JP6272296B2 - 懸濁された細胞成分を均質に分布させるための方法と装置 - Google Patents

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関連出願
本出願の請求の範囲は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に仮特許出願第６１／６２１１０７号（２０１２年４月６日出願の、発明の名称「METHOD AND DEVICE FOR THE HOMOGENEOUS DISTRIBUTION OF SUSPENDED CELL COMPONENTS」の優先権を主張し、同出願全体を参照により本明細書に包含する。

本発明は、表面上の液体中に懸濁された細胞成分を均質に分布させるための方法と、この方法を実施するための装置に関する。

細胞及びその成分、特に希少細胞の同定及び分析は、例えば細胞生物学、腫瘍学、幹細胞研究、出産前診断法などといった医学研究及び診断の様々な分野においてその重要度を増している。これに関連して、生物試料中の細胞の定量分析と、さらには定性分析とは、科学者及び医療従事者の特段の興味の対象である。

個々の細胞及びその成分の同定及び分析の前提条件は、例えば全血又は他の体液のような生物試料中の標的細胞又はその成分を定量的に検出して単離することのできる適切な方法である。

他の細胞から標的細胞を分離するためによく使用されるアプローチは、標的細胞に特異的な抗原を目的とする抗体を使用した免疫磁気法によるものである。この抗体は磁粉に連結するので、この磁粉を、磁場用いて試料から標的を単離するために使用することができる。この技術は、多くの商業的及び非商業的システムに使用される。他のアプローチは、試料物質（例えば、ＳｃｒｅｅｎＣｅｌｌ又はＯｎ−Ｑ−ｉｔｙ）の濾過によるサイズ排除の概念を使用する。代替的に、細胞を表面上に固定した後、免疫細胞化学及び／又は形態学的分析（例えば、Ｅｐｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって陽性の細胞として同定することができる。しかしながら、これらアプローチは少量の細胞懸濁液に限定される。

上記方法の欠点は、枯渇及び／又は濃縮の特異性の不足により標的細胞が失われるリスクが高いことである。免疫磁気法の場合、例えば、一般に使用される細胞表面抗原であるＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）が標的細胞の亜集団によって発現されず、結果的に濃縮プロセスの間に失われることがある。同様に、非標的細胞（通常、直径５〜７μｍの白血球）と対象である標的細胞（例えば、＞１０μｍの直径を有する循環腫瘍細胞）とのサイズ差に基づく濾過プロセスでは、通常標的細胞に観察されるサイズ範囲の下限にある対象の細胞は失われる。さらに、非標的細胞とのサイズ差を呈さない標的細胞（例えば、白血球の悪性の亜集団）は、これら方法によって単離することができない。

細胞の枯渇に基づく方法は、比較的少数の細胞にのみ適しており、従って必要な感受性を呈さない。したがって、細胞及びその成分、特に希少細胞の同定及び分析に適した代替的な方法及び装置に対する需要が存在する。

この問題は、表面上の液体中に懸濁された細胞成分を均質に分布させる方法と、この方法を実施するための装置によって解決される。

実施例に示されるように、少なくともいくつかの実施態様は、表面上の液体中に懸濁された細胞成分（細胞又はその成分）を均一に分布させることを可能にする方法を含む。この方法の結果として、液体及び液体中に懸濁された任意の材料、並びにキャリア体の表面上の液体中に懸濁された任意の物質又は粒子の、均一な分布が利用可能となる。この材料は特に、（例えば、ヒト、動物、又は植物を起源とする）生細胞又は固定細胞、細菌、ウィルス、細胞成分、タンパク質、核酸、代謝産物、又は化学物質を含むことができる。

均一な分布は、多くの理由により望ましく、且つ有利である。第１に、細胞成分を定量的に検出する必要がありうる。試料の部分的な分析しか行うことができないとき、全体を評価するために、及び／又は個々の成分を個別に試験することができるように分離するとき、均一な分布は望ましい。

当分野の既知の方法とは異なって、本発明の少なくともいくつかの実施態様は、比較的大きな表面積上において懸濁された細胞成分を均質に分布させることを可能にする。細胞学的分析又は形態学的分析について、このようなことはこれまで可能でなかった。

したがって、本発明の一の課題は、表面上の液体に懸濁された細胞又は細胞成分を均質に分布させる方法であり、この方法は、
上面を有する液体キャリアをテーブル上に位置決めすることと、
液体キャリアの上面の上方約５０〜１０００μｍ、又は３５０〜１０００μｍの距離に分配バーを位置決めすることと、
細胞成分が懸濁された液体を、液体キャリアの上面に適用することと、
中に液体キャリア上の液体中に懸濁された細胞成分を分配するために、分配バー、液体キャリア、及び／又はテーブルを動かすことと
を含む。

方法は、表面上の液体中に懸濁された細胞成分を均質に分布させる。均質性とは、システムの範囲全体にわたり特性が均一であることを示す。しかしながら、液体中に懸濁された成分を均一に分布させることは、懸濁された成分が沈溺及び相分離し易いために困難である。

したがって、均質な分布とは、液体キャリアの表面上における細胞成分の均一な分布を意味する。また、細胞成分の均一な分布は、表面上の細胞成分の単位面積当たり密度が比較的一定であることを特徴とする。ここで、単位面積当たり密度とは、単位面積当たりの細胞成分の数、例えば１ｃｍ^２当たりの個数とすることができる。試験された各面積単位に等しい数の細胞成分がカウントされる場合、これは均質な分布と評される。ここで、１ｃｍ^２当たりの細胞成分の数はむしろ、正規分布した乱数値に相当する。したがって、１ｃｍ^２当たりの一定数からの偏差は、通常の統計的範囲において許容可能である。

