の製造のため、ＰＥＧ化リン脂質として、式（１）で表される化合物を用いてもよい。

［式（１）中、ｍ１〜ｍ２はそれぞれ独立に１０〜２５の整数であり、ｎは２０〜６０の整数であり、ｍ３は、０〜１０の整数であり、Ｒはカルボキシ基、アミノ基、又はアミド基を含む基であり、Ｘ^＋は、カチオンである。］

式（１）におけるｍ１及びｍ２は、独立して、室温で固体である脂肪酸の炭素数に対応する数であることが好ましく、例えば１５〜２５であってもよく、例えば１５〜２０又は１６〜１８、具体的には１７であってもよい。また、式（１）におけるｎは、例えば２５〜５５であってもよく、例えば３０〜５０であってもよい。

また、式（１）におけるｍ３は、０〜１０の整数であり、例えば０〜６であってもよく、例えば０、１又は２であってもよい。

式（１）におけるＸ^＋は、カチオンであり、例えば、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ヨードニウムカチオン、ホスホニウムカチオン、水素イオン等が挙げられる。

また、式（１）におけるＲのカルボキシ基又はアミノ基を利用して、薬物送達の標的細胞に対する特異性を有する物質を、例えばアミド結合により結合させ、ナノ粒子を標的細胞に集積させることが可能である。また、化学架橋剤を利用した架橋反応等により共有結合させてもよい。

本明細書において、融点が３０℃以上の脂肪酸としては、室温で固体である脂肪酸を使用することができる。例えば、融点が３０℃以上の脂肪酸は、炭素数が１０〜２５の飽和脂肪酸から選択される１種以上の脂肪酸であってよく、より具体的には、例えば、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸等が挙げられる。

また、本明細書において、非ＰＥＧ化リン脂質としては、レシチン（ホスファチジルコリン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、及びホファチジルイノシトール等のホスファチジルグリセリドをはじめとするグリセロリン脂質、並びにスフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質が挙げられる。一実施形態では、非ＰＥＧ化リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、及びホファチジルイノシトールからなる群から選択される１種以上のホスファチジルグリセリドであってもよい。

融点が３０℃以上の脂肪酸及びリン脂質を膜成分として含むナノ粒子は、安定性が高いという利点がある。

ＰＥＧ化リン脂質（例えば、上記式（１）で表される化合物）は、脂質部分とポリマー部分とを有しているため、本発明に係るナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子（Ｓｏｌｉｄ−Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）とポリマー粒子とのハイブリッドであるということができる。固体脂質ナノ粒子とは、脂質コアが室温で固体である固体脂質粒子である。本発明に係るナノ粒子は、ハイブリッド固体脂質ナノ粒子（Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｏｌｉｄ−Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）であるということもできる。

ナノ粒子中に膜成分として含まれる、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質との割合は、ナノ粒子が形成される範囲であれば特に制限されず、例えば、質量比で１〜１０：１〜１０：１〜１０であってもよい。ナノ粒子中に膜成分として含まれる、ＰＥＧ化リン脂質及び非ＰＥＧ化リン脂質の合計と、融点が３０℃以上の脂肪酸との割合は、例えば、１：１〜１：５、１：１．３〜１：４、又は１：１．５〜１：３のモル比であってもよい。ナノ粒子中に膜成分として含まれる、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸との割合は、１：５０〜１：３、１：３０〜１：５、１：２０〜１：６、又は１：１５〜１：８のモル比であってもよい。

本実施形態の組成物に含まれるナノ粒子の平均直径は５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、又は２００ｎｍ以下であってよい。ナノ粒子の平均直径は、１３０ｎｍ以上、１４０ｎｍ以上、１５０ｎｍ以上、１６０ｎｍ以上、１７０ｎｍ以上、１８０ｎｍ以上、１９０ｎｍ以上であってもよい。ナノ粒子の平均直径は、例えば、１４０ｎｍ〜５００ｎｍ、１５０ｎｍ〜３００ｎｍ、又は１６０〜２００ｎｍの範囲であってもよい。粒子の直径は、当技術分野で公知の方法によって測定できるが、特に、動的光散乱法により測定することができる。動的光散乱法による測定は、市販の解析装置、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（マルバーン社）を用いて実施できる。また、粒子の直径は、例えば、粒子の透過型電子顕微鏡画像における直径を計測することによって測定してもよい。粒子画像が円形でない場合には、粒子画像と同じ面積を有する円の直径を直径とみなすとよい。本発明に係るナノ粒子は、外層とその外層に包まれている小胞とを有し得るが、外層の直径を粒子の直径とする。粒子の直径は平均値（例えば透過型電子顕微鏡画像における直径を計測する場合には１００個の粒子の平均値）であってよい。

本発明においてナノ粒子は、凝集しないことが好ましい。また、ナノ粒子は、マイナスのゼータポテンシャルを有することが好ましい。ナノ粒子のゼータポテンシャルは、より好ましくは、例えば、−１００ｍＶ〜−１ｍＶ、−８０ｍＶ〜−２ｍＶ又は−５０ｍＶ〜−３ｍＶ、又は−３０ｍＶ〜−５ｍＶであってよい。マイナスのゼータポテンシャルは粒子が親水性であることを示す。粒子のゼータゼータポテンシャルは、電気泳動光散乱法により測定することができる。電気泳動光散乱法によるゼータポテンシャルの測定は、当技術分野で公知の方法によって、例えば市販の解析装置、例えばＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（マルバーン社）を用いて実施できる。

従来の固体脂質ナノ粒子の製造方法は、界面活性剤の使用を必要とする乳化−分散プロセスを含む場合がある。界面活性剤の使用はコスト増につながる場合があり、乳化−分散プロセスは煩雑で時間を要する傾向にある。また、得られた固体脂質ナノ粒子は、薬物の担持量が低く、薬物が漏出する場合がある。

これに対し、実施例において後述するように、本発明では、薬物担持量が多く、薬物放出を長期に維持するナノ粒子を形成することができる。これは、ポリマー及び脂質の二重の膜により薬物を封入するため、薬物が脂質／ポリマー層を通過しなければ放出されず、その結果、持続的で遅延した薬物の放出が実現されるものと考えられる。

また、本発明に係るナノ粒子は、例えば図１に示すように、外層とその外層によって包まれている小胞とを有し得る。このような構造により、内包した薬物を長期にわたり放出させることができる。

本発明では、ナノ粒子の表面に、標的細胞に対する特異性を有する物質が結合していてもよい。本明細書において、標的細胞に対する特異性を有する物質とは、他の細胞と比較して、標的細胞により結合しやすい性質を持つ物質を指す。標的細胞に対する特異性を有する物質は、ナノ粒子に膜成分として含まれる少なくとも一部のＰＥＧ化リン脂質（特にＰＥＧ鎖を修飾している官能基）に結合していてもよい。結合は、好ましくは共有結合である。結合は、当技術分野で公知の技術によって行ってよい。例えば、結合は、ＰＥＧ化リン脂質に結合したアミノ基と、標的細胞に対する特異性を有する物質の有するカルボキシ基との間のアミド結合であってもよい。

標的細胞は、脳細胞であってよい。標的細胞は、腫瘍細胞、特に膠芽腫（グリオブラストーマ）細胞であってよい。

一実施形態では、ナノ粒子の表面に、標的細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が結合していてもよく、ここで、第二の物質は、第一の物質とは異なる物質である。係る場合、本実施形態の組成物は、二重の標的シグナルを有するため、ナノ粒子を標的細胞により効率良く集積させることが可能である。

一実施形態では、上記式（１）で表される化合物の少なくとも一部には、標的細胞に対する特異性を有する物質が結合していてもよい。より具体的には、上記式（１）で表される化合物の少なくとも一部は、式（１）中のＲが標的細胞に対する特異性を有する第一の物質であってもよい。係る場合、標的細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アミド結合を介して結合するため、Ｒは、アミド基を含む。

更に、標的細胞に対する特異性を有する物質として、第一の物質とは異なる第二の物質を含んでいてもよい。

標的細胞に対する特異性を有する物質としては、特に制限されず、標的細胞に応じてあらゆる物質を使用することができる。例えば、標的細胞の表面に存在するタンパク質に対する抗体、抗体断片、アプタマー；標的細胞の表面に存在する受容体に対するリガンド等が挙げられる。

標的細胞に対する特異性を有する物質としては、例えば、細胞表面に存在するインテグリンに結合する、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）のアミノ酸配列（ＲＧＤ配列）を有するペプチドが挙げられる。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、特に血管内皮癌細胞に特異性を有する。

ＲＧＤ配列を有するペプチドとしては、ＲＧＤ配列を含有するペプチドを用いることができる。本明細書において、ペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で結合したアミノ酸ポリマーをいう。ペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば２〜１００個、又は３〜５０個であってもよい。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、３〜１０、例えば、３、４、５又は６アミノ酸残基長であってよい。ＲＧＤ配列を含有するペプチドとしては、ＲＧＤトリペプチド、ＧＲＧＤＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペンタペプチド、ＧＲＧＤＮＰ（配列番号２）のアミノ酸配列を有するヘキサペプチド、又はディスインテグリン類等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、例えば市販のペプチド合成機を用いた化学合成によって調製してもよく、又は遺伝子工学的技術によって調製してもよい。あるいは、例えばシグマアルドリッチ社から市販されているＲＧＤ配列を有するペプチドを用いてもよい。

