JP6235795B2 - Composition for cell reprogramming - Google Patents
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Description
本発明は、細胞再生医療分野における複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現亢進による治療用細胞／組織の分化誘導および製造に関する。より具体的には、本発明は、複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現亢進を可能とするエキソソーム、ならびに該エキソソームを用いた体細胞リプログラミングおよび多分化能を持つ細胞（ｉＰＳ細胞など）の誘導に関する。 The present invention relates to differentiation induction and production of therapeutic cells / tissues by enhancing expression of transcription factors involved in a plurality of reprogramming in the field of cell regenerative medicine. More specifically, the present invention relates to exosomes capable of enhancing the expression of transcription factors involved in a plurality of reprogramming, and cells having somatic cell reprogramming and pluripotency (such as iPS cells) using the exosomes. Regarding induction.
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま培養することができる。この性質を利用して、多能性をもつ幹細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療の手段として期待されている。しかし、ＥＳ細胞は、臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。 Embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) can be cultured while maintaining pluripotency capable of differentiating into all cells present in the living body. Utilizing this property, pluripotent stem cells are expected as a means of cell transplantation for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes and leukemia. However, ES cells have a problem of causing rejection similar to organ transplantation. There are also many disagreements from the ethical point of view regarding the use of ES cells established by destroying embryos.
ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待されている。ｉＰＳ細胞の樹立方法として、下記特許文献１が知られている。特許文献１には、複数の特定因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の４因子）を体細胞に導入してリプログラミングを行う工程が記載されている。遺伝子の導入のために、レトロウイルス等を体細胞に導入することから、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞を分化誘導することによって得られる細胞において腫瘍発生の危険性が危惧されている。
iPS cells are expected to be usable as ideal pluripotent cells without rejection and ethical problems. The following
近年、エキソソームやマイクロベシクル（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）と呼ばれる小型脂質小胞を細胞に投与し、細胞の脱分化を試みる研究がなされている。例えば、非特許文献１には、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を多量に含むＥＳ細胞由来のマイクロベシクルをマウス骨髄由来単核球の培養系に加えると、Ｏｃｔ４遺伝子が細胞内で発現することが報告されている。また、非特許文献２には、ＥＳ細胞のマイクロベシクルを媒介として、網膜のミュラー細胞にＯｃｔ４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子およびｍｉＲＮＡを導入すると、Ｏｃｔ４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現が亢進することが報告されている。
In recent years, studies have been made to try to dedifferentiate cells by administering small lipid vesicles called exosomes or microvesicles to cells. For example, in Non-Patent
非特許文献１および２では、ＥＳ細胞を利用するため、その取得方法に倫理上の問題が伴う。さらに、非特許文献１および２では、Ｏｃｔ４遺伝子やＳｏｘ−２遺伝子の発現量を上昇させるものであるが、幹細胞性に関与するＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を上昇させるものではない。
In
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ＥＳ細胞を利用することなく、体細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる手段であって、腫瘍発生の危険性の低い手段を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a means for enhancing the expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in somatic cells without using ES cells. The aim is to provide a low means.
本発明者らは、エキソソームの作製に胎盤由来細胞を利用することで、少なくともＥＳ細胞を利用する場合に生じる倫理上の問題を解決できる点に着目した。また、胎盤由来細胞は、腫瘍性や腫瘍増殖性が極めて低いか、またはこれを有しないため、従来のｉＰＳ細胞のように腫瘍発生の危険性を低下させることできる点にも着目した。これらの知見をもとに、本発明者らは、更に研究を進め、胎盤由来細胞を利用することで、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子のみならず、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を亢進させる能力をもつエキソソームを抽出できることを見出した。 The inventors of the present invention focused on the fact that the use of placenta-derived cells for the production of exosomes can solve at least the ethical problems that arise when using ES cells. In addition, since placenta-derived cells have extremely low or no tumorigenicity or tumor proliferative potential, the inventors have also paid attention to the fact that the risk of tumor development can be reduced like conventional iPS cells. Based on these findings, the present inventors have further researched and used the placenta-derived cells to enhance not only the Oct3 / 4 gene and the Sox-2 gene but also the ability to enhance the expression of the Nanog gene. It was found that exosomes possessed can be extracted.
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物であって、
培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを含む、前記組成物。
（２）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（１）記載の組成物。
（３）リプログラミングに関わる転写因子として、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、（１）または（２）記載の組成物。
（４）エキソソームが、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子を実質的に含まない、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）標的細胞をリプログラミングするための組成物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物の製造方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
を含む、前記方法。
（７）工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、（６）記載の方法。
（８）組成物が、リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、（６）または（７）記載の方法。
（９）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
ｄ）エキソソームと標的細胞とを接触させる工程と、
を含む、前記方法。
（１１）工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、（１０）記載の方法。
（１２）リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させる、（１０）または（１１）記載の方法。
（１３）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、標的細胞をリプログラミングする方法である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、多分化能を持つ細胞を製造する方法である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞であって、体細胞のＯｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるエキソソームを産出することを特徴とする、前記細胞。
That is, the present invention includes the following.
(1) A composition for enhancing the expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
The said composition containing the exosome extracted from the placenta origin cell colonized by culture | cultivation.
(2) The composition according to (1), wherein the placenta-derived cells comprise placenta-derived stem cells.
(3) The composition according to (1) or (2), which is a composition for enhancing the expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene as a transcription factor involved in reprogramming.
(4) The composition according to any one of (1) to (3), wherein the exosome does not substantially contain an Oct3 / 4 gene and a Sox-2 gene.
(5) The composition according to any one of (1) to (4), which is a composition for reprogramming target cells.
(6) A method for producing a composition for enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
a) culturing the placenta-derived cells to form colonies;
b) obtaining colony-formed placenta-derived cells and further culturing;
c) a step of extracting exosomes from the culture supernatant obtained in step b);
Said method.
(7) The method according to (6), wherein step a) is a step of seeding and culturing placenta-derived cells at a density of 14 cells / cm 2 or less to form colonies.
(8) The method according to (6) or (7), wherein the composition is a composition for enhancing expression of Nanog gene, Oct3 / 4 gene and Sox-2 gene as transcription factors involved in reprogramming.
(9) The method according to any one of (6) to (8), wherein the placenta-derived cells include placenta-derived stem cells.
(10) A method for enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
a) culturing the placenta-derived cells to form colonies;
b) obtaining colony-formed placenta-derived cells and further culturing;
c) a step of extracting exosomes from the culture supernatant obtained in step b);
d) contacting the exosome with the target cell;
Said method.
(11) The method according to (10), wherein step a) is a step of seeding and culturing placenta-derived cells at a density of 14 cells / cm 2 or less to form colonies.
(12) The method according to (10) or (11), wherein expression of Nanog gene, Oct3 / 4 gene and Sox-2 gene is enhanced as a transcription factor involved in reprogramming.
(13) The method according to any one of (10) to (12), wherein the placenta-derived cells include placenta-derived stem cells.
(14) The method according to any one of (10) to (13), wherein the target cell is reprogrammed by enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming.
(15) The method according to any one of (10) to (13), which is a method for producing a multipotent cell by enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell.
(16) A placenta-derived cell colonized by culturing, wherein the cell produces an exosome that enhances expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene of a somatic cell.
本発明により、ＥＳ細胞を利用することなく、体細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる手段であって、腫瘍発生の危険性の低い手段を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a means for enhancing the expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in somatic cells without using ES cells and having a low risk of tumor development.
本発明者らは、培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソーム（以下本発明のエキソソームと称する場合がある）を用いて、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進できることを見出した。 The present inventors use exosomes extracted from placenta-derived cells colonized by culture (hereinafter sometimes referred to as exosomes of the present invention) to enhance the expression of multiple transcription factors involved in reprogramming in target cells. I found out that I can do it.
