JP6252639B2 - Collagen-like polypeptide - Google Patents
Collagen-like polypeptide Download PDFInfo
- Publication number
- JP6252639B2 JP6252639B2 JP2016176380A JP2016176380A JP6252639B2 JP 6252639 B2 JP6252639 B2 JP 6252639B2 JP 2016176380 A JP2016176380 A JP 2016176380A JP 2016176380 A JP2016176380 A JP 2016176380A JP 6252639 B2 JP6252639 B2 JP 6252639B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gly
- polypeptide
- pro
- collagen
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 146
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 123
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 121
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims description 21
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical group O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 19
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 11
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 description 34
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 27
- 208000012886 Vertigo Diseases 0.000 description 25
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 25
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 20
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 19
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 14
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 14
- HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 13
- CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N Glu-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O CQAHWYDHKUWYIX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 11
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 10
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 10
- -1 diamine sulfoxide Chemical class 0.000 description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical class C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 7
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 7
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 7
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 6
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 6
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 6
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 5
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 5
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 4
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 4
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 4
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 3
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000005062 Polybutadiene Substances 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012024 dehydrating agents Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 2
- TZIHFWKZFHZASV-UHFFFAOYSA-N methyl formate Chemical compound COC=O TZIHFWKZFHZASV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 2
- 229920002857 polybutadiene Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N trans-4-Hydroxy-L-proline Natural products O[C@@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloroethane Chemical compound CC(Cl)(Cl)Cl UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZXUZKXVROWEIF-UHFFFAOYSA-N 1,2-butylene carbonate Chemical compound CCC1COC(=O)O1 ZZXUZKXVROWEIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon Chemical compound CN1CCN(C)C1=O CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical compound C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNQIGYRDLYROLW-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2h-1,2,3-benzotriazine Chemical class C1=CC=C2N(O)NN=CC2=C1 FNQIGYRDLYROLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQKFPGMGQXQHLP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxytriazole Chemical class ON1C=CN=N1 FQKFPGMGQXQHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWIIJDNADIEEDB-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound CN1CCOC1=O VWIIJDNADIEEDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGHDLJAZIIFENW-UHFFFAOYSA-N 4-[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(4-hydroxy-3-prop-2-enylphenyl)propan-2-yl]-2-prop-2-enylphenol Chemical group C1=C(CC=C)C(O)=CC=C1C(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C1=CC=C(O)C(CC=C)=C1 QGHDLJAZIIFENW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N Diethyl carbonate Chemical compound CCOC(=O)OCC OIFBSDVPJOWBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N Methyl propionate Chemical compound CCC(=O)OC RJUFJBKOKNCXHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N N-methylmorpholine N-oxide Chemical compound CN1(=O)CCOCC1 LFTLOKWAGJYHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- WJEIYVAPNMUNIU-UHFFFAOYSA-N [Na].OC(O)=O Chemical compound [Na].OC(O)=O WJEIYVAPNMUNIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003522 acrylic cement Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N butadiene-styrene rubber Chemical compound C=CC=C.C=CC1=CC=CC=C1 MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- IEJIGPNLZYLLBP-UHFFFAOYSA-N dimethyl carbonate Chemical compound COC(=O)OC IEJIGPNLZYLLBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920005558 epichlorohydrin rubber Polymers 0.000 description 1
- 229920006332 epoxy adhesive Polymers 0.000 description 1
- HQQADJVZYDDRJT-UHFFFAOYSA-N ethene;prop-1-ene Chemical group C=C.CC=C HQQADJVZYDDRJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- LCFXLZAXGXOXAP-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-cyano-2-hydroxyiminoacetate Chemical compound CCOC(=O)C(=NO)C#N LCFXLZAXGXOXAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBTWLSYIZRCDFO-UHFFFAOYSA-N ethyl methyl carbonate Chemical compound CCOC(=O)OC JBTWLSYIZRCDFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L fluoridophosphate Chemical compound [O-]P([O-])(F)=O DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N hexafluoroacetone Chemical compound FC(F)(F)C(=O)C(F)(F)F VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012943 hotmelt Substances 0.000 description 1
- 229920002681 hypalon Polymers 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical group [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940017219 methyl propionate Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001084 poly(chloroprene) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- GDPAAHQJTGLHGR-UHFFFAOYSA-N propan-2-one;thiolane 1,1-dioxide Chemical compound CC(C)=O.O=S1(=O)CCCC1 GDPAAHQJTGLHGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUOJZAUFBMNUDX-UHFFFAOYSA-N propylene carbonate Chemical compound CC1COC(=O)O1 RUOJZAUFBMNUDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical group C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Description
本発明は、従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチドに関する。 The present invention relates to a collagen-like polypeptide having a higher molecular weight than conventional ones.
タンパク質の一種であるコラーゲンは、汎用的な医用材料として幅広く用いられている。天然の一型コラーゲン分子は三アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しから成る特徴的な一次構造を有する。このポリペプチドが同じ向きに３本寄り集って形成された三重らせんの三次構造をとり、コラーゲン繊維を形成する。 Collagen, a kind of protein, is widely used as a general-purpose medical material. A natural type 1 collagen molecule has a characteristic primary structure consisting of repeating three amino acid residues Gly-XY (X and Y are various amino acids, X is often Pro and Y is often Hyp) . This polypeptide takes the tertiary structure of a triple helix formed by gathering three in the same direction to form collagen fibers.
一方、コラーゲン様ポリペプチド（いわゆる合成コラーゲン）として創出された、三アミノ酸残基Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙ：プロリンまたはヒドロキシプロリン）の繰り返し構造からなるポリペプチド分子も、三重らせん構造をとることが報告されている（非特許文献１〜２）。
コラーゲン様ポリペプチドは、天然コラーゲンと異なり、感染症の危険性がないこと、工業的合成により得られるため安定な供給が可能であること、三重らせん構造の熱安定性が高いこと、着色やにおいなどがないことなど、諸々の優れた性質を有するため、様々な機能性材料としての研究がなされている（特許文献１等）。
On the other hand, a polypeptide molecule composed of a repeating structure of three amino acid residues Pro-Y-Gly (Y: proline or hydroxyproline) created as a collagen-like polypeptide (so-called synthetic collagen) can also have a triple helical structure. It has been reported (Non-Patent Documents 1 and 2).
Collagen-like polypeptides, unlike natural collagen, have no risk of infection, can be supplied stably by industrial synthesis, have a high thermal stability of triple helical structure, and can be colored or smelled. Therefore, various functional materials have been studied (Patent Document 1, etc.).
通常、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（ＹはＨｙｐまたはＰｒｏ）で示されるフラグメントを含むペプチドオリゴマーの縮合反応により製造される。例えば、特許文献２には、−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−（ＹはＨｙｐまたはＰｒｏ、ｎ＝１〜２０）で示されるペプチドフラグメントを含むペプチドオリゴマーを、ジメチルスルホキシド中やエチレンジアミンを含む水系溶媒等中で縮合反応させる方法が記載されている。 Usually, a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain is produced by a condensation reaction of a peptide oligomer containing a fragment represented by-(Pro-Y-Gly) n- (Y is Hyp or Pro). For example, Patent Document 2 discloses that a peptide oligomer containing a peptide fragment represented by-(Pro-Y-Gly) n- (Y is Hyp or Pro, n = 1 to 20), an aqueous system containing diamine sulfoxide or ethylenediamine. A method of performing a condensation reaction in a solvent or the like is described.
しかしながら、コラーゲン様ポリペプチド複合体を機能性材料として活用する場合、その加工性や物性について難点が存在する場合がある。
例えば、近年ナノファイバーが材料形態として着目されているところ、コラーゲン様ポリペプチドをナノファイバー化するに際して従来のものでは困難があった。すなわち、天然コラーゲン分子とは異なるコラーゲン様ポリペプチドはＰｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙのみからなる単純な繰り返し構造であるため、高分子ペプチドでありながら分子鎖間の相互作用に乏しく、コラーゲン様ポリペプチド単独で紡糸しようとしても途切れたりビーズが形成されたりして繊維状のものが得られなかった。
また、例えば、コラーゲン様ポリペプチドをポリマー材料として用いる場合、従来のものでは力学的強度が不十分であった。
However, when a collagen-like polypeptide complex is utilized as a functional material, there may be a difficulty in its processability and physical properties.
For example, in recent years, nanofibers have been attracting attention as a material form, and there have been difficulties in the prior art when converting collagen-like polypeptides into nanofibers. That is, since a collagen-like polypeptide different from a natural collagen molecule is a simple repeating structure consisting only of Pro-Y-Gly, the interaction between the molecular chains is poor although it is a high molecular peptide. Even when trying to spin, fibers were interrupted or beads were formed, and a fibrous product could not be obtained.
Further, for example, when a collagen-like polypeptide is used as a polymer material, the mechanical strength is insufficient with the conventional one.
これらの問題点は、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体の分子量の大きさに起因することを本発明者らは初めて見出し、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体をより高分子量化することにより解消しうると考えた。しかしながら、所望の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を得る製造方法は開発が進んでいなかった。
その理由として、コラーゲン様ポリペプチド複合体は巨大な会合構造を形成するため、正確な分子量を調べることが非常に困難であることが挙げられる。そのような状況では、得られる生成物の分子量を制御しようとしても、分子量の評価がし難いため、所望の分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得る方法の開発が進捗しないという問題もあり、その解決方法も望まれている。
The present inventors found for the first time that these problems are caused by the molecular weight of the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain and the complex thereof, and the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain and the complex thereof. It was thought that this could be resolved by increasing the molecular weight of the polymer. However, a production method for obtaining a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain having a desired molecular weight, particularly a high molecular weight, has not been developed.