標的細胞に対する特異性を有する物質の他の例としては、鉄結合性タンパク質が挙げられる。鉄結合性タンパク質は、鉄に結合する性質を有する任意のタンパク質を指す。鉄結合性タンパク質としては、限定されないが、例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びオボトランスフェリン、並びにそれらの変異体が挙げられる。変異体は、天然に存在するタンパク質においてアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入（例えば１〜１０個のアミノ酸の）を有する変異体を含み得る。変異体は、標的細胞に対する特異性を保持し得る。鉄結合性タンパク質は、好ましくは、癌細胞表面に多く存在するトランスフェリン受容体に対するリガンドである、トランスフェリンである。トランスフェリンは約７９ｋＤａのタンパク質である。鉄結合性タンパク質は、特に限定されないが、例えばヒト又はウシなどの哺乳動物に由来し得る。鉄結合性タンパク質は、当技術分野で公知の方法によって、例えば遺伝子工学的技術を用いて調製できる。あるいは、例えばシグマアルドリッチ社から市販されている鉄結合性タンパク質を用いてもよい。

実施例において後述するように、ＲＧＤトリペプチド及びトランスフェリンの双方を結合したナノ粒子は、血液脳関門を通過し、非常に効率よく脳腫瘍に薬物を送達することができた。したがって、本実施形態のナノ粒子組成物は、脳腫瘍治療用であるということもできる。

また、標的細胞に対する特異性を有する物質として、葉酸、低密度リポタンパク質、アミノグルコース、表皮増殖因子等が挙げられる。

ナノ粒子の表面に、標的細胞に対する特異性を有する第一の物質と第二の物質とが結合している場合、ナノ粒子組成物は、任意の比で第一の物質と第二の物質とを含んでよい。例えば、標的細胞に対する特異性を有する第一の物質がＲＧＤ配列を有するペプチドであり、標的細胞に対する特異性を有する第二の物質が鉄結合性タンパク質である場合、ナノ粒子組成物は、第一の物質と第二の物質とを、１：２０〜２０：１、１：１０〜１０：１、２：８〜８：２、３：７〜７：３若しくは４：６〜６：４の質量比、又はより詳細には３５：６５〜４５：５５の質量比で含み得る。また、標的細胞に対する特異性を有する第一の物質がＲＧＤ配列を有するペプチドであり、標的細胞に対する特異性を有する第二の物質が鉄結合性タンパク質である場合、ナノ粒子組成物は、第一の物質と第二の物質とを、１０：１〜２０００：１、５０：１〜１０００：１、８０：１〜５００：１、１００：１〜４００：１、１２０：１〜３００：１、又は１３０：１〜２００：１のモル比で含み得る。第一の物質と第二の物質とは、これらの質量比又はモル比でナノ粒子の表面に結合し得る。

一実施形態では、ナノ粒子は、さらに薬物を含んでもよい。薬物を含むナノ粒子は、薬物送達システムに適用することができる。薬物は、その性質に応じて、ナノ粒子の膜内に内包されてもよく、膜成分中に組み込まれてもよい。

薬物としては、例えば抗癌剤等が挙げられるが、特に限定されず、様々な性質及び活性を有する薬物を本発明に使用できる。抗癌剤としては、特に制限されず、例えば、フルオロウラシル、アザチオプリン、メトトレキサート等のＤＮＡ合成阻害剤；イリノテカン、ビンブラスチン、パクリタキセル等の細胞分裂阻害剤；シスプラチン、ナイトロジェンマスタード等のＤＮＡ損傷剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗腫瘍性抗生物質；クルシン等の細胞殺傷活性を有する化合物等が挙げられる。なお、クルシンは植物の一種であるジャトロファ・クルカスの種子に含まれる有毒タンパク質（疎水性の分子量２８ｋＤａのI型リボソーム不活性化糖タンパク質）であり、癌細胞に対する強力な殺傷活性を有することが知られている。薬物は、核酸、タンパク質、ペプチド、小分子化合物（例えば分子量１０００以下）等であってもよい。薬物の分子量は、限定されないが、２００Ｄａ〜５０ｋＤａ又は４００Ｄａ〜３０ｋＤａであってよい。薬物は、例えば、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ又は２０ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量のタンパク質であってもよい。薬物は、タキサン類化合物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルなど）又はアントラサイクリン系化合物（例えば、ドキソルビシン、ピラルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アムルビシン、ミトキサントロンなど）であってもよい。薬物は親水性でも疎水性でもよい。

これらの薬物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含み得る。

本発明の薬物を含むナノ粒子は、腫瘍、特に脳腫瘍に効率的に送達され、安定性が高く、薬物を長期にわたって放出することができる。

一実施形態では、ナノ粒子は、さらに画像化剤を含んでもよい。画像化剤を含むナノ粒子は、標的細胞の画像化に適用することができる。一実施形態では、腫瘍の画像化により、例えば、腫瘍の検出及び診断、並びに腫瘍に対する治療効果のモニタリングが可能となる。画像化剤は、その性質に応じて、ナノ粒子の膜内の水相に内包されてもよく、膜成分中に組み込まれてもよい。画像化剤は、ナノ粒子の表面に結合していてもよい。ナノ粒子は、薬物と画像化剤の両方を含んでもよい。

画像化剤としては、蛍光物質、発光物質、量子ドット、放射性物質、ＭＲＩ造影剤、Ｘ線造影剤、常磁性イオンなどが挙げられる。

本発明の画像化剤を含むナノ粒子は、効率的に腫瘍、特に脳腫瘍に送達され、腫瘍の画像化に使用され得る。

本実施形態のナノ粒子組成物は、当技術分野で公知のいずれの方法によって作製してもよいが、特に、後述の「ナノ粒子組成物の製造方法」によって製造することができる。

本発明に係るナノ粒子は、例えば図１に示すように、外層とその外層によって包まれている小胞とを有し得る。このような構造により、内包した薬物を長期にわたり放出させることができる。また本発明に係るナノ粒子は、安定性が高く、分散性に優れるという利点もある。標的細胞（特に脳腫瘍細胞）に対する特異性を有する物質が表面に結合しているナノ粒子は、血液脳関門を通過することができ、特異性高く脳腫瘍に薬物又は画像化剤などを送達することができ、一方で非特異的な組織への蓄積が少ないという利点がある。また本発明に係るナノ粒子は、長期にわたり血中を循環し、それにより、長期にわたる標的細胞への送達が可能となる。

［ナノ粒子組成物の製造方法］
本発明は、本発明に係るナノ粒子組成物の製造方法を提供する。本方法は、（ｉ）ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを揮発性有機溶媒中に含む溶液から揮発性有機溶媒を除去して、膜を形成させるステップ、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた膜を緩衝液中で超音波処理し、ナノ粒子（非標的化ナノ粒子）を生成するステップを含み得る。本方法は、（ｉｉｉ）ナノ粒子（非標的化ナノ粒子）の表面に、標的細胞に対する特異性を有する物質を結合させるステップをさらに含むことができる。本方法は、薬物又は画像化剤をナノ粒子に導入することをさらに含んでもよい。本明細書において、非標的化ナノ粒子は、標的細胞に対する特異性を有する物質が表面に結合していないナノ粒子を指す。

本方法のステップ（ｉ）において、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを含む溶液は、例えば本分野における一般的な揮発性有機溶媒、例えばクロロホルム、トルエン、エタノール、アセトン、メタノール、ジメチルスルホキシド等にこれらの物質を溶解させることにより調製することができる。本方法は、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを揮発性有機溶媒中に含む溶液を調製するステップを含んでもよい。溶液中のＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質との割合は、ナノ粒子が形成される範囲であれば特に制限されず、例えば、質量比で１〜１０：１〜１０：１〜１０であってもよい。溶液中のＰＥＧ化リン脂質、融点が３０℃以上の脂肪酸、及び非ＰＥＧ化リン脂質の濃度は、それぞれ、例えば、０．１〜２００ｍｇ／ｍＬ、１〜１００ｍｇ／ｍＬ又は１０〜５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。溶液中のＰＥＧ化リン脂質及び非ＰＥＧ化リン脂質の合計と、融点が３０℃以上の脂肪酸との割合は、例えば、１：１〜１：５、１：１．３〜１：４、又は１：１．５〜１：３のモル比であってもよい。溶液中のＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸との割合は、１：５０〜１：３、１：３０〜１：５、１：２０〜１：６、又は１：１５〜１：８のモル比であってもよい。

一実施形態では、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを含む溶液は、薬物又は画像化剤をさらに含んでもよい。これにより、製造されるナノ粒子の膜中に薬物又は画像化剤を含ませることができる。

本方法のステップ（ｉ）において、ＰＥＧ化リン脂質と、融点が３０℃以上の脂肪酸と、非ＰＥＧ化リン脂質とを揮発性有機溶媒中に含む溶液から揮発性有機溶媒を除去し、これにより膜が形成され得る。揮発性有機溶媒は、当技術分野で公知の方法によって、例えば真空乾燥法によって除去することができる。

