JP6314193B2

JP6314193B2 - Culture of primate embryonic stem cells

Info

Publication number: JP6314193B2
Application number: JP2016186252A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズエイトムソン; マークレヴァンスタイン
Original assignee: ウィスコンシンアラムニリサーチファンデーション
Priority date: 2004-09-28
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2025-09-27
Also published as: IL182143A; JP2017121262A; IL182143A0; JP6216997B2; JP2016208999A; JP6446496B2; ES2800973T3; JP2012110354A

Description

（連邦政府後援研究に関しての記述）
決定済み。
（発明の背景）
本発明は、霊長類胚性幹細胞培養物の培養方法及びその方法で有用な培養液に関する。 (Description on federal-sponsored research)
Determined.
(Background of the Invention)
The present invention relates to a method for culturing a primate embryonic stem cell culture and a culture medium useful in the method.

霊長類（例えば、サル及びヒト）の多能性の胚性幹細胞は、着床前の胚から派生されてきた。例えば、米国特許番号5,843,780 及び文献 J.Thomson et al., 282 Science 1145-1147(1998)を参照。本明細書において言及されたこれらの刊行物及びあらゆる他の刊行物の開示は、あたかも完全に本明細書において述べられているかのように参照によって組み込まれる。長期の培養にも関わらず、これらの細胞は、３つ胚体胚葉すべての後生的派生体を形成する発生能を安定して保持している。 Pluripotent embryonic stem cells of primates (eg monkeys and humans) have been derived from preimplantation embryos. See, for example, US Pat. No. 5,843,780 and document J. Thomson et al., 282 Science 1145-1147 (1998). The disclosures of these publications and any other publications mentioned herein are incorporated by reference as if fully set forth herein. Despite long-term culture, these cells stably retain the developmental ability to form all three embryonic germ layers.

霊長類（特にヒト）ES細胞株は、広範囲に及ぶヒト発生生物学、薬物発見、薬物検査及び移植医薬に関連した有用性を持っている。例えば、着床後ヒト胚に関しての最近の知見は、主として限られた数の静的な組織学領域に基づくものである。倫理的な配慮のために、初期ヒト胚の発生の決定を制御する根本的な機構は、本質的には未開拓のままである。 Primate (especially human) ES cell lines have utility related to a wide range of human developmental biology, drug discovery, drug testing and transplantation medicine. For example, recent findings regarding post-implantation human embryos are primarily based on a limited number of static histology areas. For ethical considerations, the underlying mechanisms that control the developmental decisions of early human embryos remain essentially unexplored.

マウスは実験学的哺乳類発生生物学の頼みの綱であり、発生を制御している多くの基本的な機構はマウスとヒトの間で保存されてはいるが、初期のマウスとヒトの発生の間には著しい違いが存在する。霊長類／ヒトES細胞は、それ故にそれらの分化と機能に対する重要な新たな見識を与えるはずである。 Mice are the mainstay of experimental mammalian developmental biology, and many of the basic mechanisms that control development are conserved between mice and humans, but early mouse and human developmental There are significant differences between them. Primate / human ES cells should therefore provide important new insights into their differentiation and function.

霊長類ES細胞の分化型派生体は、新たな薬剤の標的遺伝子を同定するため、新たな化合物の毒性若しくは催奇形性の試験のため及び病気の細胞集団を交換する移植のために用いられうる。ES細胞から派生された細胞の移植により扱われるであろう潜在的な状態としては、パーキンソン病、心筋梗塞、若年発症糖尿病及び白血病などが挙げられる。例えば、J. Rossant et al. 17 Nature Biotechnology 23-4 (1999) 及び J. Gearhart, 282 Science 1061-2 (1998) を参照。 Differentiated derivatives of primate ES cells can be used to identify target genes for new drugs, for testing toxicity or teratogenicity of new compounds, and for transplants that replace diseased cell populations . Potential conditions that may be treated by transplantation of cells derived from ES cells include Parkinson's disease, myocardial infarction, juvenile-onset diabetes, and leukemia. See, for example, J. Rossant et al. 17 Nature Biotechnology 23-4 (1999) and J. Gearhart, 282 Science 1061-2 (1998).

長期間増殖能、長期間培養後の発生能及び核型安定性は、霊長類胚性幹細胞培養物の有用性に関する重要な特徴である。そのような細胞（特に繊維芽細胞の支持細胞層上の）の培養液には、そのような培養の際に所望の増殖を与えるために、通常は動物血清（特にウシ胎仔血清）が補われてきた。 Long-term proliferative capacity, developmental ability after long-term culture, and karyotypic stability are important characteristics regarding the usefulness of primate embryonic stem cell cultures. The culture medium of such cells (especially on fibroblast feeder cells) is usually supplemented with animal serum (especially fetal calf serum) to provide the desired growth during such culture. I came.

例えば、米国特許番号：5,453,357、5,670,372 及び 5,690,296 には、様々な培養条件が記載されており、これには、何らかの塩基性繊維芽細胞増殖因子の型が動物血清と共に使用されている条件が含まれている。残念ながら、血清は、バッチごとに変わりやすい特性を持つ傾向にあるため、このように培養液の特性に影響する。 For example, US Pat. Nos. 5,453,357, 5,670,372, and 5,690,296 describe various culture conditions, including those in which some basic fibroblast growth factor type is used with animal serum. ing. Unfortunately, serum tends to have variable properties from batch to batch, thus affecting the properties of the culture.

国際公開番号：WO 98/30679 には、培養液中のある種の胚性幹細胞の増殖を支えるために動物血清の代わりに血清非添加培養液を供給することに関しての議論が存在した。この血清代替物は、アルブミン若しくはアルブミン代替物、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸、１つ若しくはそれ以上のビタミン、１つ若しくはそれ以上のトランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、１つ若しくはそれ以上の抗酸化作用物質、１つ若しくはそれ以上のインスリン若しくはインスリン代替物、１つ若しくはそれ以上のコラーゲン前駆体及び１つ若しくはそれ以上の微量成分を含んでいる。この代替物は、更に白血病阻害因子、造血幹細胞因子若しくは細毛状の神経栄養因子も添加されうると言及されていた。残念ながら、霊長類の胚性幹細胞の培養（特にそれらが繊維芽支持細胞層上で成長した）であるが故に、これらの培養液は、十分に判明していなかった。 International publication number: WO 98/30679 had a debate regarding supplying serum-free medium instead of animal serum to support the growth of certain embryonic stem cells in the medium. The serum replacement is albumin or albumin replacement, one or more amino acids, one or more vitamins, one or more transferrins or transferrin replacements, one or more antioxidants Contains one or more insulins or insulin substitutes, one or more collagen precursors and one or more minor components. It was mentioned that this alternative could also contain leukemia inhibitory factor, hematopoietic stem cell factor or hairy neurotrophic factor. Unfortunately, because of the culture of primate embryonic stem cells (especially they grew on the fibroblast feeder layer), these cultures were not well understood.

血清添加培養液（例えばウシ胎仔血清）との関連で、国際公開番号WO 99/20741は、霊長類の幹細胞の培養におけるbFGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）のような様々な増殖因子使用の利点について議論している。しかしながら、栄養物血清なしの培養液は記載されていない。 In the context of serum-supplemented media (eg fetal bovine serum), International Publication No. WO 99/20741 describes the use of various growth factors such as bFGF (basic fibroblast growth factor) in the culture of primate stem cells. Discussing the benefits. However, no broth without nutrient serum is described.

米国特許番号：5,405,772 では、造血細胞及び骨髄間質細胞に対する増殖培養液が記載されている。この目的のために、血清欠乏性培養液中での繊維芽細胞増殖因子の使用が提案されている。しかしながら、霊長類の胚性幹細胞の増殖条件については記載されていない。 US Patent No. 5,405,772 describes a growth medium for hematopoietic cells and bone marrow stromal cells. For this purpose, the use of fibroblast growth factor in serum-deficient culture has been proposed. However, it does not describe the growth conditions of primate embryonic stem cells.

一番初めのヒト胚性幹細胞培養は、ヒト胚性幹細胞が未分化状態を保持したまま増殖されることを可能にする性質を有する繊維芽細胞の支持細胞を使用して培養された。その後、直接指示細胞を使用するのと同じ作用を持ついわゆる調製培養液を作製するためにその培養液を支持細胞に暴露することで十分であることが発見された。支持細胞若しくは調整培養液なしでは、培養液中のヒト胚性幹細胞は、未分化状態を維持することはできないであろう。支持細胞の使用あるいは培養液の支持細胞への暴露でさえも、培養液に不必要な物質による汚染の危険にさらすため、支持細胞及び調整培養液の使用を避けることが望ましい。本明細書において、支持細胞に暴露されていない培養液は非調製培養液といわれる。 The earliest human embryonic stem cell cultures were cultured using fibroblast feeder cells that have the property of allowing human embryonic stem cells to be propagated while remaining undifferentiated. It was subsequently discovered that it is sufficient to expose the culture to supporting cells in order to produce a so-called prepared culture that has the same effect as using the indicator cells directly. Without feeder cells or conditioned media, human embryonic stem cells in the culture would not be able to maintain an undifferentiated state. It is desirable to avoid the use of feeder cells and conditioned media, as the use of feeder cells or even exposure of the culture fluid to feeder cells exposes them to the risk of contamination with unwanted substances in the culture fluid. In the present specification, a culture solution not exposed to feeder cells is referred to as a non-prepared culture solution.

それ故に、動物血清使用を必要としない霊長類の胚性幹細胞の安定的な培養技術に対する必要性は未だ存在しうる。 Therefore, there may still be a need for stable culture techniques for primate embryonic stem cells that do not require the use of animal serum.

