JP6288691B2

JP6288691B2 - 胚様体に対する空間分化誘導制御方法及びその装置

Info

Publication number: JP6288691B2
Application number: JP2013105816A
Authority: JP
Inventors: 藤井　輝夫; 輝夫藤井; 英憲阿久津; 治良川田
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2018-03-07
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: JP2014226046A

Description

本発明は、胚様体に対する空間分化誘導制御方法及びその装置に関するものである。

近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を利用してさまざまな細胞組織への分化誘導が行われており、先行研究では自己組織化によって細胞が自発的に複雑な構造を形成する例が報告されている（後述の非特許文献１参照）。体内のいくつかの組織では部位特異的な物質分布に反応して形態形成が行われるが、そのような分化現象を分析するには細胞を部位特異的なパターンに従って様々な因子に曝露しなければならない。これまで、マイクロ流体技術を応用して、細胞培養環境で空間特異的な物質分布を形成する技術が提案されてきたが、スフェロイド状の細胞塊に対して長期間安定して部位特異的に異なる物質に曝露可能な技術は未だ報告されていない。

なお、本願の発明者らは、胚様体を流れに曝すようにした生物学的対象物の分化制御方法及びその装置を、既に下記特許文献１として提案している。

特開２０１３−７４８２２号公報

Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ．，Ｔａｋａｔａ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｄａ，Ｍ．，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｅ．，Ｏｋｕｄａ，Ｓ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄＳａｓａｋｉ，Ｙ．，"Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇｏｐｔｉｃ−ｃｕｐｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ"Ｎａｔｕｒｅ４７２，ｐｐ．５１−５６，２０１１

そこで、胚様体に対して部位特異的に異なる物質を作用させることが可能な分化制御方法を提案する。この方法では、胚様体を流れに曝すことなく、空間特異的に分化誘導を行うことができる。

本発明は、上記状況に鑑みて、胚様体を流れに曝すことなく、空間特異的に分化誘導を行うことができる胚様体に対する空間分化誘導制御方法及びその装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕胚様体に対する空間分化誘導制御方法において、静水圧下で胚様体に対して部位特異的に異なる培養液に晒す空間分化誘導制御を行い、異なる分化状態を空間的に誘導できるスフェロイドを得て、簡単に細胞の分化状態を観察することを特徴とする。

〔２〕胚様体に対する空間分化誘導制御方法において、カルチャーインサートの底面に孔を有する膜を貼り付け、これをウエル内に導入し、前記膜上の孔に胚様体を固定することにより、前記膜の上と下の空間内に、それぞれ異なる培養条件を設定し、静水圧によって分節型胚様体を簡単かつ安定に保つことを特徴とする。

〔３〕上記〔２〕記載の胚様体に対する空間分化誘導制御方法において、培養された分節型胚様体を器具を使用し、二つのスフェロイドに分離、もしくは分節型の形態で取り出した後、ディッシュへ移し、観察を行うことを特徴とする。

〔４〕胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、カルチャーインサートの底面に孔を有する膜を貼り付けた構造体と、この構造体を導入するウエルと、前記膜上の孔に固定される胚様体と、前記膜の上と下の空間内に、それぞれ異なる培養条件を設定し、静水圧によって分節型胚様体を簡単かつ安定に保つ手段とを具備することを特徴とする。

〔５〕上記〔４〕記載の胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、前記孔の直径が１００μｍ〜２００μｍであることを特徴とする。

〔６〕上記〔４〕記載の胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、前記膜がＰＤＭＳ膜であることを特徴とする。

本発明によれば、静水圧下で胚様体に対して部位特異的に異なる培養液に曝すことで、異なる分化状態を空間的に誘導することができる。この技術を利用することによって、分化によって形成された複雑な組織の分析が可能となる。

本発明の実施例を示す底面に孔を有する膜が貼り付けられているカルチャーインサートを示す図である。本発明の実施例を示す静水圧によって胚様体を孔上に固定し、カルチャーインサートとウエルに異なる培養液を入れた培養法を示す図である。本発明の実施例を示す胚様体の培養方法を示す図である。本発明の実施例を示す分節型胚様体から分離されてディッシュに移された孔の上部・下部に形成されたスフェロイドを示す図面代用写真である。

胚様体に対する空間分化誘導制御方法は、静水圧下で胚様体に対して部位特異的に異なる培養液に晒す空間分化誘導制御を行い、異なる分化状態を空間的に誘導できるスフェロイドを得て、簡単に細胞の分化状態を観察する。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。

図１は本発明の実施例を示す底面に孔を有する膜が貼り付けられているカルチャーインサートを示す図であり、図１（ａ）はそのカルチャーインサートを示す図面代用写真、図１（ｂ）はその断面図、図２は本発明の実施例を示す静水圧によって胚様体を孔上に固定し、カルチャーインサートとウエルに異なる培養液を入れた培養法を示す図である。

これらの図において、１はカルチャーインサート、２はカルチャーインサート１の底面、３はその底面２に形成された孔、４はその孔に貼り付けられたＰＤＭＳ膜、５はそのカルチャーインサート１が導入されるウエル、６は胚様体である。