次いで、本方法のステップ（ｉｉ）において、ステップ（ｉ）で得られた膜を緩衝液中で超音波処理し、ナノ粒子を生成し得る。緩衝液は、生理的緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってよい。緩衝液のｐＨは、限定されないが、例えば６．８〜８．０、７．０〜７．８又は７．２〜７．６であってよい。一実施形態では、緩衝液は、薬物又は画像化剤をさらに含んでもよい。これにより、製造されるナノ粒子の膜内に薬物又は画像化剤を内包させることができる。緩衝液中の薬物又は画像化剤の濃度は、当業者であれば目的に応じて適宜調整することができるが、例えば、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、又は１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。超音波処理は、当技術分野で公知の方法によって、例えば市販の超音波処理器を用いて行うことができる。超音波処理は、透明で安定な懸濁液が得られるまで行ってもよい。超音波処理は、例えば、１０〜２００ｋＨｚ又は２０〜１００ｋＨｚの周波数で行ってもよい。

生成されたナノ粒子は、例えば遠心分離することにより（例えば３０，０００〜７０，０００ｒｐｍで２０分間〜１時間の遠心分離により）ペレット化させて、精製してもよい。遠心分離は複数回行ってもよい。

次いで、本方法のステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｉｉ）で得られたナノ粒子（非標的化ナノ粒子）の表面に、標的細胞に対する特異性を有する物質を結合させることができる。結合は、当技術分野で公知の技術のいずれによって行ってもよいが、特に化学架橋剤を用いて行うことができる。化学架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。一実施形態では、標的細胞に対する特異性を有する物質を化学架橋剤によって活性化し、活性化された当該物質をステップ（ｉｉ）で得られたナノ粒子（特に、ナノ粒子の膜成分中のＰＥＧ化リン脂質に結合したアミノ基）と反応させて、ナノ粒子の表面に当該物質を結合させることができる。活性化された、標的細胞に対する特異性を有する物質と、ナノ粒子との反応条件は、当業者であれば適宜設定し得るが、例えば０℃〜１０℃で３時間〜２４時間であってもよい。標的細胞に対する特異性を有する物質の量（２種以上の物質を用いる場合は、総量）は、反応させるナノ粒子に対して、例えば５％〜４０％（質量）、又は１０〜３０％（質量）であってよい。

ＰＥＧ化リン脂質が上記式（１）で表される化合物である場合、標的細胞に対する特異性を有する物質は、式（１）中のＲに結合させてもよい。

標的細胞に対する特異性を有する物質を２種以上結合させる場合、ナノ粒子への当該２種以上の物質の結合は、別々に行ってもよく、又は同時に行ってもよい。当該２種以上の物質を同時にナノ粒子に結合させることにより、より簡単にナノ粒子を製造できる。

標的細胞に対する特異性を有する物質が表面に結合したナノ粒子は、例えば遠心分離することにより（例えば３０，０００〜７０，０００ｒｐｍで２０分間〜１時間の遠心分離により）ペレット化させて、精製してもよい。遠心分離は複数回行ってもよい。

一実施形態において、本発明は、上記製造方法によって製造されたナノ粒子組成物を提供する。

［脳腫瘍の治療及び画像化方法］
本発明は、本発明の一実施形態に係る抗癌剤を含むナノ粒子を含む、癌の治療用の医薬組成物を提供する。癌は、好ましくは脳腫瘍である。

本明細書において、脳腫瘍は、頭蓋内に発生する任意の腫瘍を指す。脳腫瘍としては、神経膠腫（グリオーマ）、星状細胞腫、乏突起膠腫、退形成性星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、膠芽腫（グリオブラストーマ）等が挙げられるが、これらに限定されない。膠芽腫は、悪性度が最も高い神経膠腫である。

本明細書において、「治療」とは、脳腫瘍を有する被験体において、腫瘍を縮小させる又は消滅させることを意味する。脳腫瘍を有する被験体は、例えば、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）及びＭＲＩ（核磁気共鳴像）などの画像診断によって決定できる。

医薬組成物は、製剤分野で通常使用される任意の製剤補助剤をさらに含んでもよい。本明細書において、製剤補助剤としては、製薬上許容される、担体（固体又は液体担体）、賦形剤、安定化剤、崩壊剤、界面活性剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、抗酸化剤、矯臭剤、充填剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤などの、様々な担体又は添加剤を用いることができる。具体的には、製剤補助剤としては、水、生理食塩水、他の水性溶媒、製薬上許容される有機溶媒、マンニトール、ラクトース、デンプン、微結晶セルロース、ブドウ糖、カルシウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、アラビアゴム、キサンタンガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、グリセリン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトールなどが挙げられる。製剤補助剤は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択され得る。

医薬組成物は、経口的に、又は静脈内など非経口的に被験体に投与できる。医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤などの経口剤、又は注射剤、点滴剤、塗布剤などの非経口剤の製剤としてよい。当業者は、慣用の方法でこれらの製剤を製造することができる。

医薬組成物は、治療上有効な量で投与されてよい。医薬組成物の具体的な投与量は、個々の被験体に応じて、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、性別、体重及び治療に対する忍容性などに基づき、例えば医師の判断により決定される。例えば、医薬組成物は、ナノ粒子に含まれる抗癌剤が０．０００００１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日、又は０．００１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１ｍｇ／体重ｋｇ／日、又は０．００５ｍｇ／体重ｋｇ／日〜０．５ｍｇ／体重ｋｇ／日、又は０．０１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜０．１ｍｇ／体重ｋｇ／日となる量で投与してもよい。医薬組成物は、単回投与又は複数回投与することができ、例えば一定の時間間隔、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月などの間隔で、被験体に対して、数回又は数十回投与してもよい。

医薬組成物は、他の抗癌剤治療、手術（外科治療）、又は放射線治療と併用してもよい。

医薬組成物を投与する被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物等であってよく、好ましくはヒトである。被験体は、癌、好ましくは脳腫瘍を有する被験体であってよい。

本発明はまた、癌を有する被験体に、本発明の一実施形態に係る抗癌剤を含むナノ粒子又は医薬組成物を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。癌は、脳腫瘍であってよい。

本発明はまた、癌の治療薬を製造するための、本発明の一実施形態に係るナノ粒子の使用を提供する。

医薬組成物の投与により、癌、特に脳腫瘍を有する被験体の生存期間を、投与を受けていない被験体と比較して、延長させることもできる。

本発明はまた、本発明の一実施形態に係る画像化剤を含むナノ粒子を含む、腫瘍細胞を画像化するための組成物を提供する。本組成物は、上述の製剤補助剤をさらに含んでもよい。また、本組成物の投与経路、剤形、投与量、投与回数、及び投与間隔としては、医薬組成物に関して上述のもの、又は当技術分野で公知のものを適宜用いることができる。

本発明はまた、脳腫瘍の検出方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の一実施形態に係る画像化剤を含むナノ粒子又は組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法を提供する。被験体は、脳腫瘍を有するか又は脳腫瘍を有することが疑われる被験体であってよい。本方法は、脳腫瘍を検出又は診断した後、脳腫瘍を治療するステップをさらに含んでもよい。

本発明はまた、脳腫瘍に対する治療効果をモニタリングする方法であって、それを必要とする被験体に、本発明の一実施形態に係る画像化剤を含むナノ粒子又は組成物を投与するステップ、及び画像化剤の脳内での局在を検出するステップを含む、方法を提供する。被験体は、脳腫瘍に対する治療が施された被験体であってよい。本方法における投与及び検出は、通常、適当な時間間隔で複数回行われ得る。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料及び方法］
（ナノ粒子の解析）
ナノ粒子の形態は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、型式「ＪＥＭ−２２００−ＦＳ」、ＪＥＯＬ社）で観察した。加速電圧は２００ｋＶに設定した。ＴＥＭサンプルホルダーにナノ粒子を滴下して風乾し、試料を作製した。

また、解析装置（型式「Ｎａｎｏ−ＺＳ」、マルバーン社）を用いた動的光散乱法により、ナノ粒子の流体力学直径を解析した。また、表面の電荷をゼータポテンシャルにより決定した。

また、紫外−可視スペクトロメーター（型式「ＵＶ−２１００ＰＣ／３１００ＰＣ」、島津製作所）を用いて、ナノ粒子による薬物の担持及び放出を定量した。

（動物実験）
インビボ実験では、Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを使用した。実験には４８匹のマウスを用いた。これらのマウスを実験前に１週間馴化した後、ヒト膠芽腫細胞株であるＧｌ−１（理化学研究所）を頭蓋内移植（ブレグマの１ｍｍ下）した。

移植後、マウスをランダムに１群８匹ずつの６つの群に分けた。移植から９６時間後に、各マウスに後述する各組成物を静脈投与した。各組成物の投与は４８時間毎に行った。薬物の投与量は１回の投与あたり１６μｇで一定とした。

各マウスの体重を、と殺まで５日毎に測定した。１０回目の組成物の投与から４８時間後に各群について４匹のマウスを安楽死させ、潅流し、全脳を摘出した。残りの各群４匹ずつのマウスは生存率の測定に使用した。摘出した脳は、直ちに４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定から２４時間後、脳試料をスクロース溶液に移し一晩静置した。続いて脳試料を樹脂（ＯＣＴコンパウンド）に包埋し、凍結した。