（発明の要約）
ある側面において、本発明は、霊長類胚性幹細胞の培養方法を提供する。幹細胞を、本質的に哺乳類胎児血清を含まず（好ましくは、本質的にどのような動物血清をも含まず）繊維芽細胞の支持細胞層以外の出所から供給される繊維芽細胞増殖因子を含む培養液中で培養する。ある好ましい方法においては、従来は幹細胞培養を維持するために必要であった繊維芽細胞の支持細胞層は、十分量の繊維芽細胞増殖因子の添加により不要なものとなる。 (Summary of the Invention)
In one aspect, the present invention provides a method for culturing primate embryonic stem cells. Stem cells are essentially free of mammalian fetal serum (preferably essentially free of any animal serum) and contain fibroblast growth factor supplied from sources other than the fibroblast feeder layer Incubate in culture. In one preferred method, the fibroblast feeder cells previously required to maintain stem cell culture are rendered unnecessary by the addition of a sufficient amount of fibroblast growth factor.

繊維芽細胞増殖因子は、哺乳類の発生に不可欠な分子である。現在のところ、20以上の既知の繊維芽細胞増殖因子配位子及びそのための５つの繊維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体（及びその接合変異体）が存在する。一般的に D. Ornitz et al., 25 J. Biol. Chem. 15292-7 (1996) 、米国特許番号 5,453,357を参照。これらの因子におけるわずかな変異が種間に存在すると予想されており、このように繊維芽細胞増殖因子という言葉は、種限定的なものではない。しかしながら、我々は、ヒト繊維芽細胞増殖因子、より好ましくは組み換え遺伝子から作製されたヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を好んで使用する。この化合物は、Gibco BRL-Life Technologies 及びその他から容易に多量に入手可能である。 Fibroblast growth factor is an essential molecule for mammalian development. Currently, there are more than 20 known fibroblast growth factor ligands and five fibroblast growth factor signaling receptors (and conjugated variants thereof) therefor. See generally D. Ornitz et al., 25 J. Biol. Chem. 15292-7 (1996), US Pat. No. 5,453,357. Slight variations in these factors are expected to exist between species, and thus the term fibroblast growth factor is not species-specific. However, we prefer to use human fibroblast growth factor, more preferably human basic fibroblast growth factor made from recombinant genes. This compound is readily available in large quantities from Gibco BRL-Life Technologies and others.

この特許の目的のためには、培養液は、たとえ別々の成分（例えば、ウシ血清アルブミン）が血清から分離され、次に外因的に加えられていようとも本質的にそれでも指定の血清を含まなくてもよいことが言及されているべきである。その要点は、血清それ自身が加えられた時に、可変性が副産物に影響する点である。しかしながら、そのような血清から精製した１つ若しくはそれ以上のとても明確な成分を添加すれば、このようなことは起こらない。 For the purposes of this patent, the culture medium is essentially free of the specified serum even if separate components (eg, bovine serum albumin) are separated from the serum and then added exogenously. It should be mentioned that it may be. The point is that variability affects by-products when the serum itself is added. However, this does not happen if one or more very distinct components purified from such serum are added.

好ましくは、この方法を使用して培養された霊長類胚性幹細胞は、ｉ）未分化状態においてin vitroで無限の増殖が可能で、ii）長期間の培養後においても、３つの胚体胚葉のすべての派生体（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）に分化可能で、かつiii）長期間の培養を通じて正常な核型（正倍数体）を維持しているという点で、真のES細胞株であるヒト胚性幹細胞である。それ故に、これらの細胞は多能性であるといわれる。 Preferably, primate embryonic stem cells cultured using this method are capable of i) unlimited proliferation in vitro in an undifferentiated state, and ii) three embryonic germ layers even after prolonged culture. True ES cells in that they can differentiate into all derivatives (endoderm, mesoderm and ectoderm) of, and iii) maintain a normal karyotype (euploid) through long-term culture It is a human embryonic stem cell that is a strain. Therefore, these cells are said to be pluripotent.

この培養は、培養液中で１ヶ月以上もの間（好ましくは６ヶ月以上、より好ましくは12ヶ月以上もの間でさえも）、幹細胞が内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織の派生体へ分化する能力を維持し、幹細胞の核型を維持したまま、胚性幹細胞が安定的に増殖することを可能にする。 In this culture, the stem cells differentiate into endoderm, mesoderm and ectoderm tissue derivatives for over a month (preferably over 6 months, more preferably over 12 months) in culture. The embryonic stem cells can be stably propagated while maintaining the ability and maintaining the karyotype of the stem cells.

別の側面においては、本発明は、霊長類胚性幹細胞の別の培養方法を提供するものである。幹細胞を、本質的に哺乳類胎児血清を含まず（好ましくは、本質的にどの動物の血清をも含まない）、繊維芽細胞の支持細胞層以外の出所から供給される繊維細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化することのできる増殖因子を含む培養液中で増殖させる。増殖因子は、望ましくは、繊維芽細胞増殖因子であるが、繊維芽細胞増殖因子受容体を活性化するように設計されたある種の小さな合成ペプチド（例えば、組み換え改良型若しくは変異型のDNAから作製された）であってもよい。一般的に、T. Yamaguchi et al., 152 Dev. Biol. 75-88 (1992) (signaling receptors) を参照。 In another aspect, the present invention provides another method for culturing primate embryonic stem cells. Stem cells are essentially free of mammalian fetal serum (preferably essentially free of any animal serum) and receive fibrocyte growth factor signaling from sources other than the fibroblast feeder layer It is grown in a culture medium containing growth factors that can activate the body. The growth factor is desirably a fibroblast growth factor, but some small synthetic peptide designed to activate the fibroblast growth factor receptor (eg, from recombinant modified or mutated DNA). Produced). See generally T. Yamaguchi et al., 152 Dev. Biol. 75-88 (1992) (signaling receptors).

更に別の側面においては、本発明は、霊長類胚性幹細胞の培養のための培養系を提供するものである。この培養系は、繊維芽細胞の支持細胞層以外から供給されるヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子を有している。この培養系は、本質的に動物血清を含んでいない。 In yet another aspect, the present invention provides a culture system for culturing primate embryonic stem cells. This culture system has human basic fibroblast growth factor supplied from other than the supporting cell layer of fibroblasts. This culture system is essentially free of animal serum.

更に本発明の別の側面は、前述の方法を使用して派生する細胞株（好ましくは、クローン化細胞株）を与えるものである。"派生する"とは、直接的若しくは間接的に派生する株を網羅した最も広義の意味で用いられている。 Yet another aspect of the present invention is to provide a cell line (preferably a cloned cell line) derived using the method described above. “Derived” is used in the broadest sense to cover directly or indirectly derived strains.

動物血清のバッチ間の違いに起因する結果における可変性は、その結果回避される。その上、繊維芽細胞増殖因子を使用する一方で、動物血清の使用を避けることが、クローニング効率を高めうることが発見された。 Variability in results due to differences between batches of animal sera is consequently avoided. Moreover, it has been discovered that avoiding the use of animal serum while using fibroblast growth factor can increase cloning efficiency.

それ故に、霊長類胚性幹細胞に非可変性かつより効率的なクローニングを可能とする培養条件を提供することが、本発明の長所である。本発明の別の長所は、本明細書及び特許請求の範囲の調査後に明らかになるであろう。 Therefore, it is an advantage of the present invention to provide culture conditions that allow non-variable and more efficient cloning of primate embryonic stem cells. Other advantages of the invention will become apparent after a review of the specification and claims.

（好ましい実施態様の詳細な説明）
幾つかの以下の実験において、発明者の一人は、培養液への血清添加なしでヒトES細胞株を培養する本発明の方法及び培養液系を使用した。２つのクローン化的に得られたヒトES細胞株は、成分として血清を含まない培養液中で培養された時に、クローン的な派生の後８ヶ月以上も増殖し、３つの胚体胚葉すべての後生的派生体への分化能を保持していた。 Detailed Description of Preferred Embodiments
In some of the following experiments, one of the inventors used the method and culture system of the present invention for culturing human ES cell lines without the addition of serum to the culture medium. Two clonally obtained human ES cell lines grew for more than 8 months after clonal derivation when cultured in serum-free medium, and all three embryonic germ layers It retains the ability to differentiate into epigenetic derivatives.

下記の他の実験群において、比較的多量のヒト繊維芽細胞増殖因子（FGF）の添加が、血清及び支持細胞すら存在しない状態におけるヒト胚性幹細胞の培養と増殖を補助することが実証さてきた。これは、動物細胞若しくは動物細胞が培養された培養液のどちらにも暴露されていない幹細胞の培養を可能にする。これらの幹細胞培養条件（つまりは、支持細胞及び調整培地なし）は、本明細書において支持細胞非依存的いう。支持細胞によって調製される培養液の使用に基づいて従来の培養条件が記載され、支持細胞非存在なものとして記載されている。しかしながら、調製培地の使用は、未だ培養液を調整するために使用されなければならない支持細胞の使用への依存性を排除できない。本明細書に記載された技術は、正常の核型を有し未分化のままで、永久的かつ支持細胞非依存的なヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。 In other experimental groups described below, the addition of relatively large amounts of human fibroblast growth factor (FGF) has been demonstrated to assist in the culture and proliferation of human embryonic stem cells in the absence of serum and even supporting cells. . This allows for the cultivation of stem cells that are not exposed to either the animal cells or the culture medium in which the animal cells are cultured. These stem cell culture conditions (ie, without feeder cells and conditioned medium) are referred to herein as feeder cell independent. Conventional culture conditions are described based on the use of culture medium prepared by feeder cells and are described as being absent of feeder cells. However, the use of conditioned media cannot eliminate the dependence on the use of feeder cells that must still be used to prepare the culture. The techniques described herein allow for the culture of human embryonic stem cells that are permanent and feeder-independent, with normal karyotypes and undifferentiated.