The reason is that the collagen-like polypeptide complex forms a huge association structure, so that it is very difficult to examine the exact molecular weight. In such a situation, even if it is attempted to control the molecular weight of the product to be obtained, it is difficult to evaluate the molecular weight, so there is also a problem that development of a method for obtaining a collagen-like polypeptide having a desired molecular weight does not progress. Is also desired.
上記の状況に鑑み、本発明は従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造する際に、得られる生成物の分子量を所望の大きさに制御する方法を提供することをも課題とする。 In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a method for producing a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain having a higher molecular weight than conventional ones. Another object of the present invention is to provide a method for controlling the molecular weight of the resulting product to a desired size when producing a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain.
本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、コラーゲン様ポリペプチドをオリゴマーの縮合反応により製造する際に、該反応を水系溶媒中で行い、該溶媒中のリン酸イオン濃度を調節することによってより高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを製造できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ 下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合反応させる工程を含むポリペプチドの製造方法であって、前記縮合反応を０Ｍ以上０．０１Ｍ未満のリン酸イオンを含む水系溶媒中で、縮合剤又は縮合剤及び縮合助剤の存在下で行うことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ （３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０整数である。）
［２］ リン酸イオンを含む水系溶媒中で、下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプチドオリゴマーを縮合させる反応において、前記リン酸イオンの濃度を０〜０．２Ｍの範囲で調節することにより前記縮合反応の生成物の分子量を制御する方法。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ （３）
（式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは１〜１０の整数である。）
［３］ 下記式（４）で表されるペプチドフラグメントを有するポリペプチド。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ― （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｍは１００〜１７１の整数である。）
［４］ 単分子鎖の重量平均分子量が２６，７００〜４５，６００である、［３］に記載のポリペプチド。
［５］ ［３］または［４］に記載のポリペプチドを含有するナノファイバー。
The inventors of the present application have conducted intensive research to solve the above-mentioned problems. When producing a collagen-like polypeptide by condensation reaction of oligomers, the reaction is carried out in an aqueous solvent, and the phosphate ion concentration in the solvent is determined. It has been found that a higher molecular weight collagen-like polypeptide can be produced by adjusting.
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for producing a polypeptide comprising a step of subjecting a peptide oligomer represented by any one of the following formulas (1) to (3) to a condensation reaction, wherein the condensation reaction is performed at 0 M or more and less than 0.01 M phosphoric acid. A method for producing a polypeptide, which is carried out in an aqueous solvent containing ions in the presence of a condensing agent or a condensing agent and a condensing aid.
H- (Pro-Y-Gly) n- OH (1)
H- (Y-Gly-Pro) n- OH (2)
H- (Gly-Pro-Y) n- OH (3)
(In formulas (1) to (3), Y is hydroxyproline or proline, and n is an integer of 1 to 10.)
[2] In the reaction of condensing the peptide oligomer represented by any of the following formulas (1) to (3) in an aqueous solvent containing phosphate ions, the phosphate ion concentration is set to 0 to 0.2 M. A method of controlling the molecular weight of the product of the condensation reaction by adjusting the range.
H- (Pro-Y-Gly) n- OH (1)
H- (Y-Gly-Pro) n- OH (2)
H- (Gly-Pro-Y) n- OH (3)
(In formulas (1) to (3), Y is hydroxyproline or proline, and n is an integer of 1 to 10.)
[3] A polypeptide having a peptide fragment represented by the following formula (4).
― (Pro-Y-Gly) m ― (4)
(In formula (4), Y is hydroxyproline or proline, and m is an integer of 100 to 171.)
[4] The polypeptide according to [3], wherein the weight average molecular weight of the single molecular chain is 26,700 to 45,600.
[5] A nanofiber containing the polypeptide according to [3] or [4].
本発明によれば、簡便かつ安価な手段によって、生成するコラーゲン様ポリペプチドの
分子量を所望の大きさに制御することができ、従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得る手段が提供される。種々の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチドを得られることにより、その加工性が飛躍的に向上し、機能性材料としての用途の幅が広がる。
According to the present invention, the molecular weight of a collagen-like polypeptide to be produced can be controlled to a desired size by simple and inexpensive means, and a means for obtaining a collagen-like polypeptide having a higher molecular weight than before is provided. . By obtaining collagen-like polypeptides having various molecular weights, particularly high molecular weights, the processability is dramatically improved and the range of uses as functional materials is expanded.
本明細書においては、「コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖」とは、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン）の繰り返し配列を有するポリペプチドであって、三重らせん等の分子鎖間相互作用による構造を取らずに１本鎖として存在する状態をいう。また、「コラーゲン様ポリペプチド複合体」とは、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造をとった状態を示す。多くの場合において、コラーゲン様ポリペプチド複合体はさらに、三重らせんが分岐構造をとったり、三重らせん分子間で会合したりする高次構造を形成する。なお、三重らせん構造をとっているか否かは後述するように円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。 In the present specification, the “collagen-like polypeptide (single molecule) chain” is a polypeptide having a repeating sequence of Pro-Y-Gly (Y is hydroxyproline or proline), and is a molecular chain such as a triple helix. A state in which the structure exists as a single chain without taking a structure due to the inter-action. The “collagen-like polypeptide complex” indicates a state in which a collagen-like polypeptide (single molecule) chain has a triple helical structure. In many cases, the collagen-like polypeptide complex further forms a higher order structure in which the triple helix takes a branched structure or associates between triple helix molecules. Whether or not the triple helical structure is taken can be confirmed by measuring a circular dichroism spectrum as described later.
本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。
In the present specification, various amino acid residues are described by the following abbreviations.
Ala: L-alanine residue Arg: L-arginine residue Asn: L-asparagine residue Asp: L-aspartic acid residue Cys: L-cysteine residue Gln: L-glutamine residue Glu: L-glutamic acid residue Gly: glycine residue His: L-histidine residue Hyp: L-hydroxyproline residue Ile: L-isoleucine residue Leu: L-leucine residue Lys: L-lysine residue Met: L-methionine residue Phe: L-phenylalanine residue Pro: L-proline residue Sar: sarcosine residue Ser: L-serine residue Thr: L-threonine residue Trp: L-tryptophan residue Tyr: L-tyrosine residue Val: L-valine Residue In addition, the amino acid sequence of the peptide chain in this specification is N-terminal amino acid residue according to a conventional method With the C-terminal amino acid residue located on the right side.
＜１＞本発明のポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドの製造方法は、下記式（１）〜（３）のいずれかで表されるペプ
チドオリゴマーを縮合反応させる工程を含む。
Ｈ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ−ＯＨ （１）
Ｈ−（Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）ｎ−ＯＨ （２）
Ｈ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｙ）ｎ−ＯＨ （３）
式（１）〜（３）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、好ましくはヒドロキシプロリンである。ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。また、ｎは１〜１０の整数であり、１〜５の整数であることが、ハンドリングの容易さ、縮合反応の効率、ペプチドオリゴマーの入手の容易さや経済性の観点から好ましい。
本発明において、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーはいずれか１種を用いてもよいし、混合物であってもよい。また、ｎは単一の整数であってもよいし、種々の繰り返し数のオリゴマーの混合物であってもよい。
これらのペプチドオリゴマーは、既知の固相合成法または液相合成法により取得することができる。
式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーの他のペプチドオリゴマーを用いてもよい。ただし、式（１）〜（３）で表されるペプチドオリゴマーと他のペプチドオリゴマーとの使用量が重量比において１００：０〜５０：５０の範囲であることが好ましい。他のペプチドオリゴマーの使用量が前記範囲にあることにより、製造されるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が三重らせん構造を形成しやすくなる。
<1> Method for Producing Polypeptide of the Present Invention The method for producing a polypeptide of the present invention includes a step of subjecting a peptide oligomer represented by any one of the following formulas (1) to (3) to a condensation reaction.
H- (Pro-Y-Gly) n- OH (1)
H- (Y-Gly-Pro) n- OH (2)
H- (Gly-Pro-Y) n- OH (3)
In formulas (1) to (3), Y is hydroxyproline or proline, preferably hydroxyproline. Hydroxyproline is, for example, 4Hyp, and trans-4-hydroxy-L-proline is preferable. Moreover, n is an integer of 1-10, and it is preferable that it is an integer of 1-5 from a viewpoint of the ease of handling, the efficiency of a condensation reaction, the availability of a peptide oligomer, and economical efficiency.
In this invention, any 1 type may be used for the peptide oligomer represented by Formula (1)-(3), and a mixture may be sufficient as it. Further, n may be a single integer or a mixture of oligomers having various numbers of repetitions.
These peptide oligomers can be obtained by a known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method.
Other peptide oligomers represented by the formulas (1) to (3) may be used. However, it is preferable that the usage-amount of the peptide oligomer represented by Formula (1)-(3) and another peptide oligomer is the range of 100: 0-50: 50 in weight ratio. When the usage-amount of another peptide oligomer exists in the said range, the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain manufactured becomes easy to form a triple helix structure.