エキソソームは、後期エンドソーム区画由来の直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であって、脂質だけではなくタンパク質および核酸等を含むものをいう（Nature Reviews Immunology 9, 581-593, 2009）。エキソソームは、細胞が分泌する脂質二重膜に囲まれた膜小胞であり、それを別の細胞が取り込むことで細胞間のコミュニケーション、生体現象の調節が行われていることが明らかになってきている。エキソソームは、細胞の産生する生体物質であり、血中などでも分解されにくく安定な膜粒子であり、エキソソーム内部の核酸はエキソソームが取り込まれた他の細胞のなかで機能する、といった性質を有する。 An exosome is a small lipid vesicle having a diameter of 30 to 100 nm derived from a late endosomal compartment and containing not only lipid but also protein and nucleic acid (Nature Reviews Immunology 9, 581-593, 2009). Exosomes are membrane vesicles surrounded by lipid bilayers secreted by cells, and it has become clear that communication between cells and regulation of biological phenomena are carried out by taking in other cells. ing. An exosome is a biological material produced by a cell, is a stable membrane particle that is not easily decomposed even in blood or the like, and has a property that a nucleic acid inside the exosome functions in other cells into which the exosome has been incorporated.
本発明で用いるエキソソームは胎盤由来細胞から抽出されたものである。胎盤を有する動物由来のものであれば特に制限されず、例えば、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）由来のものを使用できるが、好ましくは、標的細胞と同種の動物由来のものを使用する。 The exosome used in the present invention is extracted from placenta-derived cells. It is not particularly limited as long as it is derived from an animal having a placenta. For example, those derived from mammals (eg, human, mouse, rat, monkey, dog, cat, cow, horse, etc.) can be used. Use an animal derived from the same species as the target cell.
本発明においては、培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞からエキソソームを抽出する。胎盤由来細胞には、羊膜由来細胞および臍帯由来細胞も包含される。好ましくは胎盤由来幹細胞を含むものからエキソソームを抽出する。胎盤由来幹細胞は、胎児に由来し、低免疫原性であり、三胚葉分化能を有するものである。胎盤由来幹細胞には、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胎盤多能性細胞および胚性様幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。 In the present invention, exosomes are extracted from placenta-derived cells colonized by culture. Placenta-derived cells also include amnion-derived cells and umbilical cord-derived cells. Preferably, exosomes are extracted from those containing placenta-derived stem cells. Placenta-derived stem cells are derived from the fetus, have low immunogenicity, and have the ability to differentiate into three germ layers. Placenta-derived stem cells include, but are not limited to, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, placental pluripotent cells and embryonic-like stem cells.
胎盤由来細胞の調製方法は、当技術分野で公知の方法を使用でき、特に制限されない。例えば、破砕した組織を用いたｏｕｔｇｒｏｗｔｈ法や、消化酵素を用いる方法などを使用できる。用いる消化酵素としては、マトリクスメタロプロテインナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ）、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロテインナーゼＫ、ディスパーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カルパインおよびスブチリシンが挙げられるが、これらに限定されない。 Methods for preparing placenta-derived cells are not particularly limited, and methods known in the art can be used. For example, an outgrowth method using a crushed tissue or a method using a digestive enzyme can be used. Digestive enzymes used include, but are not limited to, matrix metalloproteinases (eg, collagenase), trypsin, chymotrypsin, papain, pepsin, proteinase K, dispase, carboxypeptidase, calpain, and subtilisin.
組織を破砕する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ミンチにする、ミキサーにかける等が含まれる。胎盤組織を破砕することにより、結果として、浮遊する胎盤細胞と胎盤組織の組織混合物が生じる。組織混合物を１つまたは複数の篩、例えば、５０μｍ〜５００μｍまでの範囲の様々な孔径のストレイナーにかけることで、浮遊している胎盤細胞から組織を分離することが可能である。例えば、胎盤組織混合物を繰り返し徐々に小さな孔径のメッシュに通すことで、最後には、ほぼ全ての組織を除去し、胎盤細胞懸濁液（例えば、単細胞懸濁液）を取得することができる。 Methods for disrupting tissue are known in the art and include, for example, mincing, mixing, and the like. Breaking the placental tissue results in a tissue mixture of floating placental cells and placental tissue. By applying the tissue mixture to one or more sieves, eg strainers of various pore sizes ranging from 50 μm to 500 μm, it is possible to separate the tissue from floating placental cells. For example, the placental tissue mixture can be repeatedly passed through a small pore size mesh to finally remove almost all of the tissue and obtain a placental cell suspension (eg, a single cell suspension).
胎盤細胞懸濁液は、胎盤由来幹細胞以外に、一つまたは複数のその他の胎盤由来細胞種、例えば、上皮細胞（例えば、胎生繊毛膜細胞）を含んでいてもよい。胎盤由来幹細胞以外の胎盤由来細胞は、１回または複数回の洗浄、遠心分離、密度勾配遠心分離、溶出、ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションなど、すでに確立している方法を用いて分離することができる。 In addition to placenta-derived stem cells, the placental cell suspension may contain one or more other placenta-derived cell types, such as epithelial cells (eg, embryonic ciliary cells). Placenta-derived cells other than placenta-derived stem cells can be separated using established methods such as one or more washes, centrifugation, density gradient centrifugation, elution, positive selection and negative selection.
胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる方法は、当技術分野で公知の方法を使用でき特に制限されない。例えば、上記のようにして得た胎盤由来細胞を、培養容器の培養面に低密度で播種して培養することにより、コロニー形成させることができる。胎盤由来細胞を、好ましくは５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度、より好ましくは５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度、さらに好ましくは５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で、さらにより好ましくは２５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で、好ましくは０．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度、より好ましくは１．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度、さらに好ましくは５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度で、播種して培養することにより、コロニー形成させることができる。 The method for culturing placenta-derived cells to form colonies is not particularly limited, and methods known in the art can be used. For example, the placenta-derived cells obtained as described above can be colonized by seeding and culturing on the culture surface of the culture vessel at a low density. The placenta-derived cells, preferably 5,000cells / cm 2 or less in density, more preferably 500cells / cm 2 or less in density, more preferably a density of 50cells / cm 2 or less, even more preferably 25cells / cm 2 or less of Colony formation by seeding and culturing at a density of preferably 0.5 cells / cm 2 or more, more preferably 1.5 cells / cm 2 or more, and even more preferably 5 cells / cm 2 or more Can be made.
細胞をコンフルエントにならない条件で、低密度で播種して培養することによりコロニーを形成させ、コロニー形成能を有する細胞のみを選択することができる。培養条件は、当技術分野で公知の方法を使用でき特に制限されない。培地としては、胎盤由来細胞の培養に使用される公知の培地を使用でき、例えば、ＭＳＣＧＭ培地、１９９培地、ＢＭＥ培地（ＢＭＥ−Ｅａｒｌｅ、ＢＭＥ−Ｈａｎｋｓ）、Ａｍｅｓ'培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地、ＨＡＴ培地、Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ５ａ培地、ＲＰＭＩ１６２９倍地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地（ＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ、ＭＥＭ−Ｈａｎｋｓ）、Ｄ−ＭＥＭ培地（低グルコース（１．０ｇ／Ｌグルコース）、高グルコース（４．５ｇ／Ｌグルコース））やＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｄ）等を使用できる。培養は、３６〜３８℃の温度で、培地交換しながら、１２〜１６日間培養する。 Colonies are formed by seeding and culturing cells at low density under conditions that do not cause confluence, and only cells having colony-forming ability can be selected. Culture conditions are not particularly limited, and methods known in the art can be used. As the medium, a known medium used for culture of placenta-derived cells can be used. For example, MSCGM medium, 199 medium, BME medium (BME-Earle, BME-Hanks), Ames' medium, Ham's F10 medium, Ham's F12 medium, HAT medium, L-15 medium, McCoy5a medium, RPMI1629 medium, RPMI1640 medium, Alpha-MEM medium, MEM medium (MEM-Earle, MEM-Hanks), D-MEM medium (low glucose (1 0.0 g / L glucose), high glucose (4.5 g / L glucose)), CD medium (Chemically-Defind) and the like can be used. The culture is performed at a temperature of 36 to 38 ° C. for 12 to 16 days while changing the medium.