続いて、クライオスタットを用いて、厚さ３０μｍの脳試料の切片を作製した。切片は風乾し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。また、腫瘍の容積を測定し記録した。

［実施例１］
［製造例１］
（非標的化クルシンナノ粒子の調製）
ナノ粒子は、改変した脂質コアセルベーション法によって調製した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、アバンティ ポーラ リピッド社）２５ｍｇ／ｍＬ（約９．０×１０^−３ｍｏｌ／Ｌ）、ステアリン酸（シグマアルドリッチ社）２５ｍｇ／ｍＬ（約８．８×１０^−２ｍｏｌ／Ｌ）、及びレシチン（ホスファチジルコリン）（シグマアルドリッチ社）２５ｍｇ／ｍＬ（約３．３×１０^−２ｍｏｌ／Ｌ）をクロロホルムに溶解して一晩乾燥させ、薄膜を形成した。

続いて、薄膜にクルシンのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．４、５．３３ｍｇ／ｍＬ）を添加して、超音波処理器（アズワン社）を用いて穏やかに（４３ｋＨｚ）数分間（１〜２分間）ソニケーションし、透明で安定な懸濁液を得た。続いて、懸濁液を５００００ｒｐｍで３０分間遠心してナノ粒子をペレット化させた（洗浄工程）。この洗浄工程を繰り返し行い、製造例１のナノ粒子（非特異的な非標的化クルシンナノ粒子）を得た。

［製造例２］
（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子の調製）
緩衝液中で、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列からなるトリペプチド（ＲＧＤトリペプチド、シグマアルドリッチ社）２ｍｇに、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）（シグマアルドリッチ社）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（シグマアルドリッチ社）を添加し、チューブローテーターを用いて４℃で一晩反応させ、活性化した。

続いて、活性化したＲＧＤトリペプチドを、製造例１のナノ粒子（１０ｍｇ）に添加して４℃で４時間以上（一晩）反応させた。続いて、懸濁液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）を得た。

［製造例３］
（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子の調製）
緩衝液中で、トランスフェリン（シグマアルドリッチ社）２ｍｇに、ＥＤＣ及びＮＨＳを添加し、チューブローテーターを用いて４℃で一晩反応させ、活性化した。

続いて、活性化したトランスフェリンを、製造例１のナノ粒子（１０ｍｇ）に添加して４℃で４時間以上（一晩）反応させた。続いて、懸濁液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を得た。

［製造例４］
（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子の調製）
製造例２に記載したように調製した、活性化したＲＧＤトリペプチド（１ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する）、及び製造例３に記載したように調製した、活性化したトランスフェリン（１ｍｇのトランスフェリンに相当する）を、製造例１のナノ粒子（１０ｍｇ）に添加して４℃で４時間以上（一晩）反応させた。続いて、懸濁液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を得た。

［製造例５］
（薬物非担持ナノ粒子の調製）
クルシンのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液の代わりにＰＢＳ緩衝液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法によって、薬物非担持ナノ粒子を調製した。

［実施例２］
（ナノ粒子の解析）
製造例１〜４のナノ粒子の形状を、透過型電子顕微鏡及び動的光散乱法により解析した。

ナノ粒子の形態は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、型式「ＪＥＭ−２２００−ＦＳ」、ＪＥＯＬ社）で観察した。加速電圧は２００ｋＶに設定した。ＴＥＭサンプルホルダーにナノ粒子を滴下して風乾し、試料を作製した。図１は、製造例１〜４のナノ粒子の代表的な透過型電子顕微鏡画像である。図１に示すように、製造例１〜４のナノ粒子は、卵型の球状のナノ粒子であった。、製造例１のナノ粒子（非標的化クルシンナノ粒子）の直径は約１５０ｎｍであった（１００個のナノ粒子の平均値）。ナノ粒子は、外層とその外層によって包まれている小胞とを有することが示された。

また、解析装置（型式「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ」、マルバーン社）を用いた動的光散乱法により、ナノ粒子の流体力学直径を解析した。動的光散乱法により測定した、これらのナノ粒子の流体力学直径は約２００ｎｍであり、多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ、ＰＤＩ）は約０．２であった。これらの結果は透過型電子顕微鏡画像の結果と一致していた。ＰＤＩが低いことは、これらのナノ粒子が高度に分散し、凝集していない粒子であることを示す。粒子が凝集していないことは、これらのナノ粒子が非常に安定であることを示し、このことは治療用途にナノ材料を適用する場合の必須の要件である。

また、表面の電荷として、解析装置（型式「Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ」、マルバーン社）を用いてゼータポテンシャルを測定した。製造例１〜４のナノ粒子のいずれもマイナスのゼータポテンシャルを有していた。このことは、これらのナノ粒子が親水性であることを示す。製造例２〜４のナノ粒子は、製造例１のナノ粒子と比較してわずかにプラスにシフトしたゼータポテンシャルを有していた。これはナノ粒子の表面にＲＧＤトリペプチド又はトランスフェリンが結合した結果であると考えられた。

製造例１〜４のナノ粒子の動的光散乱法による流体力学直径及びゼータポテンシャルの結果を表１に示す。

［実施例３］
（細胞適合性の検討）
製造例１のナノ粒子を培養細胞に接触させて、細胞の生存率を測定した。細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮質神経細胞株（ＨＣＮ−１Ａ）及びグリオーマ細胞株（Ｇｌ-１）を使用した。ＨＵＶＥＣ細胞はＧｉｂｃｏ社から入手した。ＨＣＮ−１Ａ細胞はＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から入手した。Ｇｌ−１細胞（Ａ１７２細胞）は理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室から細胞番号ＲＣＢ２５３０で入手した。

各細胞の培地に、０（対照）、１、１０及び１００μｇ／ｍＬのナノ粒子を添加し、７２時間培養した。その後、ＭＴＴアッセイにより各細胞の生存率を測定した。図２は、実験結果を示すグラフである。その結果、製造例１のナノ粒子は、様々な細胞に対して細胞毒性が低く、細胞適合性があることが明らかとなった。

［実施例４］
（薬物の担持と放出）
紫外−可視スペクトロメーター（型式「ＵＶ−２１００ＰＣ／３１００ＰＣ」、島津製作所）を用いて、ナノ粒子による薬物の担持及び放出を定量した。製造例１〜４のナノ粒子によるクルシン（２８ｋＤａ）の担持は、紫外−可視スペクトル測定で２２０ｎｍ及び２５０ｎｍに特徴的なピークを検出すること、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で２８ｋＤａのバンドが得られることにより確認した。

ナノ粒子の紫外−可視吸収スペクトルではわずかなピークシフトが認められ、これはクルシンとナノ粒子成分との相互作用によるものであると考えられた。クルシンのナノ粒子への担持効率は約６７％であり、３．５ｍｇのクルシン（５４．６ｍｇのナノ粒子中）が担持されたことが明らかとなった。

ナノ粒子からのクルシンの放出は紫外−可視スペクトル測定により解析した。その結果、クルシンの放出が高度に持続することが明らかとなった。より具体的には、ナノ粒子からのクルシンの放出量は、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、それぞれ３２％、５１％及び８３％であることが明らかとなった。このような、高度に穏やかで持続的なクルシンの放出特性は、ナノ粒子の形態に直接的に関係していると考えられた。

製造例１〜４のナノ粒子は、ポリマー及び脂質の二重の膜によりクルシンを担持している。この二重の膜が、クルシンが脂質／ポリマー層を通過しなければ放出されず、その結果、持続的で遅延したクルシンの放出が実現されると考えられた。

［実施例５］
（インビボでの腫瘍の縮小）
上述した手順で動物実験を行った。より具体的には、１群８匹ずつのＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、遊離のクルシンのみ、製造例１のナノ粒子（クルシンナノ粒子）、製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）、製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）及び製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した。また、対照として、緩衝液のみを投与した群も用意した。

具体的には、実験に４８匹のマウスを用いた。これらのマウスを実験前に１週間馴化した後、ヒト膠芽腫細胞株であるＧｌ−１（理化学研究所）を頭蓋内移植（ブレグマの１ｍｍ下）した。移植後、マウスをランダムに１群８匹ずつの６つの群に分けた。移植から９６時間後に、１群８匹ずつのＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに、遊離のクルシンのみ、製造例１のナノ粒子（クルシンナノ粒子）、製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）、製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）及び製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を静脈内投与した。また、対照として、緩衝液のみを投与した群も用意した。投与は４８時間毎に繰り返し行った。薬物の投与量は１回の投与あたり１６μｇで一定とした。各マウスの体重を、と殺まで５日毎に測定した。

各マウスの体重及び行動を記録した。図３は、実験開始０日目、８日目及び１５日目のマウスの体重の変化を示すグラフである。その結果、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群のマウスは、８日目及び１５日目の体重が顕著に減少したことが明らかになった。マウスの行動も大きく変化した。バランスの崩れた動作、食餌又は水の摂取が困難になる、制限された移動、接触に対する遅延した抵抗又は無抵抗は、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群のマウスで観察された主な行動であった。

また、製造例１のナノ粒子（クルシンナノ粒子）を投与した群においても状況は似ていたが、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群と比較するとより改善されていた。

また、製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）又は製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群では、体重のわずかな減少が認められたが、異常な行動は認められなかった。