他のペプチドオリゴマーとしては、例えば下記式（５）〜（６８）で表されるペプチドオリゴマーが挙げられる。
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｏ （５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｏ （６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｏ （７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｏ （８）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （９）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１０）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１１）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１２）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１３）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１４）
（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１５）
（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１６）
（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１７）
（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１８）
（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （１９）
（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ （２０）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２２）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２３）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２４）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２５）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２６）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２７）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２８）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （２９）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３０）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３１）
（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３２）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３４）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３５）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３６）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３７）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３８）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （３９）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４０）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４１）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４２）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４３）
（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４４）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４６）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４７）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４８）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （４９）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５０）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５１）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５２）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５３）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５４）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５５）
（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５６）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５８）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （５９）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６０）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６１）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６２）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６３）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６４）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６５）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６６）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６７）
（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ （６８）
式（５）〜（２０）中ｏは１〜１０の整数であり、式（２１）〜（６８）中ｐは１〜１０の整数であり、ｑは１〜１０の整数である。ただし、縮合反応の効率及びペプチドオリゴマーの入手の容易さから、ｏ、ｐ、およびｑは独立して１〜５の整数であることが好ましく、特に好ましくは１である。
Examples of other peptide oligomers include peptide oligomers represented by the following formulas (5) to (68).
(Asp-Pro-Gly) o (5)
(Asp-Hyp-Gly) o (6)
(Glu-Pro-Gly) o (7)
(Glu-Hyp-Gly) o (8)
(Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly) o (9)
(Pro-Asn-Gly-Ile-Ala-Gly) o (10)
(Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly) o (11)
(Pro-Ile-Gly-Ile-Ala-Gly) o (12)
(Pro-Val-Gly-Ile-Ala-Gly) o (13)
(Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly) o (14)
(Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly) o (15)
(Pro-Asn-Gly-Leu-Ala-Gly) o (16)
(Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly) o (17)
(Pro-Ile-Gly-Leu-Ala-Gly) o (18)
(Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Gly) o (19)
(Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly) o (20)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly) q (21)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Ile-Ala-Gly) q (22)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly) q (23)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Ile-Ala-Gly) q (24)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Ile-Ala-Gly) q (25)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly) q (26)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly) q (27)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Leu-Ala-Gly) q (28)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly) q (29)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Leu-Ala-Gly) q (30)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Gly) q (31)
(Asp-Pro-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly) q (32)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly) q (33)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Ile-Ala-Gly) q (34)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly) q (35)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Ile-Ala-Gly) q (36)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Ile-Ala-Gly) q (37)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly) q (38)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly) q (39)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Leu-Ala-Gly) q (40)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly) q (41)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Leu-Ala-Gly) q (42)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Gly) q (43)
(Asp-Hyp-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly) q (44)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly) q (45)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Ile-Ala-Gly) q (46)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly) q (47)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Ile-Ala-Gly) q (48)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Ile-Ala-Gly) q (49)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly) q (50)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly) q (51)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Leu-Ala-Gly) q (52)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly) q (53)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Leu-Ala-Gly) q (54)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Gly) q (55)
(Glu-Pro-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly) q (56)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly) q (57)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Ile-Ala-Gly) q (58)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly) q (59)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Ile-Ala-Gly) q (60)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Ile-Ala-Gly) q (61)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly) q (62)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly) q (63)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Asn-Gly-Leu-Ala-Gly) q (64)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly) q (65)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Ile-Gly-Leu-Ala-Gly) q (66)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Val-Gly-Leu-Ala-Gly) q (67)
(Glu-Hyp-Gly) p- (Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly) q (68)
In formulas (5) to (20), o is an integer of 1 to 10, in formulas (21) to (68), p is an integer of 1 to 10, and q is an integer of 1 to 10. However, from the viewpoint of the efficiency of the condensation reaction and the availability of peptide oligomers, o, p, and q are preferably independently an integer of 1 to 5, particularly preferably 1.
本発明の製造方法における縮合反応は、リン酸イオンを含む水系溶媒中で行う。
本発明において水系溶媒とは、水を含む溶媒であり、有機溶媒が水系溶媒に混入していてもよい。ここで、有機溶媒とは、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）をいう。また、混入してもよいとは、含有量が好ましくは５０重量％未満、より好ましくは１０重量％未満、さらに好ましくは全く含まないことをいう。
The condensation reaction in the production method of the present invention is carried out in an aqueous solvent containing phosphate ions.
In the present invention, the aqueous solvent is a solvent containing water, and an organic solvent may be mixed in the aqueous solvent. Here, the organic solvent means amides (dimethylformamide, dimethylacetamide, hexamethylphosphoramide, etc.), sulfoxides (dimethylsulfoxide, etc.), nitrogen-containing cyclic compounds (N-methylpyrrolidone, pyridine, etc.), nitriles ( Acetonitrile, etc.), ethers (dioxane, tetrahydrofuran, etc.), alcohols (methyl alcohol, ethyl alcohol, propyl alcohol, etc.). Further, “may be mixed” means that the content is preferably less than 50% by weight, more preferably less than 10% by weight, and still more preferably not contained at all.
本発明において、リン酸イオンとは、リン酸二水素イオン（Ｈ２ＰＯ４ −）、リン酸水
素イオン（ＨＰＯ４ ２−）、及びリン酸イオン（ＰＯ４ ３−）の総称であり、水系溶媒中のリン酸イオン濃度は、リン酸二水素イオン（Ｈ２ＰＯ４ −）、リン酸水素イオン（ＨＰＯ４ ２−）、及びリン酸イオン（ＰＯ４ ３−）の合計濃度である。
水系溶媒中のリン酸イオン濃度を低くすると高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができ、該濃度を高くすると低分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができ、リン酸イオン濃度を調節することによって製造されるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量を制御することができる。
具体的には、例えば水系溶媒中のペプチドオリゴマーの濃度が５重量％であるときを例に説明すると、リン酸イオン濃度が０〜０．００２５Ｍの場合は重量平均分子量４５，６００〜２６，７００のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が得られ、０．００５Ｍ以上０．０１Ｍ未満の場合は、２０，３００〜１６，０００のコラーゲン様（単分子）鎖が得られ、従来得難かった高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造できる。また、０．０１２〜０．０６Ｍの場合は重量平均分子量１３，５００〜７，１００のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が得られる。
リン酸イオン濃度は、水系溶媒にリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム等のリン酸塩を添加することにより調節できる。これらのリン酸塩は簡便かつ安価に入手でき、またその濃度の調節も簡便であるため、本発明は容易に実施することが可能である。
In the present invention, phosphate ion is a general term for dihydrogen phosphate ion (H 2 PO 4 − ), hydrogen phosphate ion (HPO 4 2− ), and phosphate ion (PO 4 3− ). The phosphate ion concentration in the solvent is the total concentration of dihydrogen phosphate ion (H 2 PO 4 − ), hydrogen phosphate ion (HPO 4 2− ), and phosphate ion (PO 4 3− ).
When the phosphate ion concentration in the aqueous solvent is lowered, a high molecular weight collagen-like polypeptide (monomolecular) chain can be produced, and when the concentration is increased, a low molecular weight collagen-like polypeptide (monomolecular) chain is produced. The molecular weight of the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain produced can be controlled by adjusting the phosphate ion concentration.
Specifically, for example, when the concentration of the peptide oligomer in the aqueous solvent is 5% by weight, when the phosphate ion concentration is 0 to 0.0025M, the weight average molecular weight is 45,600 to 26,700. Collagen-like polypeptide (monomolecular) chain is obtained, and when it is 0.005 M or more and less than 0.01 M, a collagen-like (monomolecular) chain of 20,300 to 16,000 is obtained, which has been difficult to obtain conventionally. Molecular weight collagen-like polypeptide (monomolecular) chains can be produced. In the case of 0.012 to 0.06M, a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain having a weight average molecular weight of 13,500 to 7,100 is obtained.
The phosphate ion concentration can be adjusted by adding a phosphate such as potassium dihydrogen phosphate or disodium hydrogen phosphate to an aqueous solvent. Since these phosphates can be obtained easily and inexpensively and the concentration can be easily adjusted, the present invention can be easily carried out.
本発明にかかる縮合反応において、水系溶媒中のペプチドオリゴマーの濃度は、反応効率の観点から０．１〜５０重量％であることが好ましく、反応のハンドリングの観点からは４〜２５重量％であることがより好ましい。なお、ペプチドオリゴマーの濃度を小さくすることにより、生成するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量が小さくなるように制御することもできる。
また、縮合反応を行う温度は、反応効率の観点から０〜６０℃であることが好ましく、４〜２０℃であることがより好ましい。
また、反応時間は１〜９６時間であることが好ましく、２〜４８時間であることがより好ましい。
また、縮合反応を行う水系溶媒のｐＨは特に限定されないが、通常、中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）に調整される。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができる。
また、反応効率を上げるため水系溶媒を攪拌してもよいが、特に限定されない。
In the condensation reaction according to the present invention, the concentration of the peptide oligomer in the aqueous solvent is preferably 0.1 to 50% by weight from the viewpoint of reaction efficiency, and 4 to 25% by weight from the viewpoint of reaction handling. It is more preferable. In addition, it can also control by making the density | concentration of a peptide oligomer small so that the molecular weight of the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain | strand to produce | generate will become small.
