JP6242202B2

JP6242202B2 - Optical microscope system and method for observing cells using optical microscope

Info

Publication number: JP6242202B2
Application number: JP2013258619A
Authority: JP
Inventors: 大橋　陽子; 陽子大橋; 太朗林; 竜太郎秋吉
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2017-12-06
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: JP2014119762A

Description

本発明は、光学顕微鏡システムおよび光学顕微鏡を用いて細胞を観察する方法に関する。 The present invention relates to an optical microscope system and a method for observing cells using an optical microscope.

発光または蛍光を利用して、生物試料をイメージングする技術は、生命科学の研究において必須のものとなっている。例えば、ルシフェラーゼといった発光酵素を含む生きた細胞に対して、ルシフェリンといった発光基質を投与して触媒反応を生じさせ、そのときに生じる発光が顕微鏡により検出される。あるいは、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）といった蛍光タンパク質を含む生きた細胞に対して、この蛍光タンパク質に応じた励起光を照射し、これによって生じる蛍光が顕微鏡により検出される。 Techniques for imaging biological samples using luminescence or fluorescence have become essential in life science research. For example, a living cell containing a luminescent enzyme such as luciferase is administered with a luminescent substrate such as luciferin to cause a catalytic reaction, and the luminescence generated at that time is detected by a microscope. Alternatively, a living cell containing a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP) is irradiated with excitation light corresponding to the fluorescent protein, and fluorescence generated thereby is detected by a microscope.

生物試料のイメージングにおいて、観察すべき位置に適切にフォーカスを合せることが重要となる。例えば、細胞内の特定の構造を発光または蛍光を用いて観察する場合、フォーカスが合っていないと正しく細胞内の構造を認識することができない。また、光が微弱な場合には、フォーカスを合せることが難しくなるため、実験上の誤差の原因にもなりかねない。 In imaging a biological sample, it is important to appropriately focus on the position to be observed. For example, when a specific structure in a cell is observed using light emission or fluorescence, the structure in the cell cannot be correctly recognized unless the focus is achieved. In addition, when the light is weak, it is difficult to focus, which may cause experimental errors.

特許文献１および２には、フォーカスを合せる技術が開示されている。特許文献１では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ照射し、光の照射位置を上下に移動させながら試料容器の底面からの鏡面反射光の強度を順番に検出し、検出した光の感度に基づいて試料容器の底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスしている。特許文献２では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ下から斜めに照射し、試料容器の底面からの鏡面反射光のＸＹ平面上でのずれ量を光検出器で検出し、検出したずれ量に基づいて試料容器の光軸上での底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスしている。 Patent Documents 1 and 2 disclose techniques for focusing. In Patent Document 1, light is irradiated onto the bottom surface of a sample container through an objective lens, and the intensity of specular reflected light from the bottom surface of the sample container is detected in order while moving the light irradiation position up and down, and the sensitivity of the detected light is detected. The position of the bottom surface of the sample container is detected based on the above, the position of the sample in the sample container is estimated based on the detected position information, and light is focused on the estimated position. In Patent Document 2, light is irradiated obliquely from below to the bottom surface of the sample container through the objective lens, and the amount of deviation of the specular reflected light from the bottom surface of the sample container on the XY plane is detected by a photodetector, and the detected deviation is detected. The bottom surface position on the optical axis of the sample container is detected based on the amount, the position of the sample in the sample container is estimated based on the detected position information, and light is focused on the estimated position.

特表２００２−５４１４３０号公報JP-T-2002-541430 特表２００２−５４２４８０号公報Special Table 2002-542480 gazette

本発明の目的は、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得するシステムおよび方法を提供することにある。 It is an object of the present invention to provide a system and method for easily acquiring luminescence or fluorescence images of appropriately focused cells.

一実施形態に係る方法は、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を、光学顕微鏡を用いて観察する方法であって、前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置と、前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置とを、それぞれ明視野位置および観察位置として予め決定することであって、前記明視野位置および前記観察位置は、前記発光および／または蛍光に係る波長、並びに、前記光学顕微鏡の対物レンズの色収差特性および倍率ごとに決定すること、および前記細胞または前記細胞と同種の細胞について、フォーカス面を前記波長および前記対物レンズに応じた前記明視野位置に合わせて明視野画像を取得した後、フォーカス面を前記波長および前記対物レンズに応じた前記明視野位置と前記観察位置との差だけ、前記観察対象部位に向けて移動させ、前記観察対象部位の発光または蛍光の画像を取得することを含む。 A method according to an embodiment is a method of observing a cell including an observation target site that emits light and / or fluorescence using an optical microscope, and a bright-field image in which the contrast between the cell and its surroundings is maximum. the position of the focal plane resulting in the desired emission or the position of the focal plane resulting in images of fluorescence for the observation target site, the method comprising: predetermining a respective bright field position and viewing position, the bright field position And the observation position is determined for each wavelength related to the light emission and / or fluorescence, and chromatic aberration characteristics and magnification of the objective lens of the optical microscope , and a focus plane is set for the cell or the same type of cell as the cell. after obtaining the bright field image in accordance with the said bright field position corresponding to the wavelength and the objective lens, a focal plane Serial and the bright-field position corresponding to the wavelength and the objective lens by the difference between the observation position, is moved toward the observation target site comprises acquiring an image of the luminous or fluorescent of the examination site.

一実施形態に係る光学顕微鏡システムは、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を観察するためのものであり、試料からの光を受ける対物レンズおよび前記対物レンズにより作られる像を画像データに変換するイメージセンサを少なくとも含む光学系と、前記細胞を含む試料を載置するステージと、前記ステージおよび／または前記対物レンズを光軸方向に移動させる移動手段と、前記ステージおよび／または前記対物レンズの前記光軸方向の位置および前記画像データを記録でき、前記ステージおよび／または前記対物レンズに対して前記移動を行うよう指示できるコンピュータとを含み、前記コンピュータは、前記細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらす前記ステージおよび／または前記対物レンズの前記光軸方向の位置、および前記観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらす前記ステージおよび／または前記対物レンズの前記光軸方向の位置を、それぞれ明視野ステージ位置および観察ステージ位置として予め記録し、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置は、前記発光および／または蛍光に係る波長、並びに、前記対物レンズの色収差特性および倍率ごとに記録されており、前記細胞または前記細胞と同種の細胞についての画像データを取得する際に、前記ステージおよび／または前記対物レンズに対して前記波長および前記対物レンズに応じた前記明視野ステージ位置に移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた画像データを記録し、続いて、前記ステージおよび／または前記対物レンズに対して、前記波長および前記対物レンズに応じた前記明視野ステージ位置と前記観察ステージ位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動するよう指示し、移動後において前記光学系にて得られた前記画像データを記録するよう構成されている。 Optical microscopy system according to an embodiment is intended for observing the cells containing examination site which emits emission and / or fluorescence, the image produced by the objective lens and the objective lens receiving light from specimen An optical system including at least an image sensor for converting to image data; a stage on which a sample containing the cells is placed; a moving means for moving the stage and / or the objective lens in an optical axis direction; and the stage and / or A computer capable of recording the position of the objective lens in the optical axis direction and the image data, and instructing the stage and / or the objective lens to perform the movement, the computer comprising the cell and its surroundings the stage and / or the pair leads to the bright-field image with the maximum contrast of the The optical axis direction position of the lens, and the desired emission or the stage and / or the optical axis direction position, respectively brightfield stage position and observation stage of the objective lens results in an image of fluorescence for the observation target site The bright field stage position and the observation stage position are recorded for each wavelength related to the light emission and / or fluorescence, and the chromatic aberration characteristics and magnification of the objective lens. When acquiring image data on the same type of cells, the stage and / or the objective lens is instructed to move to the bright field stage position corresponding to the wavelength and the objective lens, and after the movement, recording the image data obtained by an optical system, followed by the stage and / or And instructions to the objective lens, so as to move toward only the observation target site and said observation stage position and the bright-field stage position corresponding to the wavelength and the objective lens, the optical system after moving The image data obtained in (1) is recorded.

本発明によれば、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得するシステムおよび方法が提供される。 In accordance with the present invention, a system and method are provided for easily acquiring luminescence or fluorescence images of appropriately focused cells.

図１は、細胞と、対物レンズと、フォーカス面との関係を概略的に示す図である。FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a relationship among cells, an objective lens, and a focus surface. 図２は、フォーカス面が細胞に対して特定の位置にあるときに観察される像を概略的に示す図である。FIG. 2 is a diagram schematically showing an image observed when the focus plane is at a specific position with respect to the cell. 図３は、細胞に対するフォーカス面の位置と、観察される明視野像におけるコントラストとの関係を概略的に示す図である。FIG. 3 is a diagram schematically showing the relationship between the position of the focus plane with respect to the cell and the contrast in the observed bright field image. 図４は、アクロマート、アポクロマートおよびフルオリートという３種のレンズの波長ごとの合焦位置を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing in-focus positions for each wavelength of three types of lenses, achromat, apochromate, and fluorite. 図５Ａは、フォーカス面を一定間隔ずつ移動させながら観察される、細胞の明視野画像の集まりである。FIG. 5A is a collection of bright-field images of cells observed while moving the focus plane at regular intervals. 図５Ｂは、フォーカス面を一定間隔ずつ移動させながら観察される、細胞の発光画像の集まりである。FIG. 5B is a collection of luminescence images of cells observed while moving the focus surface at regular intervals. 図６は、図５Ａおよび図５Ｂにて取得された画像の一部である。FIG. 6 is a part of the image acquired in FIGS. 5A and 5B. 図７は、発光の波長と、明視野位置と観察位置との差との関係を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the relationship between the emission wavelength and the difference between the bright field position and the observation position. 図８は、発光の波長と、明視野位置および観察位置との関係を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the relationship between the emission wavelength, the bright field position, and the observation position. 図９は、実施形態に係る光学顕微鏡システムを概略的に示す図である。FIG. 9 is a diagram schematically illustrating an optical microscope system according to the embodiment. 図１０は、実施形態を使用して取得されたタイムラプスのデータを示す図である。FIG. 10 is a diagram illustrating time-lapse data acquired using the embodiment.

本発明の第１実施形態は、発光および／または蛍光を発する観察対象部位を含む細胞を、光学顕微鏡を用いて観察する方法に関する。 1st Embodiment of this invention is related with the method of observing the cell containing the observation object site | part which emits light emission and / or fluorescence using an optical microscope.