最初のヒトES細胞株H9の派生、培養及び特徴付けに対する技術は、J. Thomson et al., 282 Science 1145-1147 (1998) に記載された。以下に記載された実験では、この細胞株及び他の細胞株によって行われたが、その方法及び結果は、特定のES細胞株とは無関係である。 Techniques for the derivation, culture and characterization of the first human ES cell line H9 were described in J. Thomson et al., 282 Science 1145-1147 (1998). The experiments described below were performed with this and other cell lines, but the methods and results are independent of the particular ES cell line.

本明細書では、繊維芽細胞増殖因子（FGF）の培養液中での補助添加及びヒトES細胞のクローン化が記載されている。FGFの添加は、２つの明確な点で重要である。第一に、中程度のレベル（例えば、4 ng/ml）でのFGFの添加は、血清を欠く培養液中での未分化ヒトES細胞の培養を可能にする。このレベルにおいて、幹細胞の分化速度はFGF低レベル状態と比較して緩やかであるが、最終的には幹細胞は分化する。第二に、より高レベルでのFGFの添加は、幹細胞が、培養液中で正倍数性の未分化型ヒトES細胞の多分化能を永久に維持するために少しも支持細胞を必要としないという点で、培養液の条件を支持細胞非依存的なものとする。 In the present specification, auxiliary addition of fibroblast growth factor (FGF) in a culture solution and cloning of human ES cells are described. The addition of FGF is important in two distinct ways. First, the addition of FGF at moderate levels (eg, 4 ng / ml) allows the culture of undifferentiated human ES cells in culture medium lacking serum. At this level, the differentiation rate of stem cells is slow compared to the low FGF state, but eventually stem cells differentiate. Second, the addition of FGF at higher levels does not require any support cells for the stem cells to permanently maintain the pluripotency of euploid undifferentiated human ES cells in culture. Therefore, the conditions of the culture solution are made independent of the supporting cells.

この第一の現象は、ヒトES細胞中のFGF受容体との相互作用におけるFGFの作用により作動されるものと信じられている。血清の使用を避けるために、多くの既存のFGF変異種が培養液中に使用されることは、特に重要なことではない。ここで、FGF2としても知られている塩基性FGFすなわちbFGFが一般に使用されるが、これは、単にbFGFがFGF群因子の中で手軽に市販で入手可能なものの１つであるという理由によるものである。20よりも多い異なるFGF群因子が同定されており、これらは、FGF-1からFGF-27と称される。本明細書においてFGFの濃度はbFGFの量で与えられるが、一方で、FGFの濃度はFGF受容体の刺激量の定量化により得られる傾向にあること及びFGFの濃度が他のFGF群因子に対して上方若しくは下方に調整されなければならないかもしれないことを理解しておくべきである。bFGFに対しては、ES細胞培養液中の好ましいFGF濃度は、およそ 0.1 ng/ml からおよそ1000 ng/mlの範囲であり、およそ 4ng/ml の範囲を超える濃度は培養液中での血清要求性を避けるのに有用である。 This first phenomenon is believed to be triggered by the action of FGF in its interaction with FGF receptors in human ES cells. It is not particularly important that many existing FGF variants are used in the culture to avoid the use of serum. Here, the basic FGF, also known as FGF2, or bFGF, is commonly used, but this is simply because bFGF is one of the readily available commercially available FGF group factors. It is. More than 20 different FGF group factors have been identified and these are referred to as FGF-1 through FGF-27. In this specification, the concentration of FGF is given by the amount of bFGF. On the other hand, the concentration of FGF tends to be obtained by quantifying the stimulation amount of FGF receptor, and the concentration of FGF is different from that of other FGF group factors. It should be understood that it may have to be adjusted up or down. For bFGF, the preferred FGF concentration in the ES cell culture is in the range of approximately 0.1 ng / ml to approximately 1000 ng / ml, with concentrations exceeding the range of approximately 4 ng / ml being the serum requirement in the culture. Useful to avoid sex.

意外にも、ヒトES細胞培養液中におけるFGFの第二の特性に対しては、FGFの変異種の選択が何らかの臨界を有していることが分かった。この効果のために、bFGFの濃度がおよそ100 ng/ml の時に、この条件は、血清及び支持細胞の双方に対する必要性を回避する、つまりは、培養液を支持細胞非依存的にするのに十分であることが分かった。この効果のために、FGF群因子のFGF2（bFGF）、FGF4、FGF9、FGF17及びFGF18は、それぞれ、ヒトES細胞培養を支持細胞非依存的にするためには培養液中に100 ng/ml の濃度で十分であることが分かった。それに対して、FGF群因子のFGF1（酸性FGF）、FGF1β、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19及びFGF20 は、支持細胞非依存性を支えるのに100 ng/ml では十分でないことが分かった。我々は、データを持ち合わせていないが、これらのFGF型を使用した結果が濃度の効果によるものではなく、高濃度の特定のFGFも支持細胞非依存性を支持することに成功しないであろうと信じている。FGF9に対しては、我々のデータは、このレベル（100 ng/ml）でFGF9がヒトES細胞培養を支持すると示唆しているが、そのデータは、不確かである。 Surprisingly, it has been found that the selection of FGF variants has some criticality for the second property of FGF in human ES cell cultures. Because of this effect, when the bFGF concentration is approximately 100 ng / ml, this condition avoids the need for both serum and feeder cells, i.e. makes the culture independent of feeder cells. It turned out to be sufficient. Because of this effect, the FGF group factors FGF2 (bFGF), FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18 are each 100 ng / ml in the culture medium in order to make human ES cell culture independent of supporting cells. The concentration was found to be sufficient. In contrast, the FGF group factors FGF1 (acidic FGF), FGF1β, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF10, FGF16, FGF19 and FGF20 are sufficient at 100 ng / ml to support support cell independence. I understood that it was not. We do not have data, but believe that the results of using these FGF types are not due to concentration effects, and that high concentrations of certain FGFs will not succeed in supporting feeder cell independence. ing. For FGF9, our data suggest that FGF9 supports human ES cell culture at this level (100 ng / ml), but the data are uncertain.

ヒトES細胞が培養液中で支持細胞非依存的であることを支持するのに十分であろう効果的FGF変異体の的確な最低量は、現時点では正確には分かっていないが、経験的な試験によって決定されうる。FGF2に対しては、培養液中の100 ng/ml のFGF2だけで十分である一方、4 ng/ml を培養液に添加することだけでは、培養液中における正倍数性の未分化ヒトES細胞の永久的維持には十分ではないことが分かっている。4 ng/ml 程度の少量を含む非調整培養液中で培養されたES細胞は、しばらくの間、そしておそらくは１回か２回継代の間、未分化状態のままでいるだろうが、最終的には分化を始めるだろう。我々の手中において、ES細胞を培養して永久に未分化状態かつ正倍数性のまま維持する培養液の能力は、ES細胞が増殖型、未分化型、正倍数性のままで、さらに、ヒトES細胞の特徴的な形態を維持しつつ少なくとも6回継代培養された時に発揮される。本明細書で用いられたように、FGFの維持濃度は、未分化型、正倍数性及び増殖状態で少なくとも6回継代の間、ヒトES細胞の維持を支持するのに必要なそのFGFの濃度である。FGF2に対しては、最低維持濃度は、4 ng/ml と100 ng/ml の間であり、その正確な最低維持濃度は、これらの量の間に入れるための下記の手順を用いて決定されうる。他の効果的FGF、例えばFGF4、FGF9、FGF17及びFGF18に対しては、それぞれのFGFに対応した最低維持濃度が同様の試験により決定されうる。 The exact minimum amount of an effective FGF variant that will be sufficient to support human ES cells being independent of feeder cells in culture is not accurately known at this time, but is empirical. It can be determined by testing. For FGF2, only 100 ng / ml FGF2 in the culture is sufficient, but adding 4 ng / ml to the culture only gives euploid undifferentiated human ES cells in the culture. It has been found that it is not sufficient for permanent maintenance. ES cells cultured in non-conditioned medium containing as little as 4 ng / ml will remain undifferentiated for some time and possibly one or two passages. Will begin to differentiate. In our hands, the ability of the culture to cultivate ES cells and keep them permanently undifferentiated and euploid is the ability of ES cells to remain proliferative, undifferentiated, euploid, It is exerted when subcultured at least 6 times while maintaining the characteristic morphology of ES cells. As used herein, the maintenance concentration of FGF is that of FGF required to support the maintenance of human ES cells for at least 6 passages in undifferentiated, euploid and proliferative state. Concentration. For FGF2, the minimum maintenance concentration is between 4 ng / ml and 100 ng / ml, and the exact minimum maintenance concentration is determined using the procedure below to put between these amounts. sell. For other effective FGFs, such as FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18, the minimum maintenance concentration corresponding to each FGF can be determined by similar tests.

