JP6298040B2 - Batch detection method for pathogenic fungi - Google Patents

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Description

本発明は、LAMP法を利用した迅速、簡便な病原性真菌の一括検出方法に関する。   The present invention relates to a rapid and simple batch detection method for pathogenic fungi using the LAMP method.

真菌は糸状菌、酵母、キノコの総称であり、生活環境において幅広く存在している菌である。通常この真菌は人体に影響はないが、真菌の種類によっては、肺や肝臓等の臓器や手、足裏等の体表面に感染した場合、疾患を引き起こすことがある。特に、好中球減少症をはじめとした免疫不全の状態になると、いわゆる日和見感染を起こしやすい状態になることが知られている。   Fungi is a general term for filamentous fungi, yeast, and mushrooms, and is a widespread fungus in the living environment. Normally, this fungus has no effect on the human body, but depending on the type of fungus, it can cause disease if it infects organs such as the lungs and liver, and body surfaces such as the hands and soles. In particular, it is known that when an immunodeficiency state such as neutropenia occurs, a so-called opportunistic infection is likely to occur.

これらの疾患のうち、真菌が肺や肝臓など、体の深部に入り込んで感染が起こっている状態を深在性真菌症という。深在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ(Trichosporon asahii)、トリコスポロン・ムコイデス(Trichosporon mucoides)等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス(Filobasidiella neoformans)等のフィロバシディエラ属の真菌等が知られている。   Among these diseases, fungal infections such as the lungs and liver that enter the deep part of the body and cause infection are called deep mycosis. Examples of fungi that cause deep mycosis include Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis and other Candida parapsilosis. Fungi, Trichosporon asahii, Trichosporon mucoides and other fungi of the genus Trichosporon, and fungi of the genus Filobasidiera such as Filobasidiella neoformans are known Yes.

また、真菌の体表面で感染が起こっている状態を表在性真菌症という。表在性真菌症を引き起こす真菌としては、例えば、トリコフィトン・ルブラム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)等のトリコフィトン属の真菌が知られている。   In addition, a state in which infection occurs on the surface of a fungal body is called superficial mycosis. As fungi causing superficial mycosis, fungi belonging to the genus Trichophyton such as Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes are known.

これら人体に疾患を引き起こす病原性の真菌を早期に検出することは非常に重要である。特に、食品分野において、製品出荷前に製品中に混入した病原性の真菌を迅速に検出することは、製品出荷停滞の縮減および生産効率の向上をはかる上で非常に重要である。   It is very important to detect pathogenic fungi that cause diseases in the human body at an early stage. In particular, in the food field, it is very important to quickly detect pathogenic fungi mixed in a product before product shipment in order to reduce the stagnation of product shipment and improve production efficiency.

これまで病原性の真菌の検出法として、分離培養する方法(特許文献1)や直接鏡検法(非特許文献1)、血清学的検査法(非特許文献1)、あるいはPCR(Polymerase Chain Reaction)法(特許文献2、3)が従来から用いられている。分離培養法は、菌がごく少量であったとしても検出可能であるが、平板培地への集落形成には数日から場合によっては数週間を要するという時間的な問題があった。直接検鏡法は検体をそのまま、あるいは液体であれば遠心分離後の沈殿物を光学顕微鏡で直接、あるいはグラム染色やギムザ染色等を施して観察するものであるが、鏡検像のみで判断するため、検体によっては判断に迷うことがあり、熟練した技術が必要といった問題があった。ELISA(Enzyme-Linked ImmmunoSorbent Assay)法やラテックス凝集(Latex Agglutination)法などの血清学的検査は、病原性真菌が保持する糖タンパク質や細胞壁の構成成分等の抗原あるいは病原性真菌の代謝産物を検出する方法であり、迅速性や簡便性に優れた方法であるが、感度が低いことや、他の真菌との抗原一致によって偽陽性となる要因が複数存在するといった問題があった。PCR法は真菌の核酸を鋳型とすることから、前記方法と比較して特異性が大幅に向上したが、核酸増幅に周期的な温度変化設定が必要なPCR反応、PCR産物の電気泳動を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。また、この方法では1回の反応で1種類しか真菌が検出できず、複数種の真菌が検査対象の場合には、それぞれの菌種についてPCR法を実施しなければならなかった。さらに、複数の病原性真菌を一括で検出する手法として、複数のプライマーを反応液に混合してPCR反応を行うマルチプレックスPCR法と、マイクロプレートハイブリダイゼーションを組み合わせて用いる手法についても報告がされている(特許文献3)。しかしながら、この方法もPCR産物を用いた検出工程を実施する必要があり、検査に長時間を要するといった問題があった。   Until now, as a method for detecting pathogenic fungi, a method of separating and culturing (patent document 1), a direct microscopic method (non-patent document 1), a serological test method (non-patent document 1), or PCR (polymerase chain reaction) ) Method (Patent Documents 2 and 3) has been conventionally used. The isolation culture method can detect even if the amount of bacteria is very small, but there is a time problem that it takes several days to several weeks for colony formation on the plate medium. The direct microscopic method is to observe the specimen as it is, or if it is liquid, the sediment after centrifugation is observed directly with an optical microscope or with Gram staining or Giemsa staining, but only by microscopic images. For this reason, there is a problem that judgment may be lost depending on the sample, and skilled techniques are required. Serological tests such as ELISA (Enzyme-Linked ImmmunoSorbent Assay) method and Latex Agglutination method detect antigens such as glycoproteins and components of cell walls, or metabolites of pathogenic fungi. Although this method is excellent in rapidity and convenience, there are problems such as low sensitivity and multiple factors that cause false positives due to antigen matching with other fungi. Since the PCR method uses fungal nucleic acid as a template, the specificity is greatly improved compared to the above method, but PCR reactions and electrophoresis of PCR products that require periodic temperature change settings for nucleic acid amplification are performed. There is a problem that it takes a long time for inspection. In addition, in this method, only one type of fungus can be detected in one reaction, and when a plurality of types of fungi are to be examined, the PCR method must be performed for each type of fungus. Furthermore, as a method for detecting a plurality of pathogenic fungi at once, a multiplex PCR method in which a PCR reaction is performed by mixing a plurality of primers in a reaction solution and a method using a combination of microplate hybridization have been reported. (Patent Document 3). However, this method also has a problem in that it requires a detection step using a PCR product, and a long time is required for the test.

特開平6−239982号公報Japanese Patent Laid-Open No. 6-239982 特開平8−89254号公報JP-A-8-89254 特開2008−54563号公報JP 2008-54563 A

深在性真菌症のガイドライン作成委員会編、「深在性真菌症の診断・治療ガイドライン2007」、協和企画、2007年2月、p.43Guidelines for Committee on Deep Mycosis, “Guidelines for Diagnosis / Treatment of Deep Mycosis 2007”, Kyowa Planning, February 2007, p. 43

従って、本発明の課題は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出できる方法を提供することにある。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a method that can rapidly and easily detect pathogenic fungi at once.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法を利用し、これに用いるLAMPプライマーセットとして、1菌種の病原性真菌の特定の領域を増幅しうるLAMPプライマーセットを用いれば、これを2菌種分以上混合しても2菌種以上の病原性真菌を一括で検出できることを見出し、本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have used a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, and as a LAMP primer set used for this, a specific region of a pathogenic fungus of one species is used. When a LAMP primer set capable of amplifying the bacterium was used, it was found that pathogenic fungi of two or more bacterial species could be collectively detected even when two or more bacterial species were mixed, and the present invention was completed.

すなわち、本発明は以下の工程(1)〜(3)
(1)試料からDNAを抽出する工程。
(2)1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上と、(1)で抽出したDNAを用いてLAMP反応を行う工程
(3)増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出方法である。
That is, the present invention includes the following steps (1) to (3).
(1) A step of extracting DNA from a sample.
(2) The LAMP primer set for amplifying at least part of the region containing the ITS region or IGS region of a pathogenic fungus of one species and two or more species, and the LAMP reaction using the DNA extracted in (1) (3) A method for collectively detecting pathogenic fungi, comprising a step of confirming the presence or absence of amplification.

また、本発明は1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットである。   The present invention also includes a LAMP primer set for amplifying at least a part of a region containing an ITS region or an IGS region of a pathogenic fungus of one bacterial species, for batch detection of pathogenic fungi, characterized by comprising two or more bacterial species. It is a LAMP primer set.

更に、本発明は上記病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キットである。   Furthermore, the present invention is a collective detection kit for pathogenic fungi comprising the LAMP primer set for collective detection of pathogenic fungi.

本発明の病原性真菌の一括検出方法は、感度よく、複数の病原性真菌を一括で検出することができる。   The collective detection method for pathogenic fungi of the present invention can detect a plurality of pathogenic fungi at a time with high sensitivity.

また、本発明の病原性真菌の一括検出方法は、温度条件も一定であり、結果を目視でも確認できるため、従来行われていたPCR法等と比べて迅速であるのみならず、試験器具が揃わないような環境下でも簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。また、本発明により、病原性真菌の一括検出が可能な検出キットを提供することができる。   In addition, the collective detection method for pathogenic fungi of the present invention has a constant temperature condition, and the result can be confirmed visually, so that it is not only faster than the conventional PCR method but also a test instrument. Pathogenic fungi can be easily detected in a lump even in an environment where they are not aligned. Moreover, according to the present invention, a detection kit capable of batch detection of pathogenic fungi can be provided.