第１のステップでは、液体キャリアをテーブル上に配置する。テーブルとは、液体キャリアの収容に適した任意の手段を意味する。結果として、テーブルは、液体キャリアを水平に配置することができる表面を有する手段である。このため、テーブルは特に平坦な表面を含むことができる。加えて、テーブルは液体キャリアへのアクセスを容易にするために適したものでありうる。このため、テーブルは例えば、液体キャリアを露出した高い位置に移動させるための、平坦な表面上の中央プラットフォーム及び／又はつまみ領域、並びに／或いは下方から液体キャリアを容易に把持することを可能にするための、平坦な表面上のアクセス用開口及び／又はチャネルといった凹部を有することができる。加えて、テーブルは、方法の実施に適したさらなる構成部品を包含することができ、例えば、液体キャリアを固定するため、又は解放可能に保持するための手段が存在してよい。テーブルは、テーブルを動かすために適した駆動装置、例えばリニアムーバー、又はテーブルを回転させるドライブシャフトに連結させることができる。

驚くべきことに、液体中に懸濁させた細胞成分の均質な分布は、液体キャリアの上方において所定の距離に分配バーを移動させる方法により達成されることが分かった。

したがって、さらなるステップでは、液体キャリアの上方において、分配バー及び液体キャリア間の距離が５０〜１０００μｍ又は３５０〜１０００μｍの位置に分配バーを配置する。分配バー上への液体の付着が生じるように、液体キャリア上に十分な液体が存在しているという前提の下に、分配バーの移動中に、細胞成分が表面上において均一に分布することが観察された。表面に対してバーが異動する間にバーに液体が付着することにより、バー及び表面間の液体領域に流れ及び乱流が生じ、それによって溶液中に懸濁された細胞成分が保持されて均一な分布が可能になると推測される。

プロセスのさらなるステップでは、液体と、その中に懸濁された細胞成分とを、液体キャリア上に適用する。液体を適用するステップと、分配バーを位置決めするステップとは、任意の順序で連続的に、又は同時に、いずれか適切な方で実行することができる。液体の適用は、テーブル上に装着されたピペット、及び／又は分配バー内の液体アプリケーターといったアプリケーターを介して行うことができる。また、液体は、チャネルを介して分配バー中に供給することができ、次いで注入、噴霧、滴下、又は他の方法で分配することができる。

本発明の少なくともいくつかの実施態様の教示によれば、液体キャリアにどんなに高い液体レベルが適用されるかは問題でない。すなわち、一実施態様では分配バーは完全に液体中に浸漬され、別の実施態様では分配バーの一部のみが液体中に浸漬される。しかしながら、液体中にバーの少なくとも一部が浸漬することは、分配バー及び液体キャリア間の相対運動により生み出される流れにより液体中において細胞成分が異動することの前提条件である。一実施態様では、分配バーは、液体キャリア上の液体が液体に接触するセクションに付着するように構成される。一実施態様では、分配バーは凸状である。凸性は、分配バーの横断プロファイルに関連するもので、すなわち、否定的特徴として表現すれば、前方が凹状に形成された分配ロッド、例えばシャベルを有する雪かき器様の装置は提案されない。

本発明の少なくともいくつかの実施態様では、細胞成分は液体中に懸濁される。懸濁とは、液体と、その中に懸濁状態に保持されて分布する固体との均質な物質混合物を意味する。このような懸濁は、細胞又は細胞成分の粗大分散であり、沈殿又は相分離する傾向を有する。懸濁を停止させることができる場合、次いで（溶液とは異なり）粒子サイズが小さすぎなければ固体は沈降物（沈殿）としてゆっくりと底に沈む。懸濁液の安定性は、ストークスの法則による異なる粒子の沈降速度を測定するセディグラフ（ｓｅｄｉｇｒａｐｈ）によって規定することができる。粒子が小さい程その密度は低く、液体の粘度が高い程沈殿プロセスに時間がかかる。粒子の形状及び構造と、粒子及び液体の他の特性も、沈殿に影響する。沈殿は遠心分離により加速することができる。

本発明の意味において、細胞成分とは、細胞内成分、細胞膜又は細胞壁、或いは細胞の他の成分といった細胞の部分と、無傷又はもはや無傷でない細胞全体との、両方の細胞成分を意味する。

細胞は、植物、動物（ヒトを含む）、細菌、又は真菌細胞といった、どのような細胞でもよい。したがって、細胞は、原核生物でも真核性でもよく、単細胞生物又は多細胞生物から得ることができる。細胞のサイズは大きく変動する。細胞は、０．２μｍ〜２００μｍ、０．５μｍ〜１００μｍ、或いは１〜３０μｍの直径を有しうる。

上述のように、細胞は原核細胞とすることができる。原核生物には、細菌及び古細菌が含まれる。或いは、細胞は真核細胞でもよい。真核細胞には、動物（ヒトを含む）細胞、植物細胞、及び真菌細胞が含まれ、これらの構造は異なっている。典型的に、真核動物細胞は、とりわけ以下の成分、すなわち、細胞核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、リボソーム、小胞、リソソーム、細胞膜、細胞質、中心子を含む。通例、植物細胞は、さらに細胞壁及び緑葉体、或いは他のプラスチド及び液胞を持っている。真菌細胞も細胞壁を持つが、キチン質のものである。