Moreover, it is preferable that the temperature which performs a condensation reaction is 0-60 degreeC from a viewpoint of reaction efficiency, and it is more preferable that it is 4-20 degreeC.
The reaction time is preferably 1 to 96 hours, more preferably 2 to 48 hours.
In addition, the pH of the aqueous solvent for performing the condensation reaction is not particularly limited, but is usually adjusted to near neutral (pH = about 6 to 8). Adjustment of pH can be normally performed using inorganic bases (sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogencarbonate, etc.), organic bases, inorganic acids (hydrochloric acid, etc.), and organic acids.
Further, the aqueous solvent may be stirred to increase the reaction efficiency, but is not particularly limited.
また、本発明の製造方法における縮合反応は、脱水剤（脱水縮合剤、縮合助剤）の存在下で行う。脱水剤の存在下で反応させることにより、脱保護とアミノ酸結合とを繰返す煩雑な処理を経ることなく、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進行する。 In addition, the condensation reaction in the production method of the present invention is performed in the presence of a dehydrating agent (dehydrating condensing agent, condensing aid). By carrying out the reaction in the presence of a dehydrating agent, the condensation reaction proceeds smoothly while suppressing dimerization and cyclization without going through a complicated process of repeating deprotection and amino acid bonding.
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤（ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等）、フルオロホスフェート系縮合剤（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ））等）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）である。
The dehydrating condensing agent is not particularly limited as long as the dehydrating condensation can be efficiently performed in the solvent. For example, a carbodiimide condensing agent (diisopropylcarbodiimide (DIPC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)) -Carbodiimide (EDC = WSCI), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (WSCI · HCl), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), etc.), fluorophosphate condensing agent (O- (7- Azabenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, O-benzotriazol-1-yl-N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluoro Phosphate, benzotriazol-1-yl-oxy-tris- Lori Gino phosphonium hexafluorophosphate, benzotriazol-1-yl - tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate product salt (BOP)), etc.), diphenylphosphoryl azide (DPPA) can be exemplified.
These dehydration condensing agents can be used alone or in combination of two or more. Preferred dehydrating condensing agents are carbodiimide condensing agents (for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride).
脱水縮合剤の使用量は、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。 The amount of the dehydrating condensing agent used is usually 0.7 to 5 mol, preferably 0.8 to 2.5 mol, more preferably, when a non-aqueous solvent not containing water is used with respect to 1 mol of the total amount of peptide oligomer. Is in the range of 0.9 to 2.3 moles (eg, 1 to 2 moles). In a solvent containing water (aqueous solvent), since the dehydration condensing agent is deactivated by water, the amount of dehydration condensing agent used is usually 2 to 500 mol, preferably 1 mol per 1 mol of the total amount of peptide oligomers. It is 5-250 mol, More preferably, it is the range of 10-125 mol.
縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類）、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）等のトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類（ＨＯＮＳｕ等）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類（ＨＯＢｔ等）である。
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドオリゴマーの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。
The condensation aid is not particularly limited as long as it accelerates the condensation reaction. For example, N-hydroxypolycarboxylic imides (for example, N-hydroxysuccinimide (HONSu), N-hydroxy-5-norbornene-2, N-hydroxydicarboxylic imides such as 3-dicarboxylic imide (HONB)), N-hydroxytriazoles (for example, N-hydroxybenzotriazoles such as 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)), 3-hydroxy-4 Examples include triazines such as -oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine (HOObt) and 2-hydroxyimino-2-cyanoacetic acid ethyl ester.
These condensation aids can also be used alone or in combination. Preferred condensation aids are N-hydroxydicarboxylic imides (HONSu, etc.), N-hydroxybenzotriazoles or N-hydroxybenzotriazines (HOBt, etc.).
The amount of the condensation aid used is usually 0.5 to 5 mol, preferably 0.7 to 2 mol, more preferably 0.8 to 0.1 mol per 1 mol of the total amount of the peptide oligomer regardless of the type of solvent. The range is 1.5 mol.
本発明において、脱水縮合剤のみを使用してもよいが、脱水縮合剤と縮合助剤とを適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が挙げられる。 In the present invention, only the dehydration condensing agent may be used, but it is preferable to use an appropriate combination of the dehydrating condensing agent and the condensation aid. Examples of the combination of the dehydration condensing agent and the condensation aid include DCC-HONSu (HOBt or HOOBt) and WSCI-HONSu (HOBt or HOOBt).
本発明の製造方法により得られたポリペプチドは、凍結乾燥により粉体にする等して、その後の加工へ供するのに取り扱いやすい形態とすることができる。凍結乾燥する場合は、縮合反応後の反応溶液をナス型フラスコ等適切な容器に入れ、凍結乾燥機（例えば、東京理科機械製；ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−２０００等）を用いて行う。凍結乾燥は、水分が蒸発して乾燥物が得られるまで実施し、通常は一夜から２日間で完了する。得られた乾燥物を任意の溶媒に所望の濃度で溶解させることにより、ファイバー、ナノファイバー、ゲル等の製造に供する原液を調製することができる。
また、本発明の製造方法により得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。得られたポリペプチドをこの後に加工等に供する場合にこれらの残存試薬が影響する恐れがあるため、除去することが好ましい。残存試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られたポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。
The polypeptide obtained by the production method of the present invention can be made into a form that can be easily handled for subsequent processing, for example, by freeze-drying into a powder. In the case of freeze-drying, the reaction solution after the condensation reaction is put into a suitable container such as an eggplant-shaped flask, and is performed using a freeze-dryer (for example, manufactured by Tokyo Science and Technology; EYELA FDU-2000). Freeze-drying is carried out until the water evaporates and a dry product is obtained, and is usually completed in one to two days. By dissolving the obtained dried product in an arbitrary solvent at a desired concentration, a stock solution for use in the production of fibers, nanofibers, gels and the like can be prepared.
Moreover, the reagent used for the reaction remains in the polypeptide obtained by the production method of the present invention. When the obtained polypeptide is subjected to subsequent processing or the like, these residual reagents may be affected, and therefore it is preferable to remove them. For removing the residual reagent, a known method such as a dialysis method, a column method, or an ultrafiltration method can be used.
In view of the stability of the polypeptide and ease of handling, it is preferable to replace the reaction solvent with a storage solvent. The replacement of the reaction solvent with the target storage solvent is performed by using the target storage solvent as the dialysis external solution in the dialysis method, and by using the target storage solvent as the mobile phase in the column method. be able to.
The preservation solvent is not particularly limited as long as it can suppress changes in physical properties and the like of the obtained polypeptide. For example, water, physiological saline, and a buffer having a buffer capacity from weak acid to weak alkali can be mentioned.
＜２＞本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、次式（４）で示されるペプチドフラグメント（以降、ポリＰ
ＹＧと記す）を有するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖である。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ― （４）
ここでＹはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。
また、式（４）中、繰り返し数ｍは１００〜１７１の整数である。すなわち、従来のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖に比して繰り返し数が大きいものである。
また、本発明のポリペプチドの重量平均分子量は単分子鎖あたり２６，７００〜４５，６００である。すなわち、従来合成されていたコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖に比して高分子量のものを含む。なお、かかる重量平均分子量は後述するＨＦＩＰ系ＧＰＣにより測定された値である。
<2> Polypeptide of the Present Invention The polypeptide of the present invention comprises a peptide fragment represented by the following formula (4) (hereinafter referred to as polyP
It is a collagen-like polypeptide (single molecule) chain having YG).
― (Pro-Y-Gly) m ― (4)
Here, Y is hydroxyproline or proline, and hydroxyproline is, for example, 4Hyp, and trans-4-hydroxy-L-proline is preferable.
Moreover, in Formula (4), the repetition number m is an integer of 100-171. That is, the number of repeats is larger than that of conventional collagen-like polypeptide (monomolecular) chains.
Moreover, the weight average molecular weight of the polypeptide of the present invention is 26,700 to 45,600 per single molecular chain. That is, it includes those having a higher molecular weight than the conventionally synthesized collagen-like polypeptide (monomolecular) chain. The weight average molecular weight is a value measured by HFIP GPC described later.
本発明のポリペプチド単分子鎖は、天然コラーゲンのように三重らせん構造をとりコラーゲン様ポリペプチド複合体を形成することができる。なお、ポリペプチドが三重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは三重らせん構造をとっていると考えられる。
本発明のポリペプチドは、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に三重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその三重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。また、ポリペプチド単分子鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。
The polypeptide single molecule chain of the present invention can take a triple helical structure like natural collagen to form a collagen-like polypeptide complex. Whether or not the polypeptide has a triple helix structure can be confirmed by measuring a circular dichroism spectrum of the polypeptide solution. Specifically, when a positive cotton effect is exhibited at a wavelength of 220 to 230 nm and a negative cotton effect is exhibited at a wavelength of 195 to 205 nm, the polypeptide is considered to have a triple helical structure.
The polypeptides of the present invention may be linear or have one or more branches. In the case of having a branch, a triple helix structure may be formed after the branch point, and a branch may be provided behind the triple helix structure. Polypeptide single molecular chains may be cross-linked with each other.