本発明の病原性真菌の一括検出方法(以下、「本発明検出方法」という)は、以下の工程(1)〜(3)を含む。
(1)試料からDNAを抽出する工程。
(2)1菌種の病原性真菌の18S−26S rDNA ITS(内部転写スペーサー、Internal Transcribed Spacer)領域またはIGS(遺伝子間スペーサー、Intergenic Spacer)領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上と、(1)で抽出したDNAを用いてLAMP反応を行う工程
(3)増幅の有無を確認する工程
The collective detection method of pathogenic fungi of the present invention (hereinafter referred to as “the detection method of the present invention”) includes the following steps (1) to (3).
(1) A step of extracting DNA from a sample.
(2) LAMP primer set that amplifies at least a part of a region containing 18S-26S rDNA ITS (Internal Transcribed Spacer) region or IGS (Intergenic Spacer) region of one pathogenic fungus 2 or more bacterial species and a step of performing a LAMP reaction using the DNA extracted in (1) (3) a step of confirming the presence or absence of amplification

本発明検出方法の工程(1)において用いられる試料としては、特に限定されないが、例えば、血液やバイオプシー(生検)などの臨床検体や、土壌などの環境試料、あるいは乳製品等の飲食品、飲食品の原材料等が挙げられる。これらの中でも、飲食品が好ましく、特に乳製品が好ましい。ここで、乳製品としては、乳由来成分を含むものであれば特に限定されず、例えば、牛乳、加工乳、乳飲料、クリーム、発酵乳、乳酸菌飲料、練乳、濃縮乳、粉乳、バター、チーズ、アイスクリーム、バターミルク等が挙げられる。これら乳製品には、最終製品のみならず、カゼイン、ホエー蛋白質、乳ペプチド、ラクトフェリン等の乳由来原料、乳酸菌による培養物等の中間加工処理物等も含まれる。   The sample used in the step (1) of the detection method of the present invention is not particularly limited. For example, clinical specimens such as blood and biopsy (biopsy), environmental samples such as soil, or food and drink such as dairy products, Examples include raw materials for foods and drinks. Among these, food and drink are preferable, and dairy products are particularly preferable. Here, the dairy product is not particularly limited as long as it contains milk-derived components. For example, milk, processed milk, milk beverage, cream, fermented milk, lactic acid bacteria beverage, condensed milk, concentrated milk, powdered milk, butter, cheese , Ice cream, buttermilk and the like. These dairy products include not only final products but also milk-derived raw materials such as casein, whey protein, milk peptides, lactoferrin, and intermediate processed products such as cultures by lactic acid bacteria.

上記試料からDNAを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、フェノールやクロロホルム、ベンジルクロライドなどの有機溶剤を用いて抽出する方法や、ガラスビーズ振盪により物理的に菌体を破砕する方法、アルカリを直接添加する方法、加熱処理による方法、あるいはプロテアーゼ処理法等の方法が挙げられる。また、試料からDNAを抽出するにあたり、市販のDNA抽出キットを用いてもよい。これらの方法の中でもプロテアーゼ処理を含む方法がDNAの抽出の所要時間が短く、かつ抽出効率が高い点から好ましい。   The method for extracting DNA from the sample is not particularly limited. For example, a method for extracting using an organic solvent such as phenol, chloroform, benzyl chloride, a method for physically crushing bacterial cells by shaking glass beads, an alkali A method such as a method of directly adding, a method by heat treatment, a protease treatment method and the like can be mentioned. A commercially available DNA extraction kit may be used for extracting DNA from a sample. Among these methods, a method including protease treatment is preferable from the viewpoint that the time required for DNA extraction is short and the extraction efficiency is high.

具体的に、試料として乳製品を用いた場合に、プロテアーゼ処理法でDNAを抽出する方法は次の通りである。乳製品をプロテアーゼで処理した後、遠心分離等により、プロテアーゼで消化されたタンパク質あるいはポリペプチドを除去する。その後、アルカリ溶液や緩衝バッファー等を添加し、加熱処理等によって菌体からDNAを露出させる。加熱処理後の溶液、あるいはこれから更に遠心分離等によって不純物を除去した後の溶液をDNA溶液とする。使用するプロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、例えば、0.1〜500mg/mlである。   Specifically, when a dairy product is used as a sample, a method for extracting DNA by a protease treatment method is as follows. After the dairy product is treated with protease, the protein or polypeptide digested with protease is removed by centrifugation or the like. Thereafter, an alkaline solution, a buffer buffer or the like is added, and DNA is exposed from the cells by heat treatment or the like. A solution after the heat treatment or a solution from which impurities are further removed by centrifugation or the like is used as a DNA solution. Although the density | concentration of the protease to be used is not specifically limited, For example, it is 0.1-500 mg / ml.

本発明検出方法の工程(2)において用いられるLAMPプライマーセットは、1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するものである。これらの領域を用いることにより、2菌種以上のプライマーセットを組み合わせたとしても、菌種ごとのITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を特異的に増幅できる。   The LAMP primer set used in the step (2) of the detection method of the present invention is for amplifying at least a part of a region containing an ITS region or an IGS region of one pathogenic fungus. By using these regions, even when primer sets of two or more bacterial species are combined, at least a part of the region including the ITS region or the IGS region for each bacterial species can be specifically amplified.

具体的に病原性真菌としては、深在性真菌症を引き起こす、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)等のカンジダ属の真菌、トリコスポロン・アサヒ(Trichosporon asahii)、トリコスポロン・ムコイデス(Trichosporon mucoides)等のトリコスポロン属の真菌、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス(Filobasidiella neoformans)等のフィロバシディエラ属の真菌、表在性真菌症を引き起こす、トリコフィトン・ルブラム(Trichophyton rubrum)、トリコフィトン・メンタグロファイテス(Trichophyton mentagrophytes)等のトリコフィトン属の真菌や、マラセチア・グロボーサ(Malassezia globosa)、マラセチア・パチダーマティス(Malassezia pachydermatis)等のマラセチア属の真菌が挙げられる。これらの病原性真菌の中でも、カンジダ属の真菌、トリコスポロン属の真菌およびフィロバシディエラ属の真菌からなる群から選ばれる2属以上が好ましく、特にカンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシローシス、トリコスポロン・アサヒ、トリコスポロン・ムコイデスおよびフィロバシディエラ・ネオフォルマンスからなる群から選ばれる2種以上が好ましく、これらの全種がより好ましい。   Specifically, pathogenic fungi cause deep mycosis, for example, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis ) And other fungi of the genus Candida, Trichosporon asahii, Trichosporon mucoides and other fungi of the genus Trichosporon, Filobasidiella neoformans and the like Fungi, superficial mycosis causing Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes and other trichophyton fungi, Malassezia globosa, Malassezia pachi Matisu (Malassezia pachydermatis) fungus Malassezia genus, and the like. Among these pathogenic fungi, at least two genera selected from the group consisting of fungi of the genus Candida, fungi of the genus Trichosporon and fungus of the genus Philobasidiella are preferred, and in particular, Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis 2 or more selected from the group consisting of Candida parapsilosis, Trichosporon Asahi, Trichosporon mucoides and Philobasidiera neoformans are preferred, and all of these are more preferred.

これら病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットには、F3、B3、FIP、BIPの4種類のプライマーが必須である。また、このLAMPプライマーセットには、検出時間を短縮するために、LF、LBといったループプライマーを追加することが好ましい。プライマー設計のためには、まず、これらのプライマーが標的とする領域として、病原性真菌のITS領域またはIGS領域の少なくとも一部を含む塩基配列から選択される標的領域の5’側から塩基配列領域としてF3、F2およびF1を選択し、前記標的領域の3’側から、塩基配列領域としてB3c、B2cおよびB1cを選択する。そして、前記B3c、B2c、B1cの相補的塩基配列を、それぞれB3、B2、B1とし、前記F3、F2、F1の相補的塩基配列を、それぞれF3c、F2c、F1cとしたとき、それぞれのプライマーは以下の(A)〜(F)のいずれかに該当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
(A)前記B2領域を3’側に有し、前記B1c領域を5’側に有する塩基配列(BIP)
(B)前記B3領域を有する塩基配列(B3)
(C)前記F2領域を3’側に有し、前記F1c領域を5’側に有する塩基配列(FIP)
(D)前記F3領域を有する塩基配列(F3)
(E)前記B1領域と前記B2領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列(LB)
(F)前記F1領域と前記F2領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列(LF)
Four types of primers F3, B3, FIP, and BIP are essential for a LAMP primer set that amplifies at least a part of the ITS region or IGS region of these pathogenic fungi. Moreover, it is preferable to add loop primers such as LF and LB to this LAMP primer set in order to shorten the detection time. For primer design, first, as a region targeted by these primers, a base sequence region from the 5 ′ side of a target region selected from a base sequence containing at least a part of an ITS region or IGS region of a pathogenic fungus F3, F2 and F1 are selected as B3c, B2c and B1c as base sequence regions from the 3 ′ side of the target region. When the complementary base sequences of B3c, B2c, and B1c are B3, B2, and B1, respectively, and the complementary base sequences of F3, F2, and F1 are F3c, F2c, and F1c, respectively, An oligonucleotide having a base sequence corresponding to any of the following (A) to (F) is preferable.
(A) a base sequence (BIP) having the B2 region on the 3 ′ side and the B1c region on the 5 ′ side
(B) Base sequence having the B3 region (B3)
(C) a base sequence having the F2 region on the 3 ′ side and the F1c region on the 5 ′ side (FIP)
(D) Base sequence having the F3 region (F3)
(E) a base sequence (LB) having a sequence complementary to a portion between the B1 region and the B2 region
(F) a base sequence (LF) having a sequence complementary to a portion between the F1 region and the F2 region