多種の細胞を含む初代培養細胞から、標的細胞に対するリプログラミング効果を有する細胞を濃縮培養するためにはコロニー形成が有効である。リプログラミング効果を有する細胞は高い増殖能を有するため、コロニー形成を行うことで、多種類の細胞のなかで、その割合を高めることができる。コロニーを形成させる具体的方法としては、当技術分野で公知の方法を使用できる（STEM CELLS (2001), 19 , 219-225, Rat Marrow Stromal Cells are More Sensitive to Plating Density and Expand More Rapidly from Single-Cell-Derived Colonies than Human Marrow Stromal Cells）。 Colony formation is effective for concentrating and culturing cells having a reprogramming effect on target cells from primary cultured cells containing various cells. Since cells having a reprogramming effect have a high proliferation ability, the ratio can be increased among many types of cells by performing colony formation. As specific methods for forming colonies, methods known in the art can be used (STEM CELLS (2001), 19, 219-225, Rat Marrow Stromal Cells are More Sensitive to Plating Density and Expand More Rapidly from Single- Cell-Derived Colonies than Human Marrow Stromal Cells).
このようにしてコロニー形成した胎盤由来細胞は、優れた増殖能を有する細胞であり、この胎盤由来細胞から抽出したエキソソームは、コンフルエントになった胎盤由来細胞から抽出したエキソソームと比較して、効果的にリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる能力において優れ、細胞をリプログラミングする能力および多分化能を持つ細胞を誘導する能力において優れている。 The placenta-derived cells colonized in this way are cells having excellent proliferation ability, and exosomes extracted from these placenta-derived cells are more effective than exosomes extracted from confluent placenta-derived cells. It is excellent in the ability to enhance the expression of transcription factors involved in reprogramming, and excellent in the ability to reprogram cells and to induce multipotent cells.
コロニー形成した胎盤由来細胞（以下、コロニー形成細胞と称する場合がある）のみを取得し、さらに培養することにより増殖させ、増殖した胎盤由来細胞からエキソソームを抽出することが好ましい。例えば、コロニー形成細胞を別の培養容器に播種して培養し、６０〜８０％コンフルエントになったら、ＰＢＳで洗浄し、培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気条件下でインキュベートし、培養上清を回収して遠心分離後、フィルトレーションを行う。培地として無血清培地を用いることにより、他の細胞種に由来するエキソソームの混入を防ぐことができる。無血清培地としては、例えば、１９９培地、ＢＭＥ培地（ＢＭＥ−Ｅａｒｌｅ、ＢＭＥ−Ｈａｎｋｓ）、Ａｍｅｓ'培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地、ＨＡＴ培地、Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ５ａ培地、ＲＰＭＩ１６２９倍地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地（ＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ、ＭＥＭ−Ｈａｎｋｓ）、Ｄ−ＭＥＭ培地（低グルコース（１．０ｇ／Ｌグルコース）、高グルコース（４．５ｇ／Ｌグルコース））やＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｄ）が挙げられる。他の細胞に由来するエキソソームが混入していても問題ない場合は、培地は特に無血清培地に制限されない。 It is preferable to obtain only colony-forming placenta-derived cells (hereinafter sometimes referred to as colony-forming cells), proliferate by further culturing, and extract exosomes from the proliferated placenta-derived cells. For example, colony-forming cells are seeded in another culture vessel and cultured. When 60-80% confluent, the cells are washed with PBS and the medium is changed under conditions of 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam. Incubate, collect the culture supernatant, centrifuge, and filter. By using a serum-free medium as the medium, contamination of exosomes derived from other cell types can be prevented. Examples of the serum-free medium include 199 medium, BME medium (BME-Earle, BME-Hanks), Ames' medium, Ham's F10 medium, Ham's F12 medium, HAT medium, L-15 medium, McCoy5a medium, RPMI1629 medium, RPMI1640 medium, Alpha-MEM medium, MEM medium (MEM-Earle, MEM-Hanks), D-MEM medium (low glucose (1.0 g / L glucose), high glucose (4.5 g / L glucose)) ) And CD medium (Chemically-Defind). If there is no problem even if exosomes derived from other cells are mixed, the medium is not particularly limited to a serum-free medium.
このとき細胞を播種する密度は、特に制限されないが、好ましくは５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度、より好ましくは５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下の密度で、好ましくは１．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度、より好ましくは５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度とする。 At this time, the density for seeding the cells is not particularly limited, but is preferably a density of 500 cells / cm 2 or less, more preferably a density of 50 cells / cm 2 or less, preferably a density of 1.5 cells / cm 2 or more, more preferably Is a density of 5 cells / cm 2 or more.
エキソソームは、任意の適切な技術を用いて、コロニー形成細胞の細胞培養上清から調製することができる（例えば、Current Protocols in Cell Biology (2006) 3.22.1-3.22.29に記載の方法が挙げられる）。具体的には、まず、得られた培養上清を、５０００〜２００００ｇ、好ましくは８０００〜１２０００ｇの速度で、１５〜６０分間、好ましくは２０〜４０分間遠心分離を行う。次に、得られた上清をさらに、５００００〜１５００００ｇ、好ましくは９００００〜１１００００ｇの速度で、５０〜１００分間、好ましくは６０〜８０分間遠心分離を行う。続いて、得られたペレットをＰＢＳに懸濁し、５００００〜１５００００ｇ、好ましくは９００００〜１１００００ｇの速度で、５０〜１００分間、好ましくは６０〜８０分間遠心分離を行う。こうして得られたペレットをエキソソームとして取得することができる。 Exosomes can be prepared from the cell culture supernatant of colony forming cells using any suitable technique (see, for example, the method described in Current Protocols in Cell Biology (2006) 3.22.1-3.22.29). ). Specifically, first, the obtained culture supernatant is centrifuged at a speed of 5000 to 20000 g, preferably 8000 to 12000 g for 15 to 60 minutes, preferably 20 to 40 minutes. Next, the obtained supernatant is further centrifuged at a speed of 50,000 to 150,000 g, preferably 90000 to 110000 g for 50 to 100 minutes, preferably 60 to 80 minutes. Subsequently, the obtained pellet is suspended in PBS and centrifuged at a speed of 50,000 to 150,000 g, preferably 90000 to 110000 g, for 50 to 100 minutes, preferably 60 to 80 minutes. The pellet thus obtained can be obtained as an exosome.