細胞は、例えば、動物または植物に由来する細胞であってよく、または、微生物細胞であってよい。細胞は、生きた細胞であってよい。また、細胞は、培養細胞のように単離された１以上の細胞であってよい。あるいは、細胞は、幹細胞のように分化過程でコロニー化した細胞群であってよい。あるいは、細胞は、組織中の１以上の細胞であってよい。この場合、例えば、組織切片を顕微鏡のステージにセットし、その切片中の１つ１つの細胞を観察してもよい。さらに、細胞は、個体中の１以上の細胞であってよい。 The cell may be, for example, a cell derived from an animal or plant, or may be a microbial cell. The cell may be a living cell. The cell may be one or more cells isolated like cultured cells. Alternatively, the cells may be a group of cells colonized during the differentiation process, such as stem cells. Alternatively, the cell may be one or more cells in the tissue. In this case, for example, a tissue section may be set on a microscope stage, and each cell in the section may be observed. Furthermore, the cell may be one or more cells in the individual.

観察対象部位は、細胞に含まれるあらゆる部分または構造であってよい。例えば、核といった細胞小器官、細胞膜、細胞質等であってよい。さらに、細胞全体が発光および／または蛍光を発する場合には、細胞自体が観察対象部位となる。 The site to be observed may be any part or structure included in the cell. For example, it may be an organelle such as a nucleus, a cell membrane, a cytoplasm, or the like. Furthermore, when the whole cell emits light and / or fluorescence, the cell itself becomes a site to be observed.

観察対象部位は、発光および／または蛍光を発する。発光を使用する場合には、例えばルシフェラーゼといった発光酵素が利用され、蛍光を使用する場合には、例えばＧＦＰといった蛍光タンパク質が利用される。発光酵素を利用する場合には、それに応じた基質を細胞に投与して、発光反応を誘導することで生物発光を生じさせる。蛍光タンパク質を利用する場合には、それに応じた励起光を細胞に照射することで蛍光を生じさせる。蛍光および発光を同時に使用する場合、同一の細胞内でこれらを生じさせてよく、あるいは異なる細胞においてそれぞれを生じさせてよい。さらに、いわゆるＦＲＥＴまたはＢＲＥＴのように、２種の蛍光タンパク質間における相互作用または発光タンパク質と蛍光タンパク質との間の相互作用を介して、発光および／または蛍光を生じさせてもよい。 The site to be observed emits light and / or fluorescence. When using luminescence, a luminescent enzyme such as luciferase is used, and when using fluorescence, a fluorescent protein such as GFP is used. When a luminescent enzyme is used, a substrate corresponding thereto is administered to the cell to induce a luminescence reaction, thereby generating bioluminescence. When a fluorescent protein is used, fluorescence is generated by irradiating cells with excitation light corresponding to the protein. If fluorescence and luminescence are used simultaneously, they may occur in the same cell or each in a different cell. Furthermore, like so-called FRET or BRET, luminescence and / or fluorescence may be generated through an interaction between two fluorescent proteins or an interaction between a luminescent protein and a fluorescent protein.

発光酵素および蛍光タンパク質は、一般的な手法により細胞に導入することができる。例えば、発光酵素および／または蛍光タンパク質の遺伝子を細胞に導入し、その遺伝子を発現させることで、発光酵素および／または蛍光タンパク質を含む細胞を作製することができる。また、これらの遺伝子に、観察対象部位に局在するタンパク質の遺伝子を繋いでおくことで、発光酵素または蛍光タンパク質とこの局在タンパク質との融合タンパク質を含む細胞を作製することができ、観察対象部位において特異的に発光または蛍光を生じさせることもできる。 A luminescent enzyme and a fluorescent protein can be introduced into a cell by a general method. For example, a cell containing a luminescent enzyme and / or fluorescent protein can be produced by introducing a gene of a luminescent enzyme and / or fluorescent protein into a cell and expressing the gene. In addition, by connecting a gene of a protein localized at the site to be observed to these genes, cells containing a fusion protein of the luminescent enzyme or fluorescent protein and this localized protein can be prepared. Luminescence or fluorescence can also be produced specifically at the site.

光学顕微鏡は、細胞を観察するのに適した倍率を有する対物レンズ、明視野像を観察するための光源、蛍光タンパク質に励起光を照射するための光源、細胞からの発光および／または蛍光を観察するためのフィルター等を必要に応じて備える。 An optical microscope has an objective lens with a magnification suitable for observing cells, a light source for observing bright field images, a light source for irradiating fluorescent proteins with excitation light, and luminescence and / or fluorescence from cells A filter or the like is provided as necessary.

光学顕微鏡は、人の目で観察するための接眼レンズを備えてよい。また、光学顕微鏡は、観察された像を画像データに変換するための撮像素子を備えてよい。さらに、光学顕微鏡は、ステージの移動、レンズの移動、撮像等を、プログラムに沿って自動で行うための手段を備えていてよい。 The optical microscope may include an eyepiece for observing with the human eye. Further, the optical microscope may include an image sensor for converting an observed image into image data. Furthermore, the optical microscope may include means for automatically performing movement of the stage, movement of the lens, imaging, and the like according to a program.

本発明に係る方法は、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置と、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置とを、それぞれ明視野位置および観察位置として予め決定することを含む。 The method according to the present invention includes a position of a focus surface that provides a bright field image in which the contrast between a cell and its surroundings is maximized, and a position of a focus surface that provides a desired luminescence or fluorescence image of a site to be observed. Each of which is determined in advance as a bright field position and an observation position.

フォーカス面とは、フォーカスが厳密に合った状態で対象を観察することができるような平面を意味する。一般に、顕微鏡の設定条件ごとに、１つのフォーカス面が存在する。図１には、細胞と、対物レンズと、フォーカス面との関係が概略的に示されている。図１では、細胞１１および培地１７が入れられたシャーレ１６が、顕微鏡に備えられているステージ１５上に置かれている様子が示されている。対物レンズ１４が、シャーレ１６の底面に位置している。シャーレ１６は例えば透明なプラスティックで出来ており、対物レンズ１４により、シャーレ１６の底面を介して、細胞１１が観察される。細胞１１の中には、核１２が存在している。対物レンズ１４に対して、ただ１つのフォーカス面１３が存在している。フォーカス面１３は、対物レンズ１４をその光軸方向に移動させたり、ステージ１５を前記光軸方向に移動させたり、光学系内部の設定を変更すること等により、また、互いの距離を対物レンズの光軸方向に対し相対的に移動可能な移動手段と組み合わせることによって光軸方向に移動させることができる。 The focus plane means a plane on which the object can be observed in a state in which the focus is in exact alignment. In general, there is one focus surface for each setting condition of the microscope. FIG. 1 schematically shows a relationship among a cell, an objective lens, and a focus plane. FIG. 1 shows the petri dish 16 containing the cells 11 and the medium 17 being placed on the stage 15 provided in the microscope. The objective lens 14 is located on the bottom surface of the petri dish 16. The petri dish 16 is made of, for example, a transparent plastic, and the cells 11 are observed by the objective lens 14 through the bottom surface of the petri dish 16. A nucleus 12 is present in the cell 11. There is only one focus surface 13 for the objective lens 14. The focus surface 13 moves the objective lens 14 in the direction of the optical axis, moves the stage 15 in the direction of the optical axis, changes the setting in the optical system, and the like. It can be moved in the optical axis direction by combining with a moving means that can move relative to the optical axis direction.

細胞に対するフォーカス面の位置に応じて、観察される細胞の像は異なる。図２には、フォーカス面が細胞に対して特定の位置にあるときに観察される像が概略的に示されている。図２ａのように、細胞２１とフォーカス面２３とが大きく離れている場合、細胞を認識することができない明視野像が得られるか（図２ｂ）、またはフォーカスが合っておらず輪郭の不鮮明な細胞の明視野像が得られる。一方、図２ｃのように、フォーカス面２３と細胞２１との距離がごく小さいか、またはフォーカス面２３と細胞２１とが交わっている場合、細胞とその周囲とのコントラストにより、輪郭が鮮明な細胞の明視野像が得られる（図２ｄ）。 The observed cell image varies depending on the position of the focus plane with respect to the cell. FIG. 2 schematically shows an image observed when the focus plane is at a specific position with respect to the cell. As shown in FIG. 2a, when the cell 21 and the focus surface 23 are largely separated from each other, a bright field image in which the cell cannot be recognized is obtained (FIG. 2b), or the focus is not correct and the outline is unclear. A bright field image of the cell is obtained. On the other hand, as shown in FIG. 2c, when the distance between the focus surface 23 and the cell 21 is very small, or when the focus surface 23 and the cell 21 cross each other, the cell having a clear outline due to the contrast between the cell and its surroundings. Is obtained (FIG. 2d).

第１実施形態に係る方法では、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像、すなわち、細胞を最も鮮明に認識することができる明視野像が得られるときの、フォーカス面の位置が決定される。 In the method according to the first embodiment, the position of the focus plane when a bright field image in which the contrast between the cell and its surroundings is maximum, that is, a bright field image that can recognize the cell most clearly is obtained. It is determined.

図３には、細胞に対するフォーカス面の位置と、明視野像のコントラストとの関係が概略的に示されている。特に、図３の左側には、フォーカス面の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と、その位置に応じた明視野像におけるコントラスト（ｃｏｎｔｒａｓｔ）との関係を示すグラフが示されている。図３の右側には、細胞３１とフォーカス面３３との位置関係が示されている。左側のグラフ中のｐｏｓｉｔｉｏｎと、右側の概略図中の、細胞３１を基準としたフォーカス面３３の位置とは対応しており、例えば、右側の概略図において、細胞３１の上部に記載されたフォーカス面３３は、左側のグラフ中の上側の破線で示される位置のコントラストを与える。 FIG. 3 schematically shows the relationship between the position of the focus plane with respect to the cell and the contrast of the bright field image. In particular, on the left side of FIG. 3, a graph showing the relationship between the position of the focus plane (position) and the contrast (contrast) in the bright field image corresponding to the position is shown. On the right side of FIG. 3, the positional relationship between the cell 31 and the focus surface 33 is shown. The position in the left graph corresponds to the position of the focus plane 33 with respect to the cell 31 in the schematic diagram on the right side. For example, the focus described above the cell 31 in the schematic diagram on the right side Surface 33 provides the contrast at the position indicated by the upper dashed line in the left graph.

図３からわかるように、細胞３１を通過するようにフォーカス面３３を移動させながら明視野像を観察した場合、コントラストがピークとなる点が２つ存在する。この２つのピークは、フォーカス面３３が、それぞれ細胞３１の上端付近および下端付近に存在するときに得られる。 As can be seen from FIG. 3, when the bright field image is observed while moving the focus surface 33 so as to pass through the cell 31, there are two points where the contrast reaches a peak. These two peaks are obtained when the focus surface 33 exists near the upper end and the lower end of the cell 31, respectively.