前記のとおりLAMP法で用いるプライマーは少なくとも4種類であり、その中には35塩基以上の長いプライマーも含まれている。したがって、2菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合してLAMP法を行う(マルチプレックスLAMP)場合、他菌種のプライマー同士が二本鎖を形成してプライマーダイマーを形成し、LAMP反応が正常に進まないことが容易に予想される。しかしながら、本願発明の発明者らは、病原性真菌のITS領域またはIGS領域の少なくとも一部を標的として、プライマーを設計し、当該プライマーを用いることにより、2菌種以上のプライマーセットを同一反応液中に混合した場合でも、LAMP反応が正常に進み、標的菌種を特異的に検出することが可能であることを見出した。
なお、本願発明において、ITS領域とはITS1領域(18S rDNAと5.8S rDNAの間に存在する)と、ITS2領域(5.8S rDNAと26S rDNAの間に存在する)の両方を含むものである。また、IGS領域とはIGS1領域(26S rDNAと5S rDNAの間に存在する)と、IGS2領域(5S rDNAと18S rDNAの間に存在する)の両方を含むものである。
As described above, there are at least four types of primers used in the LAMP method, including long primers of 35 bases or more. Therefore, when the LAMP method is performed by mixing primer sets of two or more bacterial species in the same reaction solution (multiplex LAMP), primers of other bacterial species form double strands to form primer dimers, and LAMP It is easily expected that the reaction will not proceed normally. However, the inventors of the present invention designed a primer targeting at least a part of the ITS region or IGS region of a pathogenic fungus, and used the primer to combine two or more species of primer sets in the same reaction solution. It was found that even when mixed in, the LAMP reaction proceeds normally and the target bacterial species can be specifically detected.
In the present invention, the ITS region includes both the ITS1 region (existing between 18S rDNA and 5.8S rDNA) and the ITS2 region (existing between 5.8S rDNA and 26S rDNA). The IGS region includes both the IGS1 region (existing between 26S rDNA and 5S rDNA) and the IGS2 region (existing between 5S rDNA and 18S rDNA).

本発明の病原性真菌検出用LAMPプライマーセットを構成するプライマーは、病原性真菌およびこれに近縁な菌のITS領域およびIGS領域の少なくとも一部を含む塩基配列情報を相同性解析し、病原性真菌のみ保持する塩基配列の少なくとも一部を含む塩基配列であることが好ましい。また、LAMPプライマーセットの設計は、段落0022に記載の領域を選択する以外は、例えば、ソフトウェアを用いて設計することができる。
具体的には、前記真菌の塩基配列情報を国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL−Bank/GenBank)より入手し、MAFFT Version 6(http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)やClustalWなどの相同性解析ソフトウェアを用いて解析を行い、病原性真菌のみが保持する塩基配列を見出すことにより、病原性真菌のみ保持する塩基配列情報を得ることができる。さらに、Webサイト上で提供されているLAMPプライマー設計ソフトウェア(Primer Explorer Ver.4.0(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/))を用いて設計することができる。前記ソフトウェアにより、ループプライマーも設計することができる。
Primers constituting the LAMP primer set for detecting pathogenic fungi of the present invention are obtained by analyzing the homology of base sequence information including at least a part of the ITS region and IGS region of pathogenic fungi and closely related fungi. A base sequence including at least a part of a base sequence that holds only fungi is preferable. The LAMP primer set can be designed using software, for example, except for selecting the region described in paragraph 0022.
Specifically, the base sequence information of the fungus is obtained from the international base sequence database (DDBJ / EMBL-Bank / GenBank), MAFT Version 6 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software), ClustalW, etc. The base sequence information held only by the pathogenic fungus can be obtained by performing an analysis using the above homology analysis software and finding the base sequence held only by the pathogenic fungus. Furthermore, LAMP primer design software (Primer Explorer Ver. 4.0 (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/)) provided on the website can be used. The software can also design loop primers.

以下に具体的な病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域やLAMPプライマーセットについて説明する。   Below, the area | region containing the ITS area | region or IGS area | region of a pathogenic fungus, and a LAMP primer set are demonstrated.

カンジダ・アルビカンスのITS1およびITS2領域を含む領域は、配列番号1に記載の塩基配列(アクセッションナンバー:EF567995)である。本発明検出方法においては、配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号1に記載の塩基配列の260〜490位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida albicans is the base sequence described in SEQ ID NO: 1 (accession number: EF567995). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, particularly at least a part of positions 260 to 490 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号8〜11に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号8、9、11、13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる1種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号8〜12に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号8、9、11〜13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   As a LAMP primer set capable of amplifying this sequence, a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 8 to 11 or oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 8, 9, 11, 13 1 type or more chosen from the primer set which consists of. Moreover, as a primer set, the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 8-12 which added the loop primer to this, or the base sequence of sequence number 8, 9, 11-13 It is preferred to use a primer set consisting of the indicated oligonucleotides.

カンジダ・グラブラータのITS1およびITS2領域を含む領域は、配列番号2に記載の塩基配列(アクセッションナンバー:AB032177)である。本発明検出方法においては、配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号2に記載の塩基配列の570〜793位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida glabrata is the base sequence described in SEQ ID NO: 2 (accession number: AB032177). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, particularly at least a part of positions 570 to 793 of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号14〜17に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号14〜18に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   Examples of LAMP primer sets that can amplify this sequence include primer sets consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 14 to 17. Moreover, as a primer set, it is preferable to use the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 14-18 which added the loop primer to this.

カンジダ・トロピカリスのITS1およびITS2領域を含む領域は、配列番号3に記載の塩基配列(アクセッションナンバー:AY939810)である。本発明検出方法においては、配列番号3に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号3に記載の塩基配列の280〜500位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida tropicalis is the base sequence described in SEQ ID NO: 3 (accession number: AY939810). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 3, particularly at least a part of positions 280 to 500 of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号19〜22に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号19〜23に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   As a LAMP primer set capable of amplifying this sequence, a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 19 to 22 can be mentioned. Moreover, as a primer set, it is preferable to use the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 19-23 which added the loop primer to this.

カンジダ・パラプシローシスのITS1およびITS2領域を含む領域は、配列番号4に記載の塩基配列(アクセッションナンバー:AY391843)である。本発明検出方法においては、配列番号4に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号4に記載の塩基配列の260〜570位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region containing the ITS1 and ITS2 regions of Candida parapsilosis is the base sequence described in SEQ ID NO: 4 (accession number: AY391843). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 4, particularly at least a part of positions 260 to 570 of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号24〜27に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜34に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜39に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜44に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号46〜49に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる1種以上が挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号24〜29に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、28〜30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜36に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜40に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜45に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットまたは配列番号46〜50に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットから選ばれる1種以上を用いることが好ましい。   The LAMP primer set capable of amplifying this sequence consists of a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-27 and oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 24-26, 30 Primer set, primer set consisting of oligonucleotides represented by the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 31-34, primer set consisting of oligonucleotides represented by the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 32, 37-39, and SEQ ID NOs: 41-44 1 or more selected from a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence described in (1) or a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the base sequence described in SEQ ID NOs: 46 to 49. Moreover, as a primer set, the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 24-29 which added the loop primer to this, and the base sequence of sequence number 24-26, 28-30 A primer set consisting of the oligonucleotides shown, a primer set consisting of the oligonucleotides shown in the base sequences of SEQ ID NOs: 31 to 36, a primer set consisting of the oligonucleotides shown in the base sequences of SEQ ID NOs: 32 and 37-40 , One or more selected from a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 41 to 45 or a primer set consisting of an oligonucleotide represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 46-50 preferable.

トリコスポロン・アサヒのIGS1領域を含む領域は、配列番号5記載の塩基配列(アクセッションナンバー:FJ754250)である。本発明検出方法においては、配列番号5に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号5記載の塩基配列の130〜340位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region including the IGS1 region of Trichosporon Asahi is the base sequence described in SEQ ID NO: 5 (accession number: FJ754250). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 5, particularly at least a part of positions 130 to 340 of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号51〜54に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号51〜55に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   Examples of the LAMP primer set that can amplify this sequence include a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 to 54. Moreover, as a primer set, it is preferable to use the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 51-55 which added the loop primer to this.

