JP6216507B2 - Microorganism improved in resistance to oxidative stress and method for producing the same - Google Patents
Microorganism improved in resistance to oxidative stress and method for producing the sameInfo
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Description
本発明は、微生物の分子シャペロン遺伝子の発現量を増加させることによって、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物に関する。また、微生物に特定の処理を施すことによって分子シャペロン遺伝子の発現量を増加させ、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物を製造する方法に関する。さらに、酸化ストレスに対する耐性が向上した微生物を含む食品に関する。 The present invention relates to a microorganism having improved resistance to oxidative stress by increasing the expression level of the molecular chaperone gene of the microorganism. The present invention also relates to a method for producing a microorganism having improved resistance to oxidative stress by increasing the expression level of a molecular chaperone gene by applying a specific treatment to the microorganism. Furthermore, it is related with the foodstuff containing the microorganisms which the tolerance with respect to oxidative stress improved.
プロバイオティクス菌は有益な微生物として、ヨーグルト、乳酸菌飲料、整腸剤等に応用されており、整腸効果を中心として様々な機能が知られている。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（以下、「ラクトバチルス・アシドフィルス」という場合がある。）、 Ｌｂ．ｃａｓｅｉ、 Ｌｂ．ｇａｓｓｅｒｉ（以下、「ラクトバチルス・ガセリ」という場合がある。）等のラクトバチルス属細菌が食品に利用されている。しかしながら、これらのプロバイオティクス菌がその機能を発揮するためには、生きた菌を摂取することが必須である場合も多く、プロバイオティクス菌の食品中での生残性確保は非常に重要な問題である。 Probiotic bacteria are useful microorganisms that are applied to yogurt, lactic acid bacteria beverages, intestinal preparations, and the like, and various functions are known with a focus on intestinal effect. For example, Lactobacillus acidophilus (hereinafter sometimes referred to as “Lactobacillus acidophilus”), Lb. casei, Lb. Lactobacillus bacteria such as gasseri (hereinafter sometimes referred to as “Lactobacillus gasseri”) are used in foods. However, in order for these probiotic bacteria to exert their functions, it is often necessary to ingest live bacteria, and ensuring survival of probiotic bacteria in food is very important. It is a serious problem.
食品の製造工程および保存中には、ｐＨや浸透圧等様々な要因がストレス因子として微生物に作用し、使用する微生物によっては生菌数が減少することがある。中でも乳酸菌等の嫌気性菌にとって、酸素は生残性に関わる重要な因子である。特に、プロバイオティクス乳酸菌に関しては、嫌気度が高い環境である腸内由来の菌が多いため、酸素に対する感受性が高い場合がある。しかし、製造工程を完全に嫌気状態にすることは不可能であり、製造後も真空包装を除くと食品中の酸素を完全に除去し、外部からの酸素の進入を遮断することは難しいことから、プロバイオティクス乳酸菌を使用した食品において、酸素による酸化ストレスは死滅の大きな要因となり得る。 During the production process and storage of food, various factors such as pH and osmotic pressure act on the microorganisms as stress factors, and the number of viable bacteria may decrease depending on the microorganism used. Among these, oxygen is an important factor related to survival for anaerobic bacteria such as lactic acid bacteria. In particular, probiotic lactic acid bacteria may be highly sensitive to oxygen because there are many bacteria derived from the intestine, which is an environment with a high anaerobic degree. However, it is impossible to make the manufacturing process completely anaerobic, and it is difficult to completely remove oxygen in food and block the ingress of oxygen from outside if vacuum packaging is removed after manufacturing. In foods using probiotic lactic acid bacteria, oxygen-induced oxidative stress can be a major cause of death.
さて、酸化ストレスによる悪影響は、酸素やその代謝物である過酸化水素（以下、「Ｈ2Ｏ2」という場合がある。）、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素が、菌のDNA、タンパク質等に作用すると考えられている。 The adverse effects of oxidative stress include oxygen and its metabolites, hydrogen peroxide (hereinafter sometimes referred to as “H 2 O 2 ”), superoxide radicals, hydroxyl radicals and other active oxygen, It is thought to act on proteins and the like.
酸化ストレスによる影響を防ぐため、一般的な微生物では、カタラーゼによるＨ2Ｏ2の分解やスーパーオキシドジスムターゼによるスーパーオキシドラジカルの除去等の酸化ストレス耐性機構が備わっており、好気的な環境に適応している。また、一部の乳酸菌では、カタラーゼ活性やスーパーオキシドジスムターゼ活性を有することが報告されている。しかし、多くのプロバイオティクス乳酸菌は、カタラーゼ活性やスーパーオキシドジスムターゼ活性を有していない。このような乳酸菌の酸化ストレス耐性機構として、NADHペルオキシダーゼによるＨ2Ｏ2分解やチオレドキシン／チオレドキシンレダクターゼシステムによる還元状態の維持（非特許文献１参照）、ｆｎｒ遺伝子（特許文献１参照）等の関与が報告されている。 In order to prevent the effects of oxidative stress, general microorganisms are equipped with oxidative stress tolerance mechanisms such as degradation of H 2 O 2 by catalase and removal of superoxide radicals by superoxide dismutase, and adapt to aerobic environments doing. In addition, some lactic acid bacteria have been reported to have catalase activity and superoxide dismutase activity. However, many probiotic lactic acid bacteria do not have catalase activity or superoxide dismutase activity. As oxidative stress tolerance mechanism of such lactic acid bacteria (see Non-Patent Document 1) maintenance of the reduced state by H 2 O 2 decomposition or thioredoxin / thioredoxin reductase system according NADH peroxidase, the involvement of such fnr gene (see Patent Document 1) It has been reported.
一方、微生物のストレス耐性を高める方法としては、ｈｒｃＡ遺伝子の破壊による胃酸／胆汁酸耐性の向上（特許文献２参照）等が報告されている。さらに、酸化ストレス耐性を高める方法に関しては、遺伝子組み換えによるカタラーゼ遺伝子等の酸化ストレス消去系遺伝子の導入（特許文献３参照）が報告されている。 On the other hand, as a method for increasing the stress resistance of microorganisms, improvement of gastric acid / bile acid resistance by disruption of the hrcA gene has been reported (see Patent Document 2). Furthermore, with regard to a method for increasing resistance to oxidative stress, introduction of an oxidative stress elimination gene such as a catalase gene by genetic recombination (see Patent Document 3) has been reported.
さて、変性したタンパク質の修復や、修復不能なタンパク質の分解をする分子シャペロンと呼ばれる一連のタンパク質が知られている。これら分子シャペロンは、主に熱ストレスによって合成誘導され、熱によって変性したタンパク質の修復、分解等を行うことによって微生物の熱ストレス耐性を高めることが明らかになっている。
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｈ2Ｏ2によって不活化されたロダナーゼ（ｃｙａｎｉｄｅ ｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と分子シャペロンの一つであるＧｒｏＥＬを混合してインキュベートすると、ロダナーゼが再活性化されることが報告されている（非特許文献２）。
Now, a series of proteins called molecular chaperones that repair denatured proteins and decompose unrepairable proteins are known. It has been clarified that these molecular chaperones are synthesized and induced mainly by heat stress and enhance the resistance to heat stress of microorganisms by repairing and degrading proteins denatured by heat.