また、一般に、細胞の明視野像を観察すると、細胞が黒く、その周囲が白くなるような像を示す場合と、細胞が白く、その周囲が黒くなるような像を示す場合がある。便宜上、前者のようなコントラストをポジティブコントラストと呼び、後者のようなコントラストをネガティブコントラストと呼ぶ。ポジティブコントラストとネガティブコントラストとの切り替わりは、図３のグラフにおいて、コントラストの２つのピークの間の谷になっている位置である。この位置は、細胞３１のほぼ中央の位置に相当する。 In general, when a bright-field image of a cell is observed, an image in which the cell is black and the surrounding area is white may be displayed, and an image in which the cell is white and the surrounding area is black may be displayed. For convenience, the former contrast is called positive contrast, and the latter contrast is called negative contrast. The switching between the positive contrast and the negative contrast is a position that is a valley between two peaks of contrast in the graph of FIG. This position corresponds to a substantially central position of the cell 31.

したがって、図３の左側のグラフにおけるコントラストの２つのピークのうち、一方はポジティブコントラストであり、他方はネガティブコントラストとなる。本発明において決定される、コントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置は、この２つのピークに対応する何れか１つの位置であってよく、またはこの２つのピークに対応する両方の位置であってよい。このように決定された、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすフォーカス面の位置を、便宜上、明視野位置と称し、特に、ポジティブコントラストに対応する位置を第１明視野位置、ネガティブコントラストに対応する位置を第２明視野位置とそれぞれ称する。 Therefore, one of the two contrast peaks in the left graph of FIG. 3 is positive contrast and the other is negative contrast. The position of the focus plane that results in the bright field image with the maximum contrast as determined in the present invention may be any one position corresponding to the two peaks, or both corresponding to the two peaks. It may be a position. The position of the focus plane that provides the bright field image that maximizes the contrast between the cell and its surroundings determined in this way is referred to as the bright field position for convenience, and in particular, the position corresponding to the positive contrast is the first bright field. The position corresponding to the position and the negative contrast is referred to as a second bright field position.

決定された明視野位置は、適宜、記録される。記録は、例えば顕微鏡の設定状態を記録することで行われる。顕微鏡の設定状態とは、対物レンズの位置を調整するためのハンドルの目盛の状態、ステージの高さの状態等を含む。あるいは、記録は、コンピュータ上で作動するソフトウェアによって記録される。 The determined bright field position is appropriately recorded. The recording is performed, for example, by recording the setting state of the microscope. The setting state of the microscope includes the state of the scale of the handle for adjusting the position of the objective lens, the state of the stage height, and the like. Alternatively, the record is recorded by software running on a computer.

第１実施形態に係る方法では、明視野位置とともに、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置が決定される。すなわち、フォーカス面を移動して、観察の対象として適切な発光または蛍光の像を特定し、そのときのフォーカス面の位置を決定する。観察対象部位は、細胞のなかで様々な位置に存在し得るため、最適な位置が決定される。このとき決定される、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすフォーカス面の位置を、便宜的に、観察位置と称する。 In the method according to the first embodiment, together with the bright field position, the position of the focus plane that provides the desired light emission or fluorescence image for the site to be observed is determined. That is, the focus plane is moved to identify an appropriate light emission or fluorescence image as an observation target, and the position of the focus plane at that time is determined. Since the observation target part can exist at various positions in the cell, the optimum position is determined. The position of the focus plane that provides a desired light emission or fluorescence image for the site to be observed, which is determined at this time, is referred to as an observation position for convenience.

図２ｅおよび図２ｆには、観察対象部位についての発光または蛍光の像を観察する様子が概略的に示されている。図２ｅに示される図では、細胞２１中の核２２に発光酵素または蛍光タンパク質が存在しており、既に発光または蛍光を発する状態となっている。図２ｅのように、この核２２をフォーカス面２３が通過するとき、図２ｆのように、核２２を観察することができる。なお、発光または蛍光を観察する場合には、その発光または蛍光以外の光を遮断することで、図２ｆのように、発光または蛍光のみを明瞭に観察することができる。 FIGS. 2e and 2f schematically show a state of observing a luminescence or fluorescence image of a site to be observed. In the diagram shown in FIG. 2e, a luminescent enzyme or fluorescent protein is present in the nucleus 22 in the cell 21, and is already in a state of emitting luminescence or fluorescence. When the focus plane 23 passes through the nucleus 22 as shown in FIG. 2e, the nucleus 22 can be observed as shown in FIG. 2f. In the case of observing light emission or fluorescence, only light emission or fluorescence can be clearly observed as shown in FIG. 2f by blocking light other than the light emission or fluorescence.

決定された観察位置は、適宜、記録される。記録は、例えば顕微鏡の設定状態を記録することで行われる。顕微鏡の設定状態とは、対物レンズの位置を調整するためのハンドルの目盛の状態、ステージの高さの状態等を含む。あるいは、記録は、コンピュータ上で作動するソフトウェアによって記録される。 The determined observation position is recorded as appropriate. The recording is performed, for example, by recording the setting state of the microscope. The setting state of the microscope includes the state of the scale of the handle for adjusting the position of the objective lens, the state of the stage height, and the like. Alternatively, the record is recorded by software running on a computer.

明視野位置および観察位置の決定に続き、それらの情報に基づいて、観察対象部位の発光または蛍光の画像が取得される。 Following the determination of the bright field position and the observation position, a light emission or fluorescence image of the site to be observed is acquired based on the information.

明視野位置および観察位置の決定の際に使用した細胞と、画像の取得の際に使用する細胞とは、同一の細胞であってよく、または、異なる細胞であるものの同種の細胞であってよい。例えば、細胞を経時的に観察する場合には、ある細胞を使用して位置の決定を行った後、その細胞について、引き続き画像の取得を繰り返し行うことができる。あるいは、小さなスケールで培養した細胞を使用して位置を決定した後、同一条件にて大きなスケールで培養した細胞について画像を取得することができる。 The cells used for determining the bright field position and the observation position and the cells used for acquiring the image may be the same cell, or may be the same type of cells although they are different cells. . For example, when observing a cell over time, after a position is determined using a certain cell, image acquisition can be continuously repeated for that cell. Alternatively, after determining the position using cells cultured on a small scale, images can be obtained for cells cultured on a large scale under the same conditions.

発光または蛍光の画像の取得のために、まず、フォーカス面を明視野位置に合わせて明視野の画像が取得される。明視野位置へのフォーカス面の移動は、手動で行ってもよく、または自動で行ってもよい。自動で行われる場合、例えば、コンピュータ上で作動するソフトウェア等の制御によって行われる。取得される画像は、コンピュータ等に記録される。一方、手動で行う場合、例えば、コンピュータと一体または接続されるディスプレイ上の画面に、取得した各種画像を表示させ、使用者がコンピュータと一体または接続される各種入力用操作手段（キーボード、入力用マウス等）を操作して、画面を見ながらフォーカス面を移動させてもよい。 In order to acquire a light emission or fluorescence image, first, a bright field image is acquired by adjusting the focus plane to the bright field position. The movement of the focus plane to the bright field position may be performed manually or automatically. When it is performed automatically, for example, it is performed by control of software or the like that operates on a computer. The acquired image is recorded in a computer or the like. On the other hand, when performing manually, for example, the acquired various images are displayed on a screen on a display united or connected to the computer, and various input operation means (keyboard, input unit) that the user is integrated or connected to the computer. The focus plane may be moved while viewing the screen by operating a mouse or the like.

明視野画像の取得に続いて、フォーカス面が明視野位置から移動される。このとき、フォーカス面は、明視野位置と観察位置との差の分だけ、観察対象部位に向けて移動される。すなわち、フォーカス面は観察位置に移動する。移動は、上述したように手動で行われてもよい。あるいは、移動は、例えばコンピュータ上で作動するソフトウェア等による制御によって自動で行われてもよく、この場合、コンピュータ上に記録された、明視野位置および観察位置の情報に基づいてそれらの差が算出され、その差の分だけフォーカス面が観察対象部位に移動するように顕微鏡を作動させる。 Following acquisition of the bright field image, the focus plane is moved from the bright field position. At this time, the focus plane is moved toward the observation target part by the difference between the bright field position and the observation position. That is, the focus plane moves to the observation position. The movement may be performed manually as described above. Alternatively, the movement may be performed automatically by, for example, control by software operating on a computer, and in this case, the difference between them is calculated based on the bright field position and observation position information recorded on the computer. Then, the microscope is operated so that the focus plane moves to the observation target part by the difference.

フォーカス面の移動が完了した後、観察対象部位についての発光または蛍光の画像が取得される。取得される画像は、コンピュータ等に記録される。 After the movement of the focus plane is completed, a light emission or fluorescence image for the observation target region is acquired. The acquired image is recorded in a computer or the like.

明視野画像の取得、フォーカス面の移動、および発光または蛍光の画像の取得は、繰り返し行うこともできる。例えば、経時的に観察する場合には、特定のスケジュールに基づいて、これらの操作が繰り返し行われる。例えば、画像の取得の度に、明視野位置および観察位置の決定を行うことができる。すなわち、明視野位置および観察位置の決定と、それらの位置を利用した画像の取得とから成る一連の工程を、複数回繰り返していもよい。 Acquisition of the bright field image, movement of the focus plane, and acquisition of the light emission or fluorescence image can be performed repeatedly. For example, when observing over time, these operations are repeated based on a specific schedule. For example, the bright field position and the observation position can be determined each time an image is acquired. That is, a series of steps including the determination of the bright field position and the observation position and the acquisition of an image using these positions may be repeated a plurality of times.

なお、決定される明視野位置として、第１明視野位置が選択された場合には、その第１明視野位置にて明視野画像が取得され、第１明視野位置と観察位置との差の分だけフォーカス面が移動され、一方、第２明視野位置が選択された場合には、その第２明視野位置にて明視野画像が取得され、第２明視野位置と観察位置との差の分だけフォーカス面が移動される。 When the first bright field position is selected as the bright field position to be determined, a bright field image is acquired at the first bright field position, and the difference between the first bright field position and the observation position is obtained. On the other hand, when the second bright field position is selected, a bright field image is acquired at the second bright field position, and the difference between the second bright field position and the observation position is obtained. The focus plane is moved by that amount.

