JP6292655B2 - Nanoparticles containing chitosan and hyaluronan - Google Patents
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Description
本発明は、皮膚外用剤の原料として利用され得るナノ粒子、及びそのナノ粒子の製造方法に関するものである。 The present invention relates to nanoparticles that can be used as a raw material for an external preparation for skin, and a method for producing the nanoparticles.
皮膚外用剤の有効成分を角質細胞層内に送達するためには、従来以下のような点が問題とされてきた。
皮膚の角層細胞層は、外界からの異物の侵入を防ぐためにバリア機能を有しており、有効成分が角層細胞層内に到達しにくい。
特に、有効成分が高分子化合物である場合には、高分子化合物が低浸透性であるため角層細胞層内に浸透しにくく、有効成分が皮膚表面で凝集してしまう。
In order to deliver the active ingredient of the external preparation for skin into the stratum corneum layer, the following points have conventionally been problematic.
The stratum corneum cell layer of the skin has a barrier function in order to prevent foreign substances from entering from the outside, and the active ingredient hardly reaches the stratum corneum cell layer.
In particular, when the active ingredient is a polymer compound, the polymer compound has a low permeability, so that it does not easily penetrate into the stratum corneum cell layer, and the active ingredient aggregates on the skin surface.
このような状況において、有効成分を角層細胞層内に送達するためのキャリアとして、ナノ粒子の開発が進められてきた。
特許文献１には、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーを含む複合体の凍結乾燥体が記載されている。
Under such circumstances, the development of nanoparticles has been promoted as a carrier for delivering an active ingredient into the stratum corneum cell layer.
Patent Document 1 describes a lyophilized product of a complex containing a nucleic acid, an oligonucleic acid, or a derivative thereof; a cationic polymer or a cationic lipid or an assembly containing the same; and an anionic polymer.
特許文献２には、直径１μｍ未満の活性成分の投与用のナノ粒子を得る方法であって、ａ）ヒアルロナン塩の水溶液を調製し、ｂ）カチオン性ポリマーの水溶液を調製し、ｃ）ポリアニオン塩を前記ヒアルロナン塩溶液に加え、ｄ）前記ｂ）およびｃ）において得られた溶液を撹拌混合し、自然発生的にナノ粒子を得ることを含んでおり、前記ａ）、ｂ）またはｃ）において得られた溶液のうち１つに、あるいは前記ｄ）において得られたナノ粒子の懸濁液に、前記活性成分を溶解させ、ナノ粒子に吸着させる、方法が記載されている。 Patent Document 2 discloses a method for obtaining nanoparticles for administration of an active ingredient having a diameter of less than 1 μm, in which a) an aqueous solution of hyaluronan salt is prepared, b) an aqueous solution of a cationic polymer is prepared, and c) a polyanion salt. To the hyaluronan salt solution and d) stirring and mixing the solution obtained in b) and c) to obtain nanoparticles spontaneously, in a), b) or c) A method is described in which the active ingredient is dissolved in one of the obtained solutions or in the nanoparticle suspension obtained in d) and adsorbed on the nanoparticles.
特許文献３には、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、前記ナノ粒子が、ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、およびｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる共役物を含んでおり、前記料成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする系が記載されている。 US Pat. No. 6,057,049 is a system comprising nanoparticles for releasing biologically active molecules, the nanoparticles comprising a) at least 50% by weight chitosan or chitosan derivative, and b) 50. Containing a conjugate comprising less than% by weight of polyethylene glycol (PEG) or a PEG derivative, wherein the ingredients a) and b) are covalently bonded via a chitosan amino group, and the nanoparticles are A system is described which is characterized by being crosslinked by a crosslinking agent.
特許文献４には、平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子がａ）ヒアルロナンまたはその塩；およびｂ）キトサンまたはその誘導体、を含む生物活性分子の放出のための系であって、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満であることを特徴とする系が記載されている。また、生物活性分子として核酸等を含む系、網状化剤としてトリポリリン酸塩を含む系が記載されている。 US Pat. No. 6,053,836 includes a system for the release of bioactive molecules comprising nanoparticles having an average size of less than 1 micrometer, wherein the nanoparticles comprise a) hyaluronan or a salt thereof; and b) chitosan or a derivative thereof. Describes a system characterized in that the molecular weight of chitosan or its derivatives is less than 90 kDa. In addition, a system containing nucleic acid or the like as a biologically active molecule and a system containing tripolyphosphate as a reticulating agent are described.
ところで、製造したナノ粒子を化粧水の成分などとして配合する際には、溶液中での安定性が問題となる。
特に、従来のナノ粒子は、溶液中でナノ粒子同士の凝集が起こり、粒子径が増大するという問題があった。
そこで、本発明は、キトサン及びヒアルロナンを含む、溶液中での安定性に優れた複合粒子を提供することを課題とする。特にキトサン及びヒアルロナンからなる二元複合粒子よりも溶液中での安定性に優れた複合粒子を提供することを課題とする。
By the way, when the manufactured nanoparticles are blended as a component of a lotion, stability in a solution becomes a problem.
In particular, the conventional nanoparticles have a problem that the nanoparticles aggregate in a solution and the particle size increases.
Then, this invention makes it a subject to provide the composite particle excellent in stability in a solution containing chitosan and hyaluronan. In particular, it is an object to provide composite particles that are more stable in solution than binary composite particles composed of chitosan and hyaluronan.
本発明者らは、キトサン及びヒアルロナンを含む複合粒子の溶液中での安定性を高める技術を求めて鋭意研究努力を重ねた結果、キトサン及びヒアルロナンに、キトサンに対する親和性がヒアルロナンに比して高いアニオン性ポリマーを組み合わせることにより、複合粒子の安定性が顕著に高まることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
As a result of diligent research efforts seeking a technique for enhancing the stability of composite particles containing chitosan and hyaluronan in solution, the present inventors have a higher affinity for chitosan and hyaluronan compared to hyaluronan. It was found that the stability of the composite particles was remarkably increased by combining an anionic polymer, and the present invention was completed.
That is, the present invention is as follows.
前記課題を解決するための本発明は、ヒアルロナン、キトサン、及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む複合粒子であって、前記アニオン性ポリマーは、キトサンに対する親和性がヒアルロナンより高いことを特徴とする。
キトサンに対する親和性が、ヒアルロナンに比して高いアニオン性ポリマーを、組み合わせることにより、複合粒子の溶液中での保存安定性が顕著に高まる。特に、ヒアルロナンとキトサンの二元系複合粒子は、低濃度、低温で保存した場合には、凝集を起こしやすいという問題があったが、本発明の三元系複合粒子は、このような条件でも問題となるような粒子径の増大をほとんど起こさない。すなわち、温度や濃度にかかわらず安定性が高いものである。
The present invention for solving the above-mentioned problems is a composite particle containing hyaluronan, chitosan, and an anionic polymer other than hyaluronan, wherein the anionic polymer has a higher affinity for chitosan than that of hyaluronan.
By combining an anionic polymer having an affinity for chitosan higher than that of hyaluronan, the storage stability of the composite particles in a solution is significantly increased. In particular, the binary composite particles of hyaluronan and chitosan are prone to agglomeration when stored at a low concentration and a low temperature. However, the ternary composite particles of the present invention are not susceptible to such conditions. There is almost no increase in particle size that causes problems. That is, it has high stability regardless of temperature and concentration.
前記アニオン性ポリマーとしては、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマー等を用いることが可能である。 As the anionic polymer, a sulfated polymer, a highly carboxyl group-containing polymer, or the like can be used.
例えば、前記硫酸化ポリマーは、硫酸化多糖である。本発明の複合粒子を皮膚外用剤、化粧料の成分として用いる場合には、その安全性から硫酸化多糖が好ましく用いられる。 For example, the sulfated polymer is a sulfated polysaccharide. When the composite particles of the present invention are used as an external preparation for skin and a component of cosmetics, sulfated polysaccharides are preferably used because of their safety.
前記硫酸化多糖としては、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリン及びカラギナンなどが挙げられる。 Examples of the sulfated polysaccharide include chondroitin sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, fucoidan, keratan sulfate, heparin, and carrageenan.
例えば、前記カルボキシル基高含有ポリマーは、カルボキシル基高含有多糖である。 For example, the high carboxyl group-containing polymer is a high carboxyl group-containing polysaccharide.
前記カルボキシル基高含有多糖としては、アルギン酸、ペクチンなどが挙げられる。 Examples of the high carboxyl group-containing polysaccharide include alginic acid and pectin.