トリコスポロン・ムコイデスのIGS1領域を含む領域は、配列番号6記載の塩基配列(アクセッションナンバー:EU934806)である。本発明検出方法においては、配列番号6に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号6記載の塩基配列の220〜460位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region including the IGS1 region of Trichosporon mucoides is the base sequence described in SEQ ID NO: 6 (accession number: EU934806). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 6, particularly at least a part of positions 220 to 460 of the base sequence described in SEQ ID NO: 6 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号56〜59に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号56〜60に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   As a LAMP primer set capable of amplifying this sequence, a primer set composed of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 56 to 59 can be mentioned. Moreover, as a primer set, it is preferable to use the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 56-60 which added the loop primer to this.

フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのITS1およびITS2領域を含む領域は、配列番号7記載の塩基配列(アクセッションナンバー:EU240005)である。本発明検出方法においては、配列番号7に記載の塩基配列の少なくとも一部、特に配列番号7記載の塩基配列の250〜510位の少なくとも一部が増幅されることが好ましい。   The region including the ITS1 and ITS2 regions of P. foliosidera neoformans is the base sequence described in SEQ ID NO: 7 (accession number: EU240005). In the detection method of the present invention, it is preferable that at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 7, particularly at least a part of positions 250 to 510 of the base sequence described in SEQ ID NO: 7 is amplified.

この配列を増幅できるLAMPプライマーセットとしては、配列番号61〜64に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットが挙げられる。また、プライマーセットとしては、これにループプライマーを追加した、配列番号61〜65に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いることが好ましい。   Examples of the LAMP primer set capable of amplifying this sequence include a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 to 64. Moreover, as a primer set, it is preferable to use the primer set which consists of the oligonucleotide shown by the base sequence of sequence number 61-65 which added the loop primer to this.

なお、前記のようにして設計されたLAMPプライマーセットを構成する各プライマーは、当業者によく知られた通常のDNAの合成法、例えば、DNA合成機を用いて得ることもできるし、シグマアルドリッチジャパン社やライフテクノロジーズジャパン社などのDNA合成業者等に合成を依頼して得ることができる。   In addition, each primer which comprises the LAMP primer set designed as mentioned above can be obtained using a normal DNA synthesis method well known to those skilled in the art, for example, a DNA synthesizer, or Sigma-Aldrich. It can be obtained by requesting synthesis from a DNA synthesizer such as Japan or Life Technologies Japan.

上記した1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを、2菌種分以上、好ましくは4菌種分以上、特に好ましくは7菌種分以上用い、これを工程(1)で抽出したDNAとLAMP反応させる。LAMP反応の条件は、特に限定されず、公知の条件を用いることができる。   The LAMP primer set for amplifying at least a part of the region containing the ITS region or IGS region of one pathogenic fungus as described above is more than 2 species, preferably more than 4 species, particularly preferably 7 species Using this for more than minutes, this is reacted with the DNA extracted in step (1). The conditions for the LAMP reaction are not particularly limited, and known conditions can be used.

具体的に、LAMP反応は、上記LAMPプライマーセット、工程(1)で抽出したDNA、核酸合成酵素、核酸合成の基質、その他必要により酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩やマンガン塩等)、酵素や鋳型DNAの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬等を含む反応液とし、これを58〜67℃、好ましくは60〜65℃で1〜180分間、好ましくは10〜120分間維持することにより行われる。   Specifically, the LAMP reaction includes the LAMP primer set, the DNA extracted in step (1), the nucleic acid synthesizing enzyme, the nucleic acid synthesizing substrate, other buffers that give conditions suitable for the enzymatic reaction as necessary, and salts as cofactors. (Magnesium salt, manganese salt, etc.), a protective solution that contributes to the stabilization of the enzyme and template DNA, and further, if necessary, a reaction solution containing reagents necessary for the detection of the reaction product, Preferably it is carried out by maintaining at 60 to 65 ° C. for 1 to 180 minutes, preferably 10 to 120 minutes.

前記LAMP反応に用いられるDNAの核酸合成酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、例えば、Bst DNAポリメラーゼ(ラージフラグメント)、Csa DNAポリメラーゼ、96−7 DNAポリメラーゼ等が挙げられる。また、核酸合成の基質としては、例えば、dNTP(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを含む)等が挙げられる。   The DNA nucleic acid synthase used in the LAMP reaction is preferably a template-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity. Examples of such an enzyme include Bst DNA polymerase (large fragment), Csa DNA polymerase, 96-7 DNA polymerase, and the like. Examples of the nucleic acid synthesis substrate include dNTP (including dATP, dCTP, dGTP, and dTTP).

本発明検出方法の工程(3)において増幅の有無の確認は、公知の方法で行うことができる。具体的に、LAMP法は増幅反応の副産物としてピロリン酸マグネシウムが生成し、反応液が白濁するので目視や濁度計による測定で増幅があったことを確認することもできるし、また、反応液を電気泳動させればラダーパターンが存在するかどうかによって増幅があったことを確認することができる。さらに、反応液にエチジウムブロマイドを添加して増幅させた反応液にUVを照射することで蛍光強度が増強されるため、蛍光の有無によって増幅があったことを確認することができる。   In step (3) of the detection method of the present invention, the presence or absence of amplification can be confirmed by a known method. Specifically, in the LAMP method, magnesium pyrophosphate is generated as a by-product of the amplification reaction, and the reaction solution becomes cloudy. Therefore, it can be confirmed that amplification has occurred by visual observation or measurement with a turbidimeter. Can be confirmed by the presence or absence of the ladder pattern. Furthermore, since the fluorescence intensity is enhanced by irradiating UV to the reaction solution amplified by adding ethidium bromide to the reaction solution, it can be confirmed that there was amplification depending on the presence or absence of fluorescence.

以上説明した本発明検出方法は、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができる。   The detection method of the present invention described above can quickly and easily detect pathogenic fungi at once.

また、本発明検出方法を実施するため、上記した病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットを含むキットを用いることもできる。   Moreover, in order to implement this invention detection method, the kit containing the LAMP primer set for collective detection of the pathogenic fungi mentioned above can also be used.

上記したキットの好ましい態様としては、上記した病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセット、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、核酸合成の基質と、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類(マグネシウム塩やマンガン塩等)、酵素や鋳型DNAの安定化に寄与する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬、器具類等を含むものが挙げられる。また、本発明のキットには、本発明のプライマーセットによってLAMP反応が正常に進行していることを確認するための陽性対照を含んでいてもよい。陽性対照として、例えば本発明のプライマーセットにより増幅される領域を含むDNA等が挙げられる。   Preferred embodiments of the kit described above include the LAMP primer set for batch detection of pathogenic fungi described above, a template-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity, a substrate for nucleic acid synthesis, and a buffer solution that provides conditions suitable for the enzyme reaction. , Salts containing cofactors (magnesium salts, manganese salts, etc.), protecting agents that contribute to the stabilization of enzymes and template DNA, and reagents and instruments necessary for detecting reaction products as necessary Can be mentioned. In addition, the kit of the present invention may include a positive control for confirming that the LAMP reaction proceeds normally with the primer set of the present invention. Examples of the positive control include DNA containing a region amplified by the primer set of the present invention.

以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.

実 施 例 1
病原性真菌の特異的検出:
(1)LAMPプライマーの設計および合成
まず、病原性真菌である、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)、カンジダ・グラブラータ(C. glabrata)、カンジダ・トロピカリス(C. tropicalis)、カンジダ・パラプシローシス(C. parapsilosis)、トリコスポロン・アサヒ(T. asahii)、トリコスポロン・ムコイデス(T. mucoides)、フィロバシディエラ・ネオフォルマンス(F. neoformans)、およびこれらに近縁の菌種の18S−26S rDNA ITS領域、あるいは26S−5S rDNA IGS領域の塩基配列情報を、国際塩基配列データベース(DDBJ/EMBL−Bank/GenBank)より入手した。MAFFT Version 6(http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)を用いてこれらをアライメント解析し、ITS領域またはIGS領域上の病原性真菌特異的な配列を抽出した。これらをもとに、ITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅できるLAMPプライマーを、配列番号1に記載の塩基配列の260〜490位、配列番号2に記載の塩基配列の570〜793位、配列番号3に記載の塩基配列の280〜500位、配列番号4に記載の塩基配列の260〜570位、配列番号5に記載の塩基配列の130〜340位、配列番号6に記載の塩基配列の220〜460位、配列番号7に記載の塩基配列の250〜510位を増幅できるよう、PrimerExplorer Ver. 4.0(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/)を使用して設計した。設計したLAMPプライマーを表1に示した。ここでCalb-aは配列番号8〜12、Cglaは配列番号14〜18、Ctroは配列番号19〜23、Cpar-bは配列番号24〜26、28〜30、Tasaは配列番号51〜55、Tmucは配列番号56〜60、Fneoは配列番号61〜65、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。なお、これらのプライマーはライフテクノロジーズジャパン社にDNA合成を依頼して得た。
Example 1
Specific detection of pathogenic fungi:
(1) Design and synthesis of LAMP primer First, Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, Candida parapsilosis (C. parapsilosis), Trichosporon Asahi, Trichosporon mucoides, F. neoformans, and closely related 18S-26S rDNA ITS The base sequence information of the region or 26S-5S rDNA IGS region was obtained from the international base sequence database (DDBJ / EMBL-Bank / GenBank). These were subjected to alignment analysis using MATFT Version 6 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software), and a pathogenic fungus-specific sequence on the ITS region or IGS region was extracted. Based on these, the LAMP primer capable of amplifying at least a part of the region including the ITS region or the IGS region is positioned at positions 260 to 490 of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and 570 to 570 of the base sequence described in SEQ ID NO: 2. 793, positions 280-500 of the base sequence described in SEQ ID NO: 3, positions 260-570 of the base sequence described in SEQ ID NO: 4, positions 130-340 of the base sequence described in SEQ ID NO: 5, described in SEQ ID NO: 6 In order to amplify positions 220 to 460 of the base sequence of SEQ ID NO: 7 and positions 250 to 510 of the base sequence of SEQ ID NO: 7, Primer Explorer Ver. Designed using 4.0 (https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/). The designed LAMP primers are shown in Table 1. Here, Calb-a is SEQ ID NO: 8-12, Cgla is SEQ ID NO: 14-18, Ctro is SEQ ID NO: 19-23, Cpar-b is SEQ ID NO: 24-26, 28-30, Tasa is SEQ ID NO: 51-55, Tmuc is a set of primers consisting of the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 56 to 60 and Fneo is described in SEQ ID NOs: 61 to 65, respectively. These primers were obtained by requesting DNA synthesis from Life Technologies Japan.