また、第１明視野位置と第２明視野位置との両方が決定された場合には、そのうちの何れか一方を、フォーカス面の移動および発光または蛍光の画像の取得のために使用してよく、または、それらの両方を使用してよい。両方を使用する場合、フォーカス面の移動および発光または蛍光の画像の取得を、それぞれの明視野位置に関して、それぞれ行うことができ、この場合、取得される２つの発光または蛍光の画像のうち、両方を記録することができ、または一方を記録することができる。また、取得されたこれら２つの画像に基づいて、測定上の誤差を解消するような修正等を行った１つの画像を作成してもよい。 Further, when both the first bright field position and the second bright field position are determined, any one of them may be used for moving the focus plane and acquiring a light emission or fluorescence image. Or both of them may be used. When both are used, the movement of the focus plane and the acquisition of the luminescent or fluorescent image can be performed for each bright field position, respectively, in which case both of the two luminescent or fluorescent images acquired are Can be recorded, or one can be recorded. Further, based on these two acquired images, one image may be created that has been corrected to eliminate measurement errors.

明視野位置および観察位置の決定の際の観察条件と同一の観察条件が、発光および蛍光の画像の取得にも適用されることが好ましい。観察条件の例は、対物レンズの種類、対物レンズの倍率、発光または蛍光の波長（すなわち、発光酵素または蛍光タンパク質の種類）、細胞の厚さ等である。 It is preferable that the same observation conditions as the observation conditions for determining the bright field position and the observation position are applied to the acquisition of the luminescence and fluorescence images. Examples of observation conditions include the type of objective lens, the magnification of the objective lens, the wavelength of luminescence or fluorescence (that is, the type of luminescent enzyme or fluorescent protein), the thickness of the cell, and the like.

例えば、対物レンズは、色収差の特性が種類ごとに異なっている。一般に、対物レンズでは色収差が補正されているが、補正の違いにより合焦位置に違いが生じる。図４には、アクロマート、アポクロマートおよびフルオリートという３種のレンズの波長ごとの合焦位置が示されている（http://bioimaging.jp/learn/016/より抜粋）。例えば、アクロマートは、赤（６５６．３ｎｍ）および青（４８６．１ｎｍ）の２色について補正されており、この２色については焦点位置からのずれ量がともにゼロとなっている。アポクロマートは、これら２色と紫（４３５．８ｎｍ）の計３色について補正されている。フルオリートは、これら赤（６５６．３ｎｍ）および青（４８６．１ｎｍ）の２色について補正されており、紫（４３５．８ｎｍ）については、アクロマートとアポクロマートの中間程度の補正がなされている。したがって、実施形態に係る方法では、対物レンズの特性の違いに考慮して、対物レンズを選択することが好ましい。特に、発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長が複数種類である場合には、使用される光の波長との組み合わせを考慮して対物レンズを選択するのが好ましい。 For example, the objective lens has different chromatic aberration characteristics for each type. In general, chromatic aberration is corrected in an objective lens, but a difference occurs in a focus position due to a difference in correction. FIG. 4 shows in-focus positions for each wavelength of three types of lenses, achromat, apochromate, and fluorite (extracted from http://bioimaging.jp/learn/016/). For example, the achromat is corrected for two colors of red (656.3 nm) and blue (486.1 nm), and the deviation from the focal position is zero for these two colors. The apochromat has been corrected for a total of three colors, these two colors and purple (435.8 nm). Fluorite is corrected for these two colors of red (656.3 nm) and blue (486.1 nm), and purple (435.8 nm) is corrected to an intermediate level between achromatic and apochromatic. Therefore, in the method according to the embodiment, it is preferable to select the objective lens in consideration of the difference in characteristics of the objective lens. In particular, when there are a plurality of wavelengths of light used in light emission and / or fluorescence observation, it is preferable to select an objective lens in consideration of combinations with the wavelengths of light used.

なお、実施形態に係る方法では、複数種の対物レンズにそれぞれ対応する明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定しておき、画像を取得する際には、それらの中から、使用する対物レンズに応じた組み合わせを選択して使用してもよい。特に、対物レンズの色収差の特性の違いに着目して、対物レンズごとに明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定してよい。さらに、対物レンズの色収差の特性と、発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長との関係に着目して、明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを予め決定し、画像を取得する際には、使用する対物レンズの色収差の特性と光の波長との関係に対応した組み合わせを使用してもよい。 In the method according to the embodiment, a plurality of combinations of bright field positions and observation positions respectively corresponding to a plurality of types of objective lenses are determined in advance, and are used from among these when acquiring an image. You may select and use the combination according to an objective lens. In particular, paying attention to the difference in chromatic aberration characteristics of the objective lens, a plurality of combinations of bright field positions and observation positions may be determined in advance for each objective lens. Furthermore, paying attention to the relationship between the chromatic aberration characteristics of the objective lens and the wavelength of light used in light emission and / or fluorescence observation, multiple combinations of bright field positions and observation positions are determined in advance, and images are acquired. In this case, a combination corresponding to the relationship between the chromatic aberration characteristic of the objective lens used and the wavelength of light may be used.

また、実施形態に係る方法では、画像を取得する度に、焦点を合わせるように調節することができる。すなわち、画像を取得する際に、オートフォーカスにより明視野位置および観察位置を調整してもよい。具体的には、フォーカス面を明視野位置に合わせた後、および／またはフォーカス面を、明視野位置と観察位置との差だけ前記観察対象部位に向けて移動させた後、画像の焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には焦点を合わせることができる。 In addition, in the method according to the embodiment, the image can be adjusted so as to be focused each time an image is acquired. That is, when the image is acquired, the bright field position and the observation position may be adjusted by autofocus. Specifically, after the focus surface is adjusted to the bright field position and / or the focus surface is moved toward the observation target part by the difference between the bright field position and the observation position, the image is focused. If it does not match, the focus can be adjusted.

実施形態に係る観察方法によれば、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得することができる。 According to the observation method according to the embodiment, it is possible to easily obtain a light emission or fluorescence image of a cell that is appropriately focused.

特に、画像取得の際にフォーカスを合せる操作に要する時間を短縮することができる。さらに、そのような操作を自動化することにより、画像取得の効率を飛躍的に向上させることができる。操作のための時間が短縮されることにより、例えば経時的に画像を取得する際に、画像取得の時間間隔を狭めることができ、または、画像取得のタイミングの選択肢を広げることができる。 In particular, it is possible to reduce the time required for the operation of focusing when acquiring an image. Furthermore, by automating such operations, the efficiency of image acquisition can be dramatically improved. By shortening the time for operation, for example, when acquiring images over time, the time interval of image acquisition can be narrowed, or the options for timing of image acquisition can be expanded.

また、画像取得を繰り返す場合に、毎回、決まった位置にて画像が取得されるため、実験の正確さが向上する。特に、時間の経過につれて、光が弱まったり、光が消失したりする場合であっても、画像取得すべき位置を見失うことなく、それまで取得していた位置と同じ位置にて画像を取得することができる。 In addition, since the image is acquired at a fixed position every time the image acquisition is repeated, the accuracy of the experiment is improved. In particular, even if the light becomes weaker or disappears as time passes, the image is acquired at the same position as the acquired position without losing sight of the position where the image should be acquired. be able to.

さらに、光が微弱な細胞では、毎回目視にて位置を設定することは、観察者にとって大きな負担となるものの、本発明に係る方法によればそのような負担を軽減することができる。 Furthermore, for cells with weak light, setting the position by visual observation every time is a heavy burden on the observer, but according to the method of the present invention, such a burden can be reduced.

また、レンズ毎に明視野位置および観察位置の情報を取得し、蓄積しておくことも可能であり、レンズを交換したりした場合であっても、蓄積された情報に基づいて適切な位置にフォーカスを合わせることが可能となる。 In addition, it is possible to acquire and accumulate information on the bright field position and observation position for each lens, and even when the lens is replaced, it is possible to obtain an appropriate position based on the accumulated information. The focus can be adjusted.

また、第１実施形態に係る方法では、発光および蛍光の何れを発する細胞でも使用できるが、特に発光を発する細胞を使用する場合には、発光に起因する問題を回避することが可能となる。一般的に発光は蛍光に比べて放射する光の強度が小さく、露光時間を長くとる必要がある。そのため、発光を用いてフォーカスを合わせることは、比較的手間となる。しかし、第１実施形態に係る方法を用いることで、このような手間を解消することが可能となる。 Further, in the method according to the first embodiment, cells that emit either luminescence or fluorescence can be used. However, particularly when cells that emit luminescence are used, problems due to luminescence can be avoided. In general, the intensity of emitted light is smaller than that of fluorescent light, and it is necessary to increase the exposure time. Therefore, it is relatively troublesome to focus using light emission. However, by using the method according to the first embodiment, such trouble can be eliminated.

本発明の第２実施形態は、光学顕微鏡システムに関する。 The second embodiment of the present invention relates to an optical microscope system.

図９には、実施形態に係る光学顕微鏡システム１００が概略的に示される。 FIG. 9 schematically shows an optical microscope system 100 according to the embodiment.

図示されるように、実施形態に係る光学顕微鏡システム１００は、少なくとも光学系１０７、ステージ１５、移動手段およびコンピュータ１０８を含む。 As illustrated, the optical microscope system 100 according to the embodiment includes at least an optical system 107, a stage 15, a moving unit, and a computer 108.

光学系１０７は、試料の画像データを作成する。例えば、図９では、ステージ１５上に細胞１１を含む培地１７を収容したシャーレ１６が置かれている。この場合、光学系１０７は、細胞１１を含む像を画像データとして作成する。光学系１０７は、少なくとも対物レンズ１０５およびイメージセンサ１０６を含む。光学系１０７は、結像レンズ、各種フィルター、光源等をさらに含んでよい。 The optical system 107 creates sample image data. For example, in FIG. 9, a petri dish 16 containing a medium 17 containing cells 11 is placed on the stage 15. In this case, the optical system 107 creates an image including the cells 11 as image data. The optical system 107 includes at least an objective lens 105 and an image sensor 106. The optical system 107 may further include an imaging lens, various filters, a light source, and the like.

対物レンズ１０５は、試料からの光を受けて像を形成し、イメージセンサ１０６に送る。イメージセンサ１０６は、対物レンズ１０５から送られてきた像を画像データに変換する。イメージセンサ１０６は、コンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８に向けて画像データを送る。 The objective lens 105 receives the light from the sample, forms an image, and sends the image to the image sensor 106. The image sensor 106 converts the image sent from the objective lens 105 into image data. The image sensor 106 is connected to the computer 108 and sends image data to the computer 108.