下記の実施例中で記載されている明確なヒトES細胞培養液中でヒトES細胞は、完全なる繊維芽細胞の支持細胞非存在下及び調製培地もなしで正倍数性を維持したまま永久に培養されうる。ES細胞は、このように真に支持細胞非依存的である。このヒトES細胞は、特徴的形態（小さく、そしてはっきりしない細胞膜を有しぎっしり詰まっている）、増殖及び全部ではないがたくさんの人体中の細胞型へ分化する能力を含むあらゆるヒトES細胞のすべての特徴を維持している。このヒトES細胞は、また、免疫不全マウスに注入した時に全ての３つの根本的な細胞層を形成することができる特徴を維持している。特に、このES細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に分化する能力を維持している。このES細胞は、更にES細胞の状態を表示する多分化能と関連する核転写因子Oct4の発現のような指標を提示する。この過程及び最後までを通じて、このヒトES細胞は、正常な核型を維持している。 In the clear human ES cell culture medium described in the examples below, human ES cells are permanently retained in the absence of complete fibroblast feeder cells and without prep media. Can be cultured. ES cells are thus truly feeder-independent. These human ES cells are all of all human ES cells, including their characteristic morphology (small and tightly packed with an unclear cell membrane), proliferation and ability to differentiate into many but not all cell types in the human body. Maintaining the characteristics of The human ES cells also maintain the characteristics that can form all three underlying cell layers when injected into immunodeficient mice. In particular, the ES cells maintain the ability to differentiate into ectoderm, mesoderm and endoderm. The ES cells also present indicators such as the expression of the nuclear transcription factor Oct4, which is associated with pluripotency that displays ES cell status. Throughout this process and to the end, the human ES cells maintain a normal karyotype.

本明細書の一番初めの実験では、ヒトES細胞は、放射線照射を受けた（35グレイのガンマ放射線照射）マウス胎児繊維芽細胞上に撒かれた。この実験に用いる培養液は、80%の"KnockOut”ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（Gibco BRL, Rockville, MD）、1 mM L-グルタミン、0.1 mM β-メルカプトエタノール及び1 % 非必須アミノ酸ストック（Gibco BRL, Rockville, MD）に20 % のウシ胎仔血清（HyClone, Logan, UT）若しくは20 % のもともとマウスES細胞に最適化された血清非存在の代替物であるKnockOut SR（Gibco BRL, Rockville, MD）のどちらかが追加されたものを含んでいる。KnockOut SRの成分は、国際公開番号：WO 98/30679において血清の代替物として記載されている。 In the very first experiments herein, human ES cells were seeded on irradiated (35 Gray gamma irradiated) mouse fetal fibroblasts. The culture medium used for this experiment is 80% “KnockOut” Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco BRL, Rockville, MD), 1 mM L-glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol and 1% non-essential amino acid stock. (Gibco BRL, Rockville, MD) plus 20% fetal calf serum (HyClone, Logan, UT) or 20% of KnockOut SR (Gibco BRL, Rockville, a serum-free alternative originally optimized for mouse ES cells , MD) is included. The components of KnockOut SR are described as a serum replacement in International Publication No. WO 98/30679.

別の実験において、培養液は、血清若しくは前述の血清代替物であるKnocoOut SRが追加され、また、ヒト組み換え型塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF, 4 ng/ml）の添加あり若しくは添加なしのものであった。培養液中の好ましいbFGFの濃度範囲は、1 ng/ml から500 ng/ml の間であった。 In another experiment, the culture medium is supplemented with serum or KnocoOut SR, a serum replacement as described above, and with or without the addition of human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, 4 ng / ml) It was a thing. The preferred concentration range of bFGF in the culture was between 1 ng / ml and 500 ng / ml.

培養条件を変化させた状態におけるクローン化効率を測定するために、H-9細胞は、7分間 0.05% トリプシン/0.25% EDTA と共に単一細胞集団に分離され、遠心分離により洗浄され、更に、分裂不活性化されたマウス胎児繊維芽細胞上に撒かれた（6ウェルプレート1ウェルにつき10⁵ ES cells）。単一細胞集団からクローン化ES細胞株の派生体への増殖を確認するために、個々の細胞集団は、実体顕微鏡下での直接観察によって選択され、マイクロピペットを用いて20% 血清代替物と4 ng/ml のbFGFを含む培養液と共にあるマウス胎児繊維芽細胞の支持細胞を含む96ウェルプレートの各々のウェルに移された。 To measure the cloning efficiency under varying culture conditions, H-9 cells were separated into a single cell population with 0.05% trypsin / 0.25% EDTA for 7 minutes, washed by centrifugation, and further divided. They were plated on inactivated mouse fetal fibroblasts (10 ⁵ ES cells per well of a 6-well plate). In order to confirm growth from a single cell population to a derivative of a cloned ES cell line, individual cell populations were selected by direct observation under a stereomicroscope and used as a 20% serum replacement using a micropipette. It was transferred to each well of a 96-well plate containing mouse embryonic fibroblast feeder cells along with a culture medium containing 4 ng / ml bFGF.

クローンは、1 mg/ml のIV型コラゲナーゼ（Gibco BRL, Rockville, MD）と共に５-７日毎の所定の継代をすることにより拡大された。派生から６ヶ月後に、H9細胞は、標準的なG-分染法（20の染色体スプレッドが分析される）によって、正常なXX核型を示した。しかしながら、派生から７ヶ月後には、単一の核型プレパラートにおいて、16/20 の染色体スプレッドが正常のXX核型を示したが、4/20 のスプレッドが第13番ショートアーム染色体への転座、第20番染色体の反転、第４番ショートアームへの転座及び複合的な断片化を含む任意の異常を示した。その後、派生から8、10及び12.75ヶ月後において、H9細胞は、検査された全ての20染色体スプレッドにおいて、正常な核型を示した。 Clones were expanded by routine passages every 5-7 days with 1 mg / ml type IV collagenase (Gibco BRL, Rockville, MD). Six months after derivation, H9 cells showed normal XX karyotype by standard G-staining method (20 chromosomal spreads analyzed). However, seven months after derivation, in a single karyotype preparation, the 16/20 chromosome spread showed a normal XX karyotype, but the 4/20 spread translocated to the 13th short arm chromosome. Showed any abnormalities including inversion of chromosome 20, translocation to short arm 4 and complex fragmentation. Subsequently, at 8, 10, and 12.75 months after derivation, H9 cells showed normal karyotype in all 20 chromosome spreads examined.

我々は、動物血清を含む前述の培養条件におけるヒトES細胞のクローン化効率が（bFGFの存在、非存在に関わらず）非常に低いことを観察した。我々は、更に、動物血清非存在下で、クローン化効率が上昇し、bFGF存在により更に上昇することをも観察した。FGFの添加が、一般にヒトES細胞の増殖を促進し、ヒトES細胞のクローニングを促進する際の特別の支援であることが明らかになった。 We observed that the cloning efficiency of human ES cells in the aforementioned culture conditions containing animal serum was very low (regardless of the presence or absence of bFGF). We also observed that the cloning efficiency increased in the absence of animal serum and increased further with the presence of bFGF. It has been found that the addition of FGF generally promotes the proliferation of human ES cells and is a special support in promoting the cloning of human ES cells.

下記に述べられたデータは、プレートに撒かれた10⁵のそれぞれのES細胞から生じる延べコロニー数+/-標準誤差（コロニークローン化効率の割合）である。20%の胎仔血清を含みbFGFを含まない条件では、240+/-28の結果であった。20%の胎仔血清とbFGFを含む（4 ng/ml で）条件では、ほぼ同じ結果で、260+/-12であった。血清非存在（20%の血清代替物存在）の条件では、bFGF非存在で633+/-43の結果であり、bFGF存在では826+/-61の結果であった。このように、血清は、クローン化効率には不利に作用し、血清の存在しない条件下でbFGFの存在は、クローン化効率の範囲で追加的な相乗作用の利益を有していた。 The data described below is the total number of colonies generated from 10 ⁵ each ES cells plated +/− standard error (percentage of colony cloning efficiency). In the condition containing 20% fetal serum and no bFGF, the result was 240 +/− 28. In the condition containing 20% fetal serum and bFGF (at 4 ng / ml), almost the same result was 260 +/- 12. In the absence of serum (20% serum replacement present), the result was 633 +/− 43 in the absence of bFGF and 826 +/− 61 in the presence of bFGF. Thus, serum adversely affected cloning efficiency, and the presence of bFGF under the absence of serum had additional synergistic benefits in the range of cloning efficiency.

血清存在下での長期間のヒトES細胞の培養は外因的に供給されたbFGFの添加を必要とせず、（上述のように）血清含有培養液へのbFGFの添加は、ヒトES細胞のクローン化効率を著しく上昇させるとは言えない。しかしながら、血清非存在培養液においては、bFGFは、ヒトES細胞の初期のクローン化効率を上昇させた。 Long-term culture of human ES cells in the presence of serum does not require the addition of exogenously supplied bFGF, and (as described above) the addition of bFGF to serum-containing cultures is a clone of human ES cells. It cannot be said that the conversion efficiency is remarkably increased. However, in serum free media, bFGF increased the initial cloning efficiency of human ES cells.

更に、外因性のbFGFの供給が、動物血清非存在下において霊長類胚性幹細胞が未分化状態で増殖し続けるためにとても重要であることが発見されてきた。外因性のbFGFを欠く血清非存在培養液中で、ヒトES細胞は2週間の培養によって一律に分化した。LIFのような他の因子の添加は（bFGF非存在下で）、分化を抑制しなかった。 Furthermore, it has been discovered that the supply of exogenous bFGF is very important for primate embryonic stem cells to continue to grow in an undifferentiated state in the absence of animal serum. In a serum-free medium lacking exogenous bFGF, human ES cells were uniformly differentiated by 2 weeks of culture. Addition of other factors such as LIF (in the absence of bFGF) did not inhibit differentiation.

明らかとなったこの結果は、特にクローン化株に適用できる。その際、拡大のためのクローンは、直接的な顕微鏡観察下で96ウェルプレートのウェルに細胞を個々に撒くことにより選択された。96ウェルプレートのウェルに撒かれた192のH-9細胞のうち、２つのクローンがうまく拡大できた（H-9.1及びH-9.2）。これらのクローンの両方ともに、その後血清代替物とbFGFを添加した培養液中で継続的に培養された。 This revealed result is particularly applicable to cloned strains. At that time, clones for expansion were selected by seeding cells individually into wells of a 96-well plate under direct microscopic observation. Of the 192 H-9 cells seeded in the wells of a 96 well plate, two clones were successfully expanded (H-9.1 and H-9.2). Both of these clones were subsequently cultured continuously in culture medium supplemented with serum replacement and bFGF.