本発明の好ましい形態では、ヒアルロナンを４０〜８０質量％、キトサンを１５〜４５質量％、前記アニオン性ポリマーを１〜３０質量％含む。
各成分を上記範囲で含むことにより、小さな粒子径の複合粒子を作製でき、しかも安定性も実現することが容易になる。
In a preferred embodiment of the present invention, hyaluronan is contained in an amount of 40 to 80% by mass, chitosan is contained in an amount of 15 to 45% by mass, and the anionic polymer is contained in an amount of 1 to 30% by mass.
By including each component in the above range, composite particles having a small particle diameter can be produced, and stability can be easily realized.
本発明はまた、ヒアルロナン、キトサン、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法である。
本発明の製造方法によれば、小さな粒子径であり、かつ溶液中での安定性の高い複合粒子を効率よく作製することができる。
The present invention is also a method for producing composite particles, wherein hyaluronan, chitosan, and the anionic polymer are combined in the presence of a buffer solution.
According to the production method of the present invention, composite particles having a small particle diameter and high stability in a solution can be efficiently produced.
本発明の好ましい形態では、本発明の製造方法は、ヒアルロナンを緩衝液中に溶解する工程と、キトサンを緩衝液中に溶解する工程と、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液中に溶解する工程と、ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程と、を含む。
このような方法によれば、凝集を防ぎながら粒子径の複合粒子を製造することが容易になる。
In a preferred embodiment of the present invention, the production method of the present invention comprises a step of dissolving hyaluronan in a buffer solution, a step of dissolving chitosan in a buffer solution, and a step of dissolving the anionic polymer in a buffer solution. Mixing and stirring the hyaluronan solution, the chitosan solution, and the anionic polymer solution.
According to such a method, it becomes easy to produce composite particles having a particle size while preventing aggregation.
本発明の好ましい形態では、本発明の製造方法は、前記ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程において、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．１〜１：５、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．０１〜１：２、となるように各成分の混合比を調整する。
このように電荷比に基づいた混合比で混合され、作製された複合粒子は、粒子径が小さくなり、また、保存安定性に優れたものとなる。
In a preferred embodiment of the present invention, in the production method of the present invention, in the step of mixing and stirring the hyaluronan solution, the chitosan solution, and the anionic polymer solution, the charge ratio of the amino group of chitosan and the carboxyl group of hyaluronan in the mixed solution is 1: 0.1 to 1: 5, and the charge ratio of the carboxyl group and sulfate group of the anionic polymer other than the amino group of chitosan and the hyaluronan in the mixed solution is 1: 0.01 to 1: 2. The mixing ratio of each component is adjusted so that
The composite particles produced by mixing at a mixing ratio based on the charge ratio in this way have a small particle size and excellent storage stability.
本発明の好ましい形態では、前記緩衝液はクエン酸緩衝液である。
緩衝液としてクエン酸緩衝液を用いることにより、ナノサイズ（たとえば、約１００ｎｍ以下）の複合粒子を効率よく製造することが容易になる。特に、比較的大きな分子量（たとえば、６００ｋＤａ以上）のヒアルロナンを用いた場合においても、ナノサイズの複合粒子を製造することができる。
In a preferred form of the invention, the buffer is a citrate buffer.
By using a citrate buffer as the buffer, it becomes easy to efficiently produce nano-sized (for example, about 100 nm or less) composite particles. In particular, even when hyaluronan having a relatively large molecular weight (for example, 600 kDa or more) is used, nano-sized composite particles can be produced.
本発明は、上記製造方法により製造された複合粒子の保存方法であって、前記複合粒子を、緩衝液中で保存することを特徴とする。また、この場合の緩衝液としては、クエン酸緩衝液が好ましい。
本発明の複合粒子を、緩衝液中で保存することにより、粒子径の増大を引き起こさずに安定的に保存することができる。
The present invention is a method for preserving composite particles produced by the above production method, wherein the composite particles are preserved in a buffer solution. In this case, a citrate buffer is preferable as the buffer.
By storing the composite particles of the present invention in a buffer solution, the composite particles can be stored stably without causing an increase in particle diameter.
本発明の複合粒子は、従来のヒアルロナンとキトサンの二元系複合粒子に比して、溶液中での安定性にきわめて優れる。 The composite particles of the present invention are extremely excellent in stability in solution as compared with conventional binary composite particles of hyaluronan and chitosan.
本発明は、ヒアルロナン、キトサン、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの複合粒子に関する。
まず、複合粒子を形成する各成分について説明する。
The present invention relates to composite particles of anionic polymers other than hyaluronan, chitosan, and hyaluronan.
First, each component forming the composite particle will be described.
＜１＞ヒアルロナン
本発明で用いられるヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの二糖を繰り返し単位とする多糖である。
<1> Hyaluronan Hyaluronan used in the present invention is a polysaccharide having a disaccharide of D-glucuronic acid and DN-acetylglucosamine as repeating units.
本発明で用いられるヒアルロナンの分子量は制限されないが、好ましくは１００〜２０００ｋＤａ、より好ましくは３００〜１５００ｋＤａ、さらに好ましくは４００〜１３００ｋＤａのものを用いることができる。 The molecular weight of hyaluronan used in the present invention is not limited, but preferably 100 to 2000 kDa, more preferably 300 to 1500 kDa, and still more preferably 400 to 1300 kDa.
ヒアルロナンは、ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸塩のいずれであっても良い。
ヒアルロン酸塩を形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
ヒアルロナンは、市販品を用いることが可能である。
Hyaluronan may be either hyaluronic acid or hyaluronate.
Examples of the salt forming hyaluronate include sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, basic amino acid salt and the like.
As hyaluronan, a commercially available product can be used.
＜２＞キトサン
キトサンは、キチンの脱アセチル化により得られ、グルコサミンを繰り返し単位とする多糖である。キトサンの脱アセチル化度は、例えば５０〜９８％程度である。
本発明で用いられるキトサンの分子量は制限されないが、例えば１〜５００ｋＤａ、好ましくは１０〜３００ｋＤａ、さらに好ましくは１９〜１１０ｋＤａのものを用いることができる。また、小さな粒子径の複合粒子を作製する観点からは、キトサンの分子量は好ましくは２０〜２００ｋＤａ、より好ましくは５０〜１５０ｋＤａ、さらに好ましくは、８０〜１２０ｋＤａのものが挙げられる。
<2> Chitosan Chitosan is a polysaccharide obtained by deacetylation of chitin and having glucosamine as a repeating unit. The degree of deacetylation of chitosan is, for example, about 50 to 98%.
Although the molecular weight of chitosan used by this invention is not restrict | limited, For example, 1-500 kDa, Preferably it is 10-300 kDa, More preferably, the thing of 19-110 kDa can be used. From the viewpoint of producing composite particles having a small particle size, the molecular weight of chitosan is preferably 20 to 200 kDa, more preferably 50 to 150 kDa, and still more preferably 80 to 120 kDa.
キトサンは、キトサンの誘導体であっても良い。たとえば、アセチル化、アルキル化、スルホン化、チオール化誘導体が挙げられる。また、塩酸、酢酸、クエン酸、硝酸、乳酸等の塩も使用できる。
キトサンは、市販品を用いることが可能である。
Chitosan may be a derivative of chitosan. Examples include acetylated, alkylated, sulfonated and thiolated derivatives. Further, salts of hydrochloric acid, acetic acid, citric acid, nitric acid, lactic acid, etc. can be used.
A commercially available product can be used as chitosan.
＜３＞ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマー
本発明で用いられるヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーは、キトサンに対する親和性が、ヒアルロナンのキトサンに対する親和性より高いものである。
複合粒子における第三の成分としてキトサンに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーを用いることにより、形成される複合粒子を強固なものとすることができ、溶液中での粒子同士の凝集を防ぐことが可能となる。
<3> Anionic polymer other than hyaluronan The anionic polymer other than hyaluronan used in the present invention has higher affinity for chitosan than that of hyaluronan for chitosan.
By using an anionic polymer having an affinity for chitosan higher than that of hyaluronan as the third component in the composite particles, the formed composite particles can be strengthened and prevent aggregation of particles in the solution. It becomes possible.