また、製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群は、一定の体重を示し、行動も正常であり、最も健康であった。

［実施例６］
（脳試料の観察）
実施例５に記載した１０回目の投与から４８時間後に各群について４匹のマウスを安楽死させ、全身の潅流固定を行い、全脳を摘出した。摘出された脳試料における腫瘍の成長を解析した。図４（ａ）〜（ｆ）は、各群のマウスの代表的な脳試料の写真である。図４（ａ）〜（ｆ）中、腫瘍部分を点線で囲んで示す。図４（ａ）は対照群の脳試料の写真であり、図４（ｂ）は遊離のクルシンのみを投与した群の脳試料の写真であり、図４（ｃ）は製造例１のナノ粒子（クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図４（ｄ）は製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図４（ｅ）は製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図４（ｆ）は製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真である。

その結果、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群の脳試料では、ほぼ１つのローブ全体が腫瘍化していた。また、もう一方のローブにも腫瘍が転移しており、グリオーマの浸潤性の高さを示していた。

製造例１のナノ粒子を投与した群では、約１／４の脳が腫瘍化していた。また、製造例２及び３のナノ粒子を投与した群では、製造例３のナノ粒子を投与した群の方が腫瘍の体積が比較的小さく、製造例２のナノ粒子を投与した群の方が腫瘍の体積が比較的大きかった。また、製造例４のナノ粒子を投与した群は最も治療が成功した群であり、肉眼で確認できる腫瘍は脳の表面には認められなかった。この結果は、製造例４のナノ粒子が、脳腫瘍の増殖を抑制するのに非常に効果的であることを示す。

［実施例７］
（脳試料の病理組織学的な解析）
実施例６で摘出した脳は、直ちに４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定から２４時間後、脳試料をスクロース溶液に移し一晩静置した。続いて脳試料を樹脂（ＯＣＴコンパウンド）に包埋し、凍結した。続いて、クライオスタットを用いて、厚さ３０μｍの脳試料の切片を作製した。切片は風乾し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。また、腫瘍の容積を測定し記録した。

図５（ａ）〜（ｆ）は、各群の脳試料における、腫瘍の中央部の切片のヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す写真である。図５（ａ）は対照群の脳試料の写真であり、図５（ｂ）は遊離のクルシンのみを投与した群の脳試料の写真であり、図５（ｃ）は製造例１のナノ粒子（クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図５（ｄ）は製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図５（ｅ）は製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真であり、図５（ｆ）は製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与した群の脳試料の写真である。

その結果、対照群のマウスの脳試料では、脳のほぼ半分に腫瘍が浸潤していた。更に、脳の大きさが通常の脳の約２倍に腫脹し、形態学的な構造が変形していた。

また、製造例４のナノ粒子を投与した群以外の脳では、生存及び予後に深刻な脅威となる腫瘍の浸潤が認められた。また、製造例４のナノ粒子を投与した群の脳では、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群と比較して腫瘍の体積が小さかった。

図６は、各群の脳試料における腫瘍の体積の測定結果を示すグラフである。統計学的な解析の結果、遊離のクルシンのみを投与した群の腫瘍の体積は、対照群の腫瘍の体積の約７０％であった。また、製造例１のナノ粒子を投与した群においても腫瘍の縮小は認められなかった。また、製造例２のナノ粒子を投与した群の腫瘍の体積は、対照群の腫瘍の体積の約４０％であった。また、製造例３のナノ粒子を投与した群の腫瘍の体積は、対照群の腫瘍の体積の約２５％であった。

これに対し、製造例４のナノ粒子を投与した群の腫瘍の体積は、対照群の腫瘍の体積の約１０％であり、統計学的に有意な差が認められた。

以上の結果は、製造例１〜４のナノ粒子は、血液脳関門を通過することができ、ナノ粒子の表面に配置されたリガンドの効率（標的細胞に選択的かつ特異的に結合する能力）に依存して脳腫瘍に到達することができることを示す。特に、製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）は、脳腫瘍に対して優れた治療効果を有することが示された。

［実施例８］
（生存期間の延長の検討）
実施例６で安楽死させなかった残りの各群４匹ずつのマウスは生存率の測定に使用した。各群のマウスの生存期間を計測した。表２に計測された生存期間を示す。その結果、対照群及び遊離のクルシンのみを投与した群のマウスの生存期間は、癌の移植から約２０日間であった。

また、製造例２のナノ粒子を投与した群のマウスの生存期間は対照群と比較して約５日延長した。また、製造例３のナノ粒子を投与した群のマウスの生存期間は対照群と比較して約１０日延長した。これに対し、製造例４のナノ粒子を投与した群のマウスの生存期間は対照群と比較して約２倍に延長した。

脳試料の解析結果から、製造例４のナノ粒子を投与した群では、腫瘍の体積が顕著に縮小したが、消失はしていなかった。腫瘍の移植から４０日後にマウスが死亡したことは、腫瘍細胞が残存しており、腫瘍が再発したことによると考えられた。治療を延長することにより、残存する腫瘍細胞を完全に消失させることができる可能性が考えられた。

［実施例９］
（ナノ粒子のさらなる解析）
ナノ粒子へのクルシンの取り込みをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確かめた。クルシン、製造例５のナノ粒子（薬物非担持ナノ粒子）及び製造例１のナノ粒子（非標的化クルシンナノ粒子）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルを染色して、タンパク質を解析した。結果を図７Ａに示す。クルシンは２８ｋＤａの分子量を有する。製造例１のナノ粒子では２８ｋＤａのバンドが見られ、クルシンが製造例１のナノ粒子に取り込まれていることが示された。一方、製造例５のナノ粒子（薬物非担持ナノ粒子）では、２８ｋＤａのバンドは見られなかった。

ナノ粒子へのトランスフェリンの結合をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確かめた。トランスフェリン、製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）及び製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルを染色して、タンパク質を解析した。結果を図７Ｂに示す。全てのレーンで７９ｋＤａのトランスフェリンのバンドが見られ、製造例３及び４のナノ粒子にトランスフェリンが結合していることが示された。

続いて、ＲＧＤトリペプチドのナノ粒子表面への結合をＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）質量分析によって確かめた。ＲＧＤトリペプチド、製造例２の粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）及び製造例４の粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）をＭＡＬＤＩ質量分析機器（ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ、Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、島津製作所）によって解析した。結果を図８に示す。ＲＧＤトリペプチドが通常示すピーク５６８ｍ／ｚから少しシフトしていたが、ＲＧＤトリペプチドは５８８．３５ｍ／ｚにピークを示した。製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）及び製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）は、ＲＧＤトリペプチドと同じ位置にピークを示した。このことから、製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）及び製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）中にＲＧＤトリペプチドが存在することが示された。

［実施例１０］
（生存期間の延長のさらなる検討）
４週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスを２週間馴化した後、マウス１匹あたり３０，０００個のヒト膠芽腫細胞株Ｇｌ−１細胞（理化学研究所）を頭蓋内移植し、頭蓋内腫瘍を担持するマウスを作製した。移植後、マウスに、ＰＢＳ（陰性対照）、遊離クルシン（マウス１匹あたり１６μｇ）、及び製造例１〜４のナノ粒子（１００μｌ中、約１６μｇのクルシンを含有する２５０μｇのナノ粒子）のいずれかを尾静脈に注射した。２日に１回、合計１８回投与を行った。

マウスの生存期間を図９に示す。図９（ａ）は対照群、図９（ｂ）は遊離クルシン投与群、図９（ｃ）は製造例１のナノ粒子（非標的化クルシンナノ粒子）投与群、図９（ｄ）は製造例２のナノ粒子（ＲＧＤ結合クルシンナノ粒子）投与群、図９（ｅ）は製造例３のナノ粒子（トランスフェリン結合クルシンナノ粒子）投与群、及び図９（ｆ）は製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）投与群の生存率を示す。図９の縦軸は生存率（％）を示し、図９の横軸は、移植日を０日目として移植後の日数を示す。

製造例４のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合クルシンナノ粒子）を投与したマウスの約６０％が完全な腫瘍退行を示し、健康関連異常を伴わずに８０日目まで生存した（図９（ｆ））（８０日後にマウスは安楽死させた）。一方、他の群のマウスは３０日以上生存しなかった。この結果から、ＲＧＤ及びトランスフェリンを結合させたクルシンナノ粒子は、脳腫瘍に対して優れた治療効果を奏し、生存期間を大きく延長させることが示された。

［実施例１１］
［製造例６］
（非標的化ＱＤナノ粒子の調製）
ＣｄＳｅ ＱＤ（量子ドット）をＭｏｈａｍｅｄら（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，２０１６，８，７８７６−７８８８）に記載の方法に従って調製した。具体的には、セレン（Ｓｅ）０．００７８ｇを、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）の種子から抽出した油（ＪＣ油）１ｍＬ中で２５０℃にて３０分間溶解することによって、セレン前駆体溶液を得て、この溶液を室温に冷却した。酸化カドミウム（ＣｄＯ）粉末（０．１ｍｍｏｌ）、ＪＣ油（５ｍＬ）及びオクタデセン（１０ｍＬ）の混合物を、撹拌し、溶液が透明になるまでアルゴン流の下で３００℃まで加熱した。次いで、セレン前駆体溶液を上記混合物に素早く添加し、３００℃で２分間維持し、すぐに室温に冷却した。次いで、混合物を９０００ｒｐｍで５分間エタノールを用いて遠心分離し、２回洗浄し、得られた量子ナノ結晶をクロロホルム中に懸濁した。