H-9.1及びH-9.2細胞の両方共に、クローン化後の８ヶ月以上の継続的な培養の後においても正常のXX核型を維持していた。H-9.1及びH-9.2クローンは、血清非存在培養液中での長期間の培養後においても３つの胚体胚葉すべての派生体を形成する潜在能を維持していた。６ヶ月間の培養の後、H-9.1及びH-9.2クローンは、正常の核型を持っていることが確認され、それからベージュのSCIDマウスに注入された。 Both H-9.1 and H-9.2 cells maintained normal XX karyotype after continuous culture for more than 8 months after cloning. The H-9.1 and H-9.2 clones maintained the potential to form derivatives of all three definitive germ layers even after prolonged culture in serum-free medium. After 6 months of culture, H-9.1 and H-9.2 clones were confirmed to have normal karyotype and then injected into beige SCID mice.

H-9.1及びH-9.2細胞は、消化管上皮（内胚葉）、胚性の腎臓、横紋筋、平滑筋、骨組織、軟骨（中胚葉）及び神経組織（外胚葉）を含む３つの胚体胚葉のすべての派生体を含む奇形腫を形成した。高度に継代されたH-9.1.及びH-9.2細胞の奇形腫中に観察された分化の程度は、低継代のH9親株細胞によって形成された奇形腫中に観察される程度に匹敵していた。 H-9.1 and H-9.2 cells consist of three embryos, including gastrointestinal epithelium (endoderm), embryonic kidney, striated muscle, smooth muscle, bone tissue, cartilage (mesoderm) and nerve tissue (ectodermal) Teratomas containing all derivatives of somatic germ layers were formed. The degree of differentiation observed in teratomas of highly passaged H-9.1. And H-9.2 cells is comparable to that observed in teratomas formed by low passage H9 parental cells. It was.

上記の記載から、動物血清は増殖の支えとなる一方で、ヒトES細胞培養に有益な化合物と有害な化合物の両方を含みうる複雑な混合物であることが十分に理解されるはずである。更に、種々の血清群は、ヒトES細胞の活発な未分化増殖を支援する能力において大きく異なる。血清をはっきりと確定された成分に置き換えることは、血清群のバリエーションに伴う効果の可変性を低下させ、より慎重に定義された分化研究を可能にするはずである。 From the above description, it should be appreciated that animal serum is a complex mixture that can contain both beneficial and harmful compounds for human ES cell culture while supporting growth. Furthermore, the various serogroups differ greatly in their ability to support active undifferentiated proliferation of human ES cells. Replacing serum with well-defined components should reduce the variability of effects associated with serogroup variations and allow for more carefully defined differentiation studies.

その上、血清を含む培養液中における低いクローン化効率は、従来から使用されている血清中の幹細胞の生存に有害な、特に単一の細胞群で撒かれた時の幹細胞の生存に有害な化合物の存在を示唆している。これらの化合物の使用を避けることは、それ故に強く望まれている。 In addition, the low cloning efficiency in serum-containing culture media is detrimental to the survival of stem cells in traditionally used serum, especially to the survival of stem cells when seeded with a single population of cells. The presence of the compound is suggested. It is therefore highly desirable to avoid the use of these compounds.

（支持細胞非依存的培養）
以下の追加的実験は、FGFを高濃度で含むが血清及び支持細胞の存在しない状態におけるES細胞株の培養に向けられた。３つの異なる培養液配合物が、この研究において用いられたが、これらの培養液配合物とは、ここでは、UM100、BM+及びDHEMのことである。専門語UM100は、100 ng/ml のbFGFが添加された非調製培養液のことである。このUM100培養液は、Gibco Knockout Serum Replacer 製品を含むが、あらゆる種類の繊維芽細胞の支持細胞の使用を含まず若しくは必要としない。BM+培養液は、基礎的な培養液（DMEM/F12）に添加物を加えたものであり、下記に記載されているように、これもまた支持細胞なしで細胞の培養を可能にするが、この培養液は血清代替物製品を除いている。最後に、DHEMという名前は、確定したヒト胚性幹細胞培養液のことである。この培養液もまた、下記に記載されているように、ウシアルブミンを含むBM+培養液とは対照的に、完全に無機成分及びヒト蛋白だけを含む状態でヒトES細胞の培養、クローニング及び永久増殖に十分である。 (Support cell independent culture)
The following additional experiments were directed to culturing ES cell lines with high concentrations of FGF but no serum and support cells. Three different broth formulations were used in this study, which are here UM100, BM + and DHEM. The technical term UM100 is a non-prepared culture medium supplemented with 100 ng / ml bFGF. This UM100 broth contains the Gibco Knockout Serum Replacer product, but does not include or require the use of all types of fibroblast feeders. The BM + culture medium is a basic culture medium (DMEM / F12) with an additive, as described below, which also allows cell culture without supporting cells, This culture excludes serum replacement products. Finally, the name DHEM refers to a defined human embryonic stem cell culture. This culture is also in contrast to the BM + culture containing bovine albumin, as described below, in the culture, cloning and permanent growth of human ES cells completely containing only inorganic components and human proteins. Enough.

（UM100/BM+/DHEM培養液中でのヒトES細胞株H1及びH9の培養）
UM100培養液は、次のとおり調製された。80%（v/v）DMEM/F12（Gibco/Invitrogen）並びに1 mM グルタミン（Gibco/Invitrogen）、0.1 mM β-メルカプトエタノール（Sigma-St.Louis, MO）及び1 % 非必須アミノ酸ストック（Gibco/Invitrogen）を補完した20%（v/v）Knockout-Serum Replacer（Gibco/Invitrogen）からなる非調製培養液（UM）。この培養液を完成させるために、100 ng/ml のbFGFが添加され、培養液は、0.22 μM ナイロンフィルター（Nalgene）を通して濾過された。 (Culture of human ES cell lines H1 and H9 in UM100 / BM + / DHEM culture medium)
The UM100 culture solution was prepared as follows. 80% (v / v) DMEM / F12 (Gibco / Invitrogen) and 1 mM glutamine (Gibco / Invitrogen), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma-St. Louis, MO) and 1% non-essential amino acid stock (Gibco / Non-prepared culture (UM) consisting of 20% (v / v) Knockout-Serum Replacer (Gibco / Invitrogen) supplemented with Invitrogen). To complete the culture, 100 ng / ml bFGF was added and the culture was filtered through a 0.22 μM nylon filter (Nalgene).

BM+培養液は、次のとおり調製された。16.5 mg/ml BSA（Sigma）、196 μg/ml インスリン（Sigma）、108 μg/ml トランスフェリン（Sigma）、100 ng/ml bFGF、1 mM グルタミン（Gibco/Invitrogen）、0.1 mM βメルカプトエタノール（Sigma）及び1 % 非必須アミノ酸ストック（Gibco/Invitrogen）をDMEM/F12（Gibco/Invitrogen）に加え、オスモル濃度を5 M NaCl で340 mOsm に調製された。この培養液は、その後、0.22 μM のナイロンフィルター（Nalgene）を通して濾過された。 The BM + culture broth was prepared as follows. 16.5 mg / ml BSA (Sigma), 196 μg / ml insulin (Sigma), 108 μg / ml transferrin (Sigma), 100 ng / ml bFGF, 1 mM glutamine (Gibco / Invitrogen), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma) And 1% non-essential amino acid stock (Gibco / Invitrogen) was added to DMEM / F12 (Gibco / Invitrogen) and the osmolality was adjusted to 340 mOsm with 5 M NaCl. This culture was then filtered through a 0.22 μM nylon filter (Nalgene).

DHEM培養液は、次のとおり調製された。16.5 mg/ml HSA（Sigma）、196 μg/ml インスリン（Sigma）、108 μg/ml トランスフェリン（Sigma）、100 ng/ml bFGF、1 mM グルタミン（Gibco/Invitrogen）、0.1 mM β-メルカプトエタノール（Sigma）、1 % 非必須アミノ酸ストック（Gibco/Invitrogen）、ビタミンサプリメント（Sigma）、微量の無機化合物（Cell-gro（登録商標））及び0.014 mg/Lから0.07 mg/L のセレン（Sigma）をDMEM/F12（Gibco/Invitrogen）に加え、オスモル濃度を5 M NaCl で340 mOsm に調製された。培養液中のビタミンサプリメントは、チアミン（6.6 g/L）、還元されたグルタチオン（2 mg/L）及びアスコルビン酸PO₄を含んでいてもよいことに注意する。また、培養液中の微量の無機化合物は、それぞれ1000倍の溶液として販売されているTrace Elements B（Cell-gro（登録商標）、カタログNo.：MT 99-175-Cl）及びC（Cell-gro（登録商標）、カタログNo.：MT 99-176-Cl）の組み合わせである。Trace Elements B及びCがそれぞれCleveland's Trace Elements Ｉ及びIIとして同じ組成物を含んでいることは、技術的によく知られている（Cleveland, W.L., Wood, I., Erlanger, B.F., J.Imm.Methods 56:221-234, 1983を参照）。この培養液は、それから、0.22 μMのナイロンフィルター（Nalgene）を通して濾過された。最終的に、滅菌した明確な脂質（Gibco/Invirogen）がこの培養液を完成させるために加えられた。 The DHEM culture solution was prepared as follows. 16.5 mg / ml HSA (Sigma), 196 μg / ml insulin (Sigma), 108 μg / ml transferrin (Sigma), 100 ng / ml bFGF, 1 mM glutamine (Gibco / Invitrogen), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma) ), 1% non-essential amino acid stock (Gibco / Invitrogen), vitamin supplement (Sigma), trace amounts of inorganic compounds (Cell-gro®) and 0.014 mg / L to 0.07 mg / L selenium (Sigma) in DMEM In addition to / F12 (Gibco / Invitrogen), the osmolality was adjusted to 340 mOsm with 5 M NaCl. Note that the vitamin supplement in the culture medium may contain thiamine (6.6 g / L), reduced glutathione (2 mg / L) and ascorbic acid PO ₄ . In addition, trace amounts of inorganic compounds in the culture solution are trace elements B (Cell-gro (registered trademark), catalog No .: MT 99-175-Cl) and C (Cell- gro (registered trademark), catalog No .: MT 99-176-Cl). It is well known in the art that Trace Elements B and C contain the same composition as Cleveland's Trace Elements I and II, respectively (Cleveland, WL, Wood, I., Erlanger, BF, J. Imm. Methods 56: 221-234, 1983). This culture was then filtered through a 0.22 μM nylon filter (Nalgene). Finally, sterilized clear lipid (Gibco / Invirogen) was added to complete the culture.