本発明におけるコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は、ポリＰＹＧのみからなるものであってもよいが、ポリＰＹＧの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
本発明のポリペプチド（単分子）鎖は、ポリＰＹＧと他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリＰＹＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有する。
The collagen-like polypeptide (monomolecular) chain in the present invention may be composed only of polyPYG, but may contain amino acid residues, peptide fragments or alkylenes in addition to polyPYG.
Amino acid residues include Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Sar, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val. The selected at least 1 type is mentioned. Peptide fragments include peptides in which one or more of the amino acid residues are linked. Alkylene may be either linear or branched, and is not particularly limited. Specific examples include alkylene having 1 to 18 carbon atoms, and practically alkylene having 2 to 12 carbon atoms. Is preferred.
The polypeptide (single molecule) chain of the present invention comprises poly PYG and other amino acid residues or peptide fragments or alkylene in a weight ratio of poly PYG: other amino acid residues or peptide fragments or alkylene = 1: 99 to 100: 0, preferably 10:90 to 100: 0.
本発明のポリペプチドは単分子鎖での分子量が従来のものよりも大きいため、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖又は複合体の物性として新たなまたはより優れた性質を呈する。例えば、ゲル化した場合に、その力学的強度が向上する。
また、高分子量であることにより、重量平均分子量（単分子鎖）が３０００〜２００００程度のコラーゲン様ポリペプチド複合体では不可能であった単独での繊維化が可能となる。本発明のポリペプチドを含有する繊維、特にナノファイバーは、機能性材料として、医療用材料など種々の用途に供することができる。例えば、コラーゲン様ポリペプチド複合体の有する、血液凝固因子等の生体分子への高親和性を利用した吸着剤や、血液凝固能を利用した止血剤に適用したりすることができる。
Since the polypeptide of the present invention has a higher molecular weight in a single molecular chain than that of the conventional one, it exhibits new or superior properties as physical properties of a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain or complex. For example, when gelled, the mechanical strength is improved.
In addition, the high molecular weight makes it possible to fiberize alone, which is impossible with a collagen-like polypeptide complex having a weight average molecular weight (monomolecular chain) of about 3000 to 20000. Fibers, particularly nanofibers, containing the polypeptide of the present invention can be used as functional materials for various uses such as medical materials. For example, it can be applied to an adsorbent using high affinity for biomolecules such as blood coagulation factors possessed by a collagen-like polypeptide complex or a hemostatic agent utilizing blood coagulation ability.
繊維化する方法としては、周知の手法を適用でき特に制限されないが、例えば、本発明のポリペプチドを有機溶媒（例えばヘキサフルオロイソプロパノール等）に溶解した溶液を、シリンジを用いてメタノール中に吐出する手法などが挙げられる。
また、エレクトロスピニング法による紡糸方法も挙げられる。エレクトロスピニング法であれば、繊維径５ｎｍ〜５０μｍの均一なコラーゲン様ポリペプチド複合体繊維を得ることができ、繊維径がナノメートル単位（１〜１０００ｎｍ）のナノファイバーを得ることもできる。
エレクトロスピニング法により、本発明のポリペプチドを含有する繊維（本発明のナノファイバーを含む）を紡糸する方法を以下に説明する。
まず、本発明のポリペプチドを溶媒に溶解させて紡糸溶液を調整する。かかる溶媒としては、ポリペプチドを溶解し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン、スルホランアセトン、プロパノール、ジクロロメタン、蟻酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、塩化メチレン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２−ピロリドン、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルカーボネート、アセトニトリル、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、ブチレンカーボネート、１，４−ブチロラクトン、ジエチルカーボネート、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジオキソラン、エチルメチルカーボネート、メチルホルマート、３−メチルオキサゾリジン−２−オン、メチルプロピオネート、２−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。溶媒は一種を単独で用いてもよく、複数の溶媒の混合物であってもよい。
紡糸溶液中のポリペプチド濃度は、連続繊維を形成しやすくするため、０．１〜１０．０重量％であることが好ましく、１．０〜８．０重量％であることがより好ましく、３．０〜６．０重量％であることがさらに好ましい。
A known method can be applied as the fiberizing method, and is not particularly limited. For example, a solution in which the polypeptide of the present invention is dissolved in an organic solvent (eg, hexafluoroisopropanol) is discharged into methanol using a syringe. The method etc. are mentioned.
Moreover, the spinning method by an electrospinning method is also mentioned. With the electrospinning method, uniform collagen-like polypeptide complex fibers having a fiber diameter of 5 nm to 50 μm can be obtained, and nanofibers having a fiber diameter of nanometer units (1 to 1000 nm) can also be obtained.
A method for spinning fibers containing the polypeptide of the present invention (including nanofibers of the present invention) by electrospinning will be described below.
First, the spinning solution is prepared by dissolving the polypeptide of the present invention in a solvent. Such a solvent is not particularly limited as long as it dissolves the polypeptide and evaporates at the spinning stage to form a fiber. For example, water, ethanol, methanol, isopropanol, acetone, sulfolane acetone, propanol, dichloromethane, formic acid, hexafluoroisopropanol, hexafluoroacetone, methyl ethyl ketone, chloroform, isopropanol, toluene, tetrahydrofuran, benzene, benzyl alcohol, 1,4-dioxane, Carbon tetrachloride, cyclohexane, cyclohexanone, methylene chloride, phenol, pyridine, trichloroethane, acetic acid, N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, ethylene carbonate, propylene carbonate, Dimethyl carbonate, acetonitrile, N-methylmorpholine-N-oxide, butylene carbonate, , 4-butyrolactone, diethyl carbonate, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, 1,3-dioxolane, ethyl methyl carbonate, methyl formate, 3-methyl oxazolidine-2 -One, methyl propionate, 2-methyltetrahydrofuran and the like. A solvent may be used individually by 1 type and the mixture of a some solvent may be sufficient as it.
The polypeptide concentration in the spinning solution is preferably 0.1 to 10.0% by weight, more preferably 1.0 to 8.0% by weight in order to facilitate the formation of continuous fibers. More preferably, it is 0.0 to 6.0% by weight.
また、本発明のポリペプチドは単分子鎖あたりの分子量が大きいため、単独で紡糸することが可能であるが、他のポリマーを共に用いて紡糸溶液を調製してもよい。この場合、得られる繊維の力学的強度を向上させたり、繊維長さを大きくしたり、種々の機能を付与することができる。他のポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリスチレン等、特に制限されない。
また、紡糸溶液は、紡糸を妨げない限りにおいて任意の成分を含有してもよい。かかる任意成分としては、接着剤、電解質などが挙げられる。
接着剤を添加すると、製造されたナノファイバーどうしが接触点で接着されるので、ナノファイバーを不織布の形態で得る際に強力で摩擦によるケバ立ちの少ない柔軟な不織布とすることができる。接着剤としては、製造されたナノファイバーどうしを接着でき、かつ紡糸溶液の溶媒に可溶であれば特に限定されないが、例えばホットメルト樹脂からなる接着剤、エラストマー系の接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤、ビニル系接着剤などが挙げられる。エラストマー系の接着剤としては、ポリクロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブチルゴム、アクリロニトリル・ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、クロロスルフォン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴムが例示される。接着剤を添加する場合は紡糸溶液中のポリペプチド１００重量部に対して０．５〜１０重量部添加されることが好ましい。
電解質を添加することによって紡糸溶液表面の電荷密度を上げることが出来、結果として紡糸性を向上させることが可能となる。電解質としては、紡糸溶液に可溶で、紡糸溶液中で電離するものであれば特に限定はされないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸二水素ナトリウム、炭酸マグネシウムが例示される。電解質を添加する場合は、紡糸溶液中のポリペプチドが塩析しない程度が望ましく、紡糸溶液中のポリペプチド１００重量部に対して０．５〜１０重量部添加されることが好ましい。
Further, since the polypeptide of the present invention has a large molecular weight per single molecular chain, it can be spun independently, but a spinning solution may be prepared using other polymers together. In this case, the mechanical strength of the obtained fiber can be improved, the fiber length can be increased, and various functions can be imparted. Other polymers are not particularly limited, for example, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polypropylene, polystyrene and the like.
Further, the spinning solution may contain any component as long as spinning is not hindered. Examples of such optional components include an adhesive and an electrolyte.
When the adhesive is added, the produced nanofibers are bonded to each other at the contact point. Therefore, when the nanofibers are obtained in the form of a nonwoven fabric, it can be made into a flexible nonwoven fabric that is strong and has little frictional flaking. The adhesive is not particularly limited as long as the produced nanofibers can be bonded to each other and is soluble in the solvent of the spinning solution. For example, an adhesive made of a hot melt resin, an elastomeric adhesive, an acrylic adhesive , Epoxy adhesive, vinyl adhesive and the like. Examples of elastomeric adhesives include polychloroprene rubber, styrene / butadiene rubber, butyl rubber, acrylonitrile / butadiene rubber, ethylene / propylene rubber, chlorosulfonated polyethylene rubber, and epichlorohydrin rubber. When adding an adhesive agent, it is preferable that 0.5-10 weight part is added with respect to 100 weight part of polypeptide in a spinning solution.