別の好ましいエキソソーム画分の調製法としては、遠心分離とゲルろ過カラムを用いる方法を挙げることができる。具体的には、まず、得られた培養上清をエキソソーム画分が沈殿しない条件で１回目の遠心分離を行う。例えば、１〜３０℃、５００〜４０００ｇの速度で５〜３０分間遠心分離を行う。最適な例として室温、２０００ｇ、１５分間の遠心分離が挙げられる。更に、２回目の遠心分離として１回目の遠心分離よりも速い速度でなおかつエキソソーム画分が沈殿しない条件で遠心分離を行う。２回目の遠心分離の例としては１〜３０℃、５０００〜２５０００ｇの速度で５〜１２０分間の遠心分離を挙げることができ、最も好ましい例として室温、１２０００ｇ、３５分間の遠心分離を挙げることができる。得られた上清画分を一般的な生化学実験に用いられるゲルろ過カラムに供し、溶出液の２６０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の高いフラクションをエキソソーム画分とする。ゲルろ過カラムは担体を購入し自ら作製しても、市販品を使用してもよく、ここではＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を適した例として挙げることができる。また、吸光度の高いフラクションとしては吸光度値の上位１０フラクション程度を用いればよいが、もちろん最高値を示すフラクションを以てエキソソーム画分とすることも可能である。 Another preferred method for preparing the exosome fraction includes a method using centrifugation and a gel filtration column. Specifically, first, the obtained culture supernatant is centrifuged for the first time under the condition that the exosome fraction does not precipitate. For example, centrifugation is performed at 1 to 30 ° C. and a speed of 500 to 4000 g for 5 to 30 minutes. An optimal example is centrifugation at room temperature, 2000 g for 15 minutes. Further, as the second centrifugation, the centrifugation is performed at a speed higher than that of the first centrifugation and under the condition that the exosome fraction does not precipitate. Examples of the second centrifugation can include centrifugation at 1 to 30 ° C. and 5000 to 25000 g for 5 to 120 minutes, and most preferred examples include centrifugation at room temperature and 12000 g for 35 minutes. it can. The obtained supernatant fraction is applied to a gel filtration column used for general biochemical experiments, the absorbance at 260 nm of the eluate is measured, and the fraction with high absorbance is used as the exosome fraction. As the gel filtration column, a carrier may be purchased and produced by itself, or a commercially available product may be used. Here, Sephacryl S-400 HR (GE Healthcare Bioscience) can be cited as a suitable example. In addition, as the fraction having a high absorbance, the upper 10 fractions of the absorbance value may be used. Of course, the fraction exhibiting the highest value can be used as the exosome fraction.
別の好ましいエキソソーム画分の調製法としては、例えば分画遠心分離法を挙げることができる。好ましい一具体例として、Ｒａｐｏｓｏ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２（１９９６）記載の方法を以下に示す。細胞培養物を３００ｇ、１０分間遠心分離する。得られた上清を３００ｇ、１０分間の遠心分離を２回、１００００ｇ、３０分間の遠心分離を１回、７００００ｇ、６０分間の遠心分離を１回行う。得られた沈殿を２．５Ｍ スクロース、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２を含む溶液に溶解し、２〜０．２５Ｍの密度勾配を持つスクロース溶液に重層する。１０００００×ｇ、１５時間の遠心分離を行った後、得られた残渣をＰＢＳに溶解し、更に２０００００×ｇ、１時間の超遠心分離を行う。 Another preferred method for preparing the exosome fraction is, for example, differential centrifugation. As a preferred specific example, Raposo et. al. J. et al. Exp. Med. 183: 1161-1172 (1996) is described below. The cell culture is centrifuged at 300 g for 10 minutes. The obtained supernatant is centrifuged twice at 300 g for 10 minutes, once at 10000 g for 30 minutes, and once at 70,000 g for 60 minutes. The resulting precipitate is dissolved in a solution containing 2.5 M sucrose, 20 mM Hepes / NaOH, pH 7.2 and overlaid with a sucrose solution having a density gradient of 2 to 0.25 M. After centrifugation at 100000 × g for 15 hours, the obtained residue is dissolved in PBS, and ultracentrifugation is further performed at 200000 × g for 1 hour.
本発明のエキソソームは、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることができるが、好ましくは、亢進可能なリプログラミングに関わる転写因子をコードするすべての遺伝子、例えば亢進可能なリプログラミングに関わる転写因子をコードするｍＲＮＡやＤＮＡのすべてを含まない。本発明のエキソソームは、好ましくはＯｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子、すなわち、これらをコードするｍＲＮＡやＤＮＡを実質的に含まない。ここで、遺伝子を実質的に含まないとは、検出可能な範囲で含まないことを意味し、例えば、エキソソームからのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出および逆転写を経て得られたｃＤＮＡの定量ＰＣＲにおいて、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子が検出されないことをさす。本発明のエキソソームが、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子を含まないにもかかわらず、標的細胞においてこれらをコードする遺伝子の発現を亢進可能なことは、驚くべきことである。 The exosome of the present invention can enhance the expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell, but preferably all genes encoding transcription factors involved in reprogramming that can be enhanced, for example, those that can be enhanced It does not include all mRNA and DNA encoding transcription factors involved in reprogramming. The exosome of the present invention is preferably substantially free of Oct3 / 4 gene and Sox-2 gene, that is, mRNA and DNA encoding them. Here, “substantially free of a gene” means that it does not contain within a detectable range. For example, in quantitative PCR of cDNA obtained through total RNA extraction from exosomes and reverse transcription, Oct3 / 4 The gene and the Sox-2 gene are not detected. It is surprising that the exosomes of the present invention can enhance the expression of genes encoding them in target cells, even though they do not contain Oct3 / 4 and Sox-2 genes.
本発明のエキソソームを標的細胞に接触させることにより、標的細胞において、複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることができる。本発明のエキソソームは、標的細胞において、特にＯｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させることから、標的細胞をリプログラミングすることができ、体細胞から多分化能を持つ細胞を誘導することができる。 By bringing the exosome of the present invention into contact with a target cell, expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming can be enhanced in the target cell. The exosome of the present invention enhances the expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene in the target cell, in particular, it can reprogram the target cell and has multipotency from the somatic cell. Can be induced.
Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現亢進により細胞のリプログラミングが可能であることは、例えば、Differentiation (2010), 80 , 123-129（Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT4/SOX2/NANOG）において報告されている。 The ability to reprogram cells by enhancing the expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene is, for example, Differentiation (2010), 80, 123-129 (Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT4 / SOX2 / NANOG).
「リプログラミング」または「リプログラム」とは、細胞分化とは逆のプロセス、すなわち、分化した細胞がかつて保持していた未分化状態を再度獲得することをいう。特に、細胞のリプログラミングによって、その細胞が三胚葉形成能および個体発生能を有する分化多能性を獲得した場合には、このプロセスを「核初期化」または「初期化」といい、得られた細胞を「ｉＰＳ細胞」という。この「核初期化」または「初期化」は、典型的には、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。 “Reprogramming” or “reprogramming” refers to the reverse process of cell differentiation, that is, regaining the undifferentiated state that the differentiated cell once held. This process is called “nuclear reprogramming” or “reprogramming”, especially when the cell has acquired pluripotency with trigermogenesis and ontogeny by reprogramming. Such cells are referred to as “iPS cells”. This “nuclear reprogramming” or “initialization” typically refers to the return of the somatic nucleus to the fertilized egg state.
リプログラミングに関わる転写因子は、標的細胞に独立してまたは組み合わせて発現した場合に、細胞をリプログラミングするために使用することができる核タンパク質をさす。リプログラミングに関わる転写因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ−２遺伝子）、Ｎａｎｏｇファミリー遺伝子（例えばＮａｎｏｇ遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子が知られている（ＷＯ２００７／０６９６６６）。本発明のエキソソームは、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることを特徴とするが、少なくともＮａｎｏｇ遺伝子の発現を亢進させるものであり、好ましくはさらにＳｏｘ−２遺伝子およびＯｃｔ３／４遺伝子の発現を亢進させるものである。 A transcription factor involved in reprogramming refers to a nuclear protein that can be used to reprogram a cell when expressed independently or in combination with a target cell. Transcription factors involved in reprogramming include an Oct family gene (eg, Oct3 / 4 gene), a Sox family gene (eg, Sox-2 gene), a Nanog family gene (eg, Nanog gene), a Klf family gene (eg, Klf4 gene), and Each gene of the Myc family gene (for example, c-Myc gene) is known (WO2007 / 069666). The exosome of the present invention is characterized by enhancing the expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell, and at least enhances the expression of the Nanog gene, and preferably further comprises a Sox-2 gene and an Oct3. / 4 gene expression is enhanced.