このように、細胞成分は上記の細胞成分である。さらに、細胞成分は、適切な宿主細胞内部で（細胞内で）自己増殖できる感染粒子ということもある。この例として、ウィルス、或いはウィルスから得られる構造体（人工的に作成される、又は天然に発生する）、例えばウィルス様粒子、ビリオン、カプシド変異体などが挙げられる。

さらに、細胞の成分は、液体に可溶でない限り、上述の細胞又はその成分の他のいずれかの成分でありうる。例えば、細胞の成分は、例えばタンパク質、脂質、多糖類、核酸、（小）有機分子、又は糖タンパク質といった、細胞質又は細胞膜の成分とすることができる。

一実施態様では、細胞成分は細胞である。細部は、例えば無傷のもの、もはや無傷でないもの、生細胞、死細胞、天然発生細胞、又は人工的に作り出された細胞とすることができ、これらは典型的な細胞成分を含有する。上述のように、細胞は死細胞でもよく、これは例えば精製又は他の固定の結果発生しうる。

細胞はどのような細胞でもよいが、単一の（及び分離された）細胞が多くの場合最も有用であり、以降これを単細胞と呼ぶ。ここでは、細胞は、大量の細胞又は多数の細胞からなる固定された細胞会合に含まれていないか、又はもはや含まれていない。単細胞はそのようなものとして、例えば単細胞生物の細胞、或いは、血液中を輸送される細胞（例えば、血球、幹細胞、循環細胞、転移細胞、循環ＤＮＡなど）、精子、唾液、又は胞子のような、天然には細胞会合に含まれない細胞として天然に発生しうる。或いは、細胞は、細胞会合から単離（分離）することができる。細胞の分離方法は、当業者には既知であり、例えば酵素消化（例えば、トリプシン、ヒアルロニダーゼなど）、又はせん断力の印加とすることができる。

典型的に、少量の組織液と共にサンプリングされた細胞を分配する方法により、細針吸引のような細胞学的試料が、顕微鏡スライドに適用される。このような吸引により形成された液滴は次いで、典型的には、別の顕微鏡スライド、カバーガラスを用いて、又は針自体により、もっと大きな表面積に塗布される。細胞は、細胞の変形が最小となるように、且つ最もよく提示されるように、薄く且つきめ細かく塗布しなければならないが、細胞の損傷を避けるために、塗布層は薄すぎてはならず、又は過剰なせん断力を用いることはできない。血液学的問題の調査のためなどの血液塗抹標本は同様に調製され、この場合少量の血液試料がピペット針又は注入器を用いて顕微鏡スライド上に配置され、次いで別の顕微鏡スライドといった拡散デバイス、又は一般的にわずかな角度に保持される（くさび技術）カバースリップガラスの使用により、最小の力で塗りつけられる。

パパニコロウ検査の試料は、典型的に、スパチュラ、綿スワップ、又はブラシを用いて取得される。標本は、次いで特殊な液体防腐剤中に入れられる。結果として得られる細胞懸濁液は、次いで濾過又は沈降されて、薄層を調製するための顕微鏡スライドに移される。これにより往々にして細胞が失われる、及び／又は損傷を受ける。さらに常套的なパパニコロウ塗抹試験では、標本は試料採集装置を用いて直接顕微鏡スライドに移され、それにより、細胞可視性を得にくくする血液及び粘液に由来するもののようなデブリにより多くの場合覆われた、不規則で厚い層が生成される。

細胞学的細針吸引からの細胞塗抹標本の作製、及び顕微鏡スライド上でのパパニコロウ検査試料の作製に本方法が使用される場合、中間の液体層中における細胞の懸濁は、本明細書に記載される方法により、反応表面上に分配される。

血液学的血液試料のために、本方法により反応表面上に血液塗抹標本の薄層を作ることができる。或いは、血液試料を、安定化液、抗凝結剤、又は溶解バッファ中に浸漬した後、細胞懸濁液を反応表面に直接移し、本方法を利用して分配することができる。

また、本発明による方法に使用する前に、例えば遠心分離法、差別的細胞培養、又はフローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類））によって個々の細胞を精製することができる。

中に細胞成分が懸濁された液体は、細胞成分の懸濁に適した液体であればなんでもよい。必要であれば、液体は、細胞成分の完全性及び機能の万全性を維持するために適切なものでなければならない。特に無傷細胞の場合、細胞の生存能力を維持することが望ましいことがある。タンパク質の場合、タンパク質の三次構造及び四次構造を維持する液体を選択することが必要な場合がある。

現状の技術では、これら前提条件を満たす多数の液体が既知である。通例、これらは水を主成分とする液体であり、適切な添加物、例えばバッファ、栄養分、増殖因子、塩などを水に溶解させることができる。このような媒体は当業者には周知であり、一定範囲の民間供給者から入手可能である。

液体の粘性は、細胞成分の沈殿を遅らせるために水より高くすることができる。特に、粘性は、＞２ｍＰａｓ、２ｍＰａｓ〜１０００ｍＰａｓ、又は１０ｍＰａｓ〜１００ｍＰａｓとすることができる。
粘性を高めるために、水を主成分とする液体、水より高い粘性を有する任意の極性溶媒、特に水溶性ポリマー及び／又はオリゴマー溶液を加えることができる。