クロロホルム中に懸濁したＱＤ（量子ドット）を、クロロホルムに溶解させた等濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、ステアリン酸、及びレシチンに添加し、一晩乾燥させ、薄膜を形成した。続いて、この薄膜にＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を添加して、超音波処理器（アズワン社）を用いて穏やかに（４３ｋＨｚ）数分間（１〜２分間）ソニケーション（水和）し、透明で安定な懸濁液を得た。続いて、懸濁液を５００００ｒｐｍで３０分間遠心してナノ粒子をペレット化させ、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）を得た。

［製造例７］
（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子の調製）
製造例１のナノ粒子の代わりに製造例６のナノ粒子を用いたこと以外は、製造例２と同様の方法によって、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）を調製した。

［製造例８］
（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子の調製）
製造例１のナノ粒子の代わりに製造例６のナノ粒子を用いたこと以外は、製造例３と同様の方法によって、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）を調製した。

［製造例９］
（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子の調製）
製造例１のナノ粒子の代わりに製造例６のナノ粒子を用いたこと以外は、製造例４と同様の方法によって、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）を調製した。

［実施例１２］
（ナノ粒子の腫瘍への蓄積）
実施例１０に記載したように作製した、頭蓋内腫瘍を担持するマウスをこの実験に用いた。ＰＢＳ（陰性対照）、蛍光クルシン（マウス１匹あたり１００μｇ）、及び製造例６〜９のナノ粒子（マウス１匹あたり０．５ｍｇのナノ粒子）のいずれかを、マウスに静脈内注射した。蛍光クルシンは、市販のＩＣＧ（インドシアニングリーン色素）のＮＨＳエステルを用いて調製した。精製クルシン及びＮＨＳ−ＩＣＧ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を３７℃で３０分間反応させてコンジュゲートさせ、蛍光クルシンを、製造業者の推奨に従って、分子量カットオフベースの遠心分離によって遊離クルシン及び色素から分離することによって得た。投与の６、２４及び４８時間後に、マウスを安楽死させ、脳を取り出した。腫瘍及び正常脳組織におけるＱＤ蓄積をインビボイメージングシステム（型式「Ｃｌａｉｒｖｉｖｏ Ｏｐｔ」、島津製作所）を用いて画像化した。画像化後、腫瘍を正常脳組織から分離し、腫瘍及び正常脳組織をそれぞれホモジナイズし、ＱＤの蛍光を蛍光分光光度計を用いて測定した。

ＱＤナノ粒子の脳における蓄積を図１０に示す。対照群は、予想通り、腫瘍及び正常脳において蛍光を示さなかった。クルシン投与群の脳は、腫瘍及び正常脳組織の両方に、クルシンの非特異的蓄積を示したが、腫瘍における蛍光強度は非常に低かった。製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、投与６時間後に、腫瘍組織内に赤色に画像化されたはっきりとした蛍光シグナルを示し、隣接する正常脳組織への非特異的蓄積は見られなかった。製造例７及び８のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）も、６時間までに腫瘍特異的蓄積を示した。２４時間後には、ＱＤシグナル強度は、多くの群で弱くなったが、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）では強いままだった。４８時間までに、大部分のＱＤは腫瘍から消失したが、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）のみが検出可能な蛍光を示した。

各群の腫瘍の蛍光を定量し、対照群と比較した結果を図１１Ａに示す。製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）及び製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、投与６時間後において、対照と比較してそれぞれ４、３．５、４．８及び５．８倍のナノ粒子蓄積増加を示した。投与２４時間後には、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、及び製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）で蛍光強度が６時間後より減少した。一方、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）では、蛍光は２４時間後にさらに増加し、対照と比較して約７倍であった。この結果は、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子が、脳腫瘍に送達され、腫瘍に長時間蓄積したことを示す。

正常脳組織／腫瘍の蛍光比を図１１Ｂに示す。ナノ粒子が非特異的に蓄積すると、正常脳組織と腫瘍は同様の蓄積プロファイルを示し、その結果、両組織の蛍光の比は１に近くなる。逆にナノ粒子が腫瘍に特異的に蓄積すると、比は小さくなる。投与６時間後に、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）では比は約０．８であり、一方、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）及び製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）では、比はそれぞれ０．６７、０．５７及び０．５であった。このことは、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子が、腫瘍に特異的に蓄積し、正常脳組織への非特異的な蓄積が非常に少ないことを示す。投与２４時間及び４８時間後では、多くの群で比は増加したが、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）では、４８時間後でさえ、比は約０．６と低いままだった。このことは、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子が、長時間にわたり腫瘍に特異的に蓄積することを示す。

正常脳組織における平均蛍光強度を図１１Ｃに示す。この結果は、脳組織における非特異的な蛍光クルシン又は粒子の蓄積を示す。対照群は、脳組織に蛍光をほぼ示さなかった。蛍光クルシン群も脳にほぼ蛍光を示さず、このことは、遊離薬物が血液脳関門の通過を制限されていることを示す。製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）は、脳に高い非特異的蓄積を示し、これに製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、さらに製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）が続いた。製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、正常脳組織における非特異的蓄積が非常に少なかった。

これらの結果から、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子は、長時間にわたり脳腫瘍に蓄積し、また、正常脳組織への非特異的な蓄積が少ないことが示された。

［実施例１３］
（ナノ粒子の生体内分布）
実施例１０に記載したように作製した、頭蓋内腫瘍を担持するマウスをこの実験に用いた。製造例６〜９のナノ粒子（マウス１匹あたり０．５ｍｇのナノ粒子）のいずれかを、マウスの尾静脈に注射した。投与の６、２４及び４８時間後に、マウスを安楽死させ、主な臓器（脳、肺、心臓、腎臓、脾臓、及び肝臓）を取り出し、さらに、脳の腫瘍を正常脳組織から分離した。またマウスから血液も回収した。ＱＤ蓄積を、量子ドットの元素組成に基づきＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計）（サーモ・サイエンティフィック社）を用いて定量化した。

結果を図１２及び１３に示す。図１２Ａは脳、図１２Ｂは肺、図１２Ｃは心臓、図１２Ｄは腎臓、図１３Ａは脾臓、図１３Ｂは肝臓、図１３Ｃは血液及び図１３Ｄは腫瘍における各群の平均蛍光強度を示す。

製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、製造例６〜８のナノ粒子より、正常脳組織、肺、心臓、腎臓、脾臓、及び肝臓への蓄積が少なく、このことは、非特異的蓄積が少ないことを示す（図１２Ａ〜１２Ｄ及び１３Ａ〜１３Ｂ）。非特異的蓄積は、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）で高く、これに製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、さらに製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）が続いた。一方、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、血液及び腫瘍に著しく多く検出された（図１３Ｃ及び１３Ｄ）。製造例９のナノ粒子が血中に多く存在することは、この粒子が他の粒子に比べて増加した血中半減期を有することを示す。また、製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、腫瘍に、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）と比べて約６〜７倍、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）と比べて６倍、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）と比べて約２倍多く存在し（図１３Ｄ）、この結果は、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子の腫瘍への標的化効率及び特異性の高さを示す。

［実施例１４］
（インビトロＢＢＢモデルの作製）
ヒト脳微小血管内皮細胞及びヒト脳微小血管周皮細胞をＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、ＣＳＣクラシック培地キットを用いて培養した。細胞は３７℃、加湿雰囲気及び５％ＣＯ_２で増殖させた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ(登録商標)インサート（３μｍ孔径、２４ウェル、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）を逆さに置き、周皮細胞をその上に添加して２４時間増殖させた。その後、インサートを注意しながら再度逆さにして（元に戻して）２４ウェルプレートに入れ、内皮細胞をインサートの上側に播種した。高密度の共培養が達成されるまで細胞を培養し、インビトロＢＢＢ（血液脳関門）モデルを作製した（図１４）。このインビトロＢＢＢモデルは、膜の上側（頂端側）で培養されたヒト脳内皮細胞及び下側（基底側）で培養されたヒト脳周皮細胞を有する。インビトロＢＢＢモデルを用いる以降の実験では陰性対照として、細胞のないＴｒａｎｓｗｅｌｌ(登録商標)インサートを用いた。

［実施例１５］
（インビトロＢＢＢモデルの評価）
実施例１４で作製したインビトロＢＢＢモデルのＢＢＢ完全性を確認するために、培地透過アッセイ及び頂端側から基底側への透過性分析を行った。

培地透過アッセイは、０．５ｍｌの培地をインビトロＢＢＢモデルの上部チャンバーに添加し、３０分後に下部チャンバーに透過した培地の体積を定量することによって行った。陰性対照として、細胞のないＴｒａｎｓｗｅｌｌ(登録商標)インサートを用いた。透過した培地の体積が少ないことは、ＢＢＢにおける、より強固な接合部の存在を示す。

培地透過アッセイの結果を図１５Ａに示す。対照では培地は下部チャンバーに完全に流れ出たのに対し、インビトロＢＢＢモデルでは、培地は上部チャンバーに留まり、培地の透過は非常に少ないことが示された。