ステージ１５は、細胞１１を含む試料を載置することができる。さらに、ステージ１５は、対物レンズ１０５の光軸方向に移動可能である。また、ステージ１５は、対物レンズ１０５の光軸方向と垂直な方向にも移動可能であってよい。便宜上、光軸方向の移動をＺ方向の移動と称し、光軸方向と垂直な方向の移動をＸＹ方向の移動と称する。 The stage 15 can place a sample including the cells 11. Further, the stage 15 is movable in the optical axis direction of the objective lens 105. Further, the stage 15 may be movable in a direction perpendicular to the optical axis direction of the objective lens 105. For convenience, movement in the optical axis direction is referred to as movement in the Z direction, and movement in the direction perpendicular to the optical axis direction is referred to as movement in the XY direction.

移動手段は、ステージ１５および／または対物レンズ１０５を光軸方向（すなわちＺ方向）に移動させる。移動手段によるステージ１５のＺ方向の移動は、コンピュータ１０８の指示に基づいて自動で行われる。しかしながら、Ｚ方向の移動は、自動による移動とともに、手動による移動も行うことができてよい。Ｚ方向の移動を担う移動手段は、例えば図９に示されるような、Ｚ方向駆動部１０１およびＺ方向制御部１０２であってよい。Ｚ方向駆動部１０１は、ステージ１５に接続されており、ステージ１５を直接駆動する。Ｚ方向制御部１０２は、Ｚ方向駆動部１０１およびコンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８からの指示に基づいて、Ｚ方向駆動部１０１に対して、ステージ１５の移動について指示を行う。また、移動手段は、対物レンズ１０５を移動させる駆動部および制御部であってもよい。 The moving means moves the stage 15 and / or the objective lens 105 in the optical axis direction (that is, the Z direction). The movement of the stage 15 in the Z direction by the moving means is automatically performed based on an instruction from the computer 108. However, the movement in the Z direction may be performed manually as well as automatically. The moving means responsible for the movement in the Z direction may be a Z direction driving unit 101 and a Z direction control unit 102 as shown in FIG. 9, for example. The Z direction driving unit 101 is connected to the stage 15 and directly drives the stage 15. The Z direction control unit 102 is connected to the Z direction driving unit 101 and the computer 108, and instructs the Z direction driving unit 101 about the movement of the stage 15 based on an instruction from the computer 108. The moving means may be a drive unit and a control unit that move the objective lens 105.

ＸＹ方向の移動は、コンピュータ１０８の指示に基づいて自動で行われてよく、または手動で行われてもよい。あるいは、ＸＹ方向の移動は、自動および手動の両方で行われてよい。ＸＹ方向の移動は、例えば図９に示されるような、ＸＹ方向駆動部１０３およびＸＹ方向制御部１０４によって行われてよい。ＸＹ方向駆動部１０３は、ステージ１５に接続されており、ステージ１５を直接駆動する。ＸＹ方向制御部１０４は、ＸＹ方向駆動部１０３とコンピュータ１０８に接続されており、コンピュータ１０８からの指示に基づいて、ＸＹ方向駆動部１０３に対して、ステージ１５の移動について指示をする。 The movement in the XY directions may be performed automatically based on instructions from the computer 108 or may be performed manually. Alternatively, the movement in the XY direction may be performed both automatically and manually. The movement in the XY directions may be performed by an XY direction driving unit 103 and an XY direction control unit 104 as shown in FIG. 9, for example. The XY direction driving unit 103 is connected to the stage 15 and directly drives the stage 15. The XY direction control unit 104 is connected to the XY direction driving unit 103 and the computer 108, and instructs the XY direction driving unit 103 about the movement of the stage 15 based on an instruction from the computer 108.

コンピュータ１０８は、ステージ１５の光軸方向の位置を記録できる。ステージ１５のＺ方向の位置についての情報は、例えば、Ｚ方向駆動部１０１およびＺ方向制御部１０２を介して取得される。また、コンピュータ１０８は、イメージセンサ１０６から送られてくる画像データを記録できる。さらに、コンピュータ１０８は、ステージ１５に対してＺ方向の移動を行うよう指示できる。コンピュータ１０８は、例えば、ＣＰＵ１０９およびディスプレイ１１０を含み、そのほかに入力用のデバイス等を含んでもよい。 The computer 108 can record the position of the stage 15 in the optical axis direction. Information about the position of the stage 15 in the Z direction is acquired via the Z direction driving unit 101 and the Z direction control unit 102, for example. The computer 108 can record image data sent from the image sensor 106. Further, the computer 108 can instruct the stage 15 to move in the Z direction. The computer 108 includes, for example, a CPU 109 and a display 110, and may further include an input device or the like.

コンピュータ１０８は、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置、および観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像をもたらすステージの位置を、それぞれ明視野ステージ位置および観察ステージ位置として予め記録するよう構成されている。コントラストが最大かどうかの判断および発光または蛍光の如何なる像を取得するかどうかの判断は、使用者によって行われてよく、またはコンピュータ１０８によって行われてもよい。 The computer 108 determines the position of the stage that provides the bright field image that maximizes the contrast between the cell and its surroundings, and the position of the stage that provides the desired luminescence or fluorescence image for the site being observed, respectively. The observation stage position is recorded in advance. The determination of whether the contrast is maximum and whether to obtain any image of luminescence or fluorescence may be made by the user or by the computer 108.

さらに、コンピュータ１０８は、最適な細胞の画像データを取得するよう構成されている。具体的には、コンピュータ１０８は、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定において使用した細胞、またはその細胞と同種の細胞についての画像データを取得する際に、ステージ１５に対して明視野ステージ位置に移動するよう指示し、移動後において光学系１７にて得られた画像データを記録する。これにより、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像が得られる。続いて、コンピュータ１０８は、ステージ１５に対して、明視野ステージ位置と観察ステージ位置との差だけ観察対象部位に向けて移動するよう指示し、移動後において光学系１７にて得られた前記画像データを記録する。これにより、観察対象部位についての所望の発光または蛍光の像が得られる。 Further, the computer 108 is configured to acquire optimal cell image data. Specifically, the computer 108 acquires the bright field stage position with respect to the stage 15 when acquiring image data about the cells used in the determination of the bright field stage position and the observation stage position, or the same type of cells as the cells. The image data obtained by the optical system 17 after the movement is recorded. Thereby, a bright field image in which the contrast between the cell and its surroundings is maximized is obtained. Subsequently, the computer 108 instructs the stage 15 to move toward the observation target portion by the difference between the bright field stage position and the observation stage position, and the image obtained by the optical system 17 after the movement is obtained. Record the data. As a result, a desired luminescence or fluorescence image can be obtained for the site to be observed.

さらに、コンピュータ１０８は、細胞についての画像データを経時的に取得するように構成されていてよい。そして、コンピュータ１０８は、画像データの取得の度に、予め明視野ステージ位置および観察ステージ位置の記録を行ってよい。すなわち、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定と、それらの位置を利用した画像の取得とから成る一連の工程が複数回繰り返されてもよい。 Further, the computer 108 may be configured to acquire image data about the cells over time. The computer 108 may record the bright field stage position and the observation stage position in advance every time image data is acquired. That is, a series of steps including determination of the bright field stage position and the observation stage position, and acquisition of an image using these positions may be repeated a plurality of times.

また、コンピュータ１０８は、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、互いに異なる対物レンズにそれぞれ対応する組み合わせを予め記録しておいてもよい。そして画像データを取得する場合、使用する対物レンズに対応した組み合わせを使用してよい。特に、対物レンズの色収差の特性の違いに着目して、対物レンズごとに明視野位置および観察位置の複数の組み合わせを決定してよい。さらに、発光および／または蛍光の観察において観察に使用される光の波長が複数種類である場合には、コンピュータ１０８は、前記明視野ステージ位置および前記観察ステージ位置の複数の組み合わせであって、前記対物レンズの色収差の特性並びに発光および／または蛍光の観察において使用される光の波長にそれぞれ対応する組み合わせを予め記録しておいてもよい。そして、画像データを取得する際に、使用する対物レンズおよび光の波長に応じた、明視野ステージ位置と観察ステージ位置との組み合わせを使用してよい。 The computer 108 may record in advance a plurality of combinations of the bright field stage position and the observation stage position, each corresponding to a different objective lens. And when acquiring image data, you may use the combination corresponding to the objective lens to be used. In particular, paying attention to the difference in chromatic aberration characteristics of the objective lens, a plurality of combinations of the bright field position and the observation position may be determined for each objective lens. Furthermore, when there are a plurality of wavelengths of light used for observation in observation of light emission and / or fluorescence, the computer 108 is a plurality of combinations of the bright field stage position and the observation stage position, Combinations corresponding to the characteristics of chromatic aberration of the objective lens and the wavelength of light used in the observation of light emission and / or fluorescence may be recorded in advance. And when acquiring image data, you may use the combination of the bright field stage position and observation stage position according to the objective lens to be used and the wavelength of light.

また、コンピュータ１０８は、画像データを取得する際に焦点を自動で合わせるように構成されていてよい。すなわち、画像を取得する際に、オートフォーカスにより明視野位置および観察位置を調整するように構成されていてもよい。具体的には、ステージが明視野位置に移動した後、そのときの画像データの焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には、焦点が合うようにステージを移動させる。同様に、発光または蛍光の画像データを取得する位置にステージが移動した後、そのときの画像データの焦点が合っているかを判定し、合っていない場合には、焦点が合うようにステージを移動させる。 The computer 108 may be configured to automatically focus when acquiring image data. In other words, when acquiring an image, the bright field position and the observation position may be adjusted by autofocus. Specifically, after the stage has moved to the bright field position, it is determined whether the image data at that time is in focus, and if not, the stage is moved so that it is in focus. Similarly, after the stage has moved to a position to acquire luminescence or fluorescence image data, it is determined whether the image data at that time is in focus, and if not, the stage is moved so that it is in focus. Let

実施形態に係る光学顕微鏡システム１００は、さらに、光学顕微鏡システム１００の少なくとも一部を覆うハウジング１１１を含んでもよい。ハウジング１１１は、例えば、遮光の役割や、細胞１１の培養のために必要な環境を維持する役割を担う。 The optical microscope system 100 according to the embodiment may further include a housing 111 that covers at least a part of the optical microscope system 100. For example, the housing 111 plays a role of shielding light and maintaining an environment necessary for culturing the cells 11.

以下、光学顕微鏡システム１００の動作の例を説明する。 Hereinafter, an example of the operation of the optical microscope system 100 will be described.