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(2)病原性真菌からのDNA抽出
後記する表3に示した菌をそれぞれ生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が1.0x10cells/mlになるように懸濁液を調製した。この懸濁液から、ベンジルクロライド法によりDNAを抽出した。
(2) DNA extraction from pathogenic fungi Each of the bacteria shown in Table 3 to be described later is appropriately suspended in physiological saline, and the bacterial concentration is 1.0 × 10 7 cells / ml by cell counting using a hemocytometer. A suspension was prepared. From this suspension, DNA was extracted by the benzyl chloride method.

具体的には、1mLの菌体懸濁液を15,000×gで5分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、250μL Extraction buffer(100mM Tris−HCl、40mM EDTA[pH 9.0])、0.7g ガラスビーズ(φ0.1−0.2mm)、500μL ベンジルクロライドを添加し、Fastprep FP120(Bio101)にて強さ6.5で30秒間激しく振とうした後、50μL 10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてMicroincubator(タイテック製)にて50℃、20分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後150μL 3M酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、15,000×gで8分間遠心分離を行ない、上清400μLを回収した。回収した上清に400μL冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、15,000×gで8分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに300μL冷70%エタノールを添加して転倒混和後、15,000×gで3分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、50μL TE buffer(10mM Tris−HCl、1mM EDTA[pH 8.0]で沈殿物を溶解させたものをDNA溶液とした。   Specifically, 1 mL of the cell suspension was centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. To the resulting pellet, 250 μL Extraction buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA [pH 9.0]), 0.7 g glass beads (φ0.1-0.2 mm), 500 μL benzyl chloride were added, and Fastprep FP120 ( Bio101) was vigorously shaken for 30 seconds at a strength of 6.5, then 50 μL of 10% sodium dodecyl sulfate solution was added, and the cells were crushed by vigorous shaking at 50 ° C. for 20 minutes in a Microincubator (manufactured by Taitec). did. Thereafter, 150 μL of 3M sodium acetate was added and stirred, followed by centrifugation at 15,000 × g for 8 minutes to recover 400 μL of the supernatant. 400 μL of cold isopropyl alcohol was added to the collected supernatant and mixed by inversion, followed by centrifugation at 15,000 × g for 8 minutes to remove the supernatant. 300 μL of cold 70% ethanol was added thereto and mixed by inversion, followed by centrifugation at 15,000 × g for 3 minutes. The supernatant was removed and air-dried, and the DNA solution was prepared by dissolving the precipitate with 50 μL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8.0]).

(3)LAMP法による病原性真菌の検出
上記(2)で抽出したDNAは、10μg/mLの濃度に調製して鋳型DNA溶液とした。LAMP反応は、Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学製)および表1に記載の各プライマーセットをそれぞれ単独で用いて、前記キットに添付のプロトコールに従い、表2に記載の反応液を用いて、62℃で90分間反応させた。病原性真菌のDNAの増幅評価は、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により、反応中の反応液の濁度上昇の有無で評価した(+:60分以内に濁度上昇あり(増幅あり)、−:90分経過後も濁度上昇なし(増幅なし))。評価においては、濁度0.1を閾値とし、閾値に達した際の時間(Tt)を比較基準とした。この結果を表3に示した。
(3) Detection of pathogenic fungi by the LAMP method The DNA extracted in (2) above was prepared at a concentration of 10 μg / mL and used as a template DNA solution. The LAMP reaction was performed using a Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and each primer set described in Table 1 alone, and according to the protocol attached to the kit, using the reaction solution described in Table 2, The reaction was performed at 62 ° C. for 90 minutes. The amplification evaluation of DNA of pathogenic fungi was evaluated by the presence or absence of increase in turbidity of the reaction solution during the reaction using a Loopamp real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Telamex) (+: turbidity increased within 60 minutes) Yes (with amplification),-: No increase in turbidity after 90 minutes (no amplification)). In the evaluation, the turbidity of 0.1 was used as a threshold, and the time (Tt) when the threshold was reached was used as a comparison standard. The results are shown in Table 3.

Figure 0006298040
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上記結果より、各プライマーセットは、標的とした病原性真菌のDNA配列のみを増幅し、特異的に検出することができた。   From the above results, each primer set was able to amplify only the DNA sequence of the target pathogenic fungus and specifically detect it.

実 施 例 2
LAMPプライマーの検討:
カンジダ・アルビカンス(C. albicans)に特異的なプライマーセットと、カンジダ・パラプシローシス(C. parapsilosis)グループに特異的なプライマーセット候補を、それぞれの標的菌種の5.8S−26S rDNA ITS2上に設計した。設計したプライマーを表4に示した。ここでCalb-aは配列番号8〜12、Calb-bは配列番号8、9、11〜13、Cpar-aは配列番号24〜29、Cpar-bは配列番号24〜26、28〜30、Cpar-60は配列番号31〜36、Cpar-63は配列番号32、37〜40、Cpar-65は配列番号41〜45、Cpar-68は配列番号46〜50、にそれぞれ記載の塩基配列からなるプライマーのセットである。これらのプライマーセットを用いて、カンジダ・アルビカンス(YIT 8272T)あるいはカンジダ・パラプシローシス(YIT 10333T)より、実施例1と同様にして抽出したDNA10ngを鋳型に、62℃で90分間LAMP反応を実施して、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により反応液の濁度が閾値(0.1)を越えた時間(Tt)を測定した。その結果を表5に示した。
Example 2
Examination of LAMP primers:
Primer set specific to C. albicans and candidate primer set specific to C. parapsilosis group are designed on 5.8S-26S rDNA ITS2 of each target strain did. The designed primers are shown in Table 4. Here, Calb-a is SEQ ID NO: 8-12, Calb-b is SEQ ID NO: 8, 9, 11-13, Cpar-a is SEQ ID NO: 24-29, Cpar-b is SEQ ID NO: 24-26, 28-30, Cpar-60 has the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 31 to 36, Cpar-63 has the sequence numbers 32 and 37 to 40, Cpar-65 has the sequence numbers 41 to 45, and Cpar-68 has the sequence numbers 46 to 50. A set of primers. Using these primer sets, a LAMP reaction was carried out at 62 ° C. for 90 minutes using 10 ng of DNA extracted from Candida albicans (YIT 8272 T ) or Candida parapsilosis (YIT 10333 T ) in the same manner as in Example 1. Then, the time (Tt) when the turbidity of the reaction solution exceeded the threshold (0.1) was measured with a Loopamp real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Teramex). The results are shown in Table 5.

Figure 0006298040
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上記結果より、カンジダ・アルビカンスに特異的なプライマーセットでは、Calb-bよりCalb-aでTtが早く、カンジダ・パラプシローシスグループに特異的なプライマーセットでは、Cpar-bが最もTtが早いことが確認された。   From the above results, the primer set specific to Candida albicans has a faster Tt for Calb-a than Calb-b, and the primer set specific to the Candida parapsilosis group has the fastest Tt for Cpar-b It was confirmed.

実 施 例 3
マルチプレックスLAMP(mLAMP)法の検討(1):
深在性カンジダ症起因菌および深在性トリコスポロン症起因菌による汚染をそれぞれ一回の反応で判定可能とするため、複数のプライマーセットを同一反応液に混合したmLAMP法を検討した。
Example 3
Study of multiplex LAMP (mLAMP) method (1):
In order to make it possible to determine the contamination caused by the deep candidiasis-causing bacteria and the deep-water trichosporonosis-causing bacteria in a single reaction, the mLAMP method in which a plurality of primer sets were mixed in the same reaction solution was examined.

Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学製)に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット4種(Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計21本(mCan))とそれぞれ1菌種分の鋳型DNA溶液5μL(50ng)を混合したmLAMP反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット2種(TasaおよびTmucのプライマー計10本(mTri))を混合したmLAMP反応液を用いて、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により、62℃で反応しながら、90分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値(0.1)を越えた時間(Tt)を測定した。その結果を表6に示した。   Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) includes 4 primer sets (Calb-a, Cgla, Cpar-b and Ctro primer totals 21) (mCan) for detecting deep candidiasis-causing bacteria. MLAMP reaction solution mixed with 5 μL (50 ng) of template DNA solution for bacterial species, or mLAMP reaction solution mixed with 2 types of primer set for detecting deep trichorsporonosis-causing bacteria (10 total primers (mTri) from Tasa and Tmuc) Measure the change in turbidity for 90 minutes while reacting at 62 ° C with a Loopamp real-time turbidity measurement device (LA-200: made by Telamex), and the turbidity of the reaction solution is set to the threshold (0.1). The time exceeded (Tt) was measured. The results are shown in Table 6.

実験は3連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性とした。   The experiment was performed in triplicate, and only when the increase in turbidity was observed in all reactions, the detection was positive.

Figure 0006298040
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上記の結果より、標的菌種に近縁な47菌種について交叉性を調べた結果、通常のLAMP法と同様に、プライマーセットを複数組み合わせたmLAMPにおいても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。   From the above results, as a result of investigating the crossability of 47 bacterial species closely related to the target bacterial species, only the target bacterial species is specifically detected even in mLAMP combined with a plurality of primer sets, as in the normal LAMP method. It was confirmed that it was possible.

実 施 例 4
マルチプレックスLAMP(mLAMP)法の検討(2):
深在性真菌症起因菌の検出を迅速にするために、7つのプライマーセットを同時に反応させ、mLAMP法を行った。
Example 4
Study of multiplex LAMP (mLAMP) method (2):
In order to expedite the detection of the bacteria causing the deep mycosis, 7 primer sets were reacted at the same time, and the mLAMP method was performed.

Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学製)に、表1に記載の7つのプライマーセット(Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、TasaおよびTmucのプライマー計36本(7plex))と、それぞれ1菌種分の鋳型DNA溶液5μL(50ng)を混合したmLAMP反応液を用いて、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により、62℃で反応しながら、90分間濁度の変化を測定し、反応液の濁度が閾値(0.1)を越えた時間(Tt)を測定した。その結果を表7に示した。なお、反応は同一DNA溶液について3連で実施した。   The Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) contains seven primer sets listed in Table 1 (Fneo, Calb-a, Cgla, Cpar-b, Ctro, Tasa and Tmuc primer total 36 (7plex)) Using a mLAMP reaction solution in which 5 μL (50 ng) of a template DNA solution for one bacterial species was mixed, the mixture was turbid for 90 minutes while reacting at 62 ° C. with a Loopamp real-time turbidity measurement device (LA-200: manufactured by Telamex). The change in degree was measured, and the time (Tt) when the turbidity of the reaction solution exceeded the threshold (0.1) was measured. The results are shown in Table 7. The reaction was performed in triplicate for the same DNA solution.

Figure 0006298040
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上記の結果より、プライマーセットは7種組み合わせても検出対象菌種のみを特異的に検出可能であることが確認された。   From the above results, it was confirmed that even when seven types of primer sets were combined, it was possible to specifically detect only the bacterial species to be detected.

実 施 例 5
LAMP法の検出限界の検討:
標的菌種を1.0×10cells/ml含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したDNA溶液をTE緩衝液(pH8.0)にて5倍ないし10倍で段階希釈した。LAMP反応は、Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学製)に、表1に記載の7つのプライマーセット(Fneo、Calb-a、Cgla、Cpar-b、Ctro、Tasa、Tmuc)をそれぞれ添加し、更にそれぞれ1菌種分の鋳型DNA溶液5μLを混合したLAMP反応液を用いて、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により、62℃で反応しながら、90分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一DNA希釈液について3連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表8に示した。
Example 5
Examination of detection limit of LAMP method:
A DNA solution extracted by a benzyl chloride method from a suspension containing 1.0 × 10 7 cells / ml of the target bacterial species was serially diluted 5 to 10 times with TE buffer (pH 8.0). For the LAMP reaction, the seven primer sets (Fneo, Calb-a, Cgla, Cpar-b, Ctro, Tasa, Tmuc) described in Table 1 were added to the Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical), respectively. Furthermore, using a LAMP reaction solution in which 5 μL of the template DNA solution for one bacterial species was mixed, the turbidity change for 90 minutes while reacting at 62 ° C. with a Loopamp real-time turbidity measurement device (LA-200: manufactured by Telamex) Was measured. The reaction was carried out in triplicate for the same DNA dilution, and only when the increase in turbidity was observed in all reactions was detected positive, and the detection positive value with the smallest number of bacteria was taken as the detection limit. These results are shown in Table 8.

Figure 0006298040
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qPCRでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは10cell/ml相当DNA、トリコスポロン・アサヒでは10cell/ml相当DNAと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたLAMP法はqPCR法より優れた検出感度をもつことがわかった。detection limit in qPCR is, 10 1 cell / ml corresponding DNA in Candida albicans and Candida glabrata, since it has been reported that 10 2 cell / ml corresponding DNA in Trichosporon Asahi, LAMP method using the primer set Was found to have better detection sensitivity than the qPCR method.

実 施 例 6
マルチプレックスLAMP(mLAMP)法の検出限界の検討:
標的菌種を1.0×10cells/ml含む懸濁液よりベンジルクロライド法にて抽出したDNA溶液をTE緩衝液(pH8.0)にて5倍ないし10倍で段階希釈した。mLAMP反応は、Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学製)に、深在性カンジダ症起因菌検出用プライマーセット4種(Calb-a、Cgla、Cpar-bおよびCtroのプライマー計21本(mCan))と鋳型DNA溶液5μLを混合したmLAMP反応液あるいは深在性トリコスポロン症起因菌検出用プライマーセット2種(TasaおよびTmucのプライマー計10本(mTri))を混合したmLAMP反応液を用いて、Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA−200:テラメックス製)により、62℃で反応しながら、90分間濁度の変化を測定した。なお、反応は同一DNA希釈液について3連で実施し、全ての反応で濁度上昇が観察された場合のみを検出陽性として、最も菌数が少ない検出陽性の値を検出限界とした。これらの結果を表9に示した。
Example 6
Examination of detection limit of multiplex LAMP (mLAMP) method:
A DNA solution extracted by a benzyl chloride method from a suspension containing 1.0 × 10 7 cells / ml of the target bacterial species was serially diluted 5 to 10 times with TE buffer (pH 8.0). The mLAMP reaction was carried out using a Loopamp DNA amplification reagent kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), 4 types of primer sets for detecting candidiasis caused by deep candidiasis (Calb-a, Cgla, Cpar-b and Ctro primer total 21 (mCan) ) And 5 μL of the template DNA solution, or a LAMPamp solution containing a mixture of two primer sets for detecting deep trichorsporonosis-causing bacteria (total 10 Tasa and Tmuc primers (mTri)). The change in turbidity was measured for 90 minutes while reacting at 62 ° C. with a real-time turbidity measuring device (LA-200: manufactured by Teramex). The reaction was carried out in triplicate for the same DNA dilution, and only when the increase in turbidity was observed in all reactions was detected positive, and the detection positive value with the smallest number of bacteria was taken as the detection limit. These results are shown in Table 9.

Figure 0006298040
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qPCRでの検出限界は、カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・グラブラータでは10cells/ml相当DNA、トリコスポロン・アサヒでは10cells/ml相当DNAと報告されていることから、上記プライマーセットを用いたmLAMP法はqPCR法とほぼ同等の検出感度をもつことがわかった。detection limit in qPCR is, 10 1 cells / ml corresponding DNA in Candida albicans and Candida glabrata, since it has been reported that 10 2 cells / ml corresponding DNA in Trichosporon Asahi, MLAMP method using the primer set Was found to have almost the same detection sensitivity as the qPCR method.

実 施 例 7
DNA抽出方法の検討:
フィロバシディエラ・ネオフォルマンスを生理食塩水に適宜懸濁し、血球計算盤を用いたセルカウントにより菌濃度が1.0x10cells/mlになるように懸濁液を調製した。この懸濁液を15,000×gで5分間遠心分離を行ない、上清を除去した菌体ペレットに市販の乳製品乳酸菌飲料であるヤクルト(無脂乳固形分3.1%、乳脂肪0.1%、ヤクルト本社製)を1ml添加した。これを前記乳製品乳酸菌飲料で段階希釈して調製した、種々の濃度(1.0x10〜1.0x10cells/ml)のフィロバシディエラ・ネオフォルマンスを含む擬似汚染乳製品について以下の(1)〜(3)のDNAの抽出方法について所要時間を検討した。またこれらの方法で擬似汚染乳製品から抽出したDNAと、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用い、実施例6と同様にして検出感度を測定した。
Example 7
Examination of DNA extraction method:
Filobasidiella neoformans was appropriately suspended in physiological saline, and a suspension was prepared so that the cell concentration was 1.0 × 10 7 cells / ml by cell counting using a hemocytometer. This suspension was centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed from the cell pellet. Yakult (non-fat milk solid content 3.1%, milk fat 0) 1% of Yakult HQ) was added. About the pseudo-contaminated dairy product prepared by serially diluting this with the dairy lactic acid bacteria beverage and containing Philobasidiella neoformans at various concentrations (1.0 × 10 7 to 1.0 × 10 0 cells / ml) The time required for the DNA extraction methods (1) to (3) was examined. In addition, the detection sensitivity was measured in the same manner as in Example 6 using DNA extracted from the pseudo-contaminated dairy product by these methods and a Fneo primer set specific to P. foliosideiella neoformans.