次に、頂端側から基底側への透過性分析を、低分子量のＦＩＴＣ−イヌリン（シグマアルドリッチ社）、中程度の分子量のＦＩＴＣ−デキストラン２０ｋＤａ（シグマアルドリッチ社）又は高分子量のＦＩＴＣ−デキストラン７０ｋＤａ（シグマアルドリッチ社）をインビトロＢＢＢモデルの上部チャンバー上に添加し、１５分後及び３０分後に下部チャンバーに流れ出た蛍光を測定することによって行った。イヌリン及びデキストランは、インビトロＢＢＢモデルにおいて、薬剤透過性を試験するために使用されたことが報告されている（Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１４，１１（７）：１９４９−１９６３）。陰性対照として、細胞のないＴｒａｎｓｗｅｌｌ(登録商標)インサートを用いた。

頂端側から基底側への透過性分析の結果を図１５Ｂに示す。対照と比較して、インビトロＢＢＢモデルでは、イヌリン及びデキストランはほとんど透過しないことが示された。３０分後には、インビトロＢＢＢモデルで低分子量のイヌリンがわずかに透過したが、これは、分子量に依存した透過現象（すなわち、低分子量の物質は高分子量の物質より容易に透過すること）を示す。このことは、インビトロＢＢＢモデルがインビボの血液脳関門と同等に機能することを示す。

また、インビトロＢＢＢモデルでは、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、３８２Ω／ｃｍ^２であった。ＴＥＥＲは３００Ω／ｃｍ^２より大きい場合にインビボ条件をよく反映しているとみなされる。

これらの結果は、実施例１４で作製したインビトロＢＢＢモデルが、インビボの血液脳関門をよく反映していることを示す。

［実施例１６］
（ナノ粒子の血液脳関門の通過能）
ＦＩＴＣ標識クルシン及び製造例６〜９のナノ粒子が血液脳関門を通過できるかどうかを、実施例１５に記載した頂端側から基底側への透過性分析と同様にして調べた。ＦＩＴＣ標識クルシンは、精製クルシンをＦＩＴＣのＮＨＳエステル（ＦＩＴＣ−ＮＨＳ、Ｄｏｊｉｎｄｏ社）と反応させ、分子カットオフ技術を用いて遊離クルシン及びＦＩＴＣから分離することによって調製した。ＦＩＴＣ標識クルシン又は製造例６〜９のナノ粒子（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を、実施例１４で作製したインビトロＢＢＢモデルの上部チャンバーに添加し、４時間インキュベートした。その後、下部チャンバー内のＦＩＴＣ又は量子ドットの蛍光を測定して、透過性を評価した。

結果を図１６に示す。製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は約９５％の高い透過性を示し、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）（８２％）及び製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）（７０％）が続いた。この結果は、特にＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子が、血液脳関門を効率的に通過できることを示す。

［実施例１７］
（ＲＧＤとトランスフェリンの比が、ナノ粒子の血液脳関門通過能に与える影響）
ＲＧＤトリペプチドとトランスフェリンが様々な比で結合したナノ粒子を調製した。ＲＧＤ：トランスフェリンが２：８の質量比（約５７：１のモル比）で結合したナノ粒子（ＲＧＤ２：Ｔｆ８）を、１０ｍｇのナノ粒子あたり、０．４ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する活性化したＲＧＤトリペプチド及び１．６ｍｇのトランスフェリンに相当する活性化したトランスフェリンを用いたこと以外は、製造例９と同様の方法で調製した。ＲＧＤ：トランスフェリンが４：６の質量比（約１５２：１のモル比）で結合したナノ粒子（ＲＧＤ４：Ｔｆ６）を、１０ｍｇのナノ粒子あたり、０．８ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する活性化したＲＧＤトリペプチド及び１．２ｍｇのトランスフェリンに相当する活性化したトランスフェリンを用いたこと以外は、製造例９と同様の方法で調製した。ＲＧＤ：トランスフェリンが６：４の質量比（約３４２：１のモル比）で結合したナノ粒子（ＲＧＤ６：Ｔｆ４）を、１０ｍｇのナノ粒子あたり、１．２ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する活性化したＲＧＤトリペプチド及び０．８ｍｇのトランスフェリンに相当する活性化したトランスフェリンを用いたこと以外は、製造例９と同様の方法で調製した。ＲＧＤ：トランスフェリンが８：２の質量比（約９１３：１のモル比）で結合したナノ粒子（ＲＧＤ８：Ｔｆ２）を、１０ｍｇのナノ粒子あたり、１．６ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する活性化したＲＧＤトリペプチド及び０．４ｍｇのトランスフェリンに相当する活性化したトランスフェリンを用いたこと以外は、製造例９と同様の方法で調製した。ナノ粒子ＲＧＤ２：Ｔｆ８、ＲＧＤ４：Ｔｆ６、ＲＧＤ６：Ｔｆ４又はＲＧＤ８：Ｔｆ２（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を、実施例１４で作製したインビトロＢＢＢモデルの上部チャンバーに添加し、４時間インキュベートした。その後、下部チャンバー内の量子ドットの蛍光を測定して、透過性を評価した。

結果を図１７に示す。試験したナノ粒子は全て約９０％以上の高い透過性を示した。特に、ＲＧＤ４：Ｔｆ６が、約９６％の最も高い透過性を示した。この結果は、ＲＧＤトリペプチドとトランスフェリンを様々な比率で有するナノ粒子が効率的に血液脳関門を通過できることを示し、特にＲＧＤ：トランスフェリンが４：６の質量比（約１５２：１のモル比）の場合にナノ粒子がより効率的に血液脳関門を通過できることを示す。

［実施例１８］
（標的化剤の種類が、ナノ粒子の血液脳関門通過能に与える影響）
様々な標的化剤を単一で又は組み合わせて有するナノ粒子を調製した。標的化剤として、上記のＲＧＤトリペプチド及びトランスフェリンに加えて、葉酸（ＦＡ）及びアンジネックス（Ａｎｇｉｎｅｘ）を用いた。葉酸は、膠芽腫（グリオブラストーマ）を含む多くの癌細胞で過剰発現している葉酸受容体に結合するため、癌細胞を標的化する。アンジネックスは、様々な腫瘍及び内皮細胞で発現しているガレクチン−１（ｇａｌｅｃｔｉｎ−１）に結合するため、腫瘍細胞（癌細胞）、及び新しい血管を形成する内皮細胞（血管新生）を標的化する。

葉酸（シグマアルドリッチ社）２ｍｇに、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド ヒドロクロリド（ＥＤＣ）（シグマアルドリッチ社）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（シグマアルドリッチ社）を添加し、４℃で一晩反応させ、葉酸を活性化した。活性化した葉酸を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、葉酸が結合したナノ粒子を得た。

アンジネックス（フェニックス ペプチド社）２ｍｇに、ＥＤＣ及びＮＨＳを添加し、４℃で一晩反応させ、アンジネックスを活性化した。活性化したアンジネックスを、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、アンジネックスが結合したナノ粒子を得た。

次いで、二種類の標的化剤を有するナノ粒子を調製した。葉酸２ｍｇに、ＥＤＣ及びＮＨＳを添加し、４℃で一晩反応させ、葉酸を活性化した。アンジネックス、ＲＧＤトリペプチド及びトランスフェリンも同様にそれぞれ活性化した。

活性化した葉酸（１ｍｇの葉酸に相当する）及び活性化したアンジネックス（１ｍｇのアンジネックスに相当する）を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、葉酸及びアンジネックスが結合したナノ粒子を得た。

活性化した葉酸（１ｍｇの葉酸に相当する）及び活性化したトランスフェリン（１ｍｇのトランスフェリンに相当する）を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、葉酸及びトランスフェリンが結合したナノ粒子を得た。

活性化した葉酸（１ｍｇの葉酸に相当する）及び活性化したＲＧＤトリペプチド（１ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する）を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、葉酸及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子を得た。

活性化したアンジネックス（１ｍｇのアンジネックスに相当する）及び活性化したトランスフェリン（１ｍｇのトランスフェリンに相当する）を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、アンジネックス及びトランスフェリンが結合したナノ粒子を得た。

活性化したアンジネックス（１ｍｇのアンジネックスに相当する）及び活性化したＲＧＤトリペプチド（１ｍｇのＲＧＤトリペプチドに相当する）を、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）１０ｍｇと４℃で一晩反応させた。反応液を５００００ｒｐｍで遠心して、ナノ粒子をペレット化させ、アンジネックス及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子を得た。

こうして調製したナノ粒子及び製造例７〜９のナノ粒子（濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）を、実施例１４で作製したインビトロＢＢＢモデルの上部チャンバーに添加し、４時間インキュベートした。その後、下部チャンバー内の量子ドットの蛍光を測定して、透過性を評価した。

図１８は、アンジネックスが結合したナノ粒子（Ａｎｇ）、葉酸が結合したナノ粒子（ＦＡ）、製造例７のＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子（ＲＧＤ）、製造例８のトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子（Ｔｆ）、葉酸及びアンジネックスが結合したナノ粒子（ＦＡ−Ａｎｇ）、葉酸及びトランスフェリンが結合したナノ粒子（ＦＡ−Ｔｆ）、葉酸及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子（ＦＡ−ＲＧＤ）、アンジネックス及びトランスフェリンが結合したナノ粒子（Ａｎｇ−Ｔｆ）、アンジネックス及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子（Ａｎｇ−ＲＧＤ）及び製造例９のＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子（ＲＧＤ−Ｔｆ）の透過性の結果を示す。ＲＧＤトリペプチドとトランスフェリンの組み合わせを有するナノ粒子が、最も優れた脳血液関門通過能を示した。