例えば、前記アニオン性ポリマーは、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマーである。
硫酸化ポリマーとしては、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリン、カラギナンなどの硫酸化多糖や、硫酸化ポリビニルアルコールなどの強酸性ポリマーが挙げられる。
カラギナンとしてはκ−カラギナン及びι−カラギナンが好ましく例示でき、より好ましくは硫酸化度が高いι−カラギナンが挙げられる。
カルボキシル基高含有ポリマーは、ヒアルロナンよりもキトサンに対して親和性が高いものとなるように多量のカルボキシル基を有しているポリマーと定義される。
カルボキシル基高含有ポリマーとしては、ポリアルギン酸、ペクチンなどのカルボキシル基含有多糖、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸などが挙げられる。
本発明の複合粒子を皮膚外用剤、化粧料などに用いる場合には、その安全性から多糖を用いることが好ましく、硫酸化多糖、カルボキシル基含有多糖を用いることが特に好ましい。
前記アニオン性ポリマーの分子量は、好ましくは３〜６０ｋＤａ、さらに好ましくは１０〜５０ｋＤａ、より好ましくは２０〜４０ｋＤａである。
また、前記アニオン性ポリマーとしては、好ましくは３〜３０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０〜２０００ｋＤａ、より好ましくは２０〜１８００ｋＤａのものを用いることもできる。
より具体的には、以下のものを用いることができる。
コンドロイチン硫酸・・・５〜５０ｋＤａ
ヘパリン・・・２〜３０ｋＤａ
カラギナン・・・１０００〜２０００ｋＤａ
ポリアルギン酸・・・４０〜１００ｋＤａ
ペクチン・・・３０〜５００ｋＤａ
For example, the anionic polymer is a sulfated polymer or a polymer having a high carboxyl group content.
Examples of the sulfated polymer include sulfated polysaccharides such as chondroitin sulfate, dextran sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, fucoidan, keratan sulfate, heparin and carrageenan, and strongly acidic polymers such as sulfated polyvinyl alcohol.
Carrageenans are preferably exemplified by κ-carrageenan and ι-carrageenan, more preferably ι-carrageenan having a high degree of sulfation.
A polymer having a high carboxyl group is defined as a polymer having a large amount of carboxyl groups so as to have a higher affinity for chitosan than hyaluronan.
Examples of the polymer having a high carboxyl group include carboxyl group-containing polysaccharides such as polyalginic acid and pectin, polyacrylic acid, and polyaspartic acid.
When the composite particles of the present invention are used for external preparations for skin, cosmetics, etc., it is preferable to use polysaccharides, and it is particularly preferable to use sulfated polysaccharides and carboxyl group-containing polysaccharides.
The molecular weight of the anionic polymer is preferably 3 to 60 kDa, more preferably 10 to 50 kDa, and more preferably 20 to 40 kDa.
Moreover, as said anionic polymer, Preferably it is 3-3000 kDa, More preferably, it is 10-2000 kDa, More preferably, the thing of 20-1800 kDa can also be used.
More specifically, the following can be used.
Chondroitin sulfate: 5 to 50 kDa
Heparin 2-30 kDa
Carrageenan ... 1000-2000 kDa
Polyalginic acid: 40-100 kDa
Pectin ... 30-500 kDa
次に、本発明の複合粒子について説明する。
＜４＞複合粒子
本発明の複合粒子は、上述したヒアルロナン、キトサン、及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーであって、キトサンに対する親和性がヒアルロナンよりも高いものの３成分を含む。
複合粒子における各成分の割合は、以下を基準とすることができる。
ヒアルロナン：好ましくは４０〜８０質量％、さらに好ましくは５０〜７５質量％、より好ましくは６０〜７０質量％
キトサン：好ましくは１５〜４５質量％、さらに好ましくは２０〜４０質量％、より好ましくは２５〜３５質量％
ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマー：好ましくは１〜３０質量％、さらに好ましくは２〜２０質量％、より好ましくは３〜１０質量％
Next, the composite particle of the present invention will be described.
<4> Composite Particle The composite particle of the present invention contains three components which are anionic polymers other than the above-described hyaluronan, chitosan, and hyaluronan, and have higher affinity for chitosan than that of hyaluronan.
The ratio of each component in the composite particles can be based on the following.
Hyaluronan: preferably 40-80% by mass, more preferably 50-75% by mass, more preferably 60-70% by mass
Chitosan: preferably 15 to 45% by mass, more preferably 20 to 40% by mass, more preferably 25 to 35% by mass
Anionic polymer other than hyaluronan: preferably 1 to 30% by mass, more preferably 2 to 20% by mass, more preferably 3 to 10% by mass
また、ヒアルロナンとキトサンの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．３〜５、より好ましくは０．５〜１となるような比率とすることも好ましい。
また、キトサンとヒアルロナンの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．１〜１０、さらに好ましくは０．１〜０．３もしくは０．７〜２である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１．５である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和が、０．００５以上、好ましくは０．０１〜１５、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１となるような比率とすることも好ましい。
Moreover, as a ratio of hyaluronan and chitosan, the number of carboxyl groups derived from hyaluronic acid is 0.1 or more, preferably 0.3 to 5, more preferably 0.5, with respect to the number 1 of amino groups derived from chitosan. It is also preferable to set the ratio to be ˜1.
The weight ratio of chitosan and hyaluronan is preferably 0.1 to 10, more preferably 0.1 to 0.3, or 0.7 to 2, based on chitosan 1.
Further, the weight ratio of the anionic polymer other than chitosan and hyaluronan is preferably 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 1.5 with respect to chitosan 1.
The ratio of the anionic polymer other than chitosan and hyaluronan is such that the sum of the carboxyl group and sulfate group of the anionic polymer other than hyaluron is 0.005 or more, preferably 0 with respect to the number of amino groups derived from chitosan. It is also preferable to set the ratio to be 0.01 to 15, more preferably 0.05 to 5, and still more preferably 0.1 to 1.
＜５＞複合粒子の製造方法
上述した複合粒子は、例えば、各成分を溶液中で複合することにより得ることができる。
この際、溶液として、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液としては、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＢＳなどを用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることで、小さな粒子径の複合粒子を効率よく製造できる。特に、クエン酸緩衝液を用いることで、６００ｋＤａ以上の大きい分子量のヒアルロナンを用いても、１００ｎｍ以下のナノ粒子を形成することが可能となる。
クエン酸緩衝液のｐＨは、好ましくは７．０以下、さらに好ましくは６．８以下、より好ましくは６．５以下である。また、ｐＨの下限値は特に制限されないが、例えば皮膚外用剤などに用いる場合には、皮膚への刺激性の観点などから、ｐＨ５．５程度を下限とすることが好ましい。
<5> Method for Producing Composite Particles The composite particles described above can be obtained, for example, by compounding each component in a solution.
At this time, a buffer solution is preferably used as the solution.
As the buffer solution, a citrate buffer solution, MOPS, PBS or the like can be used. By using the citrate buffer solution, composite particles having a small particle diameter can be efficiently produced. In particular, by using a citrate buffer, it is possible to form nanoparticles having a size of 100 nm or less even when a hyaluronan having a large molecular weight of 600 kDa or more is used.
The pH of the citrate buffer is preferably 7.0 or less, more preferably 6.8 or less, and more preferably 6.5 or less. The lower limit of the pH is not particularly limited, but when used for, for example, an external preparation for skin, it is preferable to set the lower limit to about pH 5.5 from the viewpoint of irritation to the skin.
また、クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度は、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜５ｍＭ、特に好ましくは１〜２ｍＭである。 Moreover, the citrate concentration in the citrate buffer is preferably 0.1 to 10 mM, more preferably 0.5 to 5 mM, and particularly preferably 1 to 2 mM.
以下、具体的な製造方法について、説明する。
（１）ヒアルロナン溶液の調製
溶媒として、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、ヒアルロナン溶液を調製する。
ヒアルロナン溶液におけるヒアルロナンの濃度は、２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でキトサン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
Hereinafter, a specific manufacturing method will be described.
(1) Preparation of hyaluronan solution A hyaluronan solution is prepared using a citrate buffer (pH 6.5) as a solvent.
The concentration of hyaluronan in the hyaluronan solution is 200 to 5000 μg / mL, more preferably 500 to 3000 μg / mL, and more preferably 1000 to 2000 μg / mL. By adjusting to such a concentration, unnecessary aggregation of particles can be avoided when mixed with a chitosan solution in a later step.
（２）キトサン溶液の調製
溶媒として、上述したクエン酸緩衝液を用い、キトサン溶液を調製する。
キトサン溶液におけるキトサンの濃度は、好ましくは２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。
(2) Preparation of chitosan solution A chitosan solution is prepared using the above-mentioned citrate buffer as a solvent.
The concentration of chitosan in the chitosan solution is preferably 200 to 5000 μg / mL, more preferably 500 to 3000 μg / mL, and more preferably 1000 to 2000 μg / mL. By adjusting to such a concentration, unnecessary aggregation of particles can be avoided when mixed with a hyaluronan solution in a later step.
（３）アニオン性ポリマー溶液
ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの溶液（以下、アニオン性ポリマー溶液）におけるアニオン性ポリマーの濃度は、２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。
(3) Anionic polymer solution The concentration of the anionic polymer in the solution of the anionic polymer other than hyaluronan (hereinafter referred to as anionic polymer solution) is 200 to 5000 μg / mL, more preferably 500 to 3000 μg / mL, and more preferably 1000. ~ 2000 μg / mL.