Ｏｃｔ３／４は、多能性の維持に重大な役割を果たすことが知られている。割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ３／４＋細胞にＯｃｔ３／４が不在になると、栄養芽層の自然分化に繋がることから、Ｏｃｔ３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能の元となると考えられている。Ｏｃｔ３／４タンパク質の例として、マウスＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１３６３３）およびヒトＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００２７０１）によってコードされるタンパク質が挙げられる。 Oct3 / 4 is known to play a critical role in maintaining pluripotency. The absence of Oct3 / 4 in Oct3 / 4 + cells such as blastomeres and embryonic stem cells leads to spontaneous differentiation of the trophoblast, and thus the presence of Oct3 / 4 is associated with the pluripotency and differentiation potential of embryonic stem cells. It is considered to be the original. Examples of Oct3 / 4 proteins include those encoded by the mouse Oct3 / 4 gene (Genbank accession number NM_013633) and the human Oct3 / 4 gene (Genbank accession number NM_002701).
Ｓｏｘファミリー遺伝子は、Ｏｃｔ３／４に類似して多能性の維持に関連するが、多能性幹細胞にのみ発現されるＯｃｔ３／４とは対照的に、多能性および単能性幹細胞に関連する。Ｓｏｘ−２は、誘導のために使用される最初の遺伝子であったが（Takahashi et al, Cell, 2006, 126: 663-76; Takahashi et al. Cell, 2007, 131-861-72; Yu et al, Science 2007, 318: 1917）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に誘導過程において作用することが見出されている。Ｓｏｘ−２タンパク質の例として、マウスＳｏｘ−２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１１４４３）およびヒトＳｏｘ−２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００３１０６）によってコードされるタンパク質が挙げられる。 Sox family genes are associated with maintenance of pluripotency similar to Oct3 / 4, but are associated with pluripotent and pluripotent stem cells as opposed to Oct3 / 4 expressed only in pluripotent stem cells To do. Sox-2 was the first gene used for induction (Takahashi et al, Cell, 2006, 126: 663-76; Takahashi et al. Cell, 2007, 131-861-72; Yu et al. al, Science 2007, 318: 1917), other genes of the Sox family have been found to act in the induction process as well. Examples of Sox-2 proteins include proteins encoded by the mouse Sox-2 gene (Genbank accession number NM — 014443) and the human Sox-2 gene (Genbank accession number NM — 003106).
Ｎａｎｏｇはホメオボックス転写因子であり、遺伝子をノックアウトするとＥＳ細胞は分化多能性を失い原始内胚葉系の細胞へと分化する。また、Ｎａｎｏｇ遺伝子を正常の数倍発現させると、マウスＥＳ細胞はＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナル非存在下で分化多能性を維持できることが報告されている。したがって、ＮａｎｏｇはＥＳ細胞の分化多能性にとって必要かつ十分な因子であると考えられている（Yamanaka et al, Cell, 2003, 113: 631-642）。Ｎａｎｏｇタンパク質の例として、マウスＮａｎｏｇ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２８０１６）およびヒトＮａｎｏｇ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２４８６５）によってコードされるタンパク質が挙げられる。 Nanog is a homeobox transcription factor. When a gene is knocked out, ES cells lose pluripotency and differentiate into primitive endoderm cells. In addition, it has been reported that when the Nanog gene is expressed several times normal, mouse ES cells can maintain pluripotency in the absence of LIF / STAT3 signal. Therefore, Nanog is considered to be a necessary and sufficient factor for differentiation pluripotency of ES cells (Yamanaka et al, Cell, 2003, 113: 631-642). Examples of Nanog proteins include those encoded by the mouse Nanog gene (Genbank accession number NM — 028016) and the human Nanog gene (Genbank accession number NM — 024865).
標的細胞においてリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進（増大）させることには、リプログラミングに関わる転写因子を過剰発現させることが包含され、標的細胞におけるリプログラミングに関わる転写因子タンパク質の量を増加させること、標的細胞におけるリプログラミングに関わる転写因子をコードするｍＲＮＡの量を増加させることが包含される。また、上記で例示したリプログラミングに関わる転写因子の遺伝子には、各遺伝子のオルソログやホモログも包含される。本発明において、遺伝子には、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が包含され、ＲＮＡにはｍＲＮＡが包含され、ＤＮＡにはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが包含される。 Increasing (increasing) expression of transcription factors involved in reprogramming in target cells includes overexpression of transcription factors involved in reprogramming, increasing the amount of transcription factor proteins involved in reprogramming in target cells. And increasing the amount of mRNA encoding a transcription factor involved in reprogramming in the target cell. In addition, the transcription factor genes involved in reprogramming exemplified above include orthologs and homologs of each gene. In the present invention, the gene includes nucleic acids including DNA and RNA, RNA includes mRNA, and DNA includes genomic DNA and cDNA.
本発明のエキソソームを接触させた標的細胞は、リプログラミングに関わる転写因子の発現が亢進する一方、テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする遺伝子の発現量は変化しない。ＴＥＲＴは、腫瘍増殖性およびテラトーマ形成との関連性が報告されており、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量は、腫瘍性または腫瘍増殖性の指標として使用される。したがって、本発明のエキソソームは、接触させた標的細胞の腫瘍化や癌化を促進せず、腫瘍性または腫瘍増殖性が低いかまたはこれを有しないと考えられる。 In the target cell contacted with the exosome of the present invention, expression of a transcription factor involved in reprogramming is enhanced, while the expression level of a gene encoding telomere reverse transcriptase (TERT) does not change. TERT has been reported to be associated with tumor growth and teratoma formation, and the expression level of TERT gene is used as an indicator of tumor growth or tumor growth. Therefore, it is considered that the exosome of the present invention does not promote tumorigenesis or canceration of the contacted target cells, and has low or no tumorigenicity or tumor growth.
本発明においてリプログラミングの標的となる標的細胞は、好ましくは、幹細胞を除く、分化した体細胞である。例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。 In the present invention, the target cells to be reprogrammed are preferably differentiated somatic cells excluding stem cells. For example, fibroblasts (eg skin fibroblasts), epithelial cells (eg gastric epithelial cells, liver epithelial cells), endothelial cells (eg blood vessels, lymphatic vessels), nerve cells (eg neurons, glial cells), pancreas Cells, blood cells, bone marrow cells, muscle cells (eg, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes), liver parenchymal cells, non-hepatic parenchymal cells, fat cells, osteoblasts, cells constituting periodontal tissues (eg, , Periodontal ligament cells, cementoblasts, gingival fibroblasts, osteoblasts), cells constituting the kidney, eye and ear.
本発明の好ましい実施態様によれば、リプログラミングの標的とする細胞は線維芽細胞、特に皮膚線維芽細胞である。本発明においてリプログラミングの標的となる細胞は、いかなる動物に由来するものであってもよいが、好ましくは哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）由来の細胞、より好ましくはマウスまたはヒトに由来する細胞である。 According to a preferred embodiment of the invention, the cells targeted for reprogramming are fibroblasts, in particular skin fibroblasts. In the present invention, the target cell for reprogramming may be derived from any animal, but is preferably derived from a mammal (eg, human, mouse, rat, monkey, dog, cat, cow, horse, etc.). Cells, more preferably cells derived from mice or humans.
以上のようにしてリプログラミングした細胞の用途としては、まず、治療用細胞としての利用が可能である。このような治療用細胞としては、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングした細胞が挙げられる。すなわち、リプログラミングされた細胞は疾患の治療に用いることができ、具体的には、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングされた細胞を用いて各種疾患の治療を行うことができる。例えば、高橋ら、実験医学、ｖｏｌ．２６、Ｎｏ．５（増刊）、２００８年（羊土社）；再生医療、第７巻、第３号、２００８年（メディカルレビュー社）；および医学のあゆみ、ｖｏｌ．２２９、Ｎｏ．９、２００９年（医歯薬出版株式会社）を参照されたい。 As a use of the cell reprogrammed as described above, it can first be used as a therapeutic cell. Examples of such therapeutic cells include cells reprogrammed to differentiated states of tissue stem cells and their progenitor cells. That is, reprogrammed cells can be used for treatment of diseases, and specifically, various diseases can be treated using cells reprogrammed to differentiated states of tissue stem cells and their precursor cells. For example, Takahashi et al., Experimental Medicine, vol. 26, no. 5 (Special Issue), 2008 (Yodosha); Regenerative Medicine, Vol. 7, No. 3, 2008 (Medical Review); and Ayumi of Medicine, vol. 229, no. 9, 2009 (Medical and Dental Publishing Co., Ltd.).