(1)ベンジルクロライド法
擬似汚染乳製品1mlを15,000×gで5分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られたペレットに、250μL Extraction buffer(100mM Tris−HCl、40mM EDTA[pH 9.0])、0.7g ガラスビーズ(φ0.1−0.2mm)、500μL ベンジルクロライドを添加し、Fastprep FP120(Bio101)にて強さ6.5で30秒間激しく振とうした後、50μL 10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を加えてMicroincubator(タイテック製)にて50℃、20分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。その後150μL 3M酢酸ナトリウムを加えて攪拌し、15,000×gで8分間遠心分離を行ない、上清400μLを回収した。回収した上清に400μL冷イソプロピルアルコールを添加し、転倒混和した後、15,000×gで8分間遠心分離を行ない、上清を除去した。これに300μL冷70%エタノールを添加して転倒混和後、15,000×gで3分間遠心分離を行なった。上清を除去し風乾後、50μL TE buffer(10mM Tris−HCl、1mM EDTA[pH 8.0]で沈殿物を溶解させたものをDNA溶液とした。
(1) Benzyl chloride method 1 ml of the pseudo-contaminated dairy product was centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. To the resulting pellet, 250 μL Extraction buffer (100 mM Tris-HCl, 40 mM EDTA [pH 9.0]), 0.7 g glass beads (φ0.1-0.2 mm), 500 μL benzyl chloride were added, and Fastprep FP120 ( Bio101) was vigorously shaken for 30 seconds at a strength of 6.5, then 50 μL of 10% sodium dodecyl sulfate solution was added, and the cells were crushed by vigorous shaking at 50 ° C. for 20 minutes in a Microincubator (manufactured by Taitec). did. Thereafter, 150 μL of 3M sodium acetate was added and stirred, followed by centrifugation at 15,000 × g for 8 minutes to recover 400 μL of the supernatant. 400 μL of cold isopropyl alcohol was added to the collected supernatant and mixed by inversion, followed by centrifugation at 15,000 × g for 8 minutes to remove the supernatant. 300 μL of cold 70% ethanol was added thereto and mixed by inversion, followed by centrifugation at 15,000 × g for 3 minutes. The supernatant was removed and air-dried, and the DNA solution was prepared by dissolving the precipitate with 50 μL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8.0]).

(2)アルカリ直接添加法
擬似汚染乳製品1mlに、アルカリ溶液(25μl 5M NaOH)を添加し、5分間、37℃で反応したものを粗DNA抽出液とした。
(2) Alkali Direct Addition Method An alkaline solution (25 μl 5M NaOH) was added to 1 ml of the pseudo-contaminated dairy product and reacted at 37 ° C. for 5 minutes to obtain a crude DNA extract.

(3)プロテアーゼ処理法
擬似汚染乳製品1mlに、1M Tris−HCl[pH 8.0]に溶解したプロテアーゼP「アマノ」3SD(天野エンザイム製)を38.3mg/mlの濃度で150μl添加し、3分間、45℃で反応後、2分間、10,000×gで遠心し、上清を除去した。これにアルカリ溶液(10% Chelex−100 resin in 50mM Tris−HCl[pH 11])を添加し、5分間、100℃で反応後、1M Tris−HCl(pH7.5)で中和した。これを1分間、20,000×gで遠心し、上清をDNA抽出液とした。
(3) Protease treatment method To 1 ml of pseudo-contaminated dairy product, 150 μl of protease P “Amano” 3SD (manufactured by Amano Enzyme) dissolved in 1M Tris-HCl [pH 8.0] was added at a concentration of 38.3 mg / ml, After reacting at 45 ° C. for 3 minutes, the supernatant was removed by centrifugation at 10,000 × g for 2 minutes. To this was added an alkaline solution (10% Chelex-100 resin in 50 mM Tris-HCl [pH 11]), and the mixture was reacted at 100 ° C. for 5 minutes, and then neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 7.5). This was centrifuged at 20,000 × g for 1 minute, and the supernatant was used as a DNA extract.

ベンジルクロライド法でDNAを抽出したところ抽出に90分かかり、検出感度は1.9×10cell/mlであった。また、アルカリ直接添加法でDNAを抽出したところ抽出は15分であったものの、検出感度は5.3×10cell/mlであった。一方、プロテアーゼ処理法でDNAを抽出したところ抽出は15分であり、検出感度は1.0×10cell/mlであった。この結果より、抽出時間と検出感度から総合的に判定するとDNAの抽出法としてはプロテアーゼ処理法が優れていることが分かった。When DNA was extracted by the benzyl chloride method, extraction took 90 minutes, and the detection sensitivity was 1.9 × 10 2 cells / ml. Further, when DNA was extracted by the alkali direct addition method, the extraction was 15 minutes, but the detection sensitivity was 5.3 × 10 6 cells / ml. On the other hand, when DNA was extracted by the protease treatment method, the extraction was 15 minutes, and the detection sensitivity was 1.0 × 10 3 cells / ml. From these results, it was found that the protease treatment method is superior as a DNA extraction method when comprehensively determined from the extraction time and detection sensitivity.

実 施 例 8
ループプライマーによる検出時間短縮の検討
実施例1と同様の方法で抽出したフィロバシディエラ・ネオフォルマンスのDNA10ngを鋳型とし、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスに特異的なFneoプライマーセットを用いて実施例1と同様の方法でLAMP反応を行った。
また、Fneoプライマーセットに含まれる5種のプライマーのうち、Fneo-LB(ループプライマー)のみを除いたプライマーセットを用いて、フィロバシディエラ・ネオフォルマンスのDNA10ngを鋳型とし同様にLAMP反応を行った。
Loopampリアルタイム濁度測定装置(RT−160C:栄研化学製)により反応液の吸光度の微分値が閾値(0.008)を越えた時間(Tt)を測定した。なお反応は同一DNA希釈液について3連で実施した。
これらの結果を表10に示す。
Example 8
Examination of shortening of detection time by loop primer Using 10 ng of P. cerevisiae Neoformans DNA extracted by the same method as in Example 1 and using Fneo primer set specific for P. foliosidei neoformans A LAMP reaction was performed in the same manner as in Example 1.
In addition, among 5 types of primers contained in the Fneo primer set, a primer set excluding only Fneo-LB (loop primer) was used, and a LAMP reaction was similarly carried out using 10 ng of Filobasidia neoformans DNA as a template. went.
The time (Tt) when the differential value of the absorbance of the reaction solution exceeded the threshold (0.008) was measured with a Loopamp real-time turbidity measuring device (RT-160C: manufactured by Eiken Chemical). The reaction was performed in triplicate for the same DNA dilution.
These results are shown in Table 10.

Figure 0006298040
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ループプライマーを用いた方が検出時間が短縮されることが分かった。 It was found that the detection time was shortened by using the loop primer.

本発明によれば、迅速、簡便に病原性真菌を一括で検出することができるので、病原性真菌を原因とする疾患の診断、予防や、病原性真菌に汚染された飲食品による出荷停滞の抑制等に利用することができる。   According to the present invention, since pathogenic fungi can be detected quickly and easily at a time, diagnosis and prevention of diseases caused by pathogenic fungi and the delay in shipment due to food and drink contaminated with pathogenic fungi It can be used for suppression.

Claims (8)