（４）各溶液の混合
続いて、調製したヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合する。
各溶液の混合割合は、例えば以下を基準として決定することが好ましい。
キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．２〜５、より好ましくは０．５〜１である。
また、ヒアルロナンとキトサンの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．３〜５、より好ましくは０．５〜１となるような比率とすることも好ましい。
また、キトサンとヒアルロナンの重量比として、キトサン１に対して、ヒアルロナンが、好ましくは０．１〜１０、さらに好ましくは０．１〜０．３もしくは０．７〜２である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１．５である。
また、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．０５〜１：５、より好ましくは１：０．１〜１：２、さらに好ましくは１：０．２〜１：１、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．０１〜１：５、より好ましくは１：０．０５〜１：２、さらに好ましくは１：０．１〜１：１、となるように各成分を混合するようにしてもよい。かかる混合比は、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして、コンドロイチン硫酸（分子量は問わない）、ヘパリン、ペクチン、κ−カラギナン、ι−カラギナンを用いる場合に特に好ましい。
またヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして、アルギン酸を用いる場合には、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．０５、より好ましくは１：０．１〜１：２、さらに好ましくは１：０．２〜１：１、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とアルギン酸のカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．００５〜１：１、好ましくは１：０．０１〜１：０．５、さらに好ましくは１：０．０５〜１：０．２、となるように調整する。
混合後の溶液に対するヒアルロナンの濃度が、好ましくは１〜２０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するキトサンの濃度が、好ましくは１〜１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するアニオン性ポリマーの濃度が、好ましくは０．２〜５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬである。
(4) Mixing of each solution Subsequently, the prepared hyaluronan solution, chitosan solution, and anionic polymer solution are mixed.
The mixing ratio of each solution is preferably determined based on, for example, the following.
The number of carboxyl groups derived from hyaluronic acid is 0.1 or more, preferably 0.2 to 5, more preferably 0.5 to 1, with respect to the number 1 of chitosan-derived amino groups.
Moreover, as a ratio of hyaluronan and chitosan, the number of carboxyl groups derived from hyaluronic acid is 0.1 or more, preferably 0.3 to 5, more preferably 0.5, with respect to the number 1 of amino groups derived from chitosan. It is also preferable to set the ratio to be ˜1.
Moreover, as a weight ratio of chitosan and hyaluronan, hyaluronan is preferably 0.1 to 10, more preferably 0.1 to 0.3 or 0.7 to 2 with respect to chitosan 1.
Further, the weight ratio of the anionic polymer other than chitosan and hyaluronan is preferably 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 1.5 with respect to chitosan 1.
The charge ratio of the amino group of chitosan and the carboxyl group of hyaluronan in the mixed solution is 1: 0.05 to 1: 5, more preferably 1: 0.1 to 1: 2, more preferably 1: 0.2. To 1: 1, and the charge ratio of the carboxyl group and sulfate group of the anionic polymer other than the amino group and hyaluronan of chitosan in the mixed solution is 1: 0.01 to 1: 5, more preferably 1: You may make it mix each component so that it may be set to 0.05-1: 2, More preferably, it is 1: 0.1-1: 1. Such a mixing ratio is particularly preferable when chondroitin sulfate (regardless of molecular weight), heparin, pectin, κ-carrageenan, or ι-carrageenan is used as an anionic polymer other than hyaluronan.
When alginic acid is used as the anionic polymer other than hyaluronan, the charge ratio of the amino group of chitosan and the carboxyl group of hyaluronan in the mixed solution is 1: 0.05, more preferably 1: 0.1 to 1: 2, more preferably 1: 0.2 to 1: 1, and the charge ratio of the amino group of chitosan and the carboxyl group and sulfate group of alginic acid in the mixture is 1: 0.005 to 1: 1, It is preferably adjusted to be 1: 0.01 to 1: 0.5, more preferably 1: 0.05 to 1: 0.2.
The concentration of hyaluronan in the mixed solution is preferably 1 to 2000 μg / mL, more preferably 10 to 1000 μg / mL.
The density | concentration of chitosan with respect to the solution after mixing becomes like this. Preferably it is 1-1000 microgram / mL, More preferably, it is 10-500 microgram / mL.
The concentration of the anionic polymer with respect to the solution after mixing is preferably 0.2 to 50 μg / mL, more preferably 0.5 to 20 μg / mL.
混合の方法としては、各溶液を一度に混合する方法、一つの溶液に、他の溶液を滴下する方法などが挙げられる。いずれも、溶液を撹拌しながら混合を行うことが、凝集を回避する観点から好ましい。
また、一つの溶液に、他の溶液を滴下する方法においては、ヒアルロナン溶液をキトサン溶液に滴下する方法が、より小さな粒径の粒子を作製する観点から好ましい。
また、アニオン性ポリマー溶液を、予めヒアルロナン溶液と混合しておいて、ここにキトサン溶液を滴下する方法が好ましく挙げられる。
Examples of the mixing method include a method of mixing each solution at a time, a method of dropping another solution into one solution, and the like. In any case, it is preferable to perform mixing while stirring the solution from the viewpoint of avoiding aggregation.
Moreover, in the method of dripping another solution to one solution, the method of dripping a hyaluronan solution to a chitosan solution is preferable from a viewpoint of producing particles having a smaller particle size.
In addition, a method in which an anionic polymer solution is mixed with a hyaluronan solution in advance and the chitosan solution is added dropwise thereto is preferable.
＜試験例１＞三元複合粒子の作製
複合粒子の作製には、以下の成分を用いた。
ヒアルロナン（ＨＡ、発酵法由来、ＭＲＣポリサッカライド社）：４８０ｋＤａ、ヒアルロナン濃度３４．３μｇ／ｍＬ（混合前の調製時濃度は１０３μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
キトサン（焼津水産工業）：３４．３ｋＤａ、キトサン濃度１６．７μｇ／ｍＬ（調製時濃度は５０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
コンドロイチン硫酸（ＣＳ，硫酸化度：１．２１％、生化学工業）：２２ｋＤａ、２．０μｇ／ｍＬ（調製時濃度は６．０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）：クエン酸濃度１ｍＭ
<Test Example 1> Preparation of ternary composite particles The following components were used for preparation of composite particles.
Hyaluronan (HA, derived from fermentation method, MRC polysaccharides): 480 kDa, hyaluronan concentration 34.3 μg / mL (the concentration at the time of preparation before mixing is 103 μg / mL, the concentration of the solution for storage is 1 mg / mL)
Chitosan (Yaizu Suisan Kogyo): 34.3 kDa, chitosan concentration 16.7 μg / mL (preparation concentration is 50 μg / mL, preparation concentration of storage solution is 1 mg / mL)
Chondroitin sulfate (CS, degree of sulfation: 1.21%, Seikagaku Corporation): 22 kDa, 2.0 μg / mL (preparation concentration is 6.0 μg / mL, preparation concentration for storage solution is 1 mg / mL)
Citrate buffer (pH 6.5): citrate concentration 1 mM
上に示す割合で、ヒアルロナンとキトサンとの二元複合粒子と、ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子を作製した。
二元複合粒子については、クエン酸緩衝液を溶媒としてヒアルロン酸ナトリウム溶液とキトサン溶液を調製し、キトサン溶液を撹拌しながら、キトサン溶液にヒアルロン酸ナトリウム溶液を滴下することにより複合粒子を作製した。
また、三元複合粒子については、クエン酸緩衝液を溶媒としてヒアルロン酸ナトリウム溶液、キトサン溶液、コンドロイチン硫酸溶液を調製し、コンドロイチン硫酸溶液をヒアルロン酸ナトリウム溶液に加え、混合した後に、混合液にキトサン溶液を滴下して撹拌し、作製した。
すなわち、１ｍｇ／ｍＬ ＨＡクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬキトサンクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬ ＣＳクエン酸溶液にクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を所定量加え希釈し、室温で１５分間静置した。希釈したＨＡ溶液とＣＳ溶液を十分混合した後、希釈したキトサン溶液を加えて室温で１５分間静置することで、ＨＡ/キトサン/ＣＳ三元複合体ナノ粒子を作製した。混合比は、キトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（Ｃ）、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。
二元複合粒子、三元複合粒子を、製造に用いたクエン酸緩衝液中、低温条件（４℃）で保存した。
表１に、複合粒子の粒子径、複合粒子の表面電荷（ゼータ電位）及び多分散指数を示す。
複合粒子の平均粒子径及び多分散指数は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−Ｚ ＺＥＮ３６００、 Ｍａｌｖｅｒｎ社（動的光散乱法）を用いて測定した。
複合粒子の表面電荷は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ ＺＥＮ３６００、 Ｍａｌｖｅｒｎ社（レーザードップラー法）を用いて測定した。
For the binary composite particles, a sodium hyaluronate solution and a chitosan solution were prepared using a citrate buffer as a solvent, and the sodium hyaluronate solution was dropped into the chitosan solution while stirring the chitosan solution to prepare composite particles.