方法のさらなるステップによれば、液体キャリア上の液体中に懸濁された細胞成分を分配するために、分配バー及び／又はテーブルを動かす。ここで、テーブルは、不動で分配バーが動くものでも、それ自体が動くものでもよい。テーブルが動く場合、分配バーは不動でも、それ自体が（場合によってはテーブルの動きとは逆方向に）動くものでもよい。直線運動によりテーブルが動き、分配バーは不動とすることができるか、又は分配バーが動き、テーブルは不動とすることができる。回転運動によりテーブルが回転し、分配バーは不動とすることができるか、又は分配バーが回転し、テーブルは不動とすることができる。テーブルと分配バーとの相対運動には、分配バーと、テーブルに固定可能な液体キャリアとの間の距離が可能な限り一定であるよう、極めて精密な制御が要求される。通常、５０〜１０００μｍ又は３５０〜１０００μｍという分配バー及び液体キャリア間の距離が、本発明の実施のために有用である。距離に関係なく、細胞成分の一定した分配が、運動中に維持されなければならない。選択された距離での液体キャリア及び分配バー間の運動により、液体キャリア上において細胞成分が均質に分配されるという効果が得られる。

一実施態様では、細胞成分は分離されて、準単層に構築される。分離とは、一の細胞成分が別の細胞成分と接触しておらず、理想的には別の細胞成分から適切な距離にあることを意味する。これにより懸濁液の各細胞成分の個々の試験が可能となり、これは例えば希少細胞の同定とその後のそれらの試験に有利となりうる。

一実施態様では、方法は、以下のステップ、すなわち、
十分に均質な分布が達成された後で液体を吸引するステップ、及び／又は
その上に細胞成分を有する液体キャリアを乾燥させるステップ、及び
乾燥後に、例えば乾燥した細胞を固定又は染色する目的で、追加の流体を適用する一又は複数のステップ
のうちの少なくとも一つをさらに含むことができる。

方法は、吸引及び乾燥の両方、並びに両ステップを含むことができ、これらは連続して、又は同時に実行することができる。吸引の代わりに液体キャリアから液体を除去する任意の方法を使用することができ、それらは例えば、乾燥、蒸発、自然蒸発、上澄みをすくい取ること、自然排水、自然流出、又は浸出である。その後、又はこれに付随して、液体キャリア上に均質に分布する細胞成分の乾燥が行われ、保存、及び／又はさらなる目的への細胞成分の提供、特に個々の細胞とその成分との同定及び分析に役立つ。

液体中に懸濁された細胞成分は、通常少なくとも一つの検出対象となる亜群を含む。

既述のように、これは細胞の亜集団でありうる。同様に上述したように、表面上における細胞成分の均質な分離は特異的同定及び分析を容易にするので、本発明は、細胞とその成分、特に希少細胞の同定及び解析に特に適している。

通常、細胞成分が細胞であることが最も適切である。このような細胞の例は、例えば循環腫瘍細胞又は循環ＤＮＡ又は腫瘍微小塞栓といった癌細胞、或いは例えばＢ細胞、Ｔ細胞、好酸球などの特定の血液細胞である。

他の実施態様では、標的細胞は、希少細胞、特に細胞全体に対する希少細胞の割合が最大で１％、特に最大で０．１％、例えば最大で０．０１％である希少細胞である。希少細胞は、患者の血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、又は循環腫瘍微小塞栓（ＣＴＭ）とすることができる。

技術的に困難であるのは、希少な腫瘍細胞を発見及び同定することがである（１０００万個の白血球及び５０億個の赤血球を有する血液１ｍｌ中に含有されるＣＴＣはわずかに１〜２個である）。しかしながら、これら細胞は腫瘍自体が検出可能であるずっと前から検出可能であるので、これは診断及び治療上、極めて重要である。検出が早い程、通例副作用が少なく治癒の可能性が高い早期治療的アプローチが可能である。

言うまでもなく、別の条件、特に別の疾病の条件を示すものを、標的細胞又はその成分とすることもできる。

一実施態様では、液体キャリアの表面の大きさは、少なくとも１００ｃｍ^２、又は１００ｃｍ^２〜１０００ｃｍ２である。液体キャリアの表面は、ＣＤ又はレコード（ＬＰ）の大きさを有することができる。通常の市販のＣＤは、直径１２０ｍｍ又は８８ｍｍであり、中央に直径１５ｍｍの穴を有する。レコードは直径７インチ、すなわち１７７．８ｍｍであり、中央に１．５インチ、すなわち３８．１ｍｍの穴を有する。液体キャリアのこのような大きさは、特に容易に操作可能であるという利点を有する。いくつかの状況下では、原理上ＣＤ生産又はＬＰ生産のための工場を使用することができ、これらに必要な修正はごくわずか又は全くないため、液体キャリアを特に安価に生産することができる。特に有利な一実施態様では、場合によっては、大量生産品であり安価に生産できる従来のＣＤ又はＬＰを液体キャリアとして使用することが可能である。

本発明のさらなる課題は、本発明による方法を実施するための装置であり、この装置は、その上に液体キャリアを位置決めすることができるテーブル、及び分配バーと、テーブル及び／又は分配バーの駆動装置とを備える。