例えば、血球系細胞をリプログラミングして造血幹細胞を得た場合には、造血幹細胞移植への利用が可能となる。具体的には、得られた造血幹細胞を点滴またはカテーテルなどを用いて移植することにより、白血病やリンパ腫、あるいは自己免疫疾患、あるいはリソソーム病やペルオキシソーム病を含む先天性代謝異常症（例えばムコ多糖症、Ｇａｕｃｈｅｒ病、Ｆａｂｒｙ病、Ｐｏｍｐｅ病、副腎白質ジストロフィー、Ｉ−ｃｅｌｌ病、異染性ロイコジストロフィー、ＧＭ１ガングリオドーシスなど）などへ適用できる。また、骨髄球系またはリンパ球系前駆細胞を得た場合には、それらの細胞そのもの、または更に赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、樹状細胞または制御性Ｔ細胞へ分化誘導した後に、直接注射するか点滴で移植することにより、造血幹細胞移植後や抗ガン化学療法後の免疫回復、抗ガン細胞治療、自己免疫疾患細胞治療、リューマチ治療、多発性硬化症治療、再生不良性貧血などの貧血治療、血小板減少症治療、外傷治療などへ利用できる。また、間葉系幹細胞を得た場合には、点滴かカテーテルなどを用いて移植することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療、あるいは関節障害の治療などへ利用できる。 For example, when hematopoietic stem cells are obtained by reprogramming blood cells, they can be used for hematopoietic stem cell transplantation. Specifically, by transplanting the obtained hematopoietic stem cells using an infusion or a catheter or the like, congenital metabolic disorders including leukemia, lymphoma, autoimmune disease, lysosomal disease and peroxisomal disease (for example, mucopolysaccharidosis) , Gaucher disease, Fabry disease, Pompe disease, adrenoleukodystrophy, I-cell disease, metachromatic leukodystrophy, GM1 gangliodosis, and the like. When myeloid or lymphoid progenitor cells are obtained, these cells themselves, or further to erythrocytes, neutrophils, basophils, eosinophils, platelets, dendritic cells or regulatory T cells. After induction of differentiation, by direct injection or transplantation by infusion, immune recovery after hematopoietic stem cell transplantation or anticancer chemotherapy, anticancer cell therapy, autoimmune disease cell therapy, rheumatism therapy, multiple sclerosis therapy, It can be used to treat anemia such as aplastic anemia, thrombocytopenia, and trauma. In addition, when mesenchymal stem cells are obtained, they can be used for the treatment of graft-versus-host disease (GvHD) or the treatment of joint disorders by transplanting them using an infusion or a catheter.
同様に、神経系では、例えば体細胞からのリプログラミングによりドーパミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することによりパーキンソン病治療へ利用できる。また、例えばオリゴデンドロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脊髄損傷治療などへ利用できる。また、例えばニューロン前駆細胞やアストロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより運動神経障害の治療などへ利用できる。また、例えばＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉなどの分化マーカー発現で識別できる神経幹細胞や神経前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脳梗塞や脳出血治療などへ利用できる。 Similarly, in the nervous system, for example, when dopamine-producing cells are obtained by reprogramming from somatic cells, they can be used for treatment of Parkinson's disease by transplanting them with a catheter or the like. For example, when oligodendrocyte progenitor cells are obtained, they can be used for treatment of spinal cord injury by direct injection into the affected area or transplantation using a catheter or the like. Further, for example, when neuron precursor cells or astrocyte precursor cells are obtained, they can be used for the treatment of motor neuropathy by directly injecting them into the affected area or transplanting them using a catheter or the like. For example, when neural stem cells or neural progenitor cells that can be identified by the expression of differentiation markers such as Nestin and Musashi are obtained, they can be directly injected into the affected area or transplanted using a catheter to treat cerebral infarction or cerebral hemorrhage. Available.
同様に、動静脈などの血管／リンパ管系、心筋／平滑筋／骨格筋／オーバル細胞などの筋組織系、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮／真皮／毛髪などの皮膚系、角膜などの視覚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用細胞を得ることもできる。例えば、腸系では、クリプト細胞などの腸前駆細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することにより、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症などの治療へ利用できる。視覚系では、例えば体細胞からリプログラミングにより網膜前駆細胞や網膜色素上皮細胞や視細胞を得た場合には、これを直接注入あるいは細胞シート化して移植することにより加齢黄斑変性症や網膜色素変性症の治療へ利用できる。膵臓系では、例えばβ細胞やインスリン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。肝臓系では、例えばアルブミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療などへ利用できる。また、例えば血液凝固因子産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療や血友病などの先天性遺伝病などへ利用できる。 Similarly, blood vessels such as arteries and veins / lymphatic vessels, muscle tissue systems such as heart muscle / smooth muscle / skeletal muscle / oval cells, digestive systems such as pancreas, liver, stomach, intestine, and skin such as epidermis / dermis / hair It is also possible to obtain therapeutic cells in the visual system such as the cornea, the cornea, and the auditory system such as the inner ear. For example, in the intestinal system, when intestinal progenitor cells such as crypt cells are obtained, they can be used for the treatment of ulcerative colitis, Crohn's disease, short bowel disease, etc. by transplanting them with a catheter or the like. In the visual system, for example, when retinal progenitor cells, retinal pigment epithelial cells and photoreceptor cells are obtained by reprogramming from somatic cells, they can be directly injected or transplanted into a cell sheet for transplantation to age-related macular degeneration or retinal pigments. Can be used to treat degeneration. In the pancreatic system, for example, when β cells or insulin-producing cells are obtained, they can be used for the treatment of diabetes by encapsulating them with a catheter or the like or encapsulating them in an immune blocking device. In the liver system, for example, when albumin-producing cells are obtained, they can be used for the treatment of trauma with massive bleeding by encapsulating them in a catheter or the like or encapsulating them in an immune blocking device. In addition, for example, when blood coagulation factor-producing cells are obtained, they can be encapsulated in a catheter or an immune blocking device and transplanted to treat congenital genetic diseases such as trauma treatment with hemorrhage and hemophilia Available to.
本発明に従ってリプログラミングした細胞はまた、治療用再生組織、器官、臓器の材料としての利用が可能である。例えば、心筋細胞、あるいはｉｓｌｅｔ−１遺伝子などを発現する心筋前駆細胞やｎｋｘ−２．５遺伝子、ｇａｔａ−４遺伝子などの心筋分化関連マーカー因子を発現する細胞を誘導し、これをカテーテルなどで直接移植する他、誘導した心筋細胞などをシート化／積層化して移植することにより、心筋梗塞などの心不全や拡張型心筋症などの心臓疾患に適用することができる。細胞のシート化／積層化は、例えば温度感受性培養皿などを利用して行うことができる。また、誘導した心筋細胞に加えて血管内皮細胞を混合して細胞シート化／積層化することにより、血管網が再構築された細胞積層シートを作ることができる。 Cells reprogrammed in accordance with the present invention can also be used as therapeutic regenerative tissues, organs, organ materials. For example, myocardial cells, or myocardial progenitor cells that express the islet-1 gene, etc., or cells that express myocardial differentiation-related marker factors such as the nkx-2.5 gene and the gata-4 gene are induced and directly induced by a catheter or the like. In addition to transplantation, the induced cardiomyocytes and the like can be applied in the form of a sheet / stacked and transplanted to a heart disease such as myocardial infarction or dilated cardiomyopathy. Cell sheeting / stacking can be performed using, for example, a temperature-sensitive culture dish. Also, by mixing vascular endothelial cells in addition to the induced cardiomyocytes to form a cell sheet / laminate, a cell laminate sheet in which the vascular network is reconstructed can be produced.