あらかじめMEF（マウス胎児繊維芽細胞）支持細胞上で成長したH1若しくはH9ヒト胚性幹細胞は、機械的にディスパーゼ（1 mg/ml）と共に継代され、マトリゲル（Becton Dickinson, Bedford, MA）上に撒かれた。細胞密度が細胞継代をするのに十分であると判断されるまで、毎日適切な培養液が交換された。細胞は、それから、記載されているようにディスパーゼで継代され、マトリゲル（Becton Dickinson）上に維持された。 H1 or H9 human embryonic stem cells previously grown on MEF (mouse fetal fibroblasts) feeder cells are mechanically passaged with dispase (1 mg / ml) on Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) I was beaten. Appropriate media was changed daily until the cell density was judged sufficient to pass. Cells were then passaged with dispase as described and maintained on Matrigel (Becton Dickinson).

（増殖速度）
各種の培養液中でのヒトES細胞の増殖速度を測定するために、細胞はおよそ5x10⁵ cells/well の細胞密度で6ウェル組織培養プレート（Nalgene）に三つ揃いで撒かれた。3日目、5日目、7日目に、三つ揃いのウェルは、トリプシン/EDTA（Gibco/Invitrogen）で処理され、個別化され、細胞数が測定された。7日目に、追加的なウェルが、トリプシンで処理され、細胞数が測定され、およそ2x10⁵ cells/well の細胞密度で新しいプレートに撒きなおすために使用された。トリプシン処理されてきた7日目の培養は、ES細胞の表面マーカーであるOct4, SSEA4及びTral-60がFACS分析により定量分析された。増殖速度は、３つの継続的な継代に対して収集された。増殖速度の実験は、UM100で培養されたヒトES細胞が、CM（調製培地）で培養されたヒトES細胞と同程度にしっかりと育つことを示唆している。 (Growth rate)
To measure the growth rate of human ES cells in various cultures, cells were seeded in triplicate in 6-well tissue culture plates (Nalgene) at a cell density of approximately 5 × 10 ⁵ cells / well. On day 3, day 5 and day 7, triplicate wells were treated with trypsin / EDTA (Gibco / Invitrogen), individualized, and cell counts were determined. On day 7, additional wells were treated with trypsin, cell counts were measured and used to repopulate new plates at a cell density of approximately 2 × 10 ⁵ cells / well. The culture on day 7 which had been trypsinized was quantitatively analyzed by FACS analysis for the surface markers of ES cells, Oct4, SSEA4 and Tral-60. Growth rates were collected for 3 consecutive passages. Growth rate experiments suggest that human ES cells cultured in UM100 grow as well as human ES cells cultured in CM (prepared medium).

（接着ダイナミクス）
各種の培養液中でのヒトES細胞の接着率を測定するために、細胞は2x10⁵ cells/well の細胞密度で6ウェル組織培養プレート（Nalgene）に撒かれた。30分から48時間までの範囲の時点において、接着していない細胞は洗い流され、接着している細胞はトリプシン/EDTA（Gibco/Invitrogen）で剥がされ、数が測定された。これらの実験は、UM100の増殖速度のデータが、UM100とCMに対する同等の増殖速度ではなく、より優れた細胞接着とより緩やかな増殖の組み合わせによるものであるのかどうかを調べるために行われた。我々は、接着の割合が、試験が行われた全ての時点において両方の培養液に対して同等であることを発見した。このように、どちらの細胞も同じ速度で増殖した。 (Adhesion dynamics)
To measure the adhesion rate of human ES cells in various cultures, cells were seeded in 6-well tissue culture plates (Nalgene) at a cell density of 2 × 10 ⁵ cells / well. At time points ranging from 30 minutes to 48 hours, non-adherent cells were washed away, adherent cells were detached with trypsin / EDTA (Gibco / Invitrogen) and counted. These experiments were performed to determine whether the growth rate data for UM100 was due to a combination of better cell adhesion and slower growth, rather than equivalent growth rates for UM100 and CM. We have found that the percentage of adhesion is equivalent for both cultures at all time points tested. Thus, both cells grew at the same rate.

（ヒトES細胞のFACS分析）
ヒトES細胞は、トリプシン/EDTA（Gibco/Invitrogen）+ 2 % ヒヨコ血清（ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH）を37℃で10分間処理して6ウェル組織培養プレート（Nalgene）から剥がされた。細胞は、等容量のFACS Buffer（PBS + 2 % FBS + 0.1 % アジ化ナトリウム）に希釈され、80 μMの細胞濾過器（Nalgene）を通して濾過された。ペレットは、1000 RPMで5分間の遠心分離により集められ、1 ml の0.5 % パラホルムアルデヒド中に再び懸濁させられた。ヒトES細胞は、37℃で10分間固定され、そのペレットは、上述の通り集められた。そのES細胞は、2 ml のFACS Bufferに再び懸濁させられ、総細胞数が血球計で測定された。細胞は、上述の通りペレット化され、90 % エタノール中に氷上で30分間浸透化された。ヒトES細胞は、上述の通りペレット化され、1x10⁵ cellsの細胞が、FACSチューブ（Becton Dickinson）中の1 ml のFACS Buffer + 0.1 % Triton X-100（Sigma）に希釈された。hESCが上述の通りペレット化され、FACS Buffer + 0.1 % Triton X-100（Sigma）に希釈された50 μlの1次抗体中で再び懸濁された。適切な対照抗体のサンプルが、並行して用いられた。hESCは、4℃で一晩中インキュベートされた。上清は流し除かれ、細胞は、50 μlの二次抗体（Molecular Probes/Invitrogen）中に室温において暗がりで30分間インキュベートされた。FACS分析は、CellQuest Software（Becton Dickinson）を用いてFascalibur（Becton Dickinson）セルソーターで行われた。FACS分析を行うためのこの方法は、このようにES細胞を持っていることを示すために細胞表面のマーカーを検出することを可能にする。観察されたその結果は、UM100中で培養されたヒトES細胞が個体数としてOct-4に対して90 % 陽性であるということであった。これは、CMで培養されたES細胞と比べても遜色なく、その細胞がES細胞集団であることを確かなものとしている。SSEA4及びTral-60の分析に対しては、その方法は、細胞がパラホルムアルデヒド若しくはメタノール中で取り扱われないことを除けば、Oct-4に対してのものと同様に行われた。細胞染色の後に、細胞は、FACS緩衝液（Tritonを含まない）中に再び懸濁させられ、上述の通りFACS緩衝液（繰り返しになるが、Tritonを含まない）中で適切な抗体と共に分析された。未分化ES細胞培養は、これらの２つの細胞表面マーカーに対して同様に平均しておよそ90 % 陽性であった。これは、上記で議論されたFACS分析によって実証された。 (FACS analysis of human ES cells)
Human ES cells were detached from 6-well tissue culture plates (Nalgene) treated with trypsin / EDTA (Gibco / Invitrogen) + 2% chick serum (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, OH) for 10 minutes at 37 ° C. . Cells were diluted in an equal volume of FACS Buffer (PBS + 2% FBS + 0.1% sodium azide) and filtered through an 80 μM cell strainer (Nalgene). The pellet was collected by centrifugation at 1000 RPM for 5 minutes and resuspended in 1 ml of 0.5% paraformaldehyde. Human ES cells were fixed for 10 minutes at 37 ° C. and the pellet was collected as described above. The ES cells were resuspended in 2 ml FACS Buffer and the total cell count was measured with a hemocytometer. Cells were pelleted as described above and permeabilized in 90% ethanol for 30 minutes on ice. Human ES cells were pelleted as described above, and 1 × 10 ⁵ cells were diluted in 1 ml FACS Buffer + 0.1% Triton X-100 (Sigma) in FACS tubes (Becton Dickinson). hESCs were pelleted as described above and resuspended in 50 μl primary antibody diluted in FACS Buffer + 0.1% Triton X-100 (Sigma). Samples of appropriate control antibodies were used in parallel. hESCs were incubated overnight at 4 ° C. The supernatant was drained and the cells were incubated in 50 μl secondary antibody (Molecular Probes / Invitrogen) for 30 minutes in the dark at room temperature. FACS analysis was performed on a Fascalibur (Becton Dickinson) cell sorter using CellQuest Software (Becton Dickinson). This method for performing FACS analysis thus makes it possible to detect cell surface markers to show that they have ES cells. The observed result was that human ES cells cultured in UM100 were 90% positive for Oct-4 as individuals. This is comparable to ES cells cultured in CM, and confirms that the cells are an ES cell population. For the analysis of SSEA4 and Tral-60, the method was performed similarly to that for Oct-4, except that the cells were not handled in paraformaldehyde or methanol. After cell staining, the cells are resuspended in FACS buffer (without Triton) and analyzed with the appropriate antibody in FACS buffer (repeated but without Triton) as described above. It was. Undifferentiated ES cell cultures were approximately 90% positive on average for these two cell surface markers as well. This was demonstrated by the FACS analysis discussed above.