他の実施態様では、単一又は複数の顕微鏡スライドを液体キャリアとして使用することが考慮される。

このような一実施態様では、テーブル及び／又は液体キャリアは三角形の断面を有するように作製される。三角形の液体キャリアの表面は、隣接して置かれる一又は複数の任意の顕微鏡スライドの大きさを有するように作製することができる。また、この大きさは、例えば７８ｍｍ×１５２ｍｍの面積（すなわち、二つの顕微鏡スライドの２倍）によって、又は１０４ｍｍ×１５２ｍｍの面積（すなわち、二つの顕微鏡スライドの４倍）によって、又は１０４ｍｍ×７６ｍｍの面積（すなわち、一つの顕微鏡スライドの４倍）によって、概ねＣＤの大きさ（すなわち、約１１１．３３ｃｍ^２）の面積値を有することができる。これに代えて、ＬＰ（すなわち、レコード）サイズの面積を選択することができ、この場合面積は、２６ｍｍ×７６ｍｍの大きさを有する約３０の顕微鏡スライドを様々に配置して四角形にすることにより、達成される。

代替的な一実施態様では、テーブル及び／又は液体キャリアは円形の断面を有するように作製される。この場合、液体キャリアは、マシン又はユーザによる操作のために中央に穴を有することができる。ＣＤには普通であるように、このようにして未使用の液体キャリア、及び場合によっては乾燥した細胞成分を伴う液体キャリアを保存及び格納することは、スピンドル内で、すなわちいわゆるケーキ箱（ｃａｋｅｂｏｘ）内で行われ、キャリアは空間を節約するために互いに上下に重ね合わせて積まれる。

また、この装置では、分配バー及びテーブル間の距離が分配バーの長さ全体にわたって一定となるように、分配バーの長手軸がテーブルと０°の角度をなすことが好ましい。しかしながら、これに代えて、０°〜１５°の角度、又は＞０°且つ＜５°の角度を付与することにより、テーブルの中央部における分配バー及びテーブル間の距離がテーブルの端部より小さくなるという仕様にしてもよい。これにより、運動中に細胞成分が液体キャリアの端部に向かってさらに押し出されるという効果が得られる。

本発明の有利な一実施態様では、分配バー及び／又は液体キャリアは、運動中に所定の距離を維持するための位置決め要素を有することができる。既述のように、分配バー及び液体キャリア間の５０〜１０００μｍ又は３５０〜１０００μｍという本発明による距離は、本発明に不可欠であり、運動中に維持されなければならない。通常、分配バーは支持構造上に可動に装着される、及び／又は上に分配バーが固定された支持構造はテーブルに対して可動に位置決めされるため、材料の疲労により、時間の経過と共に、既存の製作公差の逸脱が起こることがあり、そのようなとき本発明により必要とされる分配バー及び液体キャリア間の距離は維持されない。この対策として、位置決め要素が使用される。一実施態様では、位置決め要素は液体キャリアの縁に設けられて外壁の性質を持つ。それと同時に、液体キャリアの外側境界要素を作り、液体及び／又はその中に懸濁された細胞成分が液体キャリアから出てゆくことを防止する。液体キャリアが中央に穴を有する場合、位置決め要素は、液体及び／又はその中に懸濁された細胞成分が液体キャリアから出てゆかないように、液体キャリアの外縁と、穴を確定するその中央の両方に設けることができる。本発明のさらなる実施態様では、運動中に液体キャリアを離れないように、懸濁される細胞成分は粘性である。

一実施態様では、装置はアプリケーターピペットを有する。アプリケーターピペットにより、細胞成分を含有する液体を液体キャリア上に、特異的に、すなわち一点ずつ適用することができる。アプリケーターピペットは、分配バーに連結させることができ、例えばレールガイド又はクランプガイド（すなわち、アプリケーターピペット用のホルダを有する分配バー上に可動に配置されたクランプ）を介して、分配バー上で可動に支持することができる。

装置は、アプリケーターピペットを伴わなくてもよく、すなわちこの場合、細胞成分を含む液体は、外部フィード又は供給装置を介して液体キャリアに供給される。外部フィード又は供給装置は本発明による装置の一部である必要はない。外部供給装置は、フィード／供給パイプ（群）又はチューブ（群）を介して分配バーの出口に連結することができる。これに代えて、装置は、従業員が手動で液体を液体キャリアに適用しなければならないように作製することもできる。アプリケーターピペットは、分配バーから分離することもできる。

一実施態様では、液体キャリアの表面は、抗体及び／又は脂溶性分子によるコーティングを有する、及び／又は少なくとも部分的に静電的に帯電する、及び／又は液体キャリアはポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、又はガラスである材料からなる。このようなコーティング又は表面処理の意図は、細胞／細胞成分の液体キャリアの上側表面への付着／保持を助けることである。

細胞生物学の分野では、大量の材料が使用されうる。原則として、これらは本方法及び本装置において適切である。一般的な材料は、ポリエチレンテレフタラートのようなプラスチック、ポリカーボネート、ポリスチレン、及びポリメチルメタクリレート、及びホウケイ酸ガラスのようなガラスである。さらに、表面は、金、二酸化チタン、ジルコニウムなどとすることができる。加えて、これら表面は、物理的又は科学的に、例えばＩ型コラーゲン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、フィブロネクチン、又はラミニンによるタンパク質コーティングにより修飾することができる。また、例えば抗体、ストレプトアビジン、又は脂溶性分子によるコーティングを有するもののような、官能化された表面が可能である。この目的は、付着の非特異的改善により、又は特定種の付着の改善により、細胞成分の付着を制御することである（例えば、抗体を用いた官能化により）。