同様に、例えば脂肪細胞や骨髄細胞や血球細胞などの体細胞から間葉系幹細胞を得た場合、軟骨細胞を誘導し、これをカテーテルなどで直接移植する他、誘導した軟骨細胞などを高分子支持担体とともに移植することにより、軟骨や骨組織を再構築や関節障害の治療へ適用できる。同様に、例えば膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮／真皮／毛髪などの皮膚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用組織を高分子支持担体などを利用して培養することにより得ることもできる。例えば、肝臓組織を誘導して得た場合は、肝癌、肝硬変、急性肝不全や、ヘモクロマトーシスなどの肝代謝障害の治療へ利用できる。平滑筋／骨格筋などの筋組織系を誘導して得た場合には、これを直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより、筋ジストロフィー治療などへ利用できる。肺細胞組織を得た場合、これを患部へ移植することにより嚢胞性線維症や喘息などの肺呼吸器疾患治療へ利用できる。腎臓系では、メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞、糸球体細胞など含む組織を得た場合、これを直接移植することにより、腎不全や腎炎の治療や透析治療などへ利用できる。動静脈などの血管／リンパ管系では、細胞シート化または高分子支持担体などを用いて血管を構築し、これを直接移植することにより、冠動脈大動脈バイパス移植などの心臓疾患治療、下肢虚血性疾患治療、虚血性心疾患治療などへ利用できる。 Similarly, when mesenchymal stem cells are obtained from somatic cells such as fat cells, bone marrow cells, and blood cells, for example, chondrocytes are induced and transplanted directly with a catheter or the like, and the induced chondrocytes are polymerized. By transplanting with a support carrier, cartilage and bone tissue can be applied to reconstruct and treat joint disorders. Similarly, culture of therapeutic tissues in digestive systems such as pancreas, liver, stomach and intestines, skin systems such as epidermis / dermis / hair, and auditory systems such as inner ear using a polymer support carrier. Can also be obtained. For example, when obtained by inducing liver tissue, it can be used for the treatment of liver cancer, cirrhosis, acute liver failure, and liver metabolic disorders such as hemochromatosis. When obtained by inducing a muscular tissue system such as smooth muscle / skeletal muscle, it can be used for muscular dystrophy treatment by direct injection or transplantation using a catheter or the like. When lung cell tissue is obtained, it can be used for treatment of pulmonary respiratory diseases such as cystic fibrosis and asthma by transplanting it to the affected area. In the kidney system, when a tissue containing mesangial cells, tubular epithelial cells, glomerular cells, etc. is obtained, it can be directly transplanted to be used for treatment of renal failure or nephritis, dialysis treatment, and the like. In blood vessels / lymphatic vessels such as arteriovenous, blood vessels are constructed using cell sheets or polymer support carriers, etc., and then directly transplanted to treat heart diseases such as coronary artery aortic bypass grafts, lower limb ischemic diseases It can be used for treatment, ischemic heart disease treatment and the like.
さらに、本発明に従ってリプログラミングした細胞は、創薬研究ツールとしての利用が可能である。例えば、ヒト体細胞をリプログラミングしてヒト組織幹細胞やその前駆細胞、あるいはｉＰＳ細胞を得た場合には、これらの細胞を用いて目的の分化状態の細胞、または組織もしくは器官を誘導し、これを被検物質の薬効／毒性評価や作用メカニズムの解明、あるいは生物現象メカニズムの解析に用いることが可能である。 Furthermore, the cells reprogrammed according to the present invention can be used as a drug discovery research tool. For example, when human somatic cells are reprogrammed to obtain human tissue stem cells, their progenitor cells, or iPS cells, these cells are used to induce cells of the desired differentiation state, or tissues or organs. Can be used for evaluating the efficacy / toxicity of test substances, elucidating the mechanism of action, or analyzing the mechanism of biological phenomena.
また、本発明は、遺伝子組換え体製剤を製造する細胞への応用も可能である。すなわち、本発明のリプログラミング法により、ホルモン、代謝酵素などを産生する細胞を得た場合、これを治療用タンパク質の製造細胞とすることができる。例えば、肝臓系の、物質代謝が可能な細胞を得ることにより、アルブミン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、α１アンチトリプシンなどの代謝酵素産生細胞を作製し、産生した代謝酵素を直接注射するか点滴投与することにより、これらのタンパク質の欠乏症の治療に用いることができる。例えばβ細胞などの、物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、インスリン産生細胞を作製し、産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。さらに、得られた細胞へ所望の外来遺伝子を導入することにより、遺伝子組換え体を付加する治療用タンパク質製剤の製造細胞とすることができる。同様に、産生タンパク質に機能付加したり分泌能力を高める機能遺伝子を細胞に導入することにより、該細胞の物質生産能力を高めることができる。 Further, the present invention can be applied to cells for producing a gene recombinant preparation. That is, when cells that produce hormones, metabolic enzymes, and the like are obtained by the reprogramming method of the present invention, they can be used as cells for producing therapeutic proteins. For example, by obtaining cells that can metabolize the liver, albumin-producing cells, blood coagulation factor-producing cells, α1-antitrypsin and other metabolic enzyme-producing cells are produced, and the produced metabolic enzymes are directly injected or infused. By administering it, it can be used to treat deficiencies of these proteins. For example, insulin-producing cells can be prepared by obtaining pancreatic cells that can metabolize substances such as β cells, and the produced insulin can be directly injected to be used for the treatment of type I diabetes. Furthermore, by introducing a desired foreign gene into the obtained cells, it is possible to obtain cells for producing a therapeutic protein preparation to which a gene recombinant is added. Similarly, by introducing into a cell a functional gene that adds a function to the produced protein or enhances the secretion ability, the substance production ability of the cell can be enhanced.
本発明のエキソソームを含む組成物は、そのまま液剤として、または薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに適当な剤型の医薬組成物として製剤化することができる。ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。 The composition containing the exosome of the present invention can be formulated as a liquid as it is, or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form together with a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Here, as a pharmacologically acceptable carrier, various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, solvents (dispersing agents), solubilizing agents, suspending agents, and stabilizing agents are used. It is added as an agent, isotonic agent, buffer, pH adjuster, soothing agent and the like. If necessary, formulation additives such as preservatives and antioxidants can also be used.
前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。 Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include injectable preparations such as injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, intraarterial injections, etc.) and infusions. Can be mentioned.
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。医薬組成物中のエキソソームの含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約０．０１〜約５０重量％である。投与は、経口投与、例えば母乳、経鼻投与、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮投与などである。 The pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, such as the method described in the Japanese Pharmacopoeia. The content of exosomes in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, dosage, etc., but is, for example, about 0.01 to about 50% by weight. Administration is oral administration such as breast milk, nasal administration, parenteral administration such as intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous and transdermal administration.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the scope of the examples.