For ternary composite particles, prepare sodium hyaluronate solution, chitosan solution, chondroitin sulfate solution using citrate buffer as solvent, add chondroitin sulfate solution to sodium hyaluronate solution, mix, and then add chitosan to the mixture. The solution was added dropwise and stirred to prepare.
That is, a predetermined amount of a citrate buffer (pH 6.5) was added to a 1 mg / mL HA citric acid solution, a 1 mg / mL chitosan citrate solution, and a 1 mg / mL CS citrate solution, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After fully mixing the diluted HA solution and CS solution, the diluted chitosan solution was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to prepare HA / chitosan / CS ternary composite nanoparticles. As for the mixing ratio, the charge ratio N: C: (−) of the amino group (N) of chitosan, the carboxyl group (C) of HA, the sum of the carboxyl group and sulfate group of chondroitin sulfate (−) is 1: 0.5: It was adjusted to be 0.5.
The binary composite particles and the ternary composite particles were stored in a citrate buffer solution used for production under low temperature conditions (4 ° C.).
Table 1 shows the particle diameter of the composite particles, the surface charge (zeta potential) of the composite particles, and the polydispersity index.
The average particle size and polydispersity index of the composite particles were measured using Zetasizer Nano-Z ZEN 3600, Malvern (dynamic light scattering method).
The surface charge of the composite particles was measured using Zetasizer Nano-ZS ZEN 3600, Malvern (Laser Doppler method).
ゼータ電位においてヒアルロナン単体は約−６３ｍＶ、キトサン単体は約３ｍＶである。表１に示すように、本実施例で作製した粒子の表面電荷は、比較例１の二元複合粒子では−３１．４ｍＶ、実施例１の三元複合粒子では−３４．５ｍＶであることから、単体との違いが見られた。すなわち、本試験例の処方によって二元複合粒子及び三元複合粒子が形成されていることが確認できた。
二元複合粒子と三元複合粒子を比較すると、平均粒子径はいずれも１００ｎｍ程度であったが、多分散指数が二元複合粒子は０．２５５であるのに対して、三元複合粒子は０．１６６であった。つまり三元複合粒子の方が二元複合粒子に比して均一な粒子径を持つ集合として得られることがわかった。
At zeta potential, hyaluronan alone is about −63 mV, and chitosan alone is about 3 mV. As shown in Table 1, the surface charge of the particles produced in this example is −31.4 mV for the binary composite particles of Comparative Example 1 and −34.5 mV for the ternary composite particles of Example 1. , The difference with the single body was seen. That is, it was confirmed that binary composite particles and ternary composite particles were formed according to the formulation of this test example.
Comparing binary composite particles and ternary composite particles, the average particle diameter was about 100 nm, but the polydispersity index was 0.255 for binary composite particles, whereas ternary composite particles were It was 0.166. In other words, it was found that the ternary composite particles can be obtained as an aggregate having a uniform particle size compared to the binary composite particles.
＜試験例２＞キトサンの分子量の検討
試験例１においては分子量３４．３ｋＤａのキトサンを用いてヒアルロナンとコンドロイチン硫酸との三元複合粒子が形成できることを示した。次に、キトサンの分子量を変更した場合にも三元複合粒子が形成されるのか否かについて検討を行った。
本試験例においては分子量１１０ｋＤａのキトサン（脱アセチル化度：６４．７％、焼津工業）と、試験例１で使用した分子量４８０ｋＤａのヒアルロナン及び分子量２２ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いて三元複合粒子の作製を行った（実施例２）。なお、本実施例における三元複合粒子の作製は、試験例１と同じ方法により行った。また、各成分の作製濃度は以下に記載する通りである。
ヒアルロナン：１７．２μｇ／ｍＬ（混合前の調製時濃度は１０３μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
キトサン：２４．７μｇ／ｍＬ（調製時濃度は５０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は１ｍｇ／ｍＬ）
コンドロイチン硫酸：２．１μｇ／ｍＬ（調製時濃度は６．０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は１ｍｇ／１ｍＬ）
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）：クエン酸濃度１ｍＭ
各成分の混合比は、キトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（Ｃ）、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。
<Test Example 2> Examination of molecular weight of chitosan In Test Example 1, it was shown that ternary composite particles of hyaluronan and chondroitin sulfate can be formed using chitosan having a molecular weight of 34.3 kDa. Next, it was examined whether ternary composite particles are formed even when the molecular weight of chitosan is changed.
In this test example, ternary composite particles were prepared using chitosan having a molecular weight of 110 kDa (deacetylation degree: 64.7%, Yaizu Kogyo), hyaluronan having a molecular weight of 480 kDa and chondroitin sulfate having a molecular weight of 22 kDa used in Test Example 1. (Example 2). The ternary composite particles in this example were produced by the same method as in Test Example 1. Moreover, the preparation concentrations of each component are as described below.
Hyaluronan: 17.2 μg / mL (preparation concentration before mixing is 103 μg / mL, preparation concentration of solution for storage is 1 mg / mL)
Chitosan: 24.7 μg / mL (preparation concentration is 50 μg / mL, preparation concentration of storage solution is 1 mg / mL)
Chondroitin sulfate: 2.1 μg / mL (preparation concentration is 6.0 μg / mL, preparation concentration for storage solution is 1 mg / 1 mL)
Citrate buffer (pH 6.5): citrate concentration 1 mM
The mixing ratio of each component was such that the charge ratio N: C: (−) of the amino group (N) of chitosan, the carboxyl group (C) of HA, and the sum of the carboxyl group and sulfate group (−) of chondroitin sulfate was 1: 0. .5: Adjusted to be 0.5.
作製した複合粒子の平均粒子径、多分散指数及び表面電荷は、試験例１と同様の機器を用いて測定した。
表２に本試験例で作製した実施例２に係る三元複合粒子と、試験例１で作製した実施例１に係る三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。
The average particle size, polydispersity index, and surface charge of the produced composite particles were measured using the same equipment as in Test Example 1.
In Table 2, the ternary composite particles according to Example 2 prepared in this test example and the average particle diameter of the ternary composite particles according to Example 1 prepared in Test Example 1, the ratio of particles of 100 nm or less in the number distribution, Polydispersity index (Pdi) and surface potential (zeta potential) are shown.
表２より、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子の作製にあっては、低分子量（３４．３ｋＤａ）のキトサンよりも、高分子量（１１０ｋＤａ）のキトサンを用いた方が、より小さい粒子径を持つ複合粒子を得られることが分かった。 From Table 2, in preparation of hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate ternary composite particles, a smaller particle diameter is obtained when chitosan having a high molecular weight (110 kDa) is used than chitosan having a low molecular weight (34.3 kDa). It was found that composite particles having
＜試験例３＞ヒアルロナンの分子量の検討
試験例１及び２においては分子量４８０ｋＤａのヒアルロナンを用いた場合に、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を作製することができることを示した。次に、分子量４８０ｋＤａ以外のヒアルロナンを用いた場合においても同様に三元複合粒子を作製することができるか否か検討を行った。
本試験例では、分子量９１０及び１３００ｋＤａのヒアルロナンを用いて三元複合粒子の作製を行った。本試験例における複合粒子の作製方法、各成分の作製濃度及び測定方法等は試験例２と同様である。なお、本試験例で使用した９１０ｋＤａと１３００ｋＤａのヒアルロナンも発酵法由来、ＭＲＣポリサッカライド社製のものである。
表３に各分子量のヒアルロナンを用いた場合における三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。
<Test Example 3> Examination of Molecular Weight of Hyaluronan In Test Examples 1 and 2, when hyaluronan having a molecular weight of 480 kDa was used, it was shown that hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate ternary composite particles can be produced. Next, it was examined whether ternary composite particles can be similarly produced when hyaluronan having a molecular weight other than 480 kDa is used.
In this test example, ternary composite particles were prepared using hyaluronan having a molecular weight of 910 and 1300 kDa. The preparation method of composite particles, the preparation concentration of each component, the measurement method, and the like in this test example are the same as those in Test example 2. The 910 kDa and 1300 kDa hyaluronan used in this test example are also derived from the fermentation method and manufactured by MRC Polysaccharide.
Table 3 shows the average particle diameter of the ternary composite particles, the ratio of particles of 100 nm or less in the number distribution, the polydispersity index (Pdi), and the surface potential (zeta potential) when hyaluronan of each molecular weight is used.