乾燥プロセスは、十分な時間の、恐らくは数時間の風乾によって、或いは、適用された、対象の細胞を含有する流体層を乾燥させるために、温風又は循環気が使用される場合は、それよりも短い時間で行われる。この時間の間に、細胞は標準の顕微鏡スライドの帯電した表面に沈着して結合する。これらスライドには、典型的に、静電的に細胞標品又は細胞学的試料を引き付け、それらをスライドに結合させて、細胞標品をイオン的にガラスに結合させるブリッジを形成する恒久的な正の電荷が付与される。この乾燥プロセスは、事前に固定された細胞に対して実行されてもよい。乾燥プロセスは、スライドを〜３７℃に加熱する（例えば、スライドを加熱した表面上に位置決めする）ことにより、さらに加速することができる。

本発明のさらなる利点及び実施態様は、添付図面と併せた以下の説明により明らかとなる。

第１の実施態様による本発明の装置の上面図である。 第１の実施態様による本発明の装置の側面図である。 第２の実施態様による本発明の装置の斜視図である。 第２の実施態様による本発明の装置の上面図である。 第２の実施態様による本発明の装置の側面図である。 分配バーの斜視図と、図示の分配バーに可能ないくつかの断面とを示す。 内部構造を有する分配バーの図式的斜視図である。 第３の実施態様による本発明の装置の斜視図である。

図１は、一実施態様による本発明の装置の上面図である。テーブル１１の上に、上面１２ａを有する液体キャリア１２が位置決めされており、上面１２ａの上に、細胞成分を含有する液体が配置される又は配置可能である。テーブル１１の面積は、液体キャリア１２の面積よりいくらか大きいので、液体キャリア１２が完全にテーブル１１に載ることができる。さらに分配バー１３が示されており、図では分配バー１３は二つの支持構造１４及び１５によって両端に固定されている。支持構造１４及び１５は、互いに独立の部品とすることができるが、互いに連結されてもよい。加えて、支持構造１４及び１５は、図１の矢印によってその運動の方向１６及び１７は示されるようにテーブル１１の一辺に沿って同時に、又は別々に動くことができるように、ドライブに連結することができる。

図２は、図１に示す本発明による装置の第１の実施態様の側面図である。この実施態様によれば、テーブル１１は中央に位置決めされたプラットフォーム１８を有し、その上に液体キャリア１２が位置決めされる。プラットフォーム１８は、液体キャリア１２の面積よりいくらか小さい面積を有している。これは、装置のユーザが、液体キャリア１２のプラットフォーム１８の上に張り出した部分によって形成される突出部１９を下方から把持することによって、テーブル１１から液体１２キャリアを容易に取り外すことができるので有利である。テーブル１１は、液体キャリア１２を解放可能に保持する保持装置を備えてもよい。さらには、図示のように、支持構造１４及び１５は高さ調節可能である。すなわち、支持構造１４及び１５は、図２に運動の方向を示す矢印２１によって示すように、分配バー１３の、液体キャリア表面１２ａ及びテーブル１１からの距離２０が設定可能となるように、電気的に及び／又は機械的に駆動可能である。

図３は、本発明の別の実施態様による装置の斜視図である。テーブル３１の上に、上面３２ａを有する液体キャリア３２が位置決めされており、上面３２ａの上に、細胞成分を含有する液体を配置することができる。加えて、支持構造３４に装着された分配バー３３が示されており、その長手軸５６は少なくとも部分的に液体キャリア３２の一領域の上に延びている。分配バー３３は、この実施例では図２の参照番号２１によって示されるように、高さ調節可能に支持構造３４に装着される。加えて、分配バー３３は、長手軸５６上に分配することができる複数の（この場合は例として五つの）入口及び／又は出口３６を有する。入口及び／又は出口３６は、図７を参照してさらに詳細に説明されるように、パイプに接続可能である。図３に示す実用的な実施例では、入口及び／又は出口３６は、支持構造３４の一部である真空パイプ３７及びフィードパイプ３８に連結される。

さらには、アプリケーターピペット７７が示されており、このアプリケーターピペット７７は、図示の実用的実施例によれば、分配バー３３に連結されている。細胞成分を含有する液体は、厳密には、アプリケーターピペット７７を介して液体キャリアの上面３２ａに適用される。アプリケーターピペット７７は、例えばレールガイド（図示しない）を介して、分配バー３３に対して可動に装着することができる。

分配バー３３は、位置決め要素３５を用いて液体キャリアの表面３２ａ上に支持される。位置決め要素３５は、有利には、分配バー３３を中心として回転できるように、分配バー３３に対して装着することができ、その結果、位置決め要素は液体キャリア上面３２ａ上においてキャスター（ｃａｓｔｏｒ）のように回転することができる。本発明によれば、位置決め要素３５は、分配バー３３及び液体キャリアの上面３２ａ間の距離を設定できるように、高さ５０〜１０００μｍ又は３５０〜１０００μｍである。

図示の実用的実施例では、テーブル３１は分配バー３３に対して可動に作製されて、その上に液体キャリア３２が位置決めされるテーブル３１の表面に垂直な主軸３９を中心として回転可能である。このような回転運動４０は、図３の矢印によって示されている。テーブル３１の回転により、分配バー３３に対するテーブル３１の運動は、分配バー３３が液体キャリアの上面３２ａの上の液体に接触し、運動の間に液体中に乱流及び層流を生じさせるように行われ、この結果、液体中の細胞成分が旋回することにより、液体中の細胞成分の均質分布が得られる。装置の一修正例（図示しない）では、テーブル３１を空間中に固定して位置決めすることができ、上に分配バー３３が装着された支持構造３４をテーブル３１を中心として回転させることにより、液体キャリア表面３２ａ上において液体並びにそれに含有される細胞成分の均一分布が同様に達成される。