［実施例１９］
（インビトロにおける膠芽腫（グリオブラストーマ）への標的化）
Ｇｌ−１細胞（理化学研究所）を１２ウェルプレートに１×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。次いで、細胞を、ＦＩＴＣ標識クルシン（実施例１６に記載）、製造例６〜９のナノ粒子、ＲＧＤトリペプチドとトランスフェリンが様々な比で結合したナノ粒子（実施例１７に記載）、及び様々な標的化剤を単一で又は組み合わせて有するナノ粒子（実施例１８に記載）で２時間処理した。処理終了時に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞の取り込み効率をＦＡＣＳ装置（インテリサイト社）で分析した。

結果を図１９〜２１に示す。図１９Ａは対照、図１９Ｂは製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）、図１９Ｃは製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、図１９Ｄは製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）、図１９Ｅは製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）、図２０Ａはナノ粒子ＲＧＤ２：Ｔｆ８、図２０Ｂはナノ粒子ＲＧＤ４：Ｔｆ６、図２０Ｃはナノ粒子ＲＧＤ６：Ｔｆ４、図２０Ｄはナノ粒子ＲＧＤ８：Ｔｆ２、図２１Ａはアンジネックスが結合したナノ粒子、図２１Ｂは葉酸が結合したナノ粒子、図２１Ｃは葉酸及びアンジネックスが結合したナノ粒子、図２１Ｄはアンジネックス及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子、図２１Ｅはアンジネックス及びトランスフェリンが結合したナノ粒子、図２１Ｆは葉酸及びＲＧＤトリペプチドが結合したナノ粒子、並びに図２１Ｇは葉酸及びトランスフェリンが結合したナノ粒子の分析結果を示す。

製造例９のナノ粒子（ＲＧＤ及びトランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）は、製造例６のナノ粒子（非標的化ＱＤナノ粒子）、製造例７のナノ粒子（ＲＧＤ結合ＱＤナノ粒子）、製造例８のナノ粒子（トランスフェリン結合ＱＤナノ粒子）と比べて、標的細胞において多くの蓄積を示し（１０^３〜１０^４の範囲の強度）（図１９Ｂ〜１９Ｅ）、ＲＧＤ及びトランスフェリンが結合したナノ粒子の優れた標的化効率が示された。ＲＧＤトリペプチドとトランスフェリンの比を変化させると、ＲＧＤ：トランスフェリンが４：６の質量比の場合に膠芽腫細胞に最も多くの蓄積が示された（図２０Ａ〜２０Ｄ）。さらに、様々な標的化剤及びそれらの組み合わせを試験したが（図２１Ａ〜２１Ｇ）、ＲＧＤとトランスフェリンの組み合わせより優れた蓄積を示すものはなかった。これらの結果から、特にＲＧＤとトランスフェリンを組み合わせて有するナノ粒子が、標的細胞である膠芽腫細胞へ効率的に標的化及びアクセスできることが示された。

［実施例２０］
（さらなる薬物の担持及び放出）
薬物としてドキソルビシン又はパクリタキセルを含むナノ粒子を調製し、薬物の担持及び放出を調べた。

ナノ粒子を、改変した脂質コアセルベーション法によって調製した。等濃度の１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、アバンティ ポーラ リピッド社）、ステアリン酸（シグマアルドリッチ社）、及びレシチン（シグマアルドリッチ社）をクロロホルムに溶解して一晩乾燥させ、薄膜を形成した。

続いて、薄膜を、薬物ドキソルビシン（ＤＯＸ、シグマアルドリッチ社）又はパクリタキセル（ＰＴＸ、和光純薬工業）の溶液（緩衝液中）を用いて水和し、数分間ソニケーションし、透明で安定な懸濁液を得た。続いて、懸濁液を遠心分離機（日立社）により５００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、薬物を担持するナノ粒子をペレット化させた（洗浄工程）。この洗浄工程を繰り返し行うことによって、薬物担持ナノ粒子を得た。ドキソルビシンは、アントラサイクリン系化合物の抗癌剤であり、分子量約５４４を有する親水性化合物である。パクリタキセルは、タキサン類化合物の抗癌剤であり、分子量約８５４を有する疎水性化合物である。

１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを用いてナノ粒子の脂質殻を溶解して、ナノ粒子の薬物担持効率を定量した。放出された薬物の吸光度（ドキソルビシンの場合は４５０ｎｍ、パクリタキセルの場合は２８０ｎｍの吸光度）を分光光度計（型式「ＵＶ−２１００ＰＣ／３１００ＰＣ」、島津製作所）を用いて読み取った。薬物濃度と吸光度の関係を示す、予め作成しておいた標準曲線を用いて、測定した吸光度を薬物濃度に変換した。薬物担持効率（％）は、薬物担持ナノ粒子の調製に使用した全薬物に対する、上記の脂質殻の溶解によって放出された薬物（ナノ粒子に担持された薬物）の割合として算出した。薬物担持効率を図２２に示す。ドキソルビシン及びパクリタキセルのナノ粒子への担持効率は、それぞれ約８３％及び約６２％であることが示された。

次に、薬物を担持するナノ粒子を生理的ｐＨ（７．２）のＰＢＳ中に様々な時間（０〜９６時間）インキュベーションした後、遠心分離によってペレット化し、放出された薬物を含む上清の吸光度を分光光度計（型式「ＵＶ−２１００ＰＣ／３１００ＰＣ」、島津製作所）を用いて読み取った。薬物濃度と吸光度の関係を示す、予め作成しておいた標準曲線を用いて、測定した吸光度を薬物濃度に変換した。放出率（％）を、ナノ粒子に担持された薬物に対する、放出された薬物の割合として算出した。薬物放出プロファイルを図２３に示す。薬物の放出は、長期間にわたって高く維持された。ナノ粒子からのドキソルビシンの放出は、２９％（６時間）、５９％（２４時間）、及び９２％（７２時間）であった。パクリタキセルの放出プロファイルはドキソルビシンと類似していた。これらの結果は、ナノ粒子からの薬物の穏やかで持続的な放出を示す。

本発明によれば、血液脳関門を通過可能な薬物送達システム等に利用することができ、細胞毒性が低いナノ粒子組成物を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (18)

1. 腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、
   腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
   腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、トランスフェリンであり、
   前記ナノ粒子は、外層とその外層によって包まれている小胞とを有し、かつ前記ナノ粒子は、膜成分として、ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミンと、ステアリン酸と、ホスファチジルコリンのみを含む、ナノ粒子組成物。
2. 前記ホスファチジルエタノールアミンが、ＤＳＰＥである、請求項１に記載のナノ粒子組成物。
3. 前記ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミンが、アミノ基で修飾されたＰＥＧを有する、請求項１又は２に記載のナノ粒子組成物。
4. 前記第一の物質と前記第二の物質とを、２：８〜８：２の質量比で含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。
5. 前記第一の物質と前記第二の物質とを、３５：６５〜４５：５５の質量比で含む、請求項４に記載のナノ粒子組成物。
6. 前記ナノ粒子が薬物をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
7. 前記薬物が抗癌剤である、請求項６に記載のナノ粒子組成物。
8. 前記ナノ粒子が画像化剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子組成物。
9. 腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質が表面に結合したナノ粒子を含むナノ粒子組成物を製造する方法であって、
   （ｉ）ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミンと、ステアリン酸と、ホスファチジルコリンとを揮発性有機溶媒中に含む溶液から揮発性有機溶媒を除去して、膜を形成させるステップ、
   （ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた膜を緩衝液中で超音波処理し、ナノ粒子を生成するステップ、及び
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたナノ粒子の表面に、腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質及び第二の物質を結合させるステップ
   を含み、
   腫瘍細胞に対する特異性を有する第一の物質は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸のアミノ酸配列を含むペプチドであり、
   腫瘍細胞に対する特異性を有する第二の物質は、トランスフェリンであり、
   前記ナノ粒子は、外層とその外層によって包まれている小胞とを有する、方法。
10. 前記ステップ（ｉｉ）において緩衝液が薬物を含み、薬物を含むナノ粒子が生成される、請求項９に記載の方法。
11. 前記薬物が抗癌剤である、請求項１０に記載の方法。
12. 画像化剤をナノ粒子に導入することをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ステップ（ｉ）の溶液が、ＰＥＧが結合したホスファチジルエタノールアミン、ステアリン酸、及びホスファチジルコリンをそれぞれ１０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項７に記載のナノ粒子組成物を含む、癌の治療用の医薬組成物。
15. 癌が脳腫瘍である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 請求項８に記載のナノ粒子組成物を含む、腫瘍細胞を画像化するための組成物。
17. 請求項８に記載のナノ粒子組成物を含む、脳腫瘍を検出するための組成物。
18. 請求項８に記載のナノ粒子組成物を含む、脳腫瘍に対する治療効果をモニタリングするための組成物。

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