１つ目の例は、画像データの取得の度に、予め明視野ステージ位置および観察ステージ位置の記録を行う例である。 The first example is an example in which the bright field stage position and the observation stage position are recorded in advance every time image data is acquired.

この場合、まず、コンピュータ１０８に対し、明視野での撮影条件（露出時間、Ｚ方向の移動距離、撮影枚数等）を入力する。次に、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置を明視野ステージ位置として決定する。そして、コンピュータ１０８が、この明視野ステージ位置を記録する。さらに、必要に応じて、コンピュータ１０８は、この明視野ステージ位置における画像データを光学系１０７を介して取得し、記録する。続いて、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、観察対象として適切な発光および／または蛍光の像をもたらすステージの位置を観察ステージ位置として決定する。そして、必要に応じて、コンピュータ１０８が、この観察ステージ位置を記録する。以上が、明視野ステージ位置および観察ステージ位置の決定の工程である。 In this case, first, shooting conditions (exposure time, movement distance in the Z direction, number of shots, etc.) in the bright field are input to the computer 108. Next, the position of the stage 15 is moved manually or automatically, and the position of the stage that provides a bright field image in which the contrast between the cell and its surroundings is maximized is determined as the bright field stage position. The computer 108 records the bright field stage position. Furthermore, if necessary, the computer 108 acquires and records image data at the bright field stage position via the optical system 107. Subsequently, the position of the stage 15 is moved manually or automatically, and the position of the stage that provides an appropriate light emission and / or fluorescence image as an observation target is determined as the observation stage position. Then, if necessary, the computer 108 records the observation stage position. The above is the process of determining the bright field stage position and the observation stage position.

続いて、画像データが取得される。具体的には、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が明視野ステージ位置に移動する。移動後、明視野の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が観察ステージ位置に移動する。移動後、発光および／または蛍光の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。 Subsequently, image data is acquired. Specifically, the stage 15 moves to the bright field stage position according to an instruction from the computer 108. After the movement, bright field image data is acquired by the optical system 107, sent to the computer 108, and recorded. Next, the stage 15 moves to the observation stage position in accordance with an instruction from the computer 108. After the movement, light emission and / or fluorescence image data is acquired by the optical system 107, sent to the computer 108, and recorded.

以上のような位置の決定の工程と画像データの工程とが、経時的に繰り返される。 The position determination process and the image data process as described above are repeated over time.

２つ目の例は、使用する対物レンズ１０５に応じて、対応する明視野ステージ位置および観察ステージ位置を使用する例である。 The second example is an example in which the corresponding bright field stage position and observation stage position are used according to the objective lens 105 to be used.

この場合、まず、ある対物レンズ１０５を光学系１０７に装着した状態で、コンピュータ１０８に対し、明視野での撮影条件（対物レンズ特性、倍率、波長特性等）を入力する。次に、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、細胞とその周囲とのコントラストが最大となる明視野像をもたらすステージの位置を明視野ステージ位置として決定する。そして、コンピュータ１０８が、この明視野ステージ位置を記録する。さらに、必要に応じて、コンピュータ１０８は、この明視野ステージ位置における画像データを光学系１０７を介して取得し、記録する。続いて、手動または自動により、ステージ１５の位置を移動させ、観察対象として適切な発光および／または蛍光の像をもたらすステージの位置を観察ステージ位置として決定する。そして、必要に応じて、コンピュータ１０８が、この観察ステージ位置を記録する。このような位置の決定を、別の対物レンズ１０５に替えて繰り返す。 In this case, first, with a certain objective lens 105 attached to the optical system 107, shooting conditions (objective lens characteristics, magnification, wavelength characteristics, etc.) in a bright field are input to the computer 108. Next, the position of the stage 15 is moved manually or automatically, and the position of the stage that provides a bright field image in which the contrast between the cell and its surroundings is maximized is determined as the bright field stage position. The computer 108 records the bright field stage position. Furthermore, if necessary, the computer 108 acquires and records image data at the bright field stage position via the optical system 107. Subsequently, the position of the stage 15 is moved manually or automatically, and the position of the stage that provides an appropriate light emission and / or fluorescence image as an observation target is determined as the observation stage position. Then, if necessary, the computer 108 records the observation stage position. Such position determination is repeated in place of another objective lens 105.

続いて、画像データが取得される。具体的には、まず、観察に適した対物レンズ１０５を装着する。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が明視野ステージ位置に移動する。このとき、コンピュータ１０８は、使用する対物レンズ１０５に応じた明視野ステージ位置を指定する。移動後、明視野の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。次に、コンピュータ１０８の指示により、ステージ１５が観察ステージ位置に移動する。このとき、コンピュータ１０８は、使用する対物レンズ１０５に応じた観察ステージ位置を指定する。移動後、発光および／または蛍光の画像データが光学系１０７により取得され、コンピュータ１０８に送られ、記録される。どのような対物レンズ１０５を使用しているかは、手動でコンピュータ１０８に入力してもよいし、コンピュータ１０８が自動で情報を取得してもよい。自動で取得する場合、例えば、光学系１０７を介して、対物レンズ１０５の情報がコンピュータ１０８に伝えられる。 Subsequently, image data is acquired. Specifically, first, an objective lens 105 suitable for observation is attached. Next, the stage 15 moves to the bright field stage position in accordance with an instruction from the computer 108. At this time, the computer 108 designates a bright field stage position corresponding to the objective lens 105 to be used. After the movement, bright field image data is acquired by the optical system 107, sent to the computer 108, and recorded. Next, the stage 15 moves to the observation stage position in accordance with an instruction from the computer 108. At this time, the computer 108 designates an observation stage position corresponding to the objective lens 105 to be used. After the movement, light emission and / or fluorescence image data is acquired by the optical system 107, sent to the computer 108, and recorded. Which objective lens 105 is used may be manually input to the computer 108, or the computer 108 may automatically acquire information. When acquiring automatically, the information of the objective lens 105 is transmitted to the computer 108 via the optical system 107, for example.

実施形態に係る光学顕微鏡システムによれば、実施形態に係る観察方法と同様に、適切にフォーカスが合った細胞の発光または蛍光の画像を容易に取得することができる。 According to the optical microscope system according to the embodiment, similarly to the observation method according to the embodiment, it is possible to easily acquire a light emission or fluorescence image of a cell that is appropriately focused.

＜実施例１＞
種々のルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞を対象として、フォーカス面を移動させながら明視野画像および発光画像を取得した。さらに、取得された画像から明視野位置および観察位置を抽出し、グラフにプロットした。 <Example 1>
For HeLa cells expressing various luciferases, bright field images and luminescence images were acquired while moving the focus plane. Furthermore, the bright field position and the observation position were extracted from the acquired image and plotted on a graph.

［ＨｅＬａ細胞の準備］
それぞれ異なるルシフェラーゼ遺伝子を発現する複数のＨｅＬａ細胞を作製した。これらのルシフェラーゼは、互いに異なる波長の発光を生じる発光反応を触媒する。 [Preparation of HeLa cells]
A plurality of HeLa cells expressing different luciferase genes were prepared. These luciferases catalyze a luminescent reaction that generates light of different wavelengths.

９種のルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターを使用した。それぞれのベクターに含まれるルシフェラーゼ遺伝子は、ＮａｎｏＬｕｃ、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＣＢＧ、Ｌｕｃ２およびＣＢＲ（これら５種はプロメガ株式会社製である）、ならびにＥｌｕｃ、ＳＬＧ、ＳＬＯおよびＳＬＲ（これらの４種はＴＯＹＯＢＯ製である）であった。 Nine luciferase gene expression vectors were used. The luciferase genes contained in each vector are NanoLuc, Renilla, CBG, Luc2 and CBR (these five are from Promega), and Eluc, SLG, SLO and SLR (these four are from TOYOBO) )Met.

３５ｍｍガラスボトムディッシュにて一晩培養したＨｅＬａ細胞に対して、上記９種のルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターをそれぞれトランスフェクションし、トランスフェクトされた９種のＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ培地を用いてそれぞれ一晩培養した。遺伝子のトランスフェクションには、ＦｕＧＥＭＥ（プロメガ株式会社製）を用い、それぞれ１μｇ／μｇのＤＮＡを導入した。翌日、それぞれの培地を、ＨＥＰＥＳ入りＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、フェノールレッド抜き）に置き換えた。 The above 9 types of luciferase gene expression vectors were transfected into HeLa cells cultured overnight in a 35 mm glass bottom dish, and the 9 types of transfected HeLa cells were used in a DMEM medium containing 10% FCS. Each was cultured overnight. For gene transfection, FuGEME (Promega Corporation) was used, and 1 μg / μg of DNA was introduced. The next day, each medium was replaced with DMEM with HEPES (10% FCS without phenol red).

［ＨｅＬａ細胞の観察］
ＨｅＬａ細胞の発光観察のために、培地にそれぞれのルシフェラーゼに適した発光基質を添加し、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使用して、ＨｅＬａ細胞を観察した。ＣＢＧ、Ｌｕｃ２、ＣＢＲ、Ｅｌｕｃ、ＳＬＧ、ＳＬＯおよびＳＬＲには、Ｄ−ルシフェリン（プロメガ株式会社製：最終濃度１ｍＭ）を添加し、ＮａｎｏＬｕｃに対しては、フリマジン（プロメガ株式会社製：Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ^ＴＭＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍキット添付の基質を２００倍希釈して使用）、そしてＲｅｎｉｌｌａ観察時には、セレンテラジン（プロメガ株式会社製：最終濃度５０μＭ）を加えた。対物レンズとして、ＵＰｌａｎＡｐｏ１００ｘＮＡ１．３５Ｏｉｌ（オリンパス株式会社製）およびＵｐｌａｎＦＬＮ４０ｘＮＡ１．３Ｏｉｌ（オリンパス株式会社製）の２つを使用した。ｂｉｎｎｉｎｇは１×１と設定した。ＣＣＤカメラとして、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を顕微鏡に備え付けた。フォーカス面を移動させるために、Ｚフォーカスコントローラー（ＥＳ１０ＺＥプライアー・サイエンティフィック株式会社製）をＬＶ２００に取り付けて使用した。 [Observation of HeLa cells]
For luminescence observation of HeLa cells, a luminescence substrate suitable for each luciferase was added to the medium, and the HeLa cells were observed using a luminescence microscope LV200 (manufactured by Olympus Corporation). To CBG, Luc2, CBR, Eluc, SLG, SLO and SLR, D-luciferin (manufactured by Promega Corporation: final concentration of 1 mM) is added, and for NanoLuc, flimazine (manufactured by Promega Corporation: Nano-Glo ^TM). The substrate attached to the Luciferase Assay System kit was used at a 200-fold dilution), and coelenterazine (manufactured by Promega Corporation: final concentration 50 μM) was added during Renilla observation. Two objective lenses, UPlanApo 100x NA1.35 Oil (manufactured by Olympus Corporation) and Uplan FLN 40x NA1.3 Oil (manufactured by Olympus Corporation) were used. Binning was set to 1 × 1. As a CCD camera, ImagEM (manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) was attached to the microscope. In order to move the focus surface, a Z focus controller (ES10ZE Prior Scientific Co., Ltd.) was attached to the LV200.