図４は、円形テーブル３１及び円形液体キャリア３２を有する本発明による装置の第２の実施態様の上面図を示す。図示の実施態様では、上に液体キャリア３２が位置決めされたテーブル３１は、矢印４１によって示されるように、その主軸３９を中心に回転する。分配バー３３は、液体キャリア３２の縁から中心に向かって液体キャリア３２の直径の概ね半分の上に延びる。液体キャリア３２は、その中心に、機械的把持アーム又はユーザによる操作のための穴４２を有する。

分配バー３３は、液体キャリア３２の平面内において、矢印によって示される二つの運動の方向４３及び４４に手動で独立に動かすことができる単一の支持体により、自由に旋回するように支持構造３４に装着される。したがって、上に分配バー３３が装着された支持構造３４のトラッキングが可能である。分配バー３３は、図示の運動方向３４及び４４の一方に、テーブル３１からトラッキングすることができ、これにより妨害されることなく液体キャリアの上面３２ａにアクセスすることが可能である。

加えて、支持体が、矢印４５によって示されるように回転可能であることにより、分配バー３３がその一端を中心に回転することが可能である。この実施態様では、本発明による装置の構造は、レコード上に針を載せることができ、レコードから再び針を除去することができるレコードプレーヤーの構造に類似しており、この場合、針は概ね分配バー３３の自由端に位置しているものと想定される。したがって、分配バー３３は、図４に点線で示される休止位置４７に移転可能である。休止位置４７では、例えば、液体キャリア３２に対してスムーズにアクセスすることができる。

必要であれば、分配バーの先端４６は、図示のように液体キャリア３２の中央ではなく、液体キャリアの上面３２ａのどの位置に位置決めされてもよく、液体キャリア３２の縁と分配バー３３の間の角度αは９０°以外に選択することもできる。この場合、液体キャリア３２の回転の間に液体が分配バー３３に付着することにより、液体は、回転方向に応じて確実に液体キャリア３２の縁に向かって又は中央に向かう方向に移動する。アプリケーターピペットが、最初に液体キャリア上面３２ａの中央に液体を分配する場合、角度αを９０°未満に設定しながら、分配バー３３を液体キャリアの上面３２ａの半径の長さにわたって延ばすことにより、例えば、液体キャリア上に適用後に液体キャリアの中心に最大に分布する液体及びその中に懸濁される細胞成分を、運動により縁の方向にさらに強く押し出して、均質に分布させることが有利である。

図５では、図４及び３による実用的実施例によるデバイスの側面図を示している。テーブル３１はその中央に、液体キャリア３２の操作の改善に寄与するプラットフォーム１８を有する。本発明による距離２０は、分配バー３３と液体キャリアの上面３２ａとの間に設定される。分配バー３３は、高さ調節可能な支持体３４上に装着される。この場合も、高さの調節は矢印２１によって示されるように可能である。もう一つの矢印４１は、テーブル３１がその主軸３９を中心として回転可能であることを示す。この実施態様では、テーブル３１は、中心に、液体キャリア３２を保持するスピンドル５３を有する。スピンドル５３は、テーブル３１の表面上における極めて正確な液体キャリア３２の位置決めを可能にする。さらに二つの矢印５４及び５５は、分配バー３３を、支持体１４上に、その長手軸５６を中心として旋回可能に装着することもできることを示す。これにより、分配バー３３と液体キャリア３２との間の角度を、分配バー３３及び液体キャリアの上面３２ａ間の距離が液体キャリア３２の半径上で変動可能に設定できるように設定できる。

図６の分配バー６３は二つの位置決め要素６５を有し、これらの高さに５０〜１０００μｍ、又は３５０〜１０００μｍの差６６があることにより、本発明による分配バー６３及び液体キャリア間の距離が確実に得られる。加えて、分配バー６３の断面の種々の実施態様が示されている。第１の実施態様では、角を丸めた四角形６７の形態の断面が提供されており、この場合、構築されたデバイス内で四角形の短辺を液体キャリアの方に向けることができる。代替的な実施態様では、参照番号６８によって示すように、分配バー６３の断面は四角形にすることができる。さらなる一実施態様では参照番号６９によって示されるように、例えば両凸の、凸レンズ形態の断面が提供されている。参照番号７０によって示されるさらなる実施態様によれば、分配バー６３にはダイヤモンド形の断面も提供可能である。凸面はすべての実施態様に共通である。これら実施態様では、凸面は常に液体に向かう前進運動の方向に向けられる。さらには、平凸断面領域又は凹凸レンズの形態の領域が可能であり、この場合、最後の二つの実施態様において、液体キャリア上の分配バー６３の運動方向は、凹形状の領域が常に前進運動の方向に向くように提供される。

図７は、中央に、真空ポンプ及び／又は液体タンクに接続可能なチャネル７４を有する分配ロッド７３の内面図であり、分配ロッド７３は、中央チャネル７４に接続される複数の出口及び／又は入口７６を有する。代替的に、前記機能の一又は複数を有する複数のチャネル７４を分配バー７３に設けることができる。