Furthermore, it has been reported that, in vitro, rhodanase is reactivated by mixing and incubating rhodanase inactivated by H 2 O 2 and GroEL, one of molecular chaperones ( Non-patent document 2).
特許文献２、３には微生物のストレス耐性、酸化ストレス耐性を高める方法が開示されているが、これらの方法は外来遺伝子の導入を伴うため、食品への応用は現状では難しい。
また、分子シャペロンが微生物の熱ストレス耐性を高めることは一般的に知られているが、例えば、酸化ストレスに対する効果はいまだに明らかになっていない。
さらに、非特許文献２は、分子シャペロンの酸化ストレスに対する効果を示唆するものであるが、試験条件は限定的であり、その具体的な作用機序、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果等はいまだ解明されていない。
よって、本発明は、食品製造工程および保存中に乳酸菌が受ける酸化ストレスに着目し、乳酸菌の酸化ストレス耐性を高めることによって、酸化ストレスがかかる環境下における乳酸菌の生残性を向上させることを課題とする。
In addition, it is generally known that molecular chaperones increase the resistance of microorganisms to heat stress, but for example, the effect on oxidative stress has not yet been clarified.
Furthermore, Non-Patent
Therefore, the present invention focuses on the oxidative stress experienced by lactic acid bacteria during the food production process and during storage, and improves the survival of lactic acid bacteria in an environment subject to oxidative stress by increasing the oxidative stress resistance of lactic acid bacteria And
上記課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは特定の温度、Ｈ2Ｏ2濃度条件下で乳酸菌を処理することにより、当該乳酸菌が、致死的な濃度のＨ2Ｏ2溶液中で保存した場合であっても、その生残性が高まることを見出した。さらに、特定の温度、Ｈ2Ｏ2濃度条件下で処理した乳酸菌体は、分子シャペロン遺伝子であるｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の遺伝子の転写量が、無処理の菌体に比べて増加していることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（２）前記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）またはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）であることを特徴とする上記（１）に記載の乳酸菌。
（３）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることにより、酸化ストレス耐性が向上した上記（１）または（２）に記載の乳酸菌。
（４）前記遺伝子の転写量の増加が、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記(i)〜（iii
）
のいずれかの処理を行うことにより得られるものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の乳酸菌。
(i)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
（ii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
（iii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃA遺伝子を破壊処理する工程
（５）前記ラクトバチルス・ガセリがＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）、前記ラクトバチルス・アシドフィルスがＳＢＴ２０６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０７５）であることを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載のラクトバチルス属に属する乳酸菌。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のラクトバチルス属に属する乳酸菌を含有させることを特徴とする飲食品。
（７）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量が増加したラクトバチルス属に属する乳酸菌の製造方法であって、ラクトバチルス属に属する乳酸菌に下記(i)〜（iii）のいずれかの処理を行うことを特徴とする乳酸菌の製造方法。
(i)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
(ii)ラクトバチルス属に属する乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ以上で処理する工程
(iii）ラクトバチルス属に属する乳酸菌のｈｒｃA遺伝子を破壊処理する工程
（８）ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることによりラクトバチルス属に属する乳酸菌の酸化ストレス耐性を向上させる方法。
（９）酸化耐性が高められた乳酸菌のスクリーニング方法であって、以下の(i)〜（iii
）の工程を含む方法。
(i)乳酸菌に酸化耐性処理を行う工程
(ii)前記酸化耐性処理を施した乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現を測定する工程
(iii)乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現が、無処理のものに比べて高い乳酸菌を選択
する工程
As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors treated lactic acid bacteria under specific temperature and H 2 O 2 concentration conditions, so that the lactic acid bacteria were in a lethal concentration of H 2 O 2 solution. It was found that even if it was preserved in, its survival was increased. Furthermore, the amount of transcription of genes such as molecular chaperone genes such as dnaK, groEL, and groES is increased in lactic acid cells treated under specific temperature and H 2 O 2 concentration conditions compared to untreated cells. As a result, the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
(1) A lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus in which the transcription amount of one or more genes selected from dnaK, groEL, and groES is increased.
(2) The lactic acid bacterium according to (1) above, wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri or Lactobacillus acidophilus.
(3) The lactic acid bacterium according to (1) or (2), wherein resistance to oxidative stress is improved by increasing a transcription amount of any one or more genes selected from dnaK, groEL, and groES.
(4) The increase in the amount of transcription of the gene causes lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus to include (i) to (iii)
)
The lactic acid bacterium according to any one of the above (1) to (3), which is obtained by performing any one of the treatments.
(i) A step of treating lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus at 42 ° C. or higher (ii) A step of treating lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus with 10 ppm or more of hydrogen peroxide (iii) Disrupting the hrcA gene of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus Process (5) Any of the above (2) to (4), wherein the Lactobacillus gasseri is SBT2055 (FERM BP-10953) and the Lactobacillus acidophilus is SBT2062 (FERM BP-11075) A lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus.
(6) A food or drink comprising the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus according to any one of (1) to (5) above.
(7) A method for producing a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus in which the transcription amount of any one or more genes selected from dnaK, groEL, and groES is increased, wherein the following (i) to (iii) A method for producing a lactic acid bacterium characterized by performing any one of the treatments.
(i) A step of treating lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus at 42 ° C or higher
(ii) A process of treating lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus with 10 ppm or more of hydrogen peroxide
(iii) Step of destroying the hrcA gene of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus (8) Oxidation of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus by increasing the transcription amount of any one or more genes selected from dnaK, groEL, and groES How to improve stress tolerance.
(9) A screening method for lactic acid bacteria with enhanced oxidation resistance, comprising the following (i) to (iii)
).
(i) A process of subjecting lactic acid bacteria to oxidation resistance treatment
(ii) a step of measuring the expression of a molecular chaperone gene of lactic acid bacteria subjected to the oxidation resistance treatment
(iii) A step of selecting a lactic acid bacterium having higher expression of the molecular chaperone gene of the lactic acid bacterium than that of an untreated one
本発明によれば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳから選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させることにより、酸化ストレス耐性が向上したラクトバチルス属に属する乳酸菌を得ることができる。得られたラクトバチルス属に属する乳酸菌は、酸化ストレスがかかる環境下において生残性を向上させることができる。 According to the present invention, a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having improved oxidative stress resistance can be obtained by increasing the transcription amount of any one or more genes selected from dnaK, groEL, and groES. The obtained lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus can improve survival in an environment where oxidative stress is applied.