表３に示す通り、分子量４８０、９１０及び１３００ｋＤａのヒアルロナンのいずれを用いた場合であっても、４０ｎｍ前後の小さな複合粒子を形成できることが分かった。また、低分子量のヒアルロナンを用いた場合には、複合粒子の粒子径は小さくなるという傾向があることがわかった。 As shown in Table 3, it was found that small composite particles of around 40 nm can be formed using any of hyaluronan having a molecular weight of 480, 910 and 1300 kDa. It was also found that when low molecular weight hyaluronan was used, the particle size of the composite particles tended to be small.
＜試験例４＞コンドロイチン硫酸の分子量の検討
試験例１〜３においては分子量２２ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合に、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を作製することができることを示した。次に、分子量２２ｋＤａ以外のコンドロイチン硫酸を用いた場合においても同様に三元複合粒子を作製することができるか否か検討を行った。
本試験例では、分子量１０、１４、１５及び４０ｋＤａのコンドロイチン硫酸と、分子量１３００ｋＤａのヒアルロナンと、分子量１１０ｋＤａのキトサンとの三元複合粒子の作製を行った。本試験例における複合粒子の作製方法、各成分の作製濃度及び測定方法等は試験例２と同様である。なお、本試験例で使用したコンドロイチン硫酸の硫酸化度は、分子量１０ｋＤａのものが１．０２％、分子量１４ｋＤａのものが０．９６％、分子量１５ｋＤａのものが１．０６％、分子量４０ｋＤａのものが１．０８％であり、いずれも生化学工業より購入したものである。
表４に各分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合における三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。
<Test Example 4> Examination of Molecular Weight of Chondroitin Sulfate In Test Examples 1-3, it was shown that hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate ternary composite particles can be produced when chondroitin sulfate having a molecular weight of 22 kDa is used. Next, it was investigated whether ternary composite particles could be produced in the same manner even when chondroitin sulfate having a molecular weight other than 22 kDa was used.
In this test example, ternary composite particles of chondroitin sulfate having a molecular weight of 10, 14, 15 and 40 kDa, hyaluronan having a molecular weight of 1300 kDa, and chitosan having a molecular weight of 110 kDa were prepared. The preparation method of composite particles, the preparation concentration of each component, the measurement method, and the like in this test example are the same as those in Test example 2. The sulfation degree of chondroitin sulfate used in this test example was 1.02% for a molecular weight of 10 kDa, 0.96% for a molecular weight of 14 kDa, 1.06% for a molecular weight of 15 kDa, and a molecular weight of 40 kDa. 1.08%, both of which were purchased from Seikagaku Corporation.
Table 4 shows the average particle diameter of the ternary composite particles, the proportion of particles of 100 nm or less in the number distribution, the polydispersity index (Pdi), and the surface potential (zeta potential) when chondroitin sulfate of each molecular weight is used.
表４に示す通り、いずれの分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合であっても、比較例２の二元複合粒子よりも小さな粒子径の三元複合粒子が形成されることが分かった。この結果から、コンドロイチン硫酸はいずれの分子量であっても、ヒアルロナン／キトサン二元複合粒子よりも小さな粒子径を持つ、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を形成することができることが分かった。 As shown in Table 4, it was found that ternary composite particles having a particle diameter smaller than that of the binary composite particles of Comparative Example 2 were formed even when chondroitin sulfate of any molecular weight was used. From this result, it was found that, regardless of the molecular weight of chondroitin sulfate, hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate ternary composite particles having a smaller particle diameter than the hyaluronan / chitosan binary composite particles can be formed.
＜試験例５＞コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーの検討
試験例１〜４においては、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸からなる三元複合粒子が形成されることについて示した。
本試験例では、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーであっても、三元複合粒子を形成することができるのか否かについて検討を行った。
本試験例では、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーとして、ヘパリン（分子量５〜２０ｋＤａ、ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、ペクチン（分子量５０〜３５０ｋＤａ、和光純薬工業）、アルギン酸（６４ｋＤａ及び１１０ｋＤａ、和光純薬工業）、κ−カラギナン（１４００ｋＤａ、ＭＲＣポリサッカライド）及びι−カラギナン（１６００ｋＤａ、ＭＲＣポリサッカライド）を用いて検討を行った。
本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法等は試験例２と同様である。作製濃度は、ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）及びキトサン（１１０ｋＤａ）については試験例２と同様であり、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーについては以下に示す通りである。
ヘパリン：６．８μｇ／ｍＬ
ペクチン：８．０μｇ／ｍＬ
アルギン酸（６４ｋＤａ及び１１０ｋＤａ）：１．６μｇ／ｍＬ
κ−カラギナン：３．６μｇ／ｍＬ
ι−カラギナン：２．１μｇ／ｍＬ
上の混合比は、これまでの試験例と同様にキトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（ｃ）、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。
表５に本試験例において作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。
<Test Example 5> Examination of anionic polymers other than chondroitin sulfate Test examples 1 to 4 show that ternary composite particles composed of hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate are formed.
In this test example, it was examined whether ternary composite particles could be formed even with anionic polymers other than chondroitin sulfate.
In this test example, as an anionic polymer other than chondroitin sulfate, heparin (molecular weight 5 to 20 kDa, nacalai tesque), pectin (molecular weight 50 to 350 kDa, Wako Pure Chemical Industries), alginic acid (64 kDa and 110 kDa, Wako Pure Chemical Industries), Studies were carried out using κ-carrageenan (1400 kDa, MRC polysaccharide) and ι-carrageenan (1600 kDa, MRC polysaccharide).
The preparation method and measurement method of the composite particles in this test example are the same as in Test example 2. The production concentration is the same as in Test Example 2 for hyaluronan (1300 kDa) and chitosan (110 kDa), and is as follows for anionic polymers other than chondroitin sulfate.
Heparin: 6.8 μg / mL
Pectin: 8.0 μg / mL
Alginic acid (64 kDa and 110 kDa): 1.6 μg / mL
κ-carrageenan: 3.6 μg / mL
ι-Carrageenan: 2.1 μg / mL
The above mixing ratio is the same as in the previous test examples, the charge of the amino group (N) of chitosan, the carboxyl group of HA (c), the sum of the carboxyl group and sulfate group of the anionic polymer other than chondroitin sulfate (-). The ratio N: C: (−) is adjusted to be 1: 0.5: 0.5.
Table 5 shows the average particle diameter, the ratio of particles of 100 nm or less in the number distribution, the polydispersity index (Pdi), and the surface potential (zeta potential) of the composite particles prepared in this test example.
表５に示す通り、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーとしていずれの分子種を用いた場合であっても、１００ｎｍ以下の三元複合粒子を形成できることがわかる。 As shown in Table 5, it can be seen that ternary composite particles of 100 nm or less can be formed even when any molecular species is used as an anionic polymer other than chondroitin sulfate.
＜試験例６＞混合比の検討
これまでの試験例においてはキトサンのアミノ基（Ｎ）、ヒアルロナンのカルボキシル基（Ｃ）、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように、各成分の濃度を調整し、三元複合粒子が形成されることを確認した。
本試験例では、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．５以外の混合比であっても三元複合粒子の形成ができるか否かについて検討を行った。
本試験例においてはＮ：Ｃ比は１：０．５で固定し、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率（−）を変更して試験を行った。本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法等は試験例２と同様である。作製濃度は、ヒアルロナン及びキトサンについては試験例２と同様であり、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーについては、試験例２〜５における濃度を基に、表６〜１７に示す各実施例におけるヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率（−）に対応するように増減した。
表６〜１７に、三元複合粒子の成分、混合比（Ｎ：Ｃ：（−）比）、作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。また、図１〜１２に、作製した複合粒子の粒子径の個数分布を表すグラフを示す。
<Test Example 6> Examination of mixing ratio In the previous test examples, the amino group (N) of chitosan, the carboxyl group of hyaluronan (C), the sum of the carboxyl group and sulfate group of an anionic polymer other than hyaluronan (-) The concentration of each component was adjusted so that the charge ratio N: C: (−) was 1: 0.5: 0.5, and it was confirmed that ternary composite particles were formed.
In this test example, it was examined whether or not ternary composite particles can be formed even at a mixing ratio other than N: C: (−) = 1: 0.5: 0.5.
In this test example, the N: C ratio was fixed at 1: 0.5, and the test was performed by changing the ratio (−) of the anionic polymer other than hyaluronan. The preparation method and measurement method of the composite particles in this test example are the same as in Test example 2. The production concentration is the same as in Test Example 2 for hyaluronan and chitosan, and for anionic polymers other than chondroitin sulfate, other than hyaluronan in each Example shown in Tables 6 to 17 based on the concentrations in Test Examples 2 to 5 It increased or decreased so as to correspond to the ratio (−) of the anionic polymer.