By adding the electrolyte, the charge density on the surface of the spinning solution can be increased, and as a result, the spinnability can be improved. The electrolyte is not particularly limited as long as it is soluble in the spinning solution and ionizes in the spinning solution. For example, sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, sodium carbonate, sodium bicarbonate, sodium dihydrogen carbonate, An example is magnesium carbonate. When the electrolyte is added, it is desirable that the polypeptide in the spinning solution is not salted out, and it is preferable to add 0.5 to 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the polypeptide in the spinning solution.
次いで、調製した紡糸溶液を周知のエレクトロスピニング法の手段によって紡糸する。具体的には、紡糸溶液を充填したノズルとコレクター（基板）の間に電圧を印加した状態で、ノズルから紡糸溶液を吐出させて、コレクター上に繊維を回収する。エレクトロスピニング法を行う条件は、特に限定されず、紡糸溶液の種類や得られる繊維の用途等に応じて適宜調整すればよい。本発明の方法における一般的な条件としては、例えば、印加電圧は５〜５０ｋＶ、吐出速度は０．０１〜５．００ｍＬ／時、ノズルとコレクターの間の垂直距離は５０〜３００ｍｍとすることができ、ノズルは１８〜３０Ｇ（ゲージ）の径のものを使用することができる。紡糸環境は、相対湿度１０〜７０％、温度を１０〜３０℃とすることが好ましいが、特段厳密に制御を行わなくてもよい。
これにより、直径５ｎｍ〜５０μｍの繊維を得ることができ、直径５〜１０００ｎｍのナノファイバーを得ることもできる。また、紡糸条件の設定・調整により、平均して２００〜３００ｎｍの長く途切れない繊維を得ることができる。また、ナノファイバー中に、塊状のビーズを含まないか含まれても少ない、均一なナノファイバーを得ることができる。
The prepared spinning solution is then spun by means of a well-known electrospinning method. Specifically, in a state where a voltage is applied between the nozzle filled with the spinning solution and the collector (substrate), the spinning solution is discharged from the nozzle to collect the fiber on the collector. The conditions for performing the electrospinning method are not particularly limited, and may be appropriately adjusted according to the type of spinning solution, the use of the obtained fiber, and the like. As general conditions in the method of the present invention, for example, the applied voltage is 5 to 50 kV, the discharge speed is 0.01 to 5.00 mL / hour, and the vertical distance between the nozzle and the collector is 50 to 300 mm. The nozzle having a diameter of 18 to 30 G (gauge) can be used. The spinning environment is preferably a relative humidity of 10 to 70% and a temperature of 10 to 30 ° C., but need not be particularly strictly controlled.
Thereby, a fiber with a diameter of 5 nm to 50 μm can be obtained, and a nanofiber with a diameter of 5 to 1000 nm can also be obtained. Further, by setting / adjusting the spinning conditions, it is possible to obtain an unbroken fiber having a length of 200 to 300 nm on average. In addition, uniform nanofibers can be obtained in which the nanofibers contain no or no massive beads.
＜３＞ポリペプチドの分子量測定
ここで、本発明のポリペプチドの重量平均分子量を測定する方法について説明する。本発明においてコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の重量平均分子量は、溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノールを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィー法（以下、ＨＦＩＰ系ＧＰＣ法と記す）で測定されたものである。
<3> Molecular Weight Measurement of Polypeptide Here, a method for measuring the weight average molecular weight of the polypeptide of the present invention will be described. In the present invention, the weight average molecular weight of a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain is measured by a gel permeation chromatography method (hereinafter referred to as HFIP GPC method) using hexafluoroisopropanol as a solvent.
従来、ポリペプチドを含む高分子量のポリマーの重量平均分子量は、水溶液を移動相とするＧＰＣ法で測定するのが一般的であった。しかしながら、水溶液中でコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は三重らせん構造をとったりさらに三重らせん同士が会合して、クロマトグラムのピークがブロードになったり、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の正しい分子量を反映した位置にピークが出現しなかったりした。例えば、特許文献２ではカラムにSuperdex 200 HR 10/30を用いリン酸バッファーを移動相とするＧＰＣ法でポリペプチドの分子量を決定しているが、本発明者らによる追試ではデキストランの分子量に換算して１００，０００よりも高分子量のものについては正確な分子量の測定が不可能であることがわかっている。縮合反応により得られたコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の物性等を検討するに際しその単分子鎖の分子量を把握したいという要請があるにもかかわらず、正確に測定することが難しいという問題があった。 Conventionally, the weight average molecular weight of a high molecular weight polymer including a polypeptide is generally measured by a GPC method using an aqueous solution as a mobile phase. However, the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain has a triple helix structure in the aqueous solution, and the triple helices are associated with each other, resulting in a broad chromatogram peak or correct collagen-like polypeptide (monomolecular) chain. A peak did not appear at a position reflecting the molecular weight. For example, in Patent Document 2, the molecular weight of a polypeptide is determined by the GPC method using Superdex 200 HR 10/30 as a column and a phosphate buffer as a mobile phase, but in the additional test by the present inventors, the molecular weight of dextran is converted. Thus, it has been found that accurate molecular weight cannot be measured for those having a higher molecular weight than 100,000. When examining the physical properties of collagen-like polypeptide (monomolecular) chains obtained by condensation reactions, there is a demand for grasping the molecular weight of the monomolecular chains, but it is difficult to measure accurately. there were.
今回高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造するにあたり、かかる状況に鑑み、本発明者らはＨＦＩＰ系ＧＰＣ法によれば、高分子量ポリペプチド（単分子）鎖でも測定が可能となることを見出した。これは、１８〜５０℃のＨＦＩＰ中ではコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖は三重らせん構造をとらないという、やはり本発明者らが見出した知見に基づく。コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖が単独分子で存在することにより、三重らせんや会合状態のみかけの分子量ではなく、正確な分子量がクロマトグラムのピークに反映される。
さらに、ＰＨＧオリゴマー及び多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）により絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を分子量標準として用いることにより、コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の正確な分子量値が得られることをも見出した。
In the production of a high molecular weight collagen-like polypeptide (monomolecular) chain, the present inventors can measure even a high molecular weight polypeptide (monomolecular) chain according to the HFIP GPC method. I found out that This is based on the finding that the present inventors have found that collagen-like polypeptide (monomolecular) chains do not have a triple helical structure in HFIP at 18 to 50 ° C. When a collagen-like polypeptide (single molecule) chain is present as a single molecule, an accurate molecular weight is reflected in the chromatogram peak, not an apparent molecular weight of a triple helix or an associated state.
Furthermore, by using a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain whose absolute molecular weight is determined by a PHG oligomer and a multi-angle light scattering detector (MALS) as a molecular weight standard, an accurate molecular weight of the collagen-like polypeptide (monomolecular) chain is used. We have also found that values are obtained.
すなわち、本明細書におけるポリペプチド（単分子）鎖の重量平均分子量は以下の条件のＨＦＩＰ系ＧＰＣ法で測定されたものである。
移動相：ヘキサフルオロイソプロパノール
カラム：ＧＰＣ ＫＦ−６０６Ｍ、昭和電工株式会社製
流速：０．２〜１ｍＬ／ｍｉｎ
温度：１８〜５０℃
分子量標準：ＰＨＧオリゴマー及びＭＡＬＳにより絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖
検出：紫外線吸光度計
なお、分子量標準として用いたＰＨＧオリゴマー及びコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を表１に示す。また、上記移動相において中のコラーゲン様ポリペプチドは高次構造をとらず単分子鎖として存在していることは、円二色性スペクトルにより確認した。
That is, the weight average molecular weight of the polypeptide (monomolecular) chain in the present specification is measured by the HFIP GPC method under the following conditions.
Mobile phase: Hexafluoroisopropanol Column: GPC KF-606M, manufactured by Showa Denko KK Flow rate: 0.2-1 mL / min
Temperature: 18-50 ° C
Molecular weight standard: Collagen-like polypeptide (monomolecular) chain whose absolute molecular weight was determined by PHG oligomer and MALS Detection: UV absorbance meter The PHG oligomer and collagen-like polypeptide (monomolecular) chain used as molecular weight standards are shown in Table 1. Show. Further, it was confirmed by circular dichroism spectrum that the collagen-like polypeptide in the mobile phase was present as a monomolecular chain without taking a higher order structure.
また、本発明のポリペプチド鎖の重量平均分子量は、塩酸グアニジン処理を行えば水溶液を移動相とするＧＰＣ法でも測定することができる。従来、一般に未処理のコラーゲン様ポリペプチド複合体では三次構造が不ぞろいであるためにＧＰＣによる測定において複数のピークやブロードなピークが出現してしまい、水溶液中での正確なコラーゲン様ペプチドの分子量を測ることができなかった。本発明者らは、塩酸グアニジンによりコラーゲン様ポリペプチド複合体の三重らせんを一旦ほどき、その後巻き戻しを行うことで、水溶液を移動相とするＧＰＣ測定においてもピークが１つに収束し正確な分子量を測定できることを見出した。
具体的には、コラーゲン様ポリペプチド複合体を塩酸グアニジン水溶液中で加熱処理した後、冷却し、該溶液を水で希釈したものをＧＰＣ測定に供する試料とする。ここで、塩酸グアニジンの濃度としては４〜６Ｍが好ましく、５〜６Ｍがより好ましい。加熱は、８０〜１００℃の温度で、５〜１２０分間処理することが好ましい。
ＧＰＣ測定は通常の条件下で行うことができ、特に限定されない。例えば、リン酸塩等の水溶液（ｐＨ３〜６）を移動相として、カラムは（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷｘｌ；東ソー）を用い、流速０．５〜１ｍＬ／ｍｉｎ、温度２５〜４０℃で、分子量標準としてCalibration Standards for Aqueous P-series/ Shodexを用いることができる。
The weight average molecular weight of the polypeptide chain of the present invention can also be measured by a GPC method using an aqueous solution as a mobile phase if guanidine hydrochloride treatment is performed. Conventionally, in general, untreated collagen-like polypeptide complexes have irregular tertiary structures, so multiple peaks and broad peaks appear in GPC measurement, and the accurate molecular weight of collagen-like peptides in aqueous solution can be determined. I couldn't measure it. The present inventors once unwound the triple helix of the collagen-like polypeptide complex with guanidine hydrochloride, and then performed unwinding so that the peak converges to one in GPC measurement using an aqueous solution as a mobile phase and is accurate. It has been found that the molecular weight can be measured.