（結果）
ヒトES細胞株H1細胞は、ここでは、ヒトES細胞の形態及び特徴を保持したままUM100培養液中で33継代以上（164回の細胞数倍増以上）培養された。H1細胞は、ヒトES細胞の形態及び特徴を保持したままBM+培養液中で6継代以上（70日間）培養された。H9細胞は、DHEM培養液中で5継代以上（67日間）培養された。H9及びH7ヒトES細胞もまた、UM100培養液中で未分化状態のままそれぞれ22継代及び21継代培養された。BM+及びUM100で培養された細胞のその後の試験は、正常の核型であることを証明した。 (result)
Here, the human ES cell line H1 cells were cultured in the UM100 medium for more than 33 passages (more than 164 times the number of cells increased) while retaining the morphology and characteristics of human ES cells. H1 cells were cultured for more than 6 passages (70 days) in BM + medium while retaining the morphology and characteristics of human ES cells. H9 cells were cultured for more than 5 passages (67 days) in DHEM medium. H9 and H7 human ES cells were also cultured in passage 22 and 21 respectively in an undifferentiated state in UM100 culture medium. Subsequent testing of cells cultured with BM + and UM100 proved to be a normal karyotype.

（FGFの型の研究）
ヒトES細胞の株H1は、調製培養液中の標準的な条件下で試験培養液に移される前に３回継代の間培養された。その試験条件に対して、細胞は24時間（day 0）調整培養液上で培養され、それから翌日（day 1）、試験培養液に移された。その後、細胞は、それぞれの試験培養液中で培養された。ヒトES細胞株H9は、また、並行して試験培養液に移される前に調整培養液中のマトリゲル上で5継代の間培養された。 (Research on FGF type)
Human ES cell line H1 was cultured for 3 passages before being transferred to the test medium under standard conditions in the prepared medium. For that test condition, the cells were cultured on conditioned medium for 24 hours (day 0) and then transferred to the test medium the next day (day 1). Thereafter, the cells were cultured in their respective test medium. Human ES cell line H9 was also cultured for 5 passages on Matrigel in conditioned medium before being transferred to the test medium in parallel.

細胞は、次の手順を用いて継代された。培養細胞は、6ウェル組織培養プレートに適切な密度（およそ7日間かかる）で育てられ、それから、培養細胞は、1 ml Dipase（1mg/ml）（Gibco/Invirtogen）で37℃において5-7分間処理された。Dipaseは、それから取り除かれ、2 ml の適切な増殖培養液に交換された。5 ml ピペットを使用して、細胞は、機械的に組織培養プレートから剥がされ、それからピペッティングによって分散させられた。
細胞は、それから1000rpmで5分間、臨床の遠心分離機でペレット化された。ペレットは、それから適切な容量の培養液に再び懸濁され、好ましい希釈率で再びプレートに撒かれた。 Cells were passaged using the following procedure. Cultured cells are grown at the appropriate density (takes approximately 7 days) in 6-well tissue culture plates, then cultured cells are 1 ml Dipase (1 mg / ml) (Gibco / Invirtogen) for 5-7 minutes at 37 ° C It has been processed. The dipase was then removed and replaced with 2 ml of the appropriate growth medium. Using a 5 ml pipette, the cells were mechanically detached from the tissue culture plate and then dispersed by pipetting.
The cells were then pelleted in a clinical centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes. The pellet was then resuspended in the appropriate volume of media and re-plated at the preferred dilution.

この培養液配合物は、FGF添加の選択以外は不変であった。基本的な培養液は、好ましい試験条件に依存した可変のFGFを含むUM100であった。次のFGF変種が、それぞれ100 ng/ml で培養液に添加され試験された。：FGF1（酸性FGF）、FGF1β（酸性FGFのアイソフォーム）、FGF2（塩基性FGF）、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20。全てのFGFは、商業的に購入されたか若しくは組み換え宿主で生成された。 This culture broth formulation was unchanged except for the choice of FGF addition. The basic culture was UM100 with variable FGF depending on the preferred test conditions. The following FGF variants were added to the culture at 100 ng / ml each and tested. : FGF1 (acidic FGF), FGF1β (acidic FGF isoform), FGF2 (basic FGF), FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20. All FGFs were either purchased commercially or produced in recombinant hosts.

ヒトES細胞培養を支持する特定のFGFの能力は、それぞれの継代後に検証された。ヒトES細胞培養を支持すると判定された条件は、適切に培養中において支持細胞非依存的に未分化状態で増殖させ、効果的に継代させることができ、ヒトES細胞マーカーであるOct4、SSEA4及びTral-60を発現し続けた培養を支持した。培養中でヒトES細胞を支援しないと判定された条件は、形態観察により明らかとなる細胞の重要な分化をその中で起こす培養液を生じた、そして、その細胞は、コロニー継代によって増殖できなかった。ヒトES細胞培養を支持するFGF変種は、FGF2、FGF4、FGF17及びFGF18であった。未分化状態でヒトES細胞の維持を支持しなかったFGF変種は、FGF1、FGF1B、FGF3、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF10、FGF16、FGF19及びFGF20であった。FGF9を添加した培養液に対しての結果は、初めは欄外であった。処置を繰り返したところ、100 ng/ml で添加されたFGF9もまた培養中の未分化ヒトES細胞を支持しうるであろうことが明らかとなっている。 The ability of certain FGFs to support human ES cell cultures was verified after each passage. Conditions determined to support human ES cell culture can be propagated in an undifferentiated state in an appropriate manner in a culture independent of the support cells, and can be effectively passaged, and the human ES cell markers Oct4, SSEA4 And cultures that continued to express Tral-60 were supported. Conditions determined not to support human ES cells in culture resulted in a culture medium in which the cells undergo significant differentiation as revealed by morphological observation, and the cells can be propagated by colony passage. There wasn't. The FGF variants supporting human ES cell culture were FGF2, FGF4, FGF17 and FGF18. The FGF variants that did not support the maintenance of human ES cells in the undifferentiated state were FGF1, FGF1B, FGF3, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF10, FGF16, FGF19 and FGF20. The results for the culture medium to which FGF9 was added were initially out of line. Repeated treatments revealed that FGF9 added at 100 ng / ml could also support undifferentiated human ES cells in culture.

現時点で、FGF4、FGF17及びFGF20を添加された培養液は、未分化ヒトES培養細胞H1細胞を8継代の間支持した。同様の複製であるFGF4、FGF9、FGF17及びFGF18は、ヒトES細胞株H9及びH14においてそれぞれ3回継代及び2回継代の間進展した。 At present, the culture medium supplemented with FGF4, FGF17 and FGF20 supported undifferentiated human ES cultured cells H1 cells for 8 passages. Similar replicas, FGF4, FGF9, FGF17, and FGF18, progressed for 3 and 2 passages in human ES cell lines H9 and H14, respectively.

本発明は、その好ましい実施態様について上記に記述されてきた。この概念の他の形態も、特許請求の範囲内に含まれることを意図する。例えば、組み換え的に生成されたヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子が、上述の実験で使用されたが、自然に単離された繊維芽細胞増殖因子もまた適している。その上、これらの技術はまた、サル及び他の霊長類細胞培養にも適していることも実証されるはずである。 The present invention has been described above with respect to preferred embodiments thereof. Other forms of this concept are intended to be included within the scope of the claims. For example, recombinantly produced human basic fibroblast growth factor has been used in the above experiments, but naturally isolated fibroblast growth factor is also suitable. Moreover, these techniques should also prove to be suitable for monkey and other primate cell cultures.

このように、特許請求の範囲は、本発明の全ての範囲を審査するために向けられるべきである。 Thus, the claims should be directed to examine the full scope of the invention.

（産業上の利用可能性）
本発明は、霊長類胚性幹細胞の培養方法及びそれと共に用いる培養液を提供する。
（好ましい態様）
本発明の好ましい態様は、以下の通りである。 (Industrial applicability)
The present invention provides a method for culturing primate embryonic stem cells and a culture solution used therewith.
(Preferred embodiment)
Preferred embodiments of the present invention are as follows.