（１）胎盤由来細胞採取
帝王切開の分娩により、ヒトの胎盤組織を得た。この胎盤組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。胎盤組織から外膜を除去し、メスや剃刀等を用いて組織を個片化した。胎盤組織１０ｇあたり４０ｍｌの３ｍｇ／ｍｌのコラーゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を含有する溶液で、３７℃で６０分間の酵素処理を行った。その後、孔径１００μｍのストレイナーでフィルトレーションし、遠心分離装置で６００ｇ、５分間遠心分離し、その上清をアスピレートした。次に、胎盤組織１０ｇあたり３５ｍｌのＡＣＫバッファーで５分間、溶血処理し、胎盤組織１０ｇあたり３５ｍｌの３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と５Ｕ／ｍｌヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）で溶血反応を止めた。さらに、遠心分離装置で６００ｇ、１５分間遠心分離し、その上清をアスピレートした。ＭＳＣＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ社）でペレットを再懸濁し、細胞数計測した。
(1) Placenta-derived cell collection Human placental tissue was obtained by cesarean delivery. The placental tissue was washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS). The outer membrane was removed from the placenta tissue, and the tissue was separated into pieces using a scalpel or a razor. Enzyme treatment was performed at 37 ° C. for 60 minutes with a solution containing 40 ml of 3 mg / ml collagenase and 4 mg / ml dispase per 10 g of placental tissue. Thereafter, the mixture was filtered with a strainer having a pore diameter of 100 μm, centrifuged at 600 g for 5 minutes with a centrifugal separator, and the supernatant was aspirated. Next, hemolysis was performed with 35 ml of ACK buffer per 10 g of placental tissue for 5 minutes, and the hemolysis reaction was stopped with 35 ml of 3% fetal bovine serum (FBS) and 5 U / ml heparin (Heparin) per 10 g of placental tissue. Further, the mixture was centrifuged at 600 g for 15 minutes with a centrifuge, and the supernatant was aspirated. The pellet was resuspended in MSCGM medium (Lonza) and the number of cells was counted.
（２）コロニー形成
上記のようにして得られた胎盤由来細胞を、ＭＳＣＧＭ培地を含むφ１０ｃｍディッシュに８００個播種した（１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。３日おきに培地交換しながら２週間培養した。増殖してきた細胞をＣＦＣ（コロニー形成細胞）とした。
(2) Colony formation 800 placenta-derived cells obtained as described above were seeded in a φ10 cm dish containing MSCGM medium (14 cells / cm 2 ). The cells were cultured for 2 weeks while changing the medium every 3 days. The proliferated cells were designated as CFC (colony forming cells).
（３）培養上清作製
上記のＣＦＣを定法に従い、φ１５ｃｍディッシュに２ｘ１０６個播種した（１３，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）。７０％コンフルエントになったら、ＰＢＳで３回洗浄後、無血清ＤＭＥＭに培地交換した。その後、４８時間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気条件下でインキュベートした。４８時間経過後、培養上清を回収し、遠心分離装置で２０００ｇ、２０分間遠心分離し、その上清を回収し、孔径０．２μｍのフィルターでフィルトレーションすることにより、細胞成分を除去した。
(3) Preparation of culture supernatant According to a conventional method, 2 × 10 6 CFCs were seeded in a φ15 cm dish (13,000 cells / cm 2 ). When it became 70% confluent, the medium was replaced with serum-free DMEM after washing 3 times with PBS. Thereafter, the cells were incubated for 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated water vapor conditions. After 48 hours, the culture supernatant was collected, centrifuged at 2000 g for 20 minutes with a centrifuge, and the supernatant was collected and filtered with a filter having a pore size of 0.2 μm to remove cell components. .
（４）エキソソーム調製
上記培養上清を遠心分離装置で１０，０００ｇ、３０分間遠心分離した後、さらにその上清を１００，０００ｇ、７０分間遠心分離した。このペレットをＰＢＳに懸濁し、さらに１００，０００ｇ、７０分間遠心分離した。このペレットを培養上清２０ｍｌあたり１００μｌのＰＢＳにサスペンドした。以上のようにしてエキソソーム１を製造した。
(4) Preparation of exosomes The above culture supernatant was centrifuged at 10,000 g for 30 minutes with a centrifuge, and then the supernatant was further centrifuged at 100,000 g for 70 minutes. This pellet was suspended in PBS and further centrifuged at 100,000 g for 70 minutes. The pellet was suspended in 100 μl PBS per 20 ml culture supernatant.
また同様の手法において、（２）の工程でコロニー形成していないヒト胎盤由来細胞からエキソソームを抽出したものをエキソソーム２とし、コロニー形成していないヒト頭蓋冠骨芽細胞からエキソソームを抽出したものをエキソソーム３として調製した。
In the same method, the exosome extracted from the human placenta-derived cells not colonized in the step (2) is called
上記のエキソソーム１について、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、歯根膜由来幹細胞をポジティブコントロールとして融解曲線分析法を行い、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子の定量化を試みた。エキソソーム１には、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子が実質的に含まれていないことが示唆され、Ｎａｎｏｇ遺伝子は含まれている可能性があることが示唆された（図１）。また、リアルタイムＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、リアルタイムＰＣＲ産物のサイズを定性的に調べた（図２）。リアルタイムＰＣＲ産物のサイズから、エキソソーム１にはＯｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子が実質的に含まれず、Ｎａｎｏｇ遺伝子は含まれている可能性があることが示唆された。
The
（５）ヒト皮膚線維芽細胞への添加実験
組織培養用６ウェルプレート（ＡＧＣ旭硝子）を準備し、このディッシュにヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより入手）を１×１０５個ずつ播種した。２４時間後、ディッシュにエキソソーム１〜３をそれぞれ１００μｌずつ加えた（この時点を０日とする）。１日目および３日目のタイミングで、ｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いて回収した。
(5) Addition experiment to human dermal fibroblasts A 6-well plate (AGC Asahi Glass) for tissue culture was prepared, and 1 × 10 5 human dermal fibroblasts (obtained from Lonza) were seeded on this dish. After 24 hours, 100 μl of each of
（６）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるヒト皮膚線維芽細胞中のｍＲＮＡの定量
上記ＲＮＡからＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
(6) Quantification of mRNA in human skin fibroblasts by real-time RT-PCR From the above RNA, using the LightCycler Real-Time PCR System (Roche Applied Science), Oct3 / 4 gene, Sox-2 gene, Nanog gene, TERT Gene mRNA was quantified.
（７）結果を図３〜５に示す。縦軸は、各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示す。 (7) The results are shown in FIGS. A vertical axis | shaft shows the relative expression level of mRNA of each gene.
コロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを皮膚線維芽細胞に接触させることにより、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現が亢進することが確認された。一方、コロニー形成していなかったヒト胎盤由来細胞およびヒト頭蓋冠骨芽細胞から抽出したエキソソームを皮膚線維芽細胞に接触させても、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現亢進は観察されなかった。また、コロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させた皮膚線維芽細胞においては、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量に変化は見られなかった。 It was confirmed that the expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene was enhanced by bringing exosomes extracted from colonized placenta-derived cells into contact with dermal fibroblasts. On the other hand, even when exosomes extracted from human placenta-derived cells and human calvarial osteoblasts that were not colonized were brought into contact with dermal fibroblasts, the increased expression of Oct3 / 4 gene, Nanog gene and Sox-2 gene was Not observed. Moreover, no change was observed in the expression level of the TERT gene in dermal fibroblasts contacted with exosomes extracted from colonized placenta-derived cells.
Claims (17)
培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを含む、前記組成物。 A composition for enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
The said composition containing the exosome extracted from the placenta origin cell colonized by culture | cultivation.
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
を含む、前記方法。 A method for producing a composition for enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
a) culturing the placenta-derived cells to form colonies;
b) obtaining colony-formed placenta-derived cells and further culturing;
c) a step of extracting exosomes from the culture supernatant obtained in step b);
Said method.
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
ｄ）エキソソームと標的細胞とを接触させる工程と、
を含む、前記方法。 A method for enhancing expression of a plurality of transcription factors involved in reprogramming in a target cell,
a) culturing the placenta-derived cells to form colonies;
b) obtaining colony-formed placenta-derived cells and further culturing;
c) a step of extracting exosomes from the culture supernatant obtained in step b);
d) contacting the exosome with the target cell;
Said method.
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