Tables 6 to 17 show the components of the ternary composite particles, the mixing ratio (N: C: (−) ratio), the average particle diameter of the prepared composite particles, the ratio of particles of 100 nm or less in the number distribution, and the polydispersity index (Pdi). ) And the surface potential (zeta potential). Moreover, the graph showing the number distribution of the particle diameter of the produced composite particle is shown in FIGS.
表６〜１１及び図１〜６に示すように、種々の分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合には、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５、１：０．５：１のすべての場合において、すべての分子量のコンドロイチン硫酸において５０ｎｍ前後の三元複合粒子を得ることができることがわかった。また、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５のときには多分散指数も低く、溶液中に存在する複合粒子の粒子径の均一性も高いことが分かった。 As shown in Tables 6 to 11 and FIGS. 1 to 6, when chondroitin sulfate having various molecular weights is used, N: C: (−) = 1: 0.5: 0.1, 1: 0.5. In all cases of 1: 0.5 and 1: 0.5: 1, it was found that ternary composite particles of around 50 nm can be obtained with chondroitin sulfate of all molecular weights. In addition, when N: C: (−) = 1: 0.5: 0.1, 1: 0.5: 0.5, the polydispersity index is low, and the particle size uniformity of the composite particles present in the solution It turned out to be expensive.
表１２〜１５及び図７〜１０より、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとしてヘパリン、ペクチン、κ−カラギナン、ι−カラギナンを用いたときには、すべての混合比において１００ｎｍ程度の粒子が形成されることがわかる。
また、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５のときには多分散指数も低く、溶液中に存在する複合粒子の粒子径の均一性も高いことが分かった。
また、表１４及び図９に示すようにκ−カラギナンを用いた場合には、混合比Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．５、１：０．５：１のいずれにおいても、形成される三元複合粒子はι−カラギナンを用いた場合に比べ粒子径は大きく、且つ分散指数は高くなることがわかった。つまり、三元複合粒子の作製においてアニオン性ポリマーとしては、κ−カラギナンよりも硫酸化度が高いι−カラギナンの方がより好ましいということができる。
Tables 12 to 15 and FIGS. 7 to 10 show that when heparin, pectin, κ-carrageenan and ι-carrageenan are used as anionic polymers other than hyaluronan, particles of about 100 nm are formed at all mixing ratios. .
In addition, when N: C: (−) = 1: 0.5: 0.1, 1: 0.5: 0.5, the polydispersity index is low, and the particle size uniformity of the composite particles present in the solution It turned out to be expensive.
Further, as shown in Table 14 and FIG. 9, when κ-carrageenan was used, any of the mixing ratios N: C: (−) = 1: 0.5: 0.5, 1: 0.5: 1 Also, it was found that the ternary composite particles formed had a larger particle diameter and a higher dispersion index than when ι-carrageenan was used. That is, it can be said that ι-carrageenan having a higher degree of sulfation than κ-carrageenan is more preferable as an anionic polymer in the production of ternary composite particles.
表１６及び図９より、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして分子量６４ｋＤａのアルギン酸を用いる場合には、その混合比率が低い方が、多分散性の低い複合粒子を得ることができることがわかる。より多分散性の低い複合粒子を得ることができる混合比率はＮ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．０５及び１：０．５：０．１であった。
一方、表１７及び図１２より、分子量１１０ｋＤａのアルギン酸を用いる場合にも同様に、その混合比率が低い方が多分散指数の低い複合粒子が得られることが分かった。より多分散性の低い複合粒子を得ることができる混合比率はＮ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．０１及び１：０．５：０．０５であった。
From Table 16 and FIG. 9, it is understood that when an alginic acid having a molecular weight of 64 kDa is used as an anionic polymer other than hyaluronan, composite particles having low polydispersity can be obtained when the mixing ratio is low. The mixing ratio at which composite particles with lower polydispersity could be obtained were N: C: (−) = 1: 0.5: 0.05 and 1: 0.5: 0.1.
On the other hand, it can be seen from Table 17 and FIG. 12 that composite particles having a low polydispersity index can be obtained in the same manner when the alginic acid having a molecular weight of 110 kDa is used. The mixing ratio at which composite particles with lower polydispersity could be obtained were N: C: (−) = 1: 0.5: 0.01 and 1: 0.5: 0.05.
＜試験例７＞作製濃度の検討
本試験例においては、これまでの試験例における複合粒子の作製濃度を濃くした場合であっても、凝集することなく三元複合粒子を得ることができるのか否かについて検討を行った。
これまでの試験例で作製した実施例２〜５、７〜１１及び１３の三元複合粒子の作製時の各成分の濃度を５倍及び１５倍にした時の平均粒子径等を測定した。本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法は、作製時の各成分の濃度以外は、これまでの比較例と同様である。
また、比較例として二元複合粒子の作製濃度を変更した場合に形成される複合粒子の平均粒子径等も測定した。
表１８〜３０に、本試験例で作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。なお、表中（×１）、（×５）及び（×１５）とは、作製濃度が１倍（これまでの試験例と同じ）、５倍、１５倍であることを示す。また、図１３〜２５に本試験例で作製した複合粒子の粒子径の個数分布を表すグラフを示す。
<Test Example 7> Examination of Production Concentration In this test example, it is possible to obtain ternary composite particles without aggregation even when the production concentration of the composite particles in the previous test examples is increased. We examined whether.
The average particle diameter and the like were measured when the concentration of each component at the time of preparation of the ternary composite particles of Examples 2-5, 7-11, and 13 prepared in the previous test examples was 5 times and 15 times. The preparation method and measurement method of the composite particles in this test example are the same as those of the comparative examples so far, except for the concentration of each component at the time of preparation.
Further, as a comparative example, the average particle diameter and the like of the composite particles formed when the preparation concentration of the binary composite particles was changed were also measured.
Tables 18 to 30 show the average particle diameter, the ratio of particles of 100 nm or less in the number distribution, the polydispersity index (Pdi), and the surface potential (zeta potential) of the composite particles prepared in this test example. In the table, (× 1), (× 5), and (× 15) indicate that the production concentration is 1 time (same as the previous test example), 5 times, and 15 times. Moreover, the graph showing the number distribution of the particle diameter of the composite particle produced by this test example to FIGS. 13-25 is shown.
表１８〜２３及び図１３〜１８に示すように、ヒアルロナンの分子量を種々のものに変更した場合では、ヒアルロナン／キトサン二元複合粒子においては作製濃度が高くなるに比例して粒子径が大きくなることがわかる。また。１５倍の濃度で複合粒子を作製した場合には、その多分散指数は非常に大きくなってしまう。
一方、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子においては、いずれの分子量のヒアルロナンを用いた場合であっても、形成される三元複合粒子の平均粒子径は、作製濃度５倍までは１００ｎｍ以下となることがわかった。また、１５倍の濃度で作製した場合であっても、かかる三元複合粒子の多分散指数は、二元複合粒子と比較して低くなることがわかる。
これらの結果より、ヒアルロナン／キトサンを含む複合粒子を作製するにあたり、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）を加えると、作製濃度を濃くしても小さい粒子径であり、且つ多分散性の低い（安定性の高い）複合粒子を得ることができることがわかる。
As shown in Tables 18 to 23 and FIGS. 13 to 18, when the molecular weight of hyaluronan is changed to various ones, in hyaluronan / chitosan binary composite particles, the particle diameter increases in proportion to the production concentration. I understand that. Also. When composite particles are produced at a 15-fold concentration, the polydispersity index becomes very large.
On the other hand, in the ternary composite particles of hyaluronan / chitosan / chondroitin sulfate (22 kDa), the average particle size of the formed ternary composite particles can be up to 5 times the production concentration, regardless of the molecular weight of hyaluronan. Was found to be 100 nm or less. Further, it can be seen that the polydispersity index of the ternary composite particles is lower than that of the binary composite particles even when the concentration is 15 times higher.
From these results, when preparing composite particles containing hyaluronan / chitosan, when chondroitin sulfate (22 kDa) is added, the particle size is small even when the preparation concentration is increased, and polydispersity is low (high stability) It can be seen that composite particles can be obtained.
表２４〜３０及び図１９〜２５から分かるように、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）以外のアニオン性ポリマーであっても、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）を用いた場合と同様に、二元複合粒子と比較して、高濃度で作製したときの粒子径及び多分散指数が低くなることがわかる。
以上の結果より、ヒアルロナン及びキトサンを含む複合粒子の作製において、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを加えると、作製濃度が高濃度であっても小さく安定性の高い複合粒子を得ることができることがわかった。
As can be seen from Tables 24 to 30 and FIGS. 19 to 25, even in the case of anionic polymers other than chondroitin sulfate (22 kDa), as compared with the case of using chondroitin sulfate (22 kDa), compared with binary composite particles It can be seen that the particle diameter and polydispersity index when produced at a high concentration are low.