図１（ｂ）に示すように、カルチャーインサート１の底面２に直径２００μｍの孔３を有するＰＤＭＳ膜４を貼り付ける。なお、例えば、カルチャーインサート１の下部直径は３ｍｍ、中部直径は６ｍｍである。これを図２に示すように、ウエル５内に導入する。ＰＤＭＳ膜４上の孔３に胚様体６を固定することにより、ＰＤＭＳ膜４の上と下の空間内に、それぞれ異なる培養条件を設定することができる。ここで、カルチャーインサート１内とウエル５内の培養液の液面に差をつける、つまり、カルチャーインサート１内の培養液の液面高さをＡ、ウエル５内の培養液の液面の高さをＢとすることにより、静水圧によって分節型胚様体を簡単かつ安定して固定することが可能である。

図３はその培養方法を示す図であり、図３（ａ）は培養４日目に形成された分節型胚様体を示す図、図３（ｂ）はその観察の方法を示す図である。

また、図４は分節型胚様体１１から分離されてディッシュに移された孔の上部・下部に形成されたスフェロイド１２，１３を示す図面代用写真である。

図３（ａ）に示すように、培養４日目に分節型胚様体１１が形成され、図３（ｂ）に示すように、カルチャーインサート１内の分節型胚様体１１を培養５日目にピペット７を使用し、二つのスフェロイド１２，１３に分離した後、ディッシュ８へ移し、観察を行った。

以下、実験例について説明する。

実験では直径３００μｍ程度のマウスｉＰＳ細胞由来（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７細胞株，未分化マーカーであるＮａｎｏｇのレポーターとしてＧＦＰが発現するため未分化時に蛍光発色し、分化すると蛍光が消える）の胚様体を孔上に固定し、カルチャーインサートとウエルにそれぞれ未分化維持因子ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｅｒ（ＬＩＦ）含有培養液（ＢＤ社（バイオ・ビクトンピッケルソン＆カンパニー社製）と神経分化培養液（ＲＨＢ−Ａ培養液，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓｉｎｃ社製）を入れて、５日間培養を行った。

その結果は以下の通りである。

培養４日目に細胞を観察したところ、分節型胚様体１１は分節型の形状に変化していた〔図３（ａ）〕。これは孔の下に位置していた部位が増殖によって形状が大きくなったと考えられる。培養５日目に孔の上部に位置するスフェロイド１２を器具としてのピペット７で下部のスフェロイド１３から引き剥がし、二つのスフェロイド１２，１３に分離した後、ディッシュ８へ移して観察を行った〔図３（ｂ）〕。図４に示すように、孔の上部に位置していたスフェロイド１２はＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光蛋白質）の蛍光が強いため未分化な細胞が多いことがわかる。下部のスフェロイド１３はＧＦＰの蛍光が弱いため、ほとんどの細胞が分化してしまっていることがわかる。

これらの結果から、静水圧下で分節型胚様体１１に対して部位特異的に異なる培養液に曝すことで、未分化状態と分化状態を空間的に誘導できることが確認できた。この技術を利用することで分化によって形成された複雑な組織の分析が可能となる。

なお、上記では、主に未分化と分化について述べたが、これらに限定されるものではなく、例えば、心筋細胞と神経細胞などの異なる方向への分化という２つのことができる観点で「異なる方向への分化状態」としている。

上記では、胚様体に対する空間分化誘導制御装置を一個のみを示したが、胚様体に対する空間分化誘導制御装置を複数個のセットして、それぞれの胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、種々の分節型胚様体の観察を、従来のような流路やその流れの制御のための配線を不要にして、簡便な観察をすることができる利点がある。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明の胚様体に対する空間分化誘導制御方法は、胚様体を流れに曝すことなく、空間特異的に分化誘導を行うことができる胚様体に対する空間分化誘導制御方法として利用可能である。

１カルチャーインサート
２カルチャーインサートの底面
３底面に形成された孔
４孔に貼り付けられたＰＤＭＳ膜
５カルチャーインサートが導入されるウエル
６胚様体
７ピペット
８ディッシュ
１１分節型胚様体
１２孔の上部に位置するスフェロイド
１３孔の下部に位置するスフェロイド

Claims

静水圧下で胚様体に対して部位特異的に異なる培養液に晒す空間分化誘導制御を行い、異なる分化状態を空間的に誘導できるスフェロイドを得て、簡単に細胞の分化状態を観察することを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御方法。
カルチャーインサートの底面に孔を有する膜を貼り付け、これをウエル内に導入し、前記膜上の孔に胚様体を固定することにより、前記膜の上と下の空間内に、それぞれ異なる培養条件を設定し、静水圧によって分節型胚様体を簡単かつ安定に保つことを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御方法。
請求項２記載の胚様体に対する空間分化誘導制御方法において、培養された分節型胚様体を器具を使用し、二つのスフェロイドに分離、もしくは分節型の形態で取り出した後、ディッシュへ移し、観察を行うことを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御方法。
（ａ）カルチャーインサートの底面に孔を有する膜を貼り付けた構造体と、
（ｂ）該構造体を導入するウエルと、
（ｃ）前記膜上の孔に固定される胚様体と、
（ｄ）前記膜の上と下の空間内に、それぞれ異なる培養条件を設定し、静水圧によって分節型胚様体を簡単かつ安定に保つ手段とを具備することを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御装置。
請求項４記載の胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、前記孔の直径が１００μｍ〜２００μｍであることを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御装置。
請求項４記載の胚様体に対する空間分化誘導制御装置において、前記膜がＰＤＭＳ膜であることを特徴とする胚様体に対する空間分化誘導制御装置。