本発明の微生物として、プロバイオティクスとして用いられる乳酸菌が挙げられる。具体的には、Lactobacillus acidophilus、Lb. gasseri、Lb. casei、Lb. salivarius、Lb. plantarum、Lb. johnsonii、Lb. reuteri、Lb. rhamnosus、Lb. fermentum、Lb. murinus 等のラクトバチルス属に属する乳酸菌が挙げられる。 Examples of the microorganism of the present invention include lactic acid bacteria used as probiotics. Specifically, it belongs to the genus Lactobacillus such as Lactobacillus acidophilus, Lb. gasseri, Lb. casei, Lb. salivarius, Lb. plantarum, Lb. johnsonii, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus, Lb. fermentum, Lb. Examples include lactic acid bacteria.
本発明においてその発現が高められる遺伝子としては、分子シャペロン遺伝子が挙げられ、具体的には、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のうちいずれか１つ以上の発現が高められることが望ましい。乳酸菌の酸化ストレス耐性に分子シャペロンが関連することは、本発明において新たに明らかになったことである。分子シャペロン遺伝子は複数の種間で広く保存されているため、酸化耐性が高い有用な菌株をスクリーニングする場合の酸化耐性マーカーとしても使用することが期待できる。 Examples of genes whose expression is increased in the present invention include molecular chaperone genes. Specifically, it is desirable that expression of any one or more of dnaK, groEL, and groES genes is increased. It is newly clarified in the present invention that a molecular chaperone is related to the oxidative stress resistance of lactic acid bacteria. Since molecular chaperone genes are widely conserved among a plurality of species, they can be expected to be used as oxidation resistance markers in screening useful strains having high oxidation resistance.
本発明において、乳酸菌におけるｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の転写量を増加させる処理としては、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のいずれか一種以上の遺伝子の転写量を増加させる条件で乳酸菌を処理する方法であれば良く、特に限定はされないが、例えば、乳酸菌をＨ2Ｏ2にて処理する方法、高温環境にて処理する方法、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法等が挙げられる。なお、遺伝子の転写量の増加とは、遺伝子の転写量を増加させる処理を行う前の転写量を１とした場合に、１より高いことをいい、１．５倍以上、望ましくは２倍以上増加することにより、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の酸化ストレス耐性をより向上させることができる。
Ｈ2Ｏ2にて処理する方法としては、例えば、Ｈ2Ｏ2濃度１０ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ等の範囲が例示できる。また、Ｈ2Ｏ2で処理する場合の温度と時間の組み合わせとしては、３７℃〜４５℃で５〜２００分、好ましくは１０〜３０分処理する条件を挙げることができるが、処理濃度により処理温度を適宜調整することもできる。特に、Ｈ2Ｏ2濃度５０ｐｐｍ、３７℃で３０分間処理することにより、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子のいずれか一種以上の遺伝子の転写量をより増加させることができる。また、例えば、ブルガリクス菌などのＨ2Ｏ2を産生する乳酸菌を利用することもできる。
高温環境にて処理する方法としては、乳酸菌を増殖させるための通常の温度域よりも高い温度で処理すればよい。例えば、ラクトバチルス属やラクトバチルス・ガセリでは、通常増殖させるための温度域は３０〜３７℃であるため、４２℃以上５分以上、好ましくは４５℃以上５分以上処理を行うことが好ましい。
Ｈ2Ｏ2や高温環境で処理する場合、各菌体の培養や各処理を実施するために、還元脱脂乳培地や各菌の生育に適した合成培地、緩衝液等を用いることができる。例えば、ラクトバチルス・ガセリでは、１１％還元脱脂乳培地やMRS液体培地（ディフコ社製）等を用いることができる。
In the present invention, the treatment for increasing the transcription amount of molecular chaperone genes such as dnaK, groEL, and groES in lactic acid bacteria is performed under the condition that the transcription amount of any one or more of dnaK, groEL, and groES genes is increased. The method is not particularly limited, and examples thereof include a method of treating lactic acid bacteria with H 2 O 2, a method of treating in a high temperature environment, and a treatment method of destroying the hrcA gene. The increase in the transcription amount of the gene means that the transcription amount before the treatment for increasing the transcription amount of the gene is 1, which is higher than 1, preferably 1.5 times or more, preferably 2 times or more. By increasing, oxidative stress tolerance of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus can be further improved.
As a method for processing at H 2 O 2, for example, H 2 O 2 concentration 10ppm or more, preferably exemplified range such 10Ppm～50ppm. Moreover, as a combination of temperature and time in the case of treatment with H 2 O 2 , conditions for treatment at 37 ° C. to 45 ° C. for 5 to 200 minutes, preferably 10 to 30 minutes can be mentioned. The temperature can also be adjusted as appropriate. In particular, the amount of transcription of one or more of the dnaK, groEL, and groES genes can be further increased by treatment at an H 2 O 2 concentration of 50 ppm at 37 ° C. for 30 minutes. For example, lactic acid bacteria that produce H 2 O 2 such as Bulgaricus bacteria can also be used.
What is necessary is just to process at the temperature higher than the normal temperature range for growing lactic acid bacteria as a method of processing in a high temperature environment. For example, in the genus Lactobacillus or Lactobacillus gasseri, the temperature range for normal growth is 30 to 37 ° C., and therefore, it is preferable to perform the treatment at 42 ° C. or more and 5 minutes or more, preferably 45 ° C. or more and 5 minutes or more.
In the case of treatment in H 2 O 2 or a high temperature environment, a reduced skim milk medium, a synthetic medium suitable for the growth of each fungus, a buffer solution, or the like can be used for culturing each fungus body and performing each treatment. For example, in Lactobacillus gasseri, 11% reduced skim milk medium, MRS liquid medium (manufactured by Difco) or the like can be used.
ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法について以下に説明する。
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の発現抑制因子としてＨｒｃＡタンパク質が知られており、ＨｒｃＡタンパク質をコードするｈｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、分子シャペロン遺伝子の発現が増加し、上述の処理と同様に本発明の効果を得ることができる。ｈｒｃＡ遺伝子を破壊する処理方法としては、自然育種による方法、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射により突然変異を誘発させる方法等を使用することができる。また、Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳ）、トランスポゾン（Ｔｎ）等によるランダムな突然変異による方法、またはシングルおよびダブルクロスオーバー法による部位特異的な遺伝子破壊法等も可能であり、例えば、特許第４４７３５７０号の実施例（例えば実施例１８）に記載の方法により、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊した菌株を得ることができる。
A treatment method for disrupting the hrcA gene will be described below.
HrcA protein is known as an expression suppressor of molecular chaperone genes such as dnaK, groEL, and groES, and by destroying the hrcA gene encoding HrcA protein, the expression of the molecular chaperone gene is increased and is similar to the above treatment In addition, the effects of the present invention can be obtained. As a treatment method for destroying the hrcA gene, a method by natural breeding, a method of inducing mutation by adding a mutation agent, ultraviolet irradiation, or radiation irradiation can be used. In addition, a method based on random mutation using insertion sequence (IS), transposon (Tn) or the like, or a site-specific gene disruption method using single and double crossover methods are also possible. For example, the implementation of Japanese Patent No. 4473570 By the method described in the example (for example, Example 18), a strain in which the hrcA gene is disrupted can be obtained.