以下の工程(1)〜(3)
(1)試料からDNAを抽出する工程
(2)1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上と、(1)で抽出したDNAを用いてLAMP反応を行う工程
(3)増幅の有無を確認する工程
を含む病原性真菌の一括検出方法であって
前記LAMPプライマーセットが、以下の(a)〜(g)
(a)カンジダ・アルビカンス用LAMPプライマーセット
配列番号8〜11に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号8、9、11、13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(b)カンジダ・グラブラータ用LAMPプライマーセット
配列番号14〜17に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(c)カンジダ・トロピカリス用LAMPプライマーセット
配列番号19〜22に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(d)カンジダ・パラプシローシス用LAMPプライマーセット
配列番号24〜27に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜34に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜39に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜44に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号46〜49に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(e)トリコスポロン・アサヒ用LAMPプライマーセット
配列番号51〜54に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(f)トリコスポロン・ムコイデス用LAMPプライマーセット
配列番号56〜59に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(g)フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用LAMPプライマーセット
配列番号61〜64に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものであることを特徴とする病原性真菌の一括検出方法
The following steps (1) to (3)
(1) Step of extracting DNA from sample (2) LAMP primer set for amplifying at least part of region containing ITS region or IGS region of pathogenic fungus of one species and two or more species, (1) A step of performing a LAMP reaction using the DNA extracted in (3) a method for collectively detecting pathogenic fungi comprising a step of confirming the presence or absence of amplification,
The LAMP primer set includes the following (a) to (g)
(A) LAMP primer set for Candida albicans
1 selected from the group consisting of a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 11 and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8, 9, 11, and 13. More than seeds
(B) LAMP primer set for Candida glabrata
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 14-17
(C) LAMP primer set for Candida tropicalis
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-22
(D) LAMP primer set for Candida parapsilosis
A primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-27, a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-26, 30, and the sequences described in SEQ ID NOs: 31-34 From the primer set consisting of the oligonucleotide shown by the base sequence, the primer set consisting of the oligonucleotide shown by the base sequence shown in SEQ ID NO: 32, 37-39, and the oligonucleotide shown by the base sequence shown in SEQ ID NO: 41-44 One or more selected from the group consisting of a primer set consisting of and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 46-49
(E) LAMP primer set for Trichosporon / Asahi
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 to 54
(F) LAMP primer set for Trichosporon mucoides
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 56-59
(G) LAMP primer set for Philobasidiella neoformans
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 to 64
A method for collectively detecting pathogenic fungi, which is selected from the group consisting of:
以下の工程(1)〜(3)
(1)試料からDNAを抽出する工程
(2)1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上と、(1)で抽出したDNAを用いてLAMP反応を行う工程
(3)増幅の有無を確認する工程
を含む病原性真菌の一括検出方法であって
前記LAMPプライマーセットが、以下の(a)’〜(g)’
(a)’カンジダ・アルビカンス用LAMPプライマーセット
配列番号8〜12に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号8、9、11〜13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(b)’カンジダ・グラブラータ用LAMPプライマーセット
配列番号14〜18に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(c)’カンジダ・トロピカリス用LAMPプライマーセット
配列番号19〜23に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(d)’カンジダ・パラプシローシス用LAMPプライマーセット
配列番号24〜29に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、28〜30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜36に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜40に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜45に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号46〜50に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(e)’トリコスポロン・アサヒ用LAMPプライマーセット
配列番号51〜55に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(f)’トリコスポロン・ムコイデス用LAMPプライマーセット
配列番号56〜60に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(g)’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用LAMPプライマーセット
配列番号61〜65に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものであることを特徴とする病原性真菌の一括検出方法
The following steps (1) to (3)
(1) Extracting DNA from a sample
(2) The LAMP primer set for amplifying at least part of the region containing the ITS region or IGS region of a pathogenic fungus of one species and two or more species, and the LAMP reaction using the DNA extracted in (1) Process to perform
(3) Step of confirming the presence or absence of amplification
A method for collectively detecting pathogenic fungi including
The LAMP primer set includes the following (a) ′ to (g) ′:
(A) 'LAMP primer set for Candida albicans
1 selected from the group consisting of a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8-12 and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8, 9, 11-13 More than seeds
(B) LAMP primer set for Candida glabrata
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 14-18
(C) 'LAMP primer set for Candida tropicalis
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 19 to 23
(D) 'LAMP primer set for Candida parapsilosis
Primer sets consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-29, primer sets consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-26 and 28-30, and SEQ ID NOs: 31-36 Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described, primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 37-40, oligos represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 41 to 45 One or more selected from the group consisting of a primer set consisting of nucleotides and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 46-50
(E) 'LAMP primer set for Trichosporon Asahi
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 to 55
(F) 'LAMP primer set for Trichosporon mucoides
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 56-60
(G) 'LAMP primer set for Philobasidiella neoformans
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 to 65
A method for collectively detecting pathogenic fungi, which is selected from the group consisting of:
試料からDNAを抽出する工程にプロテアーゼ処理を含むことを特徴とする請求項1または2記載の病原性真菌の一括検出方法。 The method for collectively detecting pathogenic fungi according to claim 1 or 2, wherein the step of extracting DNA from the sample includes protease treatment. 1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上含む病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットであって、
前記LAMPプライマーセットが、以下の(a)〜(g)
(a)カンジダ・アルビカンス用LAMPプライマーセット
配列番号8〜11に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号8、9、11、13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(b)カンジダ・グラブラータ用LAMPプライマーセット
配列番号14〜17に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(c)カンジダ・トロピカリス用LAMPプライマーセット
配列番号19〜22に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(d)カンジダ・パラプシローシス用LAMPプライマーセット
配列番号24〜27に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜34に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜39に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜44に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号46〜49に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(e)トリコスポロン・アサヒ用LAMPプライマーセット
配列番号51〜54に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(f)トリコスポロン・ムコイデス用LAMPプライマーセット
配列番号56〜59に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(g)フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用LAMPプライマーセット
配列番号61〜64に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものであることを特徴とする病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセット
A LAMP primer set for collective detection of pathogenic fungi comprising at least two LAMP primer sets for amplifying at least part of a region containing an ITS region or an IGS region of a pathogenic fungus of one bacterial species ,
The LAMP primer set includes the following (a) to (g)
(A) LAMP primer set for Candida albicans
1 selected from the group consisting of a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 to 11 and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8, 9, 11, and 13. More than seeds
(B) LAMP primer set for Candida glabrata
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 14-17
(C) LAMP primer set for Candida tropicalis
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 19-22
(D) LAMP primer set for Candida parapsilosis
A primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-27, a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-26, 30, and the sequences described in SEQ ID NOs: 31-34 From the primer set consisting of the oligonucleotide shown by the base sequence, the primer set consisting of the oligonucleotide shown by the base sequence shown in SEQ ID NO: 32, 37-39, and the oligonucleotide shown by the base sequence shown in SEQ ID NO: 41-44 One or more selected from the group consisting of a primer set consisting of and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 46-49
(E) LAMP primer set for Trichosporon / Asahi
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 to 54
(F) LAMP primer set for Trichosporon mucoides
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 56-59
(G) LAMP primer set for Philobasidiella neoformans
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 to 64
A LAMP primer set for batch detection of pathogenic fungi, wherein the LAMP primer set is selected from the group consisting of:
1菌種の病原性真菌のITS領域またはIGS領域を含む領域の少なくとも一部を増幅するLAMPプライマーセットを2菌種分以上含む病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットであって、
前記LAMPプライマーセットが、以下の(a)’〜(g)’
(a)’カンジダ・アルビカンス用LAMPプライマーセット
配列番号8〜12に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号8、9、11〜13に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(b)’カンジダ・グラブラータ用LAMPプライマーセット
配列番号14〜18に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(c)’カンジダ・トロピカリス用LAMPプライマーセット
配列番号19〜23に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(d)’カンジダ・パラプシローシス用LAMPプライマーセット
配列番号24〜29に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号24〜26、28〜30に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号31〜36に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号32、37〜40に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、配列番号41〜45に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットおよび配列番号46〜50に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットからなる群から選ばれる1種以上
(e)’トリコスポロン・アサヒ用LAMPプライマーセット
配列番号51〜55に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(f)’トリコスポロン・ムコイデス用LAMPプライマーセット
配列番号56〜60に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
(g)’フィロバシディエラ・ネオフォルマンス用LAMPプライマーセット
配列番号61〜65に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット
からなる群から選ばれるものであることを特徴とする病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセット
A LAMP primer set for collective detection of pathogenic fungi comprising at least two LAMP primer sets for amplifying at least part of a region containing an ITS region or an IGS region of a pathogenic fungus of one bacterial species,
The LAMP primer set includes the following (a) ′ to (g) ′:
(A) 'LAMP primer set for Candida albicans
1 selected from the group consisting of a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8-12 and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 8, 9, 11-13 More than seeds
(B) LAMP primer set for Candida glabrata
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 14-18
(C) 'LAMP primer set for Candida tropicalis
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 19 to 23
(D) 'LAMP primer set for Candida parapsilosis
Primer sets consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-29, primer sets consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 24-26 and 28-30, and SEQ ID NOs: 31-36 Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences described, primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 32 and 37-40, oligos represented by the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 41 to 45 One or more selected from the group consisting of a primer set consisting of nucleotides and a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 46-50
(E) 'LAMP primer set for Trichosporon Asahi
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 to 55
(F) 'LAMP primer set for Trichosporon mucoides
Primer set comprising oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 56-60
(G) 'LAMP primer set for Philobasidiella neoformans
Primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 to 65
A LAMP primer set for batch detection of pathogenic fungi, wherein the LAMP primer set is selected from the group consisting of:
請求項4または5記載の病原性真菌の一括検出用LAMPプライマーセットを含むことを特徴とする病原性真菌の一括検出キット。 A batch detection kit for pathogenic fungi comprising the LAMP primer set for batch detection of pathogenic fungi according to claim 4 or 5 . 更に、核酸合成酵素と、核酸合成の基質を含む請求項に記載の病原性真菌の一括検出キット。 The kit for detecting pathogenic fungi according to claim 6 , further comprising a nucleic acid synthase and a substrate for nucleic acid synthesis. 核酸合成酵素が鎖置換活性を有する鋳型依存性DNAポリメラーゼであり、核酸合成の基質がdNTPである請求項に記載の病原性真菌の一括検出キット。 The kit for detecting pathogenic fungi according to claim 7 , wherein the nucleic acid synthase is a template-dependent DNA polymerase having strand displacement activity, and the substrate for nucleic acid synthesis is dNTP.
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