露出時間は、ルシフェラーゼの種類および対物レンズの種類に応じて決定し、以下の表１の通りとした。表の各ルシフェラーゼは、最大吸収波長（λｍａｘ）の短い順となっており、波長のＮａｎｏＬｕｃが４６１ｎｍ付近（青色）、Ｒｅｎｉｌｌａが４９３ｎｍ付近（青色）、Ｅｌｕｃが５４１ｎｍ（緑色）付近、ＣＢＧが５５０ｎｍ付近（緑色）、ＳＬＧが５５７ｎｍ付近（緑色）、ＳＬＯが５８６ｎｍ付近（黄色）、Ｌｕｃ２が６０９ｎｍ付近（橙色）、ＣＢＲが６１７ｎｍ付近（橙色）、およびＳＬＲが６２６ｎｍ付近（赤色）である。 The exposure time was determined according to the type of luciferase and the type of objective lens, and was as shown in Table 1 below. Each luciferase in the table is in the order of shortest maximum absorption wavelength (λmax), the wavelength of NanoLuc is around 461 nm (blue), Renilla is around 493 nm (blue), Eluc is around 541 nm (green), and CBG is around 550 nm. (Green), SLG is around 557 nm (green), SLO is around 586 nm (yellow), Luc2 is around 609 nm (orange), CBR is around 617 nm (orange), and SLR is around 626 nm (red).

フォーカス面を、１００倍レンズ使用時にはＺ方向に０．５μｍずつ、４０倍レンズ使用時にはＺ方向に２μｍずつ、それぞれ段階的に移動させ、各位置における明視野画像および発光画像を撮影し、保存した。これらの移動ピッチ（単位移動数）は対象となる試料（ここでは１個の細胞）の光軸方向の大きさに応じて設定し、フォーカス面が細胞を３回、好ましくは５回以上停止するようにした。このようにフォーカス面を段階的に移動させることは、蛍光よりも露光時間が長い発光の観察において効率を良くし、且つ充分な撮影精度を得るのに都合が良いことが確認された。 The focus plane was moved stepwise by 0.5 μm in the Z direction when using a 100 × lens and by 2 μm in the Z direction when using a 40 × lens, and a bright field image and a luminescent image at each position were taken and stored. . These movement pitches (unit movement number) are set according to the size of the target sample (here, one cell) in the optical axis direction, and the focus surface stops the cell three times, preferably five times or more. I did it. It has been confirmed that moving the focus surface stepwise in this manner is efficient in observing light emission having a longer exposure time than fluorescence and is convenient for obtaining sufficient photographing accuracy.

保存した観察画像を、画像解析システム“ｃｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）”（オリンパス株式会社製）を用いて、対物レンズに近い側（近点側）および遠い側（遠点側）のそれぞれにおいてコントラストの最も高い画像を与えたフォーカス面の位置と、最適な発光画像を与えたフォーカス面の位置とを決定した。 Using the image analysis system “cellSens (registered trademark)” (manufactured by Olympus Co., Ltd.), the stored observation image is measured on the side closer to the objective lens (near point side) and the far side (far point side). The position of the focus surface that gave a high image and the position of the focus surface that gave the optimum light emission image were determined.

近点側の最も高いコントラストの明視野画像を与えるフォーカス面の位置と発光画像を与えるフォーカス面の位置との差、ならびに遠点側の最も高いコントラストの明視野画像を与えるフォーカス面の位置と発光画像を与えるフォーカス面の位置との差をグラフにプロットした。 The difference between the position of the focus plane that gives the brightest image with the highest contrast on the near point side and the position of the focus plane that gives the light-emitting image, and the position and light emission of the focus surface that gives the bright-field image with the highest contrast on the far-point side The difference from the position of the focus plane giving the image was plotted on a graph.

［観察結果］
ある１つのルシフェラーゼとある１つの対物レンズを使用して取得された明視野画像および発光画像を図５Ａおよび図５Ｂに示す。 [Observation results]
FIGS. 5A and 5B show bright field images and luminescence images acquired using one luciferase and one objective lens.

図５Ａには、フォーカス面が複数の細胞が存在する試料中を通過したときに、一定間隔置きに取得された１から１７の明視野画像が配列されている。画像１から画像８付近まででは、細胞が白く、その周囲が黒く見えるのに対し、画像９付近から画像１７まででは、それらが反転し、細胞が黒く、その周囲が黒く見えている。 In FIG. 5A, 1 to 17 bright field images acquired at regular intervals when the focus surface passes through a sample in which a plurality of cells are present are arranged. In the vicinity of image 1 to image 8, the cells appear white and the surroundings appear black, whereas in the vicinity of image 9 to image 17, they are inverted, and the cells appear black and the surroundings appear black.

図５Ｂには、フォーカス面が複数の細胞が存在する試料中を通過したときに、一定間隔置きに取得された１から１７の発光画像が配列されている。これらの画像の番号は、図５Ａの画像の番号と対応しており、同じ番号の画像は、フォーカス面が同じ位置にあるときに取得された画像である。画像毎に、発光している細胞の見え方がわずかに変わっている様子がわかる。特に、特定の１つの細胞に着目した場合、画像１では、輪郭が不明瞭で弱い光で発光しているのに対し、画像８付近では、輪郭がはっきりし、光も強くなっており、しかしながら、画像１７付近では、再び輪郭が不明瞭となり、光も弱まっていることがわかる。 In FIG. 5B, 1 to 17 light emission images acquired at regular intervals when the focus surface passes through a sample in which a plurality of cells are present are arranged. These image numbers correspond to the image numbers in FIG. 5A, and the images with the same numbers are images acquired when the focus plane is at the same position. You can see how the luminescent cells look slightly different for each image. In particular, when focusing on a specific cell, the image 1 has an unclear outline and emits light with weak light, whereas the image 8 has a clear outline and a strong light near the image 8. In the vicinity of the image 17, it can be seen that the outline becomes unclear again and the light is weakened.

図５Ａおよび図５Ｂから、近点側の最も高いコントラストの明視野画像、遠点側の最も高いコントラストの明視野画像、および最適な発光画像を選択した。それらを図６に示す。図６ａは、近点側の最も高いコントラストの明視野画像であり、図５Ａでは画像６に対応する。図６ｂは、遠点側の最も高いコントラストの明視野画像であり、図５Ａでは画像１１に対応する。図６ｃは、最適な発光画像であり、図５Ｂでは画像８に対応する。 From FIG. 5A and FIG. 5B, the highest contrast bright field image on the near point side, the highest contrast bright field image on the far point side, and the optimum light emission image were selected. They are shown in FIG. FIG. 6 a is the brightest image with the highest contrast on the near point side and corresponds to image 6 in FIG. 5A. FIG. 6b is the bright field image with the highest contrast on the far point side and corresponds to image 11 in FIG. 5A. FIG. 6c is an optimal emission image and corresponds to image 8 in FIG.

種々の条件において取得された画像から、それぞれ、近点側明視野位置、遠点側の明視野位置および観察位置を決定し、それらから算出された明視野位置と観察位置との差を算出した。その結果を、ルシフェラーゼによる発光の波長を横軸とし、明視野位置と観察位置との差を縦軸とするグラフにプロットした（図７）。図７ａは、近点側の明視野位置と観察位置との差をまとめたグラフである。図７ｂは、遠点側の明視野位置と観察位置との差をまとめたグラフである。それぞれの図において、１００倍の対物レンズを使用して得られたプロットを線で結び、さらに、４０倍の対物レンズを使用して得られたプロットを線で結んでいる。 From the images acquired under various conditions, the near field side bright field position, the far point side bright field position and the observation position were determined, and the difference between the bright field position calculated from them and the observation position was calculated. . The results were plotted in a graph with the wavelength of light emitted by luciferase as the horizontal axis and the difference between the bright field position and the observation position as the vertical axis (FIG. 7). FIG. 7a is a graph summarizing the difference between the bright field position on the near point side and the observation position. FIG. 7b is a graph summarizing the difference between the bright field position on the far point side and the observation position. In each figure, the plots obtained using the 100 × objective lens are connected by lines, and further, the plots obtained using the 40 × objective lens are connected by lines.

また、近点側の明視野位置、遠点側の明視野位置および観察位置を、ルシフェラーゼによる発光の波長を横軸とし、位置を縦軸とするグラフにプロットした（図８）。図８ａには、１００倍の対物レンズを使用して得られた結果がまとめられており、図８ｂには、４０倍の対物レンズを使用して得られた結果がまとめられている。図８では、それぞれの位置を観察位置によって標準化しており、観察位置は常に０の位置となり、明視野位置は観察位置を基準とした位置としてプロットされている。また、それぞれの図において、近点側の明視野位置のプロットを線で結び（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒａｓｔ）、遠点側の明視野位置のプロットを線で結び（Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒａｓｔ）、さらに、観察位置のプロットを線で結んだ（ＬｕｃＦｏｃｕｓ）。 Further, the bright field position on the near point side, the bright field position on the far point side, and the observation position were plotted on a graph with the wavelength of light emitted by luciferase on the horizontal axis and the position on the vertical axis (FIG. 8). FIG. 8a summarizes the results obtained using a 100 × objective lens, and FIG. 8b summarizes the results obtained using a 40 × objective lens. In FIG. 8, each position is standardized by the observation position, the observation position is always 0, and the bright field position is plotted as a position based on the observation position. In each figure, the plot of the bright field position on the near point side is connected with a line (Positive contrast), the plot of the bright field position on the far point side is connected with a line (Negative contrast), and the plot of the observation position is further plotted. Connected with a line (Luc Focus).