Specifically, the collagen-like polypeptide complex is heated in an aqueous guanidine hydrochloride solution and then cooled, and the solution diluted with water is used as a sample for GPC measurement. Here, the concentration of guanidine hydrochloride is preferably 4-6M, and more preferably 5-6M. The heating is preferably performed at a temperature of 80 to 100 ° C. for 5 to 120 minutes.
The GPC measurement can be performed under normal conditions and is not particularly limited. For example, an aqueous solution (pH 3 to 6) such as phosphate is used as a mobile phase, a column is (TSKgel G6000PWxl; Tosoh), a flow rate is 0.5 to 1 mL / min, a temperature is 25 to 40 ° C., and calibration standards are used as molecular weight standards. for Aqueous P-series / Shodex can be used.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, although an example is given and the present invention is explained still in detail, the present invention is not limited to these.
＜コラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の合成＞
ＰＨＧモノマーとして、Ｌ−プロピル−Ｌ−（４−ヒドロキシプロピル）−グリシン ０．５ｇ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ ０．０５ｇを量り取り、ストックＰＢ溶液を希釈した希釈液５ｍＬに加えて４℃で攪拌した。別容器にＥＤＣ・ＨＣｌ １．５８ｇを量り取り、同様にストックＰＢ溶液を希釈した希釈液５ｍＬに加えて４℃で攪拌した。両者を混合して
縮合反応を開始し、４℃で２４時間反応させた。ここでストックＰＢ溶液とは、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４水溶液であり、これを１×ＰＢ溶液として種々のリン酸イオン濃度の反応溶媒を調製した。なお、「×０」はストックＰＢ溶液を含まない、純水である。
得られた生成物について、水系ＧＰＣ法またはＨＦＩＰ系ＧＰＣ法で単分子鎖の分子量（Ｍｎ及びＭｗ）を測定した。水系ＧＰＣ法の測定条件は、移動相：２０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４・Ｈ３ＰＯ４, ｐＨ３．０： ＭｅＯＨ=８：２、カラム：ＴＳＫ Ｇ６０００ＰＷＸＬ-ＣＰ、流速：０．６ｍＬ/ｍｉｎ、温度：４０℃、分子量標準：Calibration Standards for Aqueous P-series/ Shodexである。ＨＦＩＰ系ＧＰＣ法の測定条件は、５ｍＭ ＣＦ３ＣＯＯＮａ ＨＦＩＰ溶液、カラム：ＧＰＣ ＫＦ−６０６Ｍ、流速：０．５ｍＬ/ｍｉｎ、温度：４０℃、分子量標準：ＰＨＧ、（ＰＨＧ）２、（ＰＨＧ）４、（ＰＨＧ）１０及びＭＡＬＳにて絶対分子量を決定したコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖である。代表例として、実施例５の生成物のＨＦＩＰ系ＧＰＣ測定チャートを図１に示す。
表２に結果を示す。なお、実施例５は特許文献２に記載された製造方法におけるリン酸イオン濃度での製造例に相当する。また、参考例として（ＰＨＧ）１０＝２，６８８ｇ/ｍｏｌの結果も載せた。表２に示す通り、リン酸イオン濃度が小さいほど高分子量のポリペプチド（単分子）鎖が得られ、特にリン酸イオンを含まない場合（実施例１；０ｍＭ）は格段に分子量が大きくなった。一方リン酸イオン濃度が大きいほど低分子量となった。また、実施例５の生成物は、特許文献２ではゲル濾過法により数万レベルの分子量であるとされていたが、ＨＦＩＰ系ＧＰＣによる測定ではずっと小さい分子量であったことがわかった。
また、水系ＧＰＣでは高分子量のものは測定不能であったが、ＨＦＩＰ系ＧＰＣではポリペプチドの単分子鎖を測定対象とすることができ、高分子量のポリマーであっても正確に分子量を測定できることがわかった。
<Synthesis of collagen-like polypeptide (single molecule) chain>
As a PHG monomer, 0.5 g of L-propyl-L- (4-hydroxypropyl) -glycine and 0.05 g of HOBt · H 2 O were weighed, added to 5 mL of diluted diluent of stock PB solution, and stirred at 4 ° C. did. In a separate container, 1.58 g of EDC · HCl was weighed, and the stock PB solution was similarly added to 5 mL of a diluted solution and stirred at 4 ° C. Both were mixed to initiate a condensation reaction and reacted at 4 ° C. for 24 hours. Here, the stock PB solution is 8.1 mM Na 2 HPO 4 , 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 aqueous solution, and this is used as a 1 × PB solution to prepare reaction solvents having various phosphate ion concentrations. did. “× 0” is pure water that does not contain a stock PB solution.
About the obtained product, the molecular weight (Mn and Mw) of the monomolecular chain was measured by the aqueous GPC method or the HFIP GPC method. The measurement conditions of the aqueous GPC method are: mobile phase: 20 mM KH 2 PO 4 .H 3 PO 4 , pH 3.0: MeOH = 8: 2, column: TSK G6000PWXL-CP, flow rate: 0.6 mL / min, temperature: 40 ° C, molecular weight standard: Calibration Standards for Aqueous P-series / Shodex. The measurement conditions of the HFIP GPC method are 5 mM CF 3 COONa HFIP solution, column: GPC KF-606M, flow rate: 0.5 mL / min, temperature: 40 ° C., molecular weight standard: PHG, (PHG) 2 , (PHG) 4 , (PHG) 10 and a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain whose absolute molecular weight was determined by MALS. As a representative example, an HFIP GPC measurement chart of the product of Example 5 is shown in FIG.
Table 2 shows the results. Example 5 corresponds to an example of production at a phosphate ion concentration in the production method described in Patent Document 2. As a reference example, the result of (PHG) 10 = 2688 g / mol was also listed. As shown in Table 2, the lower the phosphate ion concentration, the higher the molecular weight polypeptide (monomolecular) chain was obtained, and the molecular weight was particularly large when phosphate ions were not included (Example 1; 0 mM). . On the other hand, the higher the phosphate ion concentration, the lower the molecular weight. The product of Example 5 was found to have a molecular weight of several tens of thousands by gel filtration in Patent Document 2, but was found to have a much lower molecular weight as measured by HFIP GPC.
In addition, high molecular weight substances cannot be measured with aqueous GPC, but single molecular chains of polypeptides can be measured with HFIP GPC, and molecular weight can be accurately measured even with high molecular weight polymers. I understood.
＜参考：グアニジン塩酸塩処理＞
実施例５のポリペプチド水溶液０．５ｍｇ／ｍＬを、６Ｍ塩酸グアニジン中で９０℃で１時間加熱後、室温（１５〜３５）℃に冷却し、ＧＰＣ移動相で５倍に希釈し、これを水系ＧＰＣ法での測定に供した。測定条件は、（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷｘｌ 東ソー、流速０．５〜１ｍＬ／ｍｉｎ、温度 ２５〜４０℃、分子量標準Calibration Standards for Aqueous P-series/ Shodex）である。
結果を図２に示す。グアニジン塩酸塩処理をせずにＧＰＣ測定を行った場合のチャートでは、複数のピークがブロードに現れ、分子量を把握することが難しかった（図２ａ）。一方、グアニジン塩酸塩処理を行った場合は、ピークが１本に収束し、コラーゲン様ポリペプチド複合体の三重らせんが巻き戻されたことによりその三次構造が１つになったためと考えられる（図２ｂ）。なお、図２ｂにおいて２５．０９３分に出現するピークは使用した塩酸グアニジンに由来する。
<Reference: Guanidine hydrochloride treatment>
0.5 mg / mL of the aqueous polypeptide solution of Example 5 was heated at 90 ° C. for 1 hour in 6M guanidine hydrochloride, cooled to room temperature (15-35) ° C., diluted 5 times with a GPC mobile phase, It used for the measurement by the aqueous GPC method. The measurement conditions are (TSKgel G6000PWxl Tosoh, flow rate 0.5-1 mL / min, temperature 25-40 ° C, molecular weight standard Calibration Standards for Aqueous P-series / Shodex).