本発明において、分子シャペロン遺伝子の発現量を調べる方法は、分子シャペロン遺伝子の発現を高める処理の有無または、分子シャペロン発現抑制因子の破壊の有無の間で発現量を比較することができれば良い。例えば、リアルタイムＰＣＲ法によって得られる増殖曲線を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の発現量を内在性コントロールとした比較Ｃｔ法によって解析して相対発現量を調べることができる。 In the present invention, the method for examining the expression level of the molecular chaperone gene may be any method as long as the expression level can be compared between the presence or absence of treatment for increasing the expression of the molecular chaperone gene or the presence or absence of destruction of the molecular chaperone expression inhibitor. For example, a growth curve obtained by a real-time PCR method can be analyzed by a comparative Ct method using an expression level of 16S rRNA gene as an endogenous control to examine a relative expression level.
一般的に、遺伝子の「発現」という用語は、その遺伝子の翻訳産物すなわちタンパク質の産生のことを指すが、そのほかにも、その遺伝子の転写産物すなわちｍＲＮＡの産生のことを指すこともある。本発明では、遺伝子の「発現」と言えば特にことわりがない限りタンパク質のレベルにおける発現、ｍＲＮＡのレベルにおける発現（遺伝子の転写）のいずれをも指すものとする。タンパク質のレベルにおける発現量増加はその遺伝子の機能を遂行する最終産物の増加を反映し、ｍＲＮＡのレベルにおける発現量増加はその遺伝子の活性化に伴う直接的な結果を反映する。
したがって、本発明における遺伝子の転写量の増加は、特にことわりがない限り、タンパク質量の増加、ｍＲＮＡ量の増加、遺伝子の転写量の増加と同義で用いられる。
In general, the term “expression” of a gene refers to the production of the translation product or protein of the gene, but may also refer to the production of a transcription product or mRNA of the gene. In the present invention, “expression” of a gene means both expression at the protein level and expression at the mRNA level (gene transcription) unless otherwise specified. An increase in the expression level at the protein level reflects an increase in the end product that performs the function of the gene, and an increase in the expression level at the mRNA level reflects a direct result of the activation of the gene.
Therefore, unless otherwise specified, an increase in the amount of gene transcription in the present invention is used synonymously with an increase in protein amount, an increase in mRNA amount, and an increase in gene transcription amount.
本発明で得られた微生物は、果汁飲料、野菜飲料、乳製品、食肉製品、水産練製品、デザート類、ドレッシング類、健康食品類、麺類等の様々な飲食品に利用可能である。特に、発酵乳製品について、スターター菌種として使用することができる。 The microorganism obtained in the present invention can be used for various foods and beverages such as fruit juice beverages, vegetable beverages, dairy products, meat products, marine products, desserts, dressings, health foods, and noodles. In particular, fermented milk products can be used as starter species.
本発明でいう酸化ストレスとは、生残性に関わる重要な因子である酸素等によるストレスをいい、酸素そのものやその代謝物であるＨ2Ｏ2、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル等の活性酸素によるストレスをも含め、広く酸素に起因するストレスを含むものとする。したがって、酸化ストレスに対する耐性の向上とは、これらの酸素が存在する環境下において生残性が向上することをいう。したがって、本発明の酸化ストレス耐性が向上した乳酸菌とは、特に、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ等の分子シャペロン遺伝子の転写量を増加させる処理を行うことにより、前記処理を行わない菌体に比べて、酸化ストレス耐性、すなわち生残性が向上している乳酸菌のことをいう。例えば、乳酸菌を１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2を添加したＭＲＳ培地中で３７℃、３０分間保存した場合の生残性が、処理を行わない場合に比べて２倍以上、好ましくは１０倍以上向上した乳酸菌がより好ましい。
このように、酸化ストレスに対する耐性が向上した乳酸菌は、当該乳酸菌を利用する食品の製造工程や食品の保存中の酸素等の存在する環境下において従来に比べて生残性が維持されるため、プロバイオティクスとしての役割を果たすことが可能である。
以下に、実施例を挙げ、本発明を詳しく説明する。しかし本発明はこの記載内容に限定されるものではない。
The oxidative stress referred to in the present invention refers to stress caused by oxygen or the like, which is an important factor relating to survival, and is caused by active oxygen such as oxygen itself or its metabolite, H 2 O 2 , superoxide radical, hydroxyl radical and the like. It is assumed to include stress caused by oxygen widely including stress. Therefore, improvement of resistance to oxidative stress means that survival is improved in an environment where these oxygens exist. Therefore, the lactic acid bacterium having improved oxidative stress resistance according to the present invention, in particular, by performing a treatment that increases the transcription amount of a molecular chaperone gene such as dnaK, groEL, groES, etc. It refers to lactic acid bacteria having improved oxidative stress tolerance, that is, survival. For example, the survival when lactic acid bacteria are stored in MRS medium supplemented with 100 ppm of H 2 O 2 at 37 ° C. for 30 minutes is improved by 2 times or more, preferably 10 times or more compared to the case where no treatment is performed. Lactic acid bacteria are more preferred.
Thus, since the lactic acid bacteria having improved resistance to oxidative stress are maintained in the environment where oxygen is present during the production process of food and the preservation of foods using the lactic acid bacteria, the survival rate is maintained as compared with the past. Can play a role as probiotics.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to this description.
［実施例１］Ｈ2Ｏ2処理による分子シャペロン遺伝子発現量の変化確認試験
プロバイオティクス菌として使用されるラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）について、様々なＨ2Ｏ2濃度で処理したときの分子シャペロン遺伝子の発現量を調べた。
（１）試験方法
i）遺伝子の転写量を増加させる処理（Ｈ2Ｏ2処理）
ＭＲＳ培地（ｐＨ６．０（ｐＨ無調整））で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体を、Ｈ2Ｏ2を添加していないＭＲＳ培地（Ｈ2Ｏ2無添加区）、Ｈ2Ｏ2を１０ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2１０ｐｐｍ処理区）、２５ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2２５ｐｐｍ処理区）、５０ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区）、１００ｐｐｍ（Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区）になるよう添加した各ＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁し、３７℃で３０分間静置した。
ii）遺伝子の転写量測定
静置後、各菌液をサンプリングしてＲＮＡの抽出を行い、ｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲ法によって得られる増殖曲線を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の発現量を内在性コントロールとした比較Ｃｔ法によって解析して、分子シャペロン遺伝子の相対発現量を調べた。なお、無添加区（ｐH６、Ｈ2Ｏ2 ０ppm）中で３７℃３０分間静置したときの各遺伝子の発現量を１として、それぞれの条件の発現量Xを求めた後、log2（X）の値を相対発現量として算出した。すなわち、無添加区の場合の各遺伝子の発現量はlog2(1)=０となり、相対発現量が１のときに無添加区の場合に比べて２1倍の発現量となる。
なお、測定対象遺伝子として、分子シャペロン遺伝子であるｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ、ｄｎａＫの他に、胆汁酸、低温、酸化ストレス等に対する耐性に関与すると細菌において報告されているｂｓｈ、ｃｆａ、ｃｌｐＣ、ｃｌｐＬ、ｃｌｐＰ、ｃｓｐＡ、ｇｓｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘについて調べた。
（２）試験結果
各遺伝子の相対発現量を図１に示した。
ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子については、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区では、Ｈ2Ｏ2無添加区に比べて各遺伝子の発現量が４倍程度高くなっていた。一方で、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区では、各遺伝子の発現量の増加は認められなかった。
また、ｃｆａ、ｃｌｐＣ、ｃｌｐＬ、ｃｌｐＰ、ｃｓｐＡ、ｇｓｈ遺伝子については、Ｈ2Ｏ2１０ｐｐｍ処理区、または２５ｐｐｍ処理区では各遺伝子の発現量の増加は認められたが、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区、１００ｐｐｍ処理区では各遺伝子の発現量が減少した。
一方、ｂｓｈ、ｌｄｈ、ｐｏｘ遺伝子は、Ｈ2Ｏ2濃度が高くなるに伴い遺伝子の発現が減少した。
よって、分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳは、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍまで濃度依存的にその発現量が増加し、Ｈ2Ｏ2処理により、遺伝子の転写が増加していることがわかった。
[Example 1] Test for confirming change in expression level of molecular chaperone gene by H 2 O 2 treatment Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) used as a probiotic bacterium is treated at various H 2 O 2 concentrations. The expression level of the molecular chaperone gene was examined.