図７および図８の結果から、観察に使用する発光の波長が異なることで、明視野位置も異なる場合があることがわかる。また、図７の結果から、より低い倍率のレンズを使用すると、明視野位置と観察位置との差が大きくなる傾向にあることがわかる。さらに、図８の結果から、近点側の明視野位置と比べて、遠点側の明視野位置の方が、観察位置に近くなる傾向にあることがわかる。また、明視野位置と観察位置との差は、発光試薬としてのルシフェラーゼの各最大吸収波長により、ずれ量が決まる傾向があった。このずれ量の大小は、発光強度ではなく使用する対物レンズの特性（とくに色収差特性と倍率）の組合せで予め調整できることが示された。このことは、例えば複数種類の発光および／蛍光によりフォーカス面を調節する場合に、試薬ごとの最大吸収波長に応じてずれ量を調節するように試料ステージを移動しながら撮像するのが好ましいことを示唆している。 From the results of FIG. 7 and FIG. 8, it can be seen that the bright field position may be different depending on the wavelength of light emission used for observation. Moreover, it can be seen from the results of FIG. 7 that when a lens with a lower magnification is used, the difference between the bright field position and the observation position tends to increase. Furthermore, it can be seen from the results of FIG. 8 that the bright field position on the far point side tends to be closer to the observation position than the bright field position on the near point side. In addition, the difference between the bright field position and the observation position tends to be determined by the maximum absorption wavelength of luciferase as a luminescent reagent. It has been shown that the magnitude of the amount of deviation can be adjusted in advance by the combination of the characteristics of the objective lens used (in particular, the chromatic aberration characteristics and the magnification) rather than the light emission intensity. This means that, for example, when the focus plane is adjusted by a plurality of types of light emission and / or fluorescence, it is preferable to perform imaging while moving the sample stage so as to adjust the shift amount according to the maximum absorption wavelength for each reagent. Suggests.

＜実施例２：タイムラプス観察＞
ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子のプロモーターで制御されたルシフェラーゼベクターを導入したＨｅＬａ細胞を対象として、フォーカス面を移動させながら明視野画像および発光画像を取得した。さらに、取得された画像から明視野位置および観察位置を抽出し、グラフにプロットした。 <Example 2: Time-lapse observation>
Bright field images and luminescence images were acquired while moving the focus plane for HeLa cells into which a luciferase vector controlled by the survivin gene promoter was introduced. Furthermore, the bright field position and the observation position were extracted from the acquired image and plotted on a graph.

［ＨｅＬａ細胞の準備］
ｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子のプロモーターで制御されたＬｕｃ２ルシフェラーゼベクターを安定的に発現したＨｅＬａ細胞を作製した。３５ｍｍガラスボトムディッシュにて一晩培養したＨｅＬａ細胞を培養し、ＨＥＰＥＳ入りＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、フェノールレッド抜き）に置き換えた。 [Preparation of HeLa cells]
HeLa cells stably expressing the Luc2 luciferase vector controlled by the survivin gene promoter were prepared. HeLa cells cultured overnight in a 35 mm glass bottom dish were cultured and replaced with DMEM (10% FCS without phenol red) containing HEPES.

［ＨｅＬａ細胞の観察］
ＨｅＬａ細胞の発光観察のために、Ｄ−ルシフェリン（プロメガ株式会社製：最終濃度１ｍＭ）を添加し、発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を使用して、ＨｅＬａ細胞を観察した。対物レンズとしてＵＰｌａｎＳＡＰＯ２０ｘ（オリンパス株式会社製）を使用した。ｂｉｎｎｉｎｇは１×１と設定した。ＣＣＤカメラとして、ＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を顕微鏡に備え付けた。フォーカス面を移動させるために、Ｚフォーカスコントローラー（ＥＳ１０ＺＥプライアー・サイエンティフィック株式会社製）をＬＶ２００に取り付けて使用した。あらかじめ遠点側の最も高いコントラストの明視野画像、および最適な発光画像に対するフォーカス位置を設定した（明視野画像：フォーカス位置１０μｍ、発光画像フォーカス位置０μｍ）。明視野画像と発光画像のタイムラプス観察を実施した。露出時間は、明視野撮影時は１００ｍｓｅｃ、発光画像撮影時を４分として、１５分間隔で、１５時間連続撮影を行った。 [Observation of HeLa cells]
For luminescence observation of HeLa cells, D-luciferin (manufactured by Promega Corporation: final concentration 1 mM) was added, and HeLa cells were observed using a luminescence microscope LV200 (manufactured by Olympus Corporation). UPlanSAPO 20x (manufactured by Olympus Corporation) was used as the objective lens. Binning was set to 1 × 1. As a CCD camera, ImagEM (manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) was attached to the microscope. In order to move the focus surface, a Z focus controller (ES10ZE Prior Scientific Co., Ltd.) was attached to the LV200. The focus position for the bright field image with the highest contrast on the far point side and the optimum light emission image was set in advance (bright field image: focus position 10 μm, light emission image focus position 0 μm). Time-lapse observation of bright field images and luminescent images was performed. The exposure time was 100 msec for bright-field shooting and 4 minutes for shooting a luminescent image, and 15 hours of continuous shooting was performed at 15-minute intervals.

［観察結果］
観察結果を図１０に示す。図１０には、観察開始時、観察５時間、観察１０時間および観察１５時間の４つの時点における、明視野画像（フォーカス位置は１０μｍおよび０μｍ）および発光画像（フォーカス位置は０μｍ）が示される。 [Observation results]
The observation results are shown in FIG. FIG. 10 shows a bright-field image (focus positions are 10 μm and 0 μm) and a luminescent image (focus position is 0 μm) at four time points of observation start, observation 5 hours, observation 10 hours, and observation 15 hours.

２種の明視野画像を比較すると、フォーカス位置が１０μｍである場合の方が、より高いコントラストで細胞１つずつの様子を観察できることがわかる。フォーカス位置が０μｍの場合、発光画像としては適切であるが、明視野画像としては適切でないことがわかる。また、経時的に繰り返し観察を行っても、明視野画像および観察画像のそれぞれに適切な画像が取得できることがわかる。 Comparing the two types of bright-field images, it can be seen that when the focus position is 10 μm, the state of each cell can be observed with higher contrast. When the focus position is 0 μm, it is appropriate as a light emission image, but not as a bright field image. It can also be seen that appropriate images can be acquired for each of the bright field image and the observed image even when repeated observation is performed over time.

１１…細胞、１２…核、１３…フォーカス面、１４…対物レンズ、１５…ステージ、１６…シャーレ、１７…培地、２１…細胞、２２…核、２３…フォーカス面、２４…視野、３１…細胞、３２…核、３３…フォーカス面、１００…光学顕微鏡システム、１０１…Ｚ方向駆動部、１０２…Ｚ方向制御部、１０３…ＸＹ方向駆動部、１０４…ＸＹ方向制御部、１０５…対物レンズ、１０６…イメージセンサ、１０７…光学系、１０８…コンピュータ、１０９…ＣＰＵ、１１０…ディスプレイ、１１１…ハウジング。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Cell, 12 ... Nucleus, 13 ... Focus surface, 14 ... Objective lens, 15 ... Stage, 16 ... Petri dish, 17 ... Medium, 21 ... Cell, 22 ... Nucleus, 23 ... Focus surface, 24 ... Field of view, 31 ... Cell 32 ... nucleus 33 ... focus plane 100 ... optical microscope system 101 ... Z direction drive unit 102 ... Z direction control unit 103 ... XY direction drive unit 104 ... XY direction control unit 105 ... objective lens 106 DESCRIPTION OF SYMBOLS ... Image sensor, 107 ... Optical system, 108 ... Computer, 109 ... CPU, 110 ... Display, 111 ... Housing.

Claims

An optical microscope system for observing a cell including a site to be observed that emits light and / or fluorescence,
An optical system including at least an image sensor for converting an image into image data produced by the objective lens and the objective lens receiving light from specimen,
A stage for placing a sample containing the cells;
Moving means for moving the stage and / or the objective lens in the optical axis direction;
A computer capable of recording the optical axis position of the stage and / or the objective lens and the image data, and instructing the stage and / or the objective lens to perform the movement;
The computer
The contrast of the cell and its surroundings is to provide the desired emission or fluorescence image of about the position in the optical axis direction, and the observation target region of the stage and / or the objective lens results in a bright-field image with the maximum The position of the stage and / or the objective lens in the optical axis direction is recorded in advance as a bright field stage position and an observation stage position, respectively.
The bright field stage position and the observation stage position are recorded for each wavelength relating to the light emission and / or fluorescence, and for each chromatic aberration characteristic and magnification of the objective lens,
When acquiring image data about the cell or a cell of the same type as the cell, the stage and / or the objective lens is instructed to move to the bright field stage position corresponding to the wavelength and the objective lens. , Recording the image data obtained by the optical system after the movement, and then, for the stage and / or the objective lens , the bright field stage position and the observation according to the wavelength and the objective lens An optical microscope system configured to instruct to move toward the observation target portion by a difference from a stage position, and to record the image data obtained by the optical system after the movement.

2. The computer is configured to acquire image data of the cell or a cell of the same type as the cell over time, and record the bright field stage position and the observation stage position each time the data is acquired. The optical microscope system described in 1.

The computer, when acquiring image data, after the stage has moved to the bright field position and / or the stage from the bright field stage position, only the difference between the bright field stage position and the observation stage position After moving toward the observation target region, it is determined whether the image data obtained by the optical system is in focus, and if not, the image data is moved further with respect to the stage so as to be in focus. 3. An optical microscope system according to claim 1 or 2 configured to indicate.

A method of observing a cell containing an observation target site that emits light and / or fluorescence using an optical microscope,
The position of the focus plane that provides a bright-field image that maximizes the contrast between the cell and its surroundings, and the position of the focus plane that provides a desired luminescence or fluorescence image for the site to be observed are the bright-field position and Determining the observation position in advance, and determining the bright field position and the observation position for each wavelength related to the light emission and / or fluorescence, and chromatic aberration characteristics and magnification of the objective lens of the optical microscope , And obtaining a bright field image of the cell or a cell of the same type as the cell by aligning the focus plane with the bright field position corresponding to the wavelength and the objective lens, and then adjusting the focus plane according to the wavelength and the objective lens. only the difference between the observation position and the bright-field positions, is moved toward the observation target site, the observation pairs Obtaining a luminescence or fluorescence image of the elephant site.

The method according to claim 4 , wherein the acquisition of the image is performed over time, and the bright field position and the observation position are determined for each acquisition.

After acquiring the image, after adjusting the focus plane to the bright field position and / or moving the focus plane toward the observation target site by the difference between the bright field position and the observation position, 6. A method according to claim 4 or 5 , comprising determining whether the image is in focus and focusing if not.