図８は、別の実施態様による本発明の装置の斜視図である。テーブル１１上には多数のプラットフォーム１８が位置決めされ、その上に液体キャリア（群）８１が位置決めされる。プラットフォーム１８は、液体キャリア８１の面積よりいくらか小さい面積を有し、周囲の空気の障壁による表面張力によって液体を封じ込める。隣接する液体キャリア８１、例えば顕微鏡スライドは、十分に大きな間隙８３及び８４によって分離され、隣接するキャリアに流体を橋渡しすることなく個々のキャリア８１上に液体アリコートを包含する。分配バー１３は液体キャリアの上面８１ａの上の液体に接触し、運動の間に液体中に乱流及び層流を生じさせ、この結果、液体中の細胞成分が旋回することにより、液体中の細胞成分の均質分布が得られる。

さらには、アプリケーターピペット７７が示されており、このアプリケーターピペット７７は、実用的実施例によれば、分配バー１３に連結されている。細胞成分を含有する液体は、アプリケーターピペット７７を介して液体キャリアの上面８１ａ上に特異的に適用される。アプリケーターピペット７７は、例えばレールガイド（図示しない）を介して、分配バー３３に対して可動に装着することができる。代替的に、アプリケーターピペットは、分配バー１３から分離することもできる。

液体キャリア８１の各々が固有の同定領域８２を有し、同定領域８２は、個々のキャリア又は一組のキャリアに適用された試料の参照を可能にする。同定手段は、事前印刷されたラベル、バーコード、手動で作成された情報、又は他の電子手段によるものとすることができる。

Claims (17)

1. 表面上の液体中に懸濁された細胞成分を均質に分布させる方法であって、
   ａ．上面を有する液体キャリアをテーブル上に、水平に配置すること、
   ｂ．液体キャリアの上面の上方３５０μｍ〜１０００μｍの距離に分配バーを、水平に配置すること、
   ｃ．中に細胞成分が懸濁された液体を、分配バーの少なくとも一部分が液体中に浸漬される液体レベルで、液体キャリアの上面に適用すること、及び
   ｄ．分配バー、テーブル、及び液体キャリアのうちの一又は複数を動かすことにより、分配バーの少なくとも一部分が液体中に浸漬し、液体キャリアの上面の上の液体中に懸濁された細胞成分を均一に分布させること
   を含む、方法。
2. 液体中の細胞成分が分離されている、請求項１に記載の方法。
3. 液体中の細胞成分は、細胞学細針吸引により得られる細胞成分、パパニコロウ検査により得られる細胞成分、又は循環腫瘍細胞成分を含む、請求項１に記載の方法。
4. 液体キャリアの上面が、コーティング又は他の細胞保持特性を有する、請求項１に記載の方法。
5. テーブル上に位置決めされた液体キャリアの表面は、その上に、少なくとも部分的に静電的に帯電した表面を有するか、或いは一又は複数の抗体及び／又は脂溶性分子のコーティングを有する、請求項４に記載の方法。
6. ａ．液体キャリアの表面上において液体が均質に分布した後で液体を除去することであって、細胞成分の均一層がキャリア表面上に保持される、除去するステップと、
   ｂ．キャリア表面上に均一に細胞成分が保持されるように液体キャリアを乾燥させるステップと、
   ｃ．液体キャリアを乾燥させた後で、その上に保持された細胞成分を固定又は染色するために、液体キャリアの上面に一又は複数のさらなる流体を適用するステップと
   のうちの少なくとも一つのステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 液体中に懸濁された細胞成分は、検出対象となる少なくとも一つの亜群を含む、請求項１に記載の方法。
8. 液体キャリアは顕微鏡スライドである、請求項１に記載の方法。
9. 液体キャリアは円形である、請求項１に記載の方法。
10. 液体キャリアの上面の面積は少なくとも１００ｃｍ^２であるか、１００ｃｍ^２〜１０００ｃｍ^２であるか、或いはＣＤ又はレコードの大きさである、請求項９に記載の方法。
11. 表面上の液体中に懸濁された細胞成分を均質に分布させるための装置であって、
    ａ．その上に液体キャリアを水平に配置することのできるテーブル、
    ｂ．テーブル上に水平に配置された液体キャリアに、中に細胞成分が懸濁された液体を適用するための液体適用装置、
    ｃ．液体キャリアの上方に、液体キャリアから離間させて配置され、テーブル上に水平に配置される分配バー、及び
    ｄ．液体キャリア表面全体に均一に液体を移動させるために、テーブル、分配バー、又はそれらの両方を、個別に又は同時に動かすことのできる駆動装置
    を備え、
    分配バー、液体キャリア、又はそれら両方は、駆動装置の係合中に液体キャリア表面から固定の距離を維持するための位置決め要素を有しており、距離は３５０μｍ〜１０００μｍである、装置。
12. 液体キャリア上の液体が分配バーに付着する分配バーの断面は凸状である、請求項１１に記載の装置。
13. 液体キャリアは一又は複数の顕微鏡スライドを含む、請求項１１に記載の装置。
14. 液体キャリアの断面は円形である、請求項１１に記載の装置。
15. 液体適用装置は、分配バー内に、中央チャネルと、一又は複数の入口又は出口とを含む、請求項１１に記載の装置。
16. 液体適用装置はピペットである、請求項１１に記載の装置。
17. テーブル上に位置決めされた液体キャリアの表面は、少なくとも部分的に静電的に帯電した表面を有するか、或いは一又は複数の抗体及び／又は脂溶性分子のコーティングを有する、請求項１１に記載の装置。

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