１．ヒト胚性幹細胞の培養方法であって：
幹細胞を本質的に哺乳類胎児血清を含まない培養液中で培養し、アミノ酸類、ビタミン類、塩類、無機物類、トランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、インスリン若しくはインスリン代替物、アルブミン及び支持細胞層以外の出所から供給され少なくとも維持濃度で存在する繊維芽細胞増殖因子を含む幹細胞培養液中で培養することを含み、前記培養液は、支持細胞層若しくは支持細胞層への培養液の暴露を必要としない少なくとも6回継代されたヒト未分化増殖型正倍数性胚性幹細胞の培養と増殖を支持する能力のある培養方法。
２．培養液中に本質的にいずれの動物の血清をも含まない上記１に記載の方法。
３．FGFが、FGF2、FGF4、FGF9、FGF17及びFGF18からなる群より選択された上記１に記載の方法。
４．FGFが、100 ng/mlで培養液中に存在するFGF2である上記１に記載の方法。
５．血清及び支持細胞層を含まない既知組成培養液中でのヒト胚性幹細胞の培養方法であって：
幹細胞をアルブミン、アミノ酸類、ビタミン類、無機物類、少なくとも１つのトランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン若しくはインスリン代替物を含む培養液で培養し、前記培養液は本質的に哺乳類胎児血清を含まず、繊維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化する能力のある少なくともおよそ100 ng/mlの繊維芽細胞増殖因子を含み、前記繊維芽細胞増殖因子は支持細胞層以外の出所から供給され、前記培養液は支持細胞層若しくは調製培養液を含まないで幹細胞が未分化状態で増殖することを支持する培養方法。
６．前記の培養工程が、内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織の派生体へ分化する幹細胞の能力を維持し、幹細胞の核型を維持したままの一ヶ月間以上の培養液中での胚性幹細胞の増殖を含む上記５に記載の方法。
７．FGFが、FGF2、FGF4、FGF9、FGF17及びFGF18からなる群より選択された上記５に記載の方法。
８．ヒト胚性幹細胞の培養物であって：
ヒト胚性幹細胞を含み；
アルブミン、アミノ酸類、ビタミン類、無機物類、少なくとも１つのトランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン若しくはインスリン代替物を含む幹細胞培養液であって、本質的に哺乳類胎児血清を含まず、少なくとも繊維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化する能力を有する維持濃度の繊維芽細胞増殖因子を含み、血清非存在下、支持細胞層非存在下及び支持細胞層に暴露された培養液も非存在下で永久に幹細胞を培養可能な培養液を含み、
幹細胞が未分化状態において永久に正常な核型状態であることを維持することが可能な培養物。
９．繊維芽細胞増殖因子が、少なくともおよそ100 ng/ml の濃度で培養液中に存在するFGF2である上記８に記載の培養物。
１０．支持細胞層非依存的なヒト胚性幹細胞の培養物であって：
幹細胞培養液中のヒト胚性幹細胞を含み；
前記幹細胞培養液は、アルブミン、アミノ酸類、ビタミン類、無機物類、少なくとも１つのトランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン若しくはインスリン代替物を含み、本質的に哺乳類胎児血清を含まず、FGF2、FGF4、FGF9、FGF17及びFGF18からなる群より選択された繊維芽細胞増殖因子を少なくとも維持濃度で含み；
幹細胞が正倍数体及び未分化状態であり続ける支持細胞非依存的な培養物。
１１．繊維芽細胞増殖因子が、少なくともおよそ100 ng/ml の濃度で存在する上記１０に記載の培養物。 1. A method for culturing human embryonic stem cells comprising:
Stem cells are cultured in a culture medium that is essentially free of mammalian fetal serum and from sources other than amino acids, vitamins, salts, minerals, transferrin or transferrin substitutes, insulin or insulin substitutes, albumin and supporting cell layers Culturing in a stem cell culture medium comprising fibroblast growth factor that is supplied and present at least at a maintenance concentration, wherein the culture medium does not require at least 6 exposure of the culture medium to the support cell layer or the support cell layer A culture method capable of supporting the culture and proliferation of passivated human undifferentiated proliferative euploid embryonic stem cells.
2. 2. The method according to 1 above, wherein serum of any animal is essentially not contained in the culture solution.
3. 2. The method according to 1 above, wherein the FGF is selected from the group consisting of FGF2, FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18.
4). 2. The method according to 1 above, wherein the FGF is FGF2 present in the culture solution at 100 ng / ml.
5. A method for culturing human embryonic stem cells in a known composition culture medium that does not include serum and feeder cells, comprising:
Stem cells are cultured in a medium containing albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin or transferrin substitute, at least one insulin or insulin substitute, said medium essentially containing mammalian fetal serum And including at least approximately 100 ng / ml fibroblast growth factor capable of activating fibroblast growth factor signaling receptors, said fibroblast growth factor being supplied from a source other than the feeder cell layer, A culture method for supporting that stem cells proliferate in an undifferentiated state without containing a support cell layer or a prepared culture solution.
6). Embryonic stem cells in a culture solution in which the culture step maintains the ability of stem cells to differentiate into endoderm, mesoderm and ectoderm tissue derivatives and maintain the stem cell karyotype for a month or more. 6. The method according to 5 above, comprising the growth of
7). 6. The method according to 5 above, wherein FGF is selected from the group consisting of FGF2, FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18.
8). A culture of human embryonic stem cells comprising:
Including human embryonic stem cells;
Stem cell culture medium comprising albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin or transferrin substitute, at least one insulin or insulin substitute, essentially free of mammalian fetal serum and at least fibroblasts Contains a maintenance concentration of fibroblast growth factor capable of activating cell growth factor signaling receptors, in the absence of serum, in the absence of support cell layer and in the absence of culture medium exposed to support cell layer Contains a culture medium that can permanently cultivate stem cells,
A culture capable of maintaining that a stem cell is permanently in a normal karyotype in an undifferentiated state.
9. 9. The culture according to 8 above, wherein the fibroblast growth factor is FGF2 present in the culture medium at a concentration of at least about 100 ng / ml.
10. A culture of human embryonic stem cells independent of feeder cell layers, comprising:
Including human embryonic stem cells in a stem cell culture;
The stem cell culture medium contains albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin or transferrin substitute, at least one insulin or insulin substitute, essentially free of mammalian fetal serum, FGF2, FGF4 Including at least a maintenance concentration of a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9, FGF17 and FGF18;
A feeder cell independent culture in which stem cells remain euploid and undifferentiated.
11. The culture of claim 10, wherein the fibroblast growth factor is present at a concentration of at least about 100 ng / ml.

Claims

A method for culturing human pluripotent stem cells, comprising:
Stem cells, and amino acids free of mammalian fetal serum, vitamins, salts, cultured in inorganic acids, transferrin, insulin, medium containing minimal fibroblast growth factor (FGF) concentrations of albumin and 100 ng / ml It said method comprising the FGF is for is selected from the group consisting of FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18, wherein the culture medium, without the need for exposure of the culture to feeder cells or feeder cells, at least twice passaged culture method capable of supporting the growth and culture of human undifferentiated proliferating euploid pluripotent stem cells.

A method of culturing human pluripotent stem cells in a culture medium of known composition not containing serum and supporting cells,
The stem cells, albumin, amino acids, vitamins, minerals acids, and cultured in a medium containing at least one transferrin and at least one insulin, the culture medium essentially free of mammalian fetal serum, FGF4, FGF9, is selected from the group consisting of FGF17, and FGF18, comprise at least 100 ng / ml of FGF, wherein the culture medium, not include support cells or prepared cultures, stem cells undifferentiated state for at least two passages wherein the supporting the in to proliferate.

Pluripotent stem cells in a culture medium for more than one month while maintaining the karyotype of the stem cells while maintaining the ability of the stem cells to differentiate into endoderm, mesoderm and ectoderm tissue derivatives The method of claim 2 comprising the growth of.

A culture of human pluripotent stem cells,
Human pluripotent stem cells;
A stem cell culture medium comprising albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin and at least one insulin;
Including
The stem cell culture medium is essentially free of mammalian fetal serum, contains fibroblast growth factor (FGF) at a concentration of at least 100 ng / ml, and the FGF is from the group consisting of FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18. The selected culture medium is capable of culturing stem cells permanently in the absence of serum, in the absence of feeder cells and in the absence of culture medium exposed to feeder cells, and the culture is a karyotype of the stem cells. while maintaining the cultures, characterized in that as possible out to maintain the stem cells permanently in an undifferentiated state.

A culture of human pluripotent stem cells independent of feeder cells,
Including human pluripotent stem cells in a stem cell culture,
The stem cell culture medium contains albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin and at least one insulin, essentially free of mammalian fetal serum, and from the group consisting of FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18. Comprising selected fibroblast growth factor (FGF) at a concentration of at least 100 ng / ml;
A culture characterized in that the culture is independent of feeder cells while the stem cells are maintained in euploid and undifferentiated state for at least two passages.

A culture medium comprising albumin, amino acids, vitamins, minerals, at least one transferrin and at least one insulin, which does not contain mammalian fetal serum and is 100 ng / ml fibroblast growth factor A culture comprising a minimum concentration of (FGF), wherein said FGF is selected from the group consisting of FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18, and said culture medium is cultured in the absence of serum, in the absence of feeder cells and exposed to feeder cells liquid even in the absence, it is possible culturing primate pluripotent stem cells permanently, and the culture solution, culture medium, characterized in that it is possible to maintain indefinitely the stem cells in an undifferentiated state .

The culture solution according to claim 6, wherein the primate pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.

A culture medium containing albumin, amino acids, vitamins, inorganics, at least one transferrin and at least one insulin, the culture liquid does not contain mammalian fetal serum, and consists of FGF4, FGF9, FGF17 and FGF18 Primate pluripotent stem cells can be cultured in the absence of serum, in the absence of feeder cells, and in the absence of culture medium exposed to feeder cells, containing at least 100 ng / ml FGF selected from There, and the culture solution, culture medium, characterized in that it is possible to maintain the stem cells to at least twice passaged in an undifferentiated state.

The FGF is FGF4 or FGF17, and the culture medium is capable of supporting the culture and proliferation of human undifferentiated proliferative euploid pluripotent stem cells for at least 8 passages. Culture method .

6. The FGF according to claim 5, wherein the FGF is FGF4 or FGF17, and the culture medium is capable of supporting culture and proliferation of human undifferentiated proliferative euploid pluripotent stem cells for at least 8 passages. Culture .

9. The FGF according to claim 8, wherein the FGF is FGF4 or FGF17, and the culture medium is capable of supporting the culture and proliferation of human undifferentiated proliferative euploid pluripotent stem cells for at least 8 passages. Culture fluid .