(1) Test method
i) Treatment to increase gene transcription (H 2 O 2 treatment)
Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) cells subcultured in MRS medium (pH 6.0 (pH unadjusted)) were collected by centrifugation. The collected bacterial cells, MRS medium without the addition of H 2 O 2 (H 2 O 2 untreated silage), 10 ppm of H 2 O 2 (H 2 O 2 10ppm treated group), 25ppm (H 2 O 2 25ppm (Treatment group), 50 ppm (H 2 O 2 50 ppm treatment group), and 100 ppm (H 2 O 2 100 ppm treatment group) were added to each MRS medium, and the suspension was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
ii) Measurement of gene transcription amount After standing, each bacterial solution was sampled and RNA was extracted to obtain cDNA. The growth curve obtained by the real-time PCR method was analyzed by the comparative Ct method using the expression level of 16S rRNA gene as an endogenous control, and the relative expression level of the molecular chaperone gene was examined. In addition, after obtaining the expression level X of each gene when the expression level of each gene when left at 37 ° C. for 30 minutes in an additive-free section (pH 6, H 2 O 2 0 ppm) is 1, log 2 (X ) Was calculated as a relative expression level. That is, the expression level of each gene in the case of no addition group becomes log 2 (1) = 0, and the 2 1 times the expression level in comparison with the case of the relative expression level untreated silage at 1.
In addition to the molecular chaperone genes groEL, groES, and dnaK as measurement target genes, bsh, cfa, clpC, clpL, clpP, which are reported in bacteria to be involved in resistance to bile acids, low temperature, oxidative stress, etc. cspA, gsh, ldh, and pox were examined.
(2) Test results The relative expression level of each gene is shown in FIG.
dnaK, groEL, for groES gene, the H 2 O 2 50 ppm treated group, the expression level of each gene as compared to the H 2 O 2 untreated silage was higher about 4 times. On the other hand, no increase in the expression level of each gene was observed in the H 2 O 2 100 ppm treatment group.
Regarding cfa, clpC, clpL, clpP, cspA, and gsh genes, an increase in the expression level of each gene was observed in the H 2 O 2 10 ppm treatment group or the 25 ppm treatment group, but the H 2 O 2 50 ppm treatment group. In the 100 ppm treatment group, the expression level of each gene decreased.
On the other hand, bsh, ldh, and pox genes decreased in gene expression with increasing H 2 O 2 concentration.
Therefore, it was found that the expression level of molecular chaperone genes dnaK, groEL and groES increased in a concentration-dependent manner up to 50 ppm of H 2 O 2 , and that gene transcription was increased by H 2 O 2 treatment.
［実施例２］酸化ストレス耐性試験
実施例１の結果から、Ｈ2Ｏ2濃度０ｐｐｍから１００ｐｐｍの間で分子シャペロン遺伝子の発現量に変化があることがわかった。
次に、これらのＨ2Ｏ2濃度で処理したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
（１）酸化ストレス耐性試験
実施例１．（１）．i）の方法に従って、０、１０、２５、５０、１００ｐｐｍ濃度に
よりＨ2Ｏ2処理を行った。
各処理後の菌液を遠心分離して、各菌体を回収し、Ｈ2Ｏ2濃度１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地にそれぞれ懸濁した。保存０時間として各濃度中の菌体のサンプリングを行った後、１０℃で２４時間静置保存した。保存終了後に再度サンプリングを行った。保存２４時間後のサンプルの生菌数（Ｎ1）を保存０時間のサンプルの生菌数（Ｎ0）で除してその常用対数の値を生残性（生残率）とした（下記式）。
生残性（生残率）＝ｌｏｇ10（Ｎ1／Ｎ0）
（２）実施結果
Ｈ2Ｏ2で処理を行った菌体の生残性を図２に示した。Ｈ2Ｏ2処理により生残性が向上しており、特にＨ2Ｏ2５０ｐｐｍ処理区ではＨ2Ｏ2無添加区に比べて１００倍以上生残性が向上した。一方で、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍ処理区では無添加区より生残性が低下した。
以上の結果から、Ｈ2Ｏ2１０〜５０ｐｐｍで処理を行うことにより、濃度依存的に酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）耐性が向上することがわかった。したがって、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現量がＨ2Ｏ2耐性に関与することが明らかとなった。
[Example 2] Oxidative stress tolerance test From the results of Example 1, it was found that there was a change in the expression level of the molecular chaperone gene between 0 ppm and 100 ppm of H 2 O 2 concentration.
Next, to confirm the resistance to oxidative stress (H 2 O 2) of these concentration of H 2 O 2 treated with Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953).
(1) Oxidative stress tolerance test Example 1 (1). According to the method of i), H 2 O 2 treatment was performed at concentrations of 0, 10, 25, 50, and 100 ppm.
The bacterial solution after each treatment was centrifuged, and each bacterial cell was collected and suspended in an MRS medium adjusted to a H 2 O 2 concentration of 100 ppm. Sampling of the bacterial cells in each concentration was performed as
Survival (survival rate) = log 10 (N 1 / N 0 )
(2) the survival of the bacterial cells were treated with implementation results H 2 O 2 shown in FIG. H 2 O 2 viability has been improved by treatment, has improved 100 times viability compared to H 2 O 2 untreated silage, especially H 2 O 2 50 ppm treated group. On the other hand, in the H 2 O 2 100 ppm treated section, the survival was lower than in the non-added section.
From the above results, by performing the process with H 2 O 2 10 to 50 ppm, a concentration-dependent manner oxidative stress (H 2 O 2) resistance was improved. Therefore, it was revealed that the expression levels of dnaK, groEL, and groES are related to H 2 O 2 resistance.
［実施例３］ｐＨ処理、熱処理による分子シャペロン遺伝子の発現量の変化確認試験
ｐＨや温度条件を変えて処理したときの分子シャペロン遺伝子の発現量を調べた。
（１）試験方法
i）遺伝子の転写量を増加させる処理（高温環境処理）
ＭＲＳ培地（ｐＨ６．０（ｐＨ無調整））で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体をＭＲＳ培地（ｐＨ６．０）または、ｐH５．０になるよう乳酸で調整したＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁し、温度（３７℃または４５℃）、Ｈ2Ｏ2濃度（０ｐｐｍまたは５０ｐｐｍ）条件をかえて処理を行い、３０分間静置した。
（各処理条件：ｐH、温度、Ｈ2Ｏ2濃度）
・ｐH６．０、３７℃、０ｐｐｍ（「コントロール」という。）
・ｐH５．０、３７℃、０ｐｐｍ（「ｐH５．０」という。）
・ｐH６．０、４５℃、０ｐｐｍ（「４５℃」という。）
・ｐH６．０、３７℃、５０ｐｐｍ（「５０ｐｐｍ」という。）
ii）遺伝子の転写量測定
実施例１．（１）．ii）の方法に従って遺伝子転写量の測定を行った。なお、コントロ
ールの遺伝子の発現量を１としてそれぞれの条件の場合の発現量Xを求めた後、log2（X）の値を相対発現量として算出した。
なお、分子シャペロン遺伝子としては、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳについて調べた。
（２）試験結果
各条件で処理した場合の分子シャペロン遺伝子の発現量を図３に示した。
ｄｎａＫに関しては、４５℃は、コントロールに比べて４倍程度の発現量であった。５０ｐｐｍと同等の高い結果であった。
一方、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳに関しては、４５℃処理でコントロールの２倍以上の発現量が得られたが、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍに比べると発現量は少なかった。
なお、ｐH５．０処理では、いずれの分子シャペロン遺伝子でも発現量の大きな変化は認められなかった。
[Example 3] Confirmation test of change in expression level of molecular chaperone gene due to pH treatment and heat treatment The expression level of molecular chaperone gene when the treatment was carried out under different pH and temperature conditions was examined.
(1) Test method
i) Treatment to increase gene transcription (high temperature environment treatment)
Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) cells subcultured in MRS medium (pH 6.0 (pH unadjusted)) were collected by centrifugation. The collected cells are suspended in MRS medium (pH 6.0) or MRS medium adjusted with lactic acid so as to have a pH of 5.0, respectively (temperature (37 ° C. or 45 ° C.)), H 2 O 2 concentration (0 ppm or 50 ppm). The treatment was performed under different conditions, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes.
(Each treatment condition: pH, temperature, H 2 O 2 concentration)
PH 6.0, 37 ° C., 0 ppm (referred to as “control”)
・ PH 5.0, 37 ° C., 0 ppm (referred to as “pH 5.0”)
・ PH 6.0, 45 ° C., 0 ppm (referred to as “45 ° C.”)
・ PH 6.0, 37 ° C., 50 ppm (referred to as “50 ppm”)
ii) Measurement of gene transcription level Example 1 (1). The amount of gene transcription was measured according to the method of ii). The expression level X of each control condition was determined with the expression level of the control gene as 1, and the value of log 2 (X) was calculated as the relative expression level.
In addition, as a molecular chaperone gene, it investigated about dnaK, groEL, and groES.
(2) Test results The expression level of the molecular chaperone gene when treated under each condition is shown in FIG.
Regarding dnaK, the expression level at 45 ° C. was about 4 times that of the control. The result was as high as 50 ppm.
On the other hand, with regard to groEL and groES, an expression level more than twice that of the control was obtained by treatment at 45 ° C., but the expression level was small compared to 50 ppm of H 2 O 2 .
In addition, in pH 5.0 treatment, no significant change in the expression level was observed in any molecular chaperone gene.
［実施例４］酸化ストレス耐性試験
実施例３の各条件で処理を行ったラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５５３５）の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
(１)実施方法
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）を用いて、実施例３．（１）．i）の各処理を行った。処理を施した菌体を実施例２の酸化ストレス耐性試験に従い、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地でそれぞれ懸濁して１０℃で２４時間保存し、２４時間保存後の生残性を測定した。
（２）実施結果
各条件の生残性を図４に示した。
４５℃処理、５０ｐｐｍ処理ともコントロールに比べて生残性の向上が認められた。５０ｐｐｍ処理の効果が最も高かった。
以上より、高温環境で処理を行うことにより、酸化ストレス耐性が向上することが確認できた。なお、ｐH５．０処理では生残性の向上はみられなかった。
[Example 4] Oxidative stress tolerance test The resistance of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-15535) treated under the conditions of Example 3 to oxidative stress (H 2 O 2 ) was confirmed.
(1) Method of implementation Example 3 using Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953). (1). Each process of i) was performed. The treated cells were suspended in MRS medium adjusted to 100 ppm of H 2 O 2 according to the oxidative stress resistance test of Example 2, stored at 10 ° C. for 24 hours, and the survival after 24 hours storage was measured. did.
(2) Implementation results The survival of each condition is shown in FIG.
In both the 45 ° C. treatment and the 50 ppm treatment, an improvement in survival was observed compared to the control. The effect of the 50 ppm treatment was the highest.
From the above, it was confirmed that the resistance to oxidative stress was improved by performing the treatment in a high temperature environment. The treatment with pH 5.0 did not improve survival.
［実施例５］ｈｒｃA遺伝子破壊株における分子シャペロン遺伝子の発現量の変化確認試験
分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現抑制因子としてHｒｃAタンパク質が知られている。そこで、特許第４４７３５７０号実施例１８の方法に従って取得したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）ｈｒｃＡ遺伝子破壊株（以下、「ΔｈｒｃＡ株」という。）の分子シャペロン遺伝子ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの発現量を調べた。
（１）試験方法
ＭＲＳ培地で継代培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）ΔｈｒｃＡ株の菌体を遠心分離により回収し、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子の発現量を調べた。遺伝子の発現量は、実施例１．（１）．ii）の方法に従ってに実施した。なお、実施例１の無添加区の各遺伝子の発現量を１としてΔｈｒｃＡ株の各遺伝子の発現量を算出した。
（２）試験結果
結果を図５に示した。ΔｈｒｃＡ株のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量
は１６倍以上であり、発現量が著しく高いことがわかった。なお結果は示さなかったが、ｂｓｈ、ｃｆａなど実施例１に示したｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ以外の遺伝子については、野生株とΔｈｒｃＡ株との間で発現量の違いはみられなかった。
[Example 5] Test for confirming change in expression level of molecular chaperone gene in hrcA gene disruption strain HrcA protein is known as an expression inhibitor of molecular chaperone genes dnaK, groEL, and groES. Therefore, expression of molecular chaperone genes dnaK, groEL, and groES of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) hrcA gene disruption strain (hereinafter referred to as “ΔhrcA strain”) obtained according to the method of Example 18 of Japanese Patent No. 4473570. The amount was examined.
(1) Test Method Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) ΔhrcA strain cells subcultured in MRS medium were collected by centrifugation, and the expression levels of dnaK, groEL, and groES genes were examined. The gene expression level was determined in Example 1. (1). It was carried out according to the method of ii). In addition, the expression level of each gene of the ΔhrcA strain was calculated by setting the expression level of each gene in the additive-free section of Example 1 to 1.
(2) Test results The results are shown in FIG. The relative expression levels of dnaK, groEL, and groES of the ΔhrcA strain were 16 times or more, indicating that the expression levels were remarkably high. Although the results were not shown, there was no difference in the expression level between the wild strain and the ΔhrcA strain for genes other than dnaK, groEL, and groES shown in Example 1, such as bsh and cfa.
［実施例６］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５およびラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃＡ株の酸化ストレス（Ｈ2Ｏ2）に対する耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例２の方法に従って実施した。Ｈ2Ｏ2無添加（０ｐｐｍ）、または１００ｐｐｍに調整したＭＲＳ培地（ｐＨ６．０）でラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３、変異株と区別するために「野生株」という。）またはラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５ΔｈｒｃＡ株をそれぞれ懸濁して１０℃で２４時間保存し、
生残性を算出した。
（２）実施結果
結果を図６に示した。Ｈ2Ｏ2無添加では、両株とも生残性の低下は認められなかったが、Ｈ2Ｏ2１００ｐｐｍに保存した場合、野生株は２時間で１０,０００分の１以下まで生残性が低下した。一方、ΔｈｒｃＡ株の生残性は１００分の１以下であり、高い生残
性を示した。
以上の結果より、ｈｒｃＡ遺伝子を破壊することにより、ｄｎａＫ遺伝子等の発現が高まり、酸化ストレス耐性が向上することが確認できた。またΔｈｒｃＡ株では実施例５で
示したようにｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳ遺伝子の発現量が特異的に増加している。ΔｈｒｃＡ株で野生株に比べて酸化ストレス耐性が向上したことから、実施例１に示し
たｂｓｈ等の遺伝子は本発明でいう酸化ストレス耐性の向上に関与しないと言える。
[Example 6] Oxidative stress tolerance test The resistance of Lactobacillus gasseri SBT2055 and Lactobacillus gasseri SBT2055ΔhrcA strains to oxidative stress (H 2 O 2 ) was confirmed.
(1) Method of Implementation The method was performed according to the method of Example 2. Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953, referred to as “wild strain” to distinguish it from mutant strains) or lactate in MRS medium (pH 6.0) without H 2 O 2 (0 ppm) or adjusted to 100 ppm. Bacillus gasseri strain SBT2055ΔhrcA was suspended and stored at 10 ° C. for 24 hours,
Survival was calculated.
(2) Implementation results The results are shown in FIG. When H 2 O 2 was not added, the viability of both strains was not decreased, but when stored at 100 ppm of H 2 O 2 , the wild strains survived to 1 / 10,000 or less in 2 hours. Decreased. On the other hand, the survival of the ΔhrcA strain was 1/100 or less, indicating a high survival.
From the above results, it was confirmed that by disrupting the hrcA gene, the expression of dnaK gene and the like was increased, and the resistance to oxidative stress was improved. In the ΔhrcA strain, as shown in Example 5, the expression levels of dnaK, groEL, and groES genes are specifically increased. Since the ΔhrcA strain has improved oxidative stress resistance compared to the wild strain, it can be said that the genes such as bsh shown in Example 1 are not involved in the improvement of oxidative stress resistance in the present invention.
［実施例７］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２５）、ＳＢＴ１７０３（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８５）、ＳＢＴ０２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３９）の酸化ストレス耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例１．（１）、i）の方法に従って遺伝子の転写量を増加させる処理（５０ｐｐｍ
Ｈ2Ｏ2処理）を行い、処理菌体を実施例２の方法に従って１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2に保存し、酸化ストレス耐性を調べた。
（２）実施結果
各菌株のＨ2Ｏ2１００ｐｐｍ中での生残性を図７に示した。ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５、ＳＢＴ１７０３、ＳＢＴ０２７４の３株とも、Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍで処理を行った場合に生残性の向上が確認できた。なお、結果は示さなかったが、前記３株のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量も２倍以上に増加していた。
[Example 7] Oxidative stress tolerance test Lactobacillus gasseri SBT1265 (FERM P-14825), SBT1703 (FERM P-17785), and SBT0274 (FERM BP-11039) were confirmed to be resistant to oxidative stress.
(1) Method of Implementation Example 1 (1) A treatment for increasing the amount of gene transcription according to the method of i) (50 ppm)
H 2 O 2 treatment) was performed, and the treated cells were stored in 100 ppm of H 2 O 2 according to the method of Example 2 to examine resistance to oxidative stress.
(2) Implementation results FIG. 7 shows the survival of each strain in 100 ppm of H 2 O 2 . Lactobacillus gasseri SBT1265, SBT1703, and SBT0274 were all confirmed to have improved survival when treated with 50 ppm of H 2 O 2 . Although the results were not shown, the relative expression levels of the three strains of dnaK, groEL, and groES increased more than twice.
［実施例８］
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５について、Ｈ2Ｏ2０ｐｐｍまたは５０ｐｐｍで処理した菌を含む発酵乳を調製し、保存時のガセリ菌の生残性を調べた。
（１）発酵乳の調製
脱脂粉乳とショ糖を水に溶解し、９%(w/w)還元脱脂乳、８％(w/w)ショ糖を含む培地を調製し、当該培地を９５℃で１０分間殺菌した。前記殺菌培地にLb. delbrueckii.subsp bulgaricus およびStreptococcus thermophilusを含むスターターを接種して、４１℃でｐH４．５まで発酵させて、発酵乳を調製した。
（２）発酵乳へのガセリ菌添加と保存
MRSで培養したラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を実施例１、（１）、i）の方法
に従ってＨ2Ｏ2濃度０ｐｐｍ、または５０ｐｐｍのMRS培地中で、３７℃で３０分間処理し、菌体を回収した。回収した菌体を１１５℃、２０分間滅菌した９％脱脂乳で懸濁してガセリ菌液とした。このガセリ菌液を、（１）で調製した発酵乳に添加、混合して１０℃で保存した。調製直後と１４日後、２８日後の生菌数を測定し、保存後（１４、２８日）のサンプルの生菌数（Ｎ1）を調製直後のサンプルの生菌数（Ｎ0）で除してその常用対数の値を生残性（生残率）とした（下記式）。
生残性（生残率）＝ｌｏｇ10（Ｎ1／Ｎ0）
（３）実施結果
保存後のガセリ菌の生残性を図８に示した。Ｈ2Ｏ2５０ｐｐｍで処理した場合、生残性はほとんど低下せず、保存２８日目では、Ｈ2Ｏ2で処理をしなかった（０ｐｐｍ）場合に比べて１０倍以上の高い生残性を示した。
以上より、本発明の微生物を用いることにより、乳製品等の飲食品中での生残性を向上させることができることが明らかである。
[Example 8]
For Lactobacillus gasseri SBT2055, fermented milk containing bacteria treated with 0 ppm or 50 ppm of H 2 O 2 was prepared, and the survival of gasseri bacteria during storage was examined.
(1) Preparation of fermented milk Skim milk powder and sucrose are dissolved in water to prepare a medium containing 9% (w / w) reduced skim milk and 8% (w / w) sucrose. For 10 minutes. The sterilized medium was inoculated with a starter containing Lb. delbrueckii. Subsp bulgaricus and Streptococcus thermophilus and fermented to pH 4.5 at 41 ° C. to prepare fermented milk.
(2) Addition and storage of gasseri bacteria to fermented milk
Lactobacillus gasseri SBT2055 cultured in MRS was treated for 30 minutes at 37 ° C. in an MRS medium with an H 2 O 2 concentration of 0 ppm or 50 ppm according to the method of Example 1, (1), i), and the cells were collected. did. The collected cells were suspended in 9% skim milk sterilized at 115 ° C. for 20 minutes to obtain a gasseri bacterial solution. This gasseri bacterial solution was added to the fermented milk prepared in (1), mixed and stored at 10 ° C. Immediately after preparation, 14 days, and 28 days, the number of viable bacteria is measured, and after storage (14, 28 days), the number of viable bacteria (N 1 ) is divided by the number of viable bacteria (N 0 ) of the sample immediately after preparation. The value of the common logarithm was defined as survival (survival rate) (the following formula).
Survival (survival rate) = log 10 (N 1 / N 0 )
(3) Implementation results Fig. 8 shows the survival of the gasseri after storage. When treated with 50 ppm of H 2 O 2 , the viability was hardly reduced, and on the 28th day of storage, the survival was 10 times higher than when no treatment was performed with H 2 O 2 (0 ppm). showed that.
From the above, it is clear that the survival in food and drink such as dairy products can be improved by using the microorganism of the present invention.
［実施例９］酸化ストレス耐性試験
ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０７５）の酸化ストレス耐性を確認した。
（１）実施方法
実施例１、（１）、i）の方法に従って、遺伝子の転写量を増加させる処理（２５ｐｐｍ
Ｈ2Ｏ2処理）を行い。処理菌体を実施例２の方法により１００ｐｐｍのＨ2Ｏ2に保存し、酸化ストレス耐性を調べた。
（２）実施結果
各菌株のＨ2Ｏ2１００ｐｐｍ中での生残性を図９に示した。ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２をＨ2Ｏ2２５ｐｐｍで処理を行った場合に生残性の向上が確認できた。なお、結果は示さなかったが、ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの相対発現量は２倍以上に増加していた。
[Example 9] Oxidative stress tolerance test The oxidative stress tolerance of Lactobacillus acidophilus SBT2062 (FERM BP-11075) was confirmed.
(1) Implementation method Treatment for increasing the amount of gene transcription (25 ppm) according to the method of Example 1, (1), i)
H 2 O 2 treatment). The treated cells were stored in 100 ppm of H 2 O 2 by the method of Example 2 and examined for oxidative stress resistance.
(2) Implementation results The survival of each strain in 100 ppm of H 2 O 2 is shown in FIG. When Lactobacillus acidophilus SBT2062 was treated with 25 ppm of H 2 O 2, it was confirmed that the survival was improved. Although the results were not shown, the relative expression levels of dnaK, groEL, and groES of Lactobacillus acidophilus SBT2062 increased more than twice.
本発明によれば、乳酸菌の分子シャペロン遺伝子の発現を高めることにより、酸化ストレスがかかる環境下でも生残性が高い乳酸菌を製造することができる。したがって、このようにして得られる乳酸菌を酸化ストレスにさらされることの多い発酵乳等の食品に使用すれば、保存後においても乳酸菌の生残性の高い食品を提供することが可能となる。 According to the present invention, by increasing the expression of the molecular chaperone gene of a lactic acid bacterium, it is possible to produce a lactic acid bacterium having high survival even in an environment where oxidative stress is applied. Therefore, if the lactic acid bacteria obtained in this way are used for foods such as fermented milk that are often exposed to oxidative stress, it is possible to provide foods with high survival of lactic acid bacteria even after storage.
[寄託生物材料への言及]
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３
[Reference to deposited biological materials]
Lactobacillus gasseri SBT2055
The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566)
Date of deposit of biological materials at the depository in Loi March 27, 1996 Deposit number FERM BP-10953 assigned to the deposit by the depository in the high
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１２６５
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成７年３月１４日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２５
Lactobacillus gasseri SBT1265
The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566)
Date of deposit of biological material at the depository of Loi March 14, 1995 Deposit number FERM P-14825 attached by the depository of hi
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ１７０３
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８５
Lactobacillus gasseri SBT1703
The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566)
Date of deposit of biological materials at the depository in Loi March 15, 2000 Deposit number FERM P-17785 attached by the depository in the high on the deposit
ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ０２７４
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３９
Lactobacillus gasseri SBT0274
The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566)
Date of deposit of biological materials at the depository in Loi March 15, 2000 Deposit number FERM BP-11039 attached to the depository by the depository in Hai
ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ２０６２
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１年５月１８日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０７５
Lactobacillus acidophilus SBT2062
The name and address of the depository that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1-chome, East 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 6 (zip code 305-8566)
Date of deposit of biological material at the depository in Loi May 18, 2001 Deposit number FERM BP-11075 attached by the depository in the high on deposit
Claims (4)
（１）乳酸菌を４２℃以上で処理する工程
（２）乳酸菌を過酸化水素１０ｐｐｍ〜５０ｐｐｍで処理する工程 A lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus gasseri or Lactobacillus acidophilus is treated with the following (1) or (2) to produce a lactic acid bacterium having higher expression of dnaK, groEL and groES than those without any treatment. Method.
(1) Process of treating lactic acid bacteria at 42 ° C. or higher (2) Process of treating lactic acid bacteria with hydrogen peroxide 10 ppm to 50 ppm
（１）乳酸菌に酸化耐性処理として、熱処理または過酸化水素処理を行う工程
（２）前記酸化耐性処理を施した乳酸菌のｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ及びｇｒｏＥＳの発現を測定する工程
（３）前記ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ及びｇｒｏＥＳの発現が、いずれも無処理のものに比べて高い乳酸菌を選択する工程 A method for screening lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus gasseri or Lactobacillus acidophilus having enhanced oxidation resistance, the method comprising the following steps (1) to (3):
(1) A step of performing heat treatment or hydrogen peroxide treatment as an oxidation resistance treatment on lactic acid bacteria (2) A step of measuring expression of dnaK, groEL and groES of lactic acid bacteria subjected to the oxidation resistance treatment (3) The dnaK, groEL and The process of selecting lactic acid bacteria whose groES expression is higher than that of the untreated one
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