From the above results, it was found that when an anionic polymer other than hyaluronan was added in the preparation of composite particles containing hyaluronan and chitosan, small and highly stable composite particles could be obtained even when the preparation concentration was high. .
＜試験例８＞保存安定性の検討（１）
これまでの試験例において、種々の分子量、分子種を用いて、ヒアルロナン、キトサン及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む三元複合粒子の形成ができることを示した。本試験例においては、かかる三元複合粒子の保存安定性について検討した。
<Test Example 8> Examination of storage stability (1)
In the previous test examples, it was shown that ternary composite particles containing anionic polymers other than hyaluronan, chitosan and hyaluronan can be formed using various molecular weights and molecular species. In this test example, the storage stability of such ternary composite particles was examined.
まず、試験例１において作製した実施例１及び比較例１に係る複合粒子の保存安定性について検討を行った。保存温度を４℃としたときのこれら複合粒子の作製時、１日後、１週間後における平均粒子径等を試験例１と同様の測定方法により測定した。表３１にその結果を示す。また、この時の粒子径分布を図２６及び２７に示す。 First, the storage stability of the composite particles according to Example 1 and Comparative Example 1 produced in Test Example 1 was examined. When preparing these composite particles at a storage temperature of 4 ° C., the average particle diameter and the like after 1 day and 1 week were measured by the same measurement method as in Test Example 1. Table 31 shows the results. The particle size distribution at this time is shown in FIGS.
表３１、図２６及び２７から分かるように、二元複合粒子は、作製１日後に平均粒子径が大きくなり、作製１週間後には、２倍近くまでに平均粒子径が大きくなった。一方、三元複合粒子は、作製１日後には平均粒子径がほとんど変わらず、作製１週間後でも、２０％程度の増大であった。 As can be seen from Table 31 and FIGS. 26 and 27, the binary composite particles had an average particle size that increased after one day of production, and increased to an average particle size of nearly twice after one week of production. On the other hand, the average particle diameter of the ternary composite particles hardly changed after 1 day of production, and increased by about 20% even after 1 week of production.
次に、比較例１及び実施例１に係る二元複合粒子及び三元複合粒子を、調製時および保存時のキトサン濃度は変えずに、室温、又は３７℃で保存した。
表３２、３３に、複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
また、図２８〜３１に、複合粒子の粒子径の変化を示す。
Next, the binary composite particles and the ternary composite particles according to Comparative Example 1 and Example 1 were stored at room temperature or 37 ° C. without changing the chitosan concentration during preparation and storage.
Tables 32 and 33 show the particle diameter of the composite particles and the surface charge of the composite particles.
28 to 31 show changes in the particle diameter of the composite particles.
表３２、３３及び図２８〜３１から分かるように、二元複合粒子及び三元複合粒子のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒径はほとんど変化しなかった。
これらの結果より、三元複合粒子は、二元複合粒子に比べて、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
As can be seen from Tables 32 and 33 and FIGS. 28 to 31, the average particle size hardly changed immediately after the production and one week after the production in any of the binary composite particles and the ternary composite particles.
From these results, it was found that the ternary composite particles are greatly superior in stability of the particles during low-temperature storage compared to the binary composite particles.
次に、試験例１で用いた二元複合粒子及び三元複合粒子を、調製時および保存時のキトサン濃度を２５１μｇ／ｍＬ、ヒアルロナン濃度を５１６μｇ／ｍＬ、コンドロイチン硫酸濃度を２９．３μｇ／ｍＬとして、４℃、室温、又は３７℃で保存した。すなわち、試験例１における作製濃度の１５倍の濃度で二元及び三元複合粒子を作製した。
表３４〜３６に、複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
また、図３２〜３７に、複合粒子の粒子径の変化を示す。
Next, the binary composite particles and ternary composite particles used in Test Example 1 were prepared with a chitosan concentration of 251 μg / mL at the time of preparation and storage, a hyaluronan concentration of 516 μg / mL, and a chondroitin sulfate concentration of 29.3 μg / mL. Stored at 4 ° C., room temperature, or 37 ° C. That is, binary and ternary composite particles were produced at a concentration 15 times the production concentration in Test Example 1.
Tables 34 to 36 show the particle diameter of the composite particles and the surface charge of the composite particles.
32 to 37 show changes in the particle diameter of the composite particles.
表３４〜３６、図３２〜３７から分かるように、二元複合粒子及び三元複合粒子のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒径はほとんど変化しなかった。
試験例１の結果と併せて、三元複合粒子は、二元複合粒子に比べて、低濃度、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。
As can be seen from Tables 34 to 36 and FIGS. 32 to 37, in both the binary composite particles and the ternary composite particles, the average particle diameter hardly changed immediately after the production and one week after the production.
Combined with the results of Test Example 1, it was found that the ternary composite particles were greatly superior in stability of the particles during low concentration and low temperature storage compared to the binary composite particles.
＜試験例９＞保存安定性の検討（２）
次に試験例３〜５で作製した実施例４、７、９に係る三元複合粒子の保存安定性について検討を行った。実施例４に係る三元複合粒子については４℃、室温（ＲＴ）及び３７℃における、作製時、１日後、１週間後、１か月後の平均粒子径等を測定した（表４０〜４２及び図４１〜４３参照）。なお、比較として、試験例４で作製した比較例２についても同様に平均粒子径等の継時的な変化を測定した（表３７〜３９及び図３８〜４０参照）。
また実施例７及び９に係る三元複合粒子の保存安定性については、室温においてのみ検討を行った（表４３、４４及び図４４、４５参照）。
<Test Example 9> Examination of storage stability (2)
Next, the storage stability of the ternary composite particles according to Examples 4, 7, and 9 produced in Test Examples 3 to 5 was examined. For the ternary composite particles according to Example 4, the average particle diameter and the like after production, at 1 day, after 1 week, and after 1 month were measured at 4 ° C., room temperature (RT), and 37 ° C. (Tables 40 to 42). And FIGS. 41 to 43). For comparison, Comparative Example 2 produced in Test Example 4 was also measured for changes over time such as the average particle diameter (see Tables 37 to 39 and FIGS. 38 to 40).
The storage stability of the ternary composite particles according to Examples 7 and 9 was examined only at room temperature (see Tables 43 and 44 and FIGS. 44 and 45).
表３７〜３９に示す通り、いずれの保存温度においても二元複合粒子は作製後、徐々に多分散性が上昇しているのがわかる。一方、表４０〜４２に示す通り、三元複合粒子は作製後一週間経過した後であっても多分散指数は０．１〜０．２程度を維持している。
また、表４３及び４４に示すように、分子量２２ｋＤａコンドロイチン硫酸に代えて分子量１５ｋＤａのコンドロイチン硫酸及びヘパリンを用いたときも、作製後１週間経過後であっても多分散指数は０．１〜０．２程度を維持できていることがわかる。
以上の結果より、ヒアルロナン及びキトサンを含む複合粒子の作製において、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを加えてできる三元複合粒子は、二元複合粒子と比較して保存安定性に優れていることがわかった。
As shown in Tables 37 to 39, it can be seen that the polydispersity gradually increases after the binary composite particles are produced at any storage temperature. On the other hand, as shown in Tables 40 to 42, the ternary composite particles maintain the polydispersity index of about 0.1 to 0.2 even after one week has passed after the preparation.
In addition, as shown in Tables 43 and 44, when chondroitin sulfate and heparin having a molecular weight of 15 kDa are used instead of the molecular weight of 22 kDa chondroitin sulfate, the polydispersity index is 0.1 to 0 even after one week has elapsed after preparation. It can be seen that about 2 can be maintained.
From the above results, it was found that ternary composite particles made by adding anionic polymers other than hyaluronan are superior in storage stability compared to binary composite particles in the preparation of composite particles containing hyaluronan and chitosan. It was.
本発明は、高分子化合物を有効成分として用いる化粧料の製造に応用できる。 The present invention can be applied to the production of cosmetics using a polymer compound as an active ingredient.
Claims (13)
ヒアルロナン、キトサン、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法。 A method for producing a composite particle according to any one of claims 1 to 7,
A method for producing composite particles, comprising combining hyaluronan, chitosan and the anionic polymer in the presence of a buffer solution.
キトサンを緩衝液中に溶解する工程と、
前記アニオン性ポリマーを、緩衝液中に溶解する工程と、
ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程と、
を含む、請求項８に記載の複合粒子の製造方法。 Dissolving hyaluronan in a buffer;
Dissolving chitosan in a buffer;
Dissolving the anionic polymer in a buffer;
Mixing and stirring the hyaluronan solution, the chitosan solution, and the anionic polymer solution;
The manufacturing method of the composite particle of Claim 8 containing this.
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