The results are shown in FIG. In the chart when GPC measurement was performed without guanidine hydrochloride treatment, a plurality of peaks appeared broadly, and it was difficult to grasp the molecular weight (FIG. 2a). On the other hand, when the guanidine hydrochloride treatment was performed, it is considered that the peak converged to one, and that the triple structure of the collagen-like polypeptide complex was unwound so that the tertiary structure became one (Fig. 2b). In addition, the peak which appears in 25.093 minutes in FIG. 2b originates in the guanidine hydrochloride used.
＜ナノファイバーの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し（ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−２０００；東京理科機械製、以下同じ）、これを用いて、エレクトロスピニング法によりナノファイバーを作製した。紡糸溶液は、該ポリペプチドをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して５重量％の溶液とし、２７Ｇステンレスニードルとコレクターとの間（垂直距離１５０ｍｍ）に高電圧発生装置により２５ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．５ｍＬ／時でコレクター上に押し出した。なお、紡糸環境の相対湿度は３７％、温度は２４℃であった。
得られたナノファイバーを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。使用機器はＪＳＭ-５６００（ＪＥＯＬ社製）、加速電圧は３０ｋＶで観察を行った。図３及び図４に示す結果のとおり、本発明のコラーゲン様ポリペプチドナノファイバーは、直径１００〜２００ｎｍの均一で長い繊維状であった。
なお、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液を用いて同様の操作を行ったが、紡糸の際に途切れたりビーズが形成されたりして繊維状とはならず、ナノファイバーを得られなかった。
<Production of nanofibers>
The polypeptide aqueous solution after the reaction in Example 1 was freeze-dried (EYELA FDU-2000; manufactured by Tokyo Science Machine Co., Ltd., the same applies hereinafter), and nanofibers were produced by the electrospinning method. For the spinning solution, the polypeptide was dissolved in hexafluoroisopropanol to give a 5% by weight solution, and a voltage of 25 kV was applied between the 27G stainless needle and the collector (vertical distance 150 mm) by a high voltage generator. The spinning solution was filled in a syringe connected to the needle and extruded onto the collector at a discharge rate of 0.5 mL / hour. The relative humidity in the spinning environment was 37% and the temperature was 24 ° C.
The obtained nanofiber was observed with a scanning electron microscope (SEM). The equipment used was JSM-5600 (manufactured by JEOL), and the acceleration voltage was 30 kV. As shown in FIGS. 3 and 4, the collagen-like polypeptide nanofiber of the present invention was a uniform and long fiber having a diameter of 100 to 200 nm.
In addition, although the same operation was performed using the aqueous polypeptide solution after the reaction of Example 5, the fiber was not cut off during spinning or beads were formed, and nanofibers could not be obtained. .
＜ファイバーの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し、ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解して８重量％の溶液とした。これを２５Ｇの注射針を装着したシリンジに充填し、該注射針からメタノール中に該溶液を押し出したところ、糸を得ることができた。
なお、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液については、同様の操作では糸状のものは得られなかった。
<Production of fiber>
The aqueous polypeptide solution after the reaction in Example 1 was freeze-dried and dissolved in hexafluoroisopropanol to obtain an 8% by weight solution. When this was filled into a syringe equipped with a 25G injection needle and the solution was extruded from the injection needle into methanol, a thread could be obtained.
In addition, about the polypeptide aqueous solution after reaction of Example 5, a filamentous thing was not obtained by the same operation.
＜ゲルの作製＞
実施例１の反応後のポリペプチド水溶液を凍結乾燥し、ギ酸に溶解して１重量％の溶液とした。ガラス容器中でこの溶液の上に純水を重層して、ギ酸を水で置換することによりゲルを得た。ゲルは容器の底に形成したが、容器を転倒放置してもなお、その形状を保った。
また、実施例５の反応後のポリペプチド水溶液についても、同様の操作でゲルを得た。ただし、このゲルは実施例１の物よりも軟らかく、容器の転倒により崩れる程度の強度であった。
<Production of gel>
The aqueous polypeptide solution after the reaction in Example 1 was lyophilized and dissolved in formic acid to give a 1% by weight solution. A gel was obtained by overlaying pure water on this solution in a glass container and replacing the formic acid with water. Although the gel was formed at the bottom of the container, the shape was maintained even when the container was left to fall.
Moreover, also about the polypeptide aqueous solution after reaction of Example 5, gel was obtained by the same operation. However, this gel was softer than that of Example 1 and had such strength that it collapsed when the container fell.
本発明によれば、簡便かつ安価な手段によって、生成するコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖の分子量を所望の大きさに制御することができ、従来よりも高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖を製造することができる。種々の分子量、特に高分子量のコラーゲン様ポリペプチド（単分子）鎖及びその複合体を得られることにより、その加
工性が飛躍的に向上し、機能性材料としての用途の幅が広がるため、産業上非常に有用である。
According to the present invention, the molecular weight of a collagen-like polypeptide (monomolecular) chain to be produced can be controlled to a desired size by a simple and inexpensive means. Molecular) chains can be produced. By obtaining various molecular weights, especially high molecular weight collagen-like polypeptide (monomolecular) chains and complexes thereof, the processability is dramatically improved and the range of applications as functional materials is expanded. Very useful on top.
Claims (3)
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｍ― （４）
（式（４）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｍは１００〜１７１の整数である。） A polypeptide having a peptide fragment represented by the following formula (4).
― (Pro-Y-Gly) m ― (4)
(In formula (4), Y is hydroxyproline or proline, and m is an integer of 100 to 171.)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016176380A JP6252639B2 (en) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | Collagen-like polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016176380A JP6252639B2 (en) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | Collagen-like polypeptide |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012146685A Division JP6051619B2 (en) | 2012-06-29 | 2012-06-29 | Method for producing collagen-like polypeptide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017008094A JP2017008094A (en) | 2017-01-12 |
| JP6252639B2 true JP6252639B2 (en) | 2017-12-27 |
Family
ID=57763150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016176380A Active JP6252639B2 (en) | 2016-09-09 | 2016-09-09 | Collagen-like polypeptide |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6252639B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116650342A (en) * | 2019-10-30 | 2023-08-29 | 诺斯贝尔化妆品股份有限公司 | Collagen nano instant mask of yeast recombinant collagen and preparation method thereof |
| KR102284800B1 (en) * | 2020-12-30 | 2021-08-03 | 주식회사 하플사이언스 | Medium composition for culturing animal cell for production of recombinant extracellular matrix proteins, and method using the same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5070442B2 (en) * | 2002-02-28 | 2012-11-14 | 株式会社Ｐｈｇ | Novel polypeptide and method for producing the same |
| JP2008263955A (en) * | 2007-03-29 | 2008-11-06 | Sanyo Chem Ind Ltd | Serum-free medium |
| US7858741B2 (en) * | 2008-02-06 | 2010-12-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Stabilization of the collagen triple helix by O-methylation of hydroxyproline residues |
-
2016
- 2016-09-09 JP JP2016176380A patent/JP6252639B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017008094A (en) | 2017-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6051619B2 (en) | Method for producing collagen-like polypeptide | |
| JP5871234B2 (en) | Method for producing synthetic collagen nanofiber | |
| Toksoz et al. | Electrostatic effects on nanofiber formation of self-assembling peptide amphiphiles | |
| Boothroyd et al. | From fibres to networks using self-assembling peptides | |
| Luo et al. | Thermoresponsive self‐assembly of nanostructures from a collagen‐like peptide‐containing diblock copolymer | |
| Sahoo et al. | Electrostatic-driven self-sorting and nanostructure speciation in self-assembling tetrapeptides | |
| Qi et al. | A new collagen solution with high concentration and collagen native structure perfectly preserved | |
| He et al. | Multi-responsive hydrogels derived from the self-assembly of tethered allyl-functionalized racemic oligopeptides | |
| Murphy et al. | Hydrogels from amphiphilic star block copolypeptides | |
| Qin et al. | Hierarchical self-assembly of a β-amyloid peptide derivative | |
| EP2976112A1 (en) | Improvements in and relating to collagen based materials | |
| Vacogne et al. | Fibrillar gels via the self-assembly of poly (L-glutamate)-based statistical copolymers | |
| JP6252639B2 (en) | Collagen-like polypeptide | |
| Federico et al. | Supramolecular hydrogel networks formed by molecular recognition of collagen and a peptide grafted to hyaluronic acid | |
| Zanna et al. | Self-healing hydrogels triggered by amino acids | |
| Diaferia et al. | Bi-functional peptide-based 3D hydrogel-scaffolds | |
| Popescu et al. | Stimuli responsive fibrous hydrogels from hierarchical self-assembly of a triblock copolypeptide | |
| Kim et al. | Nanofibers produced by electrospinning of ultrarigid polymer rods made from designed peptide bundlemers | |
| CN103590133A (en) | Method for preparing polypeptide copolymer porous nanofiber by using electrostatic spinning | |
| US20220265739A1 (en) | Bacteriophage Hydrogel Compositions and Uses Thereof | |
| Zhao et al. | OEGylated collagen mimetic polypeptides with enhanced supramolecular assembly | |
| JP5915427B2 (en) | Hemostatic material | |
| US9327050B2 (en) | Hemostatic material containing nano-fiber containing synthetic collagen | |
| Hachisu et al. | Preparation of Silk‐Like Fibers Designed by Self‐Assembled Ionic Polypeptides | |
| WO2021187500A1 (en) | Chemically modified artificial protein for molding material and method for producing said protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170822 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170927 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171031 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171113 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6252639 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |