JP6210998B2 - Infectious disease prevention method by combined use of vector vaccine and live vaccine - Google Patents
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Description
本願発明は、ベクターワクチン及び生ワクチンの併用による感染症の予防方法に関する。詳細には、感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルスからなるベクターワクチンと該感染因子の弱毒化生ワクチンを併用することを特徴とする、ヒト以外の感染症の予防方法、並びに該ベクターワクチン及び該弱毒化生ワクチンを有効成分とするワクチンに関する。 The present invention relates to a method for preventing infection by the combined use of a vector vaccine and a live vaccine. Specifically, a method for preventing non-human infectious diseases, characterized by using a vector vaccine comprising a recombinant vector virus in which an infection protective antigen derived from an infectious agent is incorporated, and a live attenuated vaccine of the infectious agent, And a vaccine comprising the vector vaccine and the live attenuated vaccine as active ingredients.
ワクチンの有効性向上及びワクチネーションの省力化を達成する手段として、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、等をベクターとしたウイルスベクターワクチンの研究が盛んに行われている。しかしながら、これらのウイルスベクターワクチンは、単独では十分な免疫効果を与えず、ワクチンの追加投与を必要とするケースがある。特に早期の免疫応答が必要な場合や、血清型の多い感染症に対しては、ウイルスベクター単独で十分なワクチン効果を示すことは容易ではなく、生ワクチンの追加接種が必要とされることが多い。 Viral vector vaccines using vaccinia viruses, herpesviruses, adenoviruses, etc. as vectors have been actively studied as means for achieving improved vaccine efficacy and labor saving. However, these viral vector vaccines alone do not give a sufficient immune effect and may require additional administration of the vaccine. In particular, when an early immune response is required or for infections with many serotypes, it is not easy to obtain a sufficient vaccine effect with a virus vector alone, and additional live vaccines may be required. Many.
例えば、ヒト用ワクチンにおいて一例をあげると、ワクチニアウイルスベクターで結核菌の防御抗原を発現するウイルスベクターは単独では十分な有効性を示さないため、従来のBCG（ウシ型結核菌）生ワクチンによるプライミングを必要とする（非特許文献１）。 For example, in the case of a human vaccine, a virus vector that expresses the protective antigen of Mycobacterium tuberculosis with a vaccinia virus vector does not show sufficient efficacy by itself, so it is based on a conventional live BCG (Bovine tuberculosis) live vaccine. Priming is required (Non-patent Document 1).
鶏のワクチンでは、マレック病ウイルス1型（MDV1）あるいは七面鳥ヘルペスウイルス（HVT）ベクターでニューカッスル病（ND）や伝染性ファブリキウス嚢病（IBD）の防御抗原を発現する組換えウイルス（特許文献１、非特許文献２）がワクチンとして実用化されている。こちらの場合、単独でも十分な有効性を発揮するが、免疫の立ち上がりに時間を要する。
In chicken vaccines, recombinant viruses that express protective antigens against Newcastle disease (ND) and infectious bursal disease (IBD) using Marek's disease virus type 1 (MDV1) or turkey herpesvirus (HVT) vectors (
一方、鶏の伝染性気管支炎（IB）の場合、複数の血清型が存在するため、複数の生ワクチン株を投与していく必要がある（非特許文献３）。 On the other hand, in the case of chicken infectious bronchitis (IB), since multiple serotypes exist, it is necessary to administer multiple live vaccine strains (Non-patent Document 3).
ウイルスベクターの開発により、従来よりも省力的なワクチネーションプログラムの設定が可能とはなったが、現状では依然として改善の余地が残されている状況にある。 Although the development of virus vectors has made it possible to set a labor-saving vaccination program than before, there is still room for improvement at present.
本願発明の目的は、動物に感染症を引き起こす感染因子由来の感染防御抗原をベクターウイルスゲノムに組み込んで得られる組換えベクターウイルス（以下、「ベクターワクチン」と称することもある）、該感染因子を弱毒化して得られるワクチン（以下、「生ワクチン」と称することもある）及びこれらのワクチンの併用によるヒト以外の感染症の予防方法、並びに該ベクターワクチン及び該生ワクチンを有効成分とするワクチンを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a recombinant vector virus (hereinafter sometimes referred to as “vector vaccine”) obtained by integrating an infection protective antigen derived from an infectious agent that causes an infectious disease in a vector virus genome, A vaccine obtained by attenuation (hereinafter also referred to as “live vaccine”), a method for preventing infectious diseases other than humans by using these vaccines in combination, and a vaccine comprising the vector vaccine and the live vaccine as an active ingredient It is to provide.
本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ウイルスベクターワクチンと生ワクチンを同時にあるいは混合して投与することで、ベクターワクチンによる抗体の立ち上がりを改善し、追加投与を必要としないワクチンあるいはワクチネーションプログラムを開発するに至った。また、複数の血清型を有する感染症に対しては、ベクターワクチンで一つの血清型に対する抗体を惹起し、さらに別の血清型を投与することで必要とされる複数の血清型に対する抗体を惹起し、より省力的なワクチネーションプログラムを確立するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the inventors of the present application have improved the rise of the antibody by the vector vaccine by administering the viral vector vaccine and the live vaccine simultaneously or in combination, and additional administration Has led to the development of vaccines or vaccination programs that do not require any. For infectious diseases with multiple serotypes, antibodies against one serotype are raised by vector vaccine, and antibodies against multiple serotypes required by administering another serotype are raised. As a result, a labor-saving vaccination program was established.
鶏感染症に対するワクチンを例にあげてその効果を以下に示す。すなわち、ニューカッスル病ウイルス（NDV）の感染防御抗原の一つであるFタンパク質が挿入された組換えマレック病ウイルス（ベクターワクチン）とニューカッスル病（ND）の生ワクチンの混合物を市販鶏の雛に１回投与することにより、該鶏体内に早期にNDVに対する感染防御抗体が上昇すること、且つ該抗体の力価が長期にわたり高く維持されることを発見した。また鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）の感染防御抗原の一つであるS1タンパク質が挿入された組換えマレック病ウイルス（ベクターワクチン）を鶏雛に投与後、鶏伝染性気管支炎（IB）の生ワクチンを１回追加投与することにより、ベクターワクチン及び生ワクチン株とは異なる血清型の株を含む複数のIBVに対する感染防御抗体の上昇を認めることに加え、抗体価が長期に亘って維持されることを見出し、本願発明を完成するに至った。 Taking the vaccine against chicken infection as an example, the effect is shown below. That is, a mixture of a recombinant Marek's disease virus (vector vaccine) into which an F protein, which is one of the protective antigens of Newcastle disease virus (NDV), is inserted and a live vaccine of Newcastle disease (ND) is added to a commercial chicken chick. It has been discovered that the anti-NDV antibody against NDV can be raised early in the chicken and that the titer of the antibody can be maintained at a high level for a long period of time. In addition, after the administration of recombinant Marek's disease virus (vector vaccine) with S1 protein, one of the protective antigens of chicken infectious bronchitis virus (IBV), to chicken chicks, chicken infectious bronchitis (IB) By adding a single live vaccine, the antibody titer is maintained over a long period of time, in addition to the increase in anti-infection antibodies against multiple IBV, including serotype strains different from vector vaccines and live vaccine strains. As a result, the present invention has been completed.
本願発明のベクターワクチン及び生ワクチン、並びにこれらのワクチンの併用による投与方法は、動物の感染症の予防に有効に利用され得るものである。したがって、本願発明は、以下の通りである。
〔１〕感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することを特徴とする、ヒト以外の感染症の予防方法。
〔２〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、〔１〕に記載の予防方法。
〔３〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、〔１〕に記載の予防方法。
〔４〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンを混合して投与することを特徴とする、〔３〕に記載の予防方法。
〔５〕前記ベクターワクチンを投与した後に、前記生ワクチンを投与することを特徴とする、〔３〕に記載の予防方法。
〔６〕前記生ワクチンを、ベクターワクチン投与後、1-200日の間に投与することを特徴とする、〔５〕に記載の予防方法。
〔７〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、〔２〕又は〔４〕に記載の予防方法。
〔８〕前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、〔１〕ないし〔７〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔９〕前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、〔１〕ないし〔７〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔１０〕前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、〔１〕ないし〔９〕のいずれか一項に記載の予防方法。
〔１１〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、〔１０〕に記載の予防方法。
〔１２〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、〔１０〕に記載の予防方法。
〔１３〕感染因子の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を有効成分とすることを特徴とする、ワクチン。
〔１４〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、混合された一つのワクチンである、〔１３〕に記載のワクチン。
〔１５〕前記ベクターワクチンと前記生ワクチンの混合比が、１：1-10である、〔１４〕に記載のワクチン。
〔１６〕前記ベクターワクチン及び前記生ワクチンが、独立した二つのワクチンである、〔１３〕に記載のワクチン。
〔１７〕前記ベクターウイルスが、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスからなる群より選ばれる、〔１３〕ないし〔１６〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔１８〕前記ベクターウイルスが、マレック病ウイルスである、〔１３〕ないし〔１６〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔１９〕前記感染因子が、鶏に感染する因子（鶏感染因子）である、〔１３〕ないし〔１８〕のいずれか一項に記載のワクチン。
〔２０〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質又はHNタンパク質、鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質、マレック病ウイルスのgBタンパク質、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのVP2タンパク質、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルスのgBタンパク質、七面鳥鼻気管炎ウイルスのFタンパク質、トリ白血病ウイルスのEnvタンパク質、細網内皮症ウイルスのEnvタンパク質、鶏貧血ウイルスのVP1+VP2タンパク質、トリインフルエンザウイルスのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、及びロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質からなる群より選ばれる、〔１９〕に記載のワクチン。
〔２１〕前記鶏感染因子の感染防御抗原が、ニューカッスル病ウイルスのFタンパク質若しくはHNタンパク質、又は鶏伝染性気管支炎由来のS1タンパク質である、〔１９〕に記載のワクチン。The vector vaccine and live vaccine of the present invention and the administration method using these vaccines in combination can be effectively used for the prevention of infectious diseases in animals. Therefore, the present invention is as follows.
[1] A method for preventing infectious diseases other than humans, which comprises using a recombinant vector virus (vector vaccine) incorporating an infection protective antigen of an infectious agent and the attenuated infectious agent (live vaccine).
[2] The preventive method according to [1], wherein the vector vaccine and the live vaccine are mixed vaccines.
[3] The prevention method according to [1], wherein the vector vaccine and the live vaccine are two independent vaccines.
[4] The preventive method according to [3], wherein the vector vaccine and the live vaccine are mixed and administered.
[5] The prevention method according to [3], wherein the live vaccine is administered after the vector vaccine is administered.
[6] The preventive method according to [5], wherein the live vaccine is administered for 1 to 200 days after administration of the vector vaccine.
[7] The prevention method according to [2] or [4], wherein the mixing ratio of the vector vaccine and the live vaccine is 1: 1-10.
[8] The prevention method according to any one of [1] to [7], wherein the vector virus is selected from the group consisting of herpes virus, paramyxovirus, rhabdovirus, poxvirus, and adenovirus.
[9] The prevention method according to any one of [1] to [7], wherein the vector virus is Marek's disease virus.
[10] The prevention method according to any one of [1] to [9], wherein the infectious agent is a factor that infects chickens (chicken infectious agent).
[11] The protective antigen of the chicken infectious agent is Newcastle disease virus F protein or HN protein, chicken infectious bronchitis-derived S1 protein, Marek's disease virus gB protein, chicken infectious bursal disease virus VP2 protein , Chicken infectious laryngotracheitis virus gB protein, turkey rhinotracheitis virus F protein, avian leukemia virus Env protein, reticuloendotheliosis virus Env protein, chicken anemia virus VP1 + VP2 protein, avian influenza virus The prophylactic method according to [10], which is selected from the group consisting of HA protein, p29 protein of Mycoplasma gallisepticum, and MSA1 protein of Leucochitozone Cowleri.
[12] The prevention method according to [10], wherein the infection protective antigen of the chicken infectious agent is Fcastle protein or HN protein of Newcastle disease virus, or S1 protein derived from chicken infectious bronchitis.
[13] A vaccine comprising as an active ingredient a recombinant vector virus (vector vaccine) incorporating an infection protective antigen of an infectious agent and the attenuated infectious agent (live vaccine).
[14] The vaccine according to [13], wherein the vector vaccine and the live vaccine are mixed vaccines.
[15] The vaccine of [14], wherein the mixing ratio of the vector vaccine and the live vaccine is 1: 1-10.
[16] The vaccine according to [13], wherein the vector vaccine and the live vaccine are two independent vaccines.
[17] The vaccine according to any one of [13] to [16], wherein the vector virus is selected from the group consisting of herpes virus, paramyxovirus, rhabdovirus, poxvirus, and adenovirus.
[18] The vaccine according to any one of [13] to [16], wherein the vector virus is Marek's disease virus.
[19] The vaccine according to any one of [13] to [18], wherein the infectious agent is a factor that infects chickens (chicken infectious agent).
[20] Infection protective antigen of the chicken infectious agent is Newcastle disease virus F protein or HN protein, chicken infectious bronchitis-derived S1 protein, Marek's disease virus gB protein, chicken infectious bursal disease virus VP2 protein , Chicken infectious laryngotracheitis virus gB protein, turkey rhinotracheitis virus F protein, avian leukemia virus Env protein, reticuloendotheliosis virus Env protein, chicken anemia virus VP1 + VP2 protein, avian influenza virus The vaccine according to [19], which is selected from the group consisting of HA protein, Mycoplasma gallisepticum p29 protein, and Leucochitozone Cowleri MSA1 protein.
[21] The vaccine according to [19], wherein the protective antigen of the chicken infectious agent is Newcastle disease virus F protein or HN protein, or S1 protein derived from chicken infectious bronchitis.
本願発明に従えば、感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）及び弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することからなる、ヒト以外の感染症の予防方法、及び動物感染症の予防に用いるワクチンが提供される。 According to the present invention, prevention of infectious diseases other than humans comprising the combined use of a recombinant vector virus (vector vaccine) incorporating an infection protective antigen derived from an infectious agent and the attenuated infectious agent (live vaccine) Methods and vaccines for use in preventing animal infections are provided.
例えば、鶏のNDV感染症（ND）に対するベクターワクチンと生ワクチンの混合物を鶏雛（又は鶏卵）に１回投与することにより、ベクターワクチンを単独投与したときよりも早期にNDVに対する中和抗体が誘導され、且つ該中和抗体は、高い力価で長期間維持される。したがって、本願発明の方法は、移行抗体が低下する期間のNDV感染の阻止に有用である。 For example, by administering a mixture of a vector vaccine and a live vaccine against chicken NDV infection (ND) to chicken chicks (or eggs) once, neutralizing antibodies against NDV can be obtained earlier than when a vector vaccine is administered alone. The induced and neutralizing antibodies are maintained for a long time at high titers. Therefore, the method of the present invention is useful for preventing NDV infection during the period when the transferred antibody decreases.
また、例えば、鶏のIBV感染症（IB）に対するベクターワクチンを鶏雛に皮下接種又は鶏卵へ接種し、その後、IBVの生ワクチンを1回点眼することにより、ワクチン株に対する感染防御抗体が早期に惹起され、長期に亘り維持されるだけでなく、該感染防御抗体は、血清型の異なる種々のウイルス株に対しても効力を有する。 In addition, for example, by inoculating a chicken chick with a vector vaccine against chicken IBV infection (IB) subcutaneously or inoculating chicken eggs, and then instilling a live vaccine of IBV once, the protective antibody against the vaccine strain can be rapidly introduced. In addition to being raised and maintained for a long time, the protective antibody is also effective against various virus strains of different serotypes.
更に、マレック病ウイルスに対する抗体が惹起され二価ワクチンとしての効果を併せ持つので、ワクチン接種の回数を減らすなど、種々の鶏感染症に対する効率的なワクチン投与プログラムを策定することができる。 Furthermore, since an antibody against Marek's disease virus is induced and has an effect as a bivalent vaccine, it is possible to formulate an efficient vaccine administration program for various chicken infections such as reducing the number of vaccinations.
本願発明は、感染症を予防するための方法及びワクチンを提供するものであり、動物に感染症を引き起こすウイルスや微生物等の感染因子由来の感染防御抗原をベクターウイルスに組み込んで得られる組換ベクターウイルス（ベクターワクチン）と、弱毒化した該感染因子（生ワクチン）を併用することに特徴がある。 The present invention provides a method and vaccine for preventing infectious diseases, and is a recombinant vector obtained by incorporating an infection protective antigen derived from an infectious agent such as a virus or microorganism causing an infectious disease in an animal into a vector virus. It is characterized by the combined use of a virus (vector vaccine) and the attenuated infectious agent (live vaccine).
本願発明における「併用」とは、該ベクターワクチン及び該生ワクチンを混合した一つのワクチンを投与する場合及び該ベクターワクチン及び該生ワクチンの独立した二つのワクチンを、該感染症予防のためのワクチネーションプログラムにおいて同時期又は異なる時期に投与する場合を意味する。 The term “combination” in the present invention refers to a case where one vaccine mixed with the vector vaccine and the live vaccine is administered, and two independent vaccines of the vector vaccine and the live vaccine are used to prevent infection. It means the case of administration at the same time or different time in the Nation program.
本願発明を構成するベクターワクチン及び生ワクチンは、以下の方法により取得できる。なお、以下、鶏感染症に対するワクチンを一例として説明するが、鶏感染症に何ら限定されるものではない。 The vector vaccine and the live vaccine constituting the present invention can be obtained by the following method. Hereinafter, a vaccine against chicken infection will be described as an example, but the vaccine is not limited to chicken infection.
（１）生ワクチンの調製
本願発明の生ワクチンには、鶏に対して毒性や副作用の弱い、弱毒化鶏感染因子（鶏感染症を引き起こす感染因子）が用いられる。鶏感染因子は、該鶏感染因子が感染した鶏から単離し、これを発育鶏卵、鶏初代細胞（例えば、CEF、腎細胞）、株化細胞（LMH、DT40）等に接種・培養して増殖させることにより得られる。発育鶏卵を用いる場合は、鶏感染因子を８-12日齢発育鶏卵に接種した後、34-37℃、２-４日間の培養が行われる。(1) Preparation of Live Vaccine The live vaccine of the present invention uses an attenuated chicken infectious factor (an infectious agent causing chicken infection) that has low toxicity and side effects on chickens. Chicken infectious agents are isolated from chickens infected with the chicken infectious agents, and are inoculated and cultured in growing chicken eggs, chicken primary cells (eg, CEF, kidney cells), cell lines (LMH, DT40), etc. Is obtained. In the case of using a growing chicken egg, the chicken infectious agent is inoculated into an 8-12 day-old growing egg and then cultured at 34-37 ° C. for 2-4 days.
細胞を用いる場合は、鶏感染因子を106-108の細胞に接種し、該鶏感染因子接種細胞の培養が行われる。細胞培養に用いる培地は、市販のM199-earle base（日水）、イーグルMEM（E-MEM）（日水）、ダルベッコMEM（D-MEM）（日水）、SC-UCM102（日水）、UP-SFM（GIBCO BRL）、EX-CELL302（ニチレイ）、EX-CELL293-S（ニチレイ）、TFBM-01（ニチレイ）、ASF104（味の素）等から選択される。必要に応じて、該培地に血清、アミノ酸、塩類、ビタミン、抗カビ・抗菌剤等が添加される。培養条件は、通常の細胞培養条件（培養温度30-37℃、培養期間２-５日間、pH6-8）と同じである。When cells are used, 10 6 -10 8 cells of the chicken infectious agent are inoculated, and the cells inoculated with the chicken infectious agent are cultured. Medium used for cell culture is commercially available M199-earle base (Nissui), Eagle MEM (E-MEM) (Nissui), Dulbecco MEM (D-MEM) (Nissui), SC-UCM102 (Nissui), It is selected from UP-SFM (GIBCO BRL), EX-CELL302 (Nichirei), EX-CELL293-S (Nichirei), TFBM-01 (Nichirei), ASF104 (Ajinomoto) and the like. If necessary, serum, amino acids, salts, vitamins, antifungal / antibacterial agents and the like are added to the medium. The culture conditions are the same as normal cell culture conditions (culture temperature 30-37 ° C., culture period 2-5 days, pH 6-8).
上記の方法により得られる鶏感染因子として、例えば、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、マレック病ウイルス（MDV）、鶏伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV）、鶏伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（TRTV）、トリ白血病ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（REV）、鶏貧血ウイルス（CAV）、トリインフルエンザウイルス（AIV）、トリレオウイルス（ARV）、 鳩痘ウイルス（PPV）、鶏痘ウイルス（FPV）、七面鳥ヘルぺスウイルス（HVT）、EDS-76ウイルス（EDS）、鶏脳脊髄炎ウイルス（AEV）、EDS-76ウイルス（EDS）、サルモネラ・プローラム（SP）、サルモネラ・エンテリティーディス（SE）、アビバクテリウム・パラガリナルム（H.pg）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mg）,マイコプラズマ・シノビエ（MS）、アイメリア属原虫、ロイコチトゾーン・カウレリー等が挙げられる。但し、鶏感染因子は、これらの例示に限定されるものではない。 Examples of chicken infectious agents obtained by the above method include Newcastle disease virus (NDV), chicken infectious bronchitis virus (IBV), Marek's disease virus (MDV), chicken infectious bursal disease virus (IBDV), and chicken infection Laryngotracheitis virus (ILTV), turkey rhinotracheitis virus (TRTV), avian leukemia virus (ALV), reticuloendotheliosis virus (REV), chicken anemia virus (CAV), avian influenza virus (AIV), avian leo Virus (ARV), Pigeonpox virus (PPV), Fowlpox virus (FPV), Turkey herpesvirus (HVT), EDS-76 virus (EDS), Chicken encephalomyelitis virus (AEV), EDS-76 virus ( EDS), Salmonella prolam (SP), Salmonella enteritidis (SE), Abibacterium paragalinalum (H.pg), Mycoplasma gallicepticum (Mg), Ma Kopurazuma-Shinobie (MS), Eimeria protozoa, Leucocytozoonosis-Kaureri, and the like. However, chicken infection factors are not limited to these examples.
上記の鶏感染因子を弱毒化して得られる弱毒化鶏感染因子の作出には、鶏感染因子接種細胞の継代を繰り返す方法、あるいは毒性を示すタンパク質をコードする遺伝子を変異又は除去する方法が取られる。細胞継代は、上記の細胞培養と同じ方法、条件が用いられるが、培養温度は、30-37℃の低温で行う場合が多い。感染因子の弱毒化の判定は、鶏への感染力、病気の減弱等により行うが、このとき感染因子の増殖における温度依存性、増殖力、制限酵素切断パターンやゲノムの塩基配列等のマーカーが指標にされる。病原性を担う遺伝子が明らかにされている場合は、後述の遺伝子組み換え技術により該遺伝子の変異や除去が行われる。 In order to produce an attenuated chicken infectious agent obtained by attenuating the above chicken infectious agent, a method of repeating passage of the chicken infectious agent-inoculated cells or a method of mutating or removing a gene encoding a protein showing toxicity is used. It is done. Cell passage is performed using the same method and conditions as the above cell culture, but the culture temperature is often low at 30-37 ° C. Attenuation of infectious agents is determined based on the infectivity of chickens, attenuation of diseases, etc. At this time, markers such as temperature dependency, proliferative power, restriction enzyme cleavage pattern and genome base sequence in the growth of infectious agents are included. Be an indicator. When a gene responsible for pathogenicity is clarified, the gene is mutated or removed by a genetic recombination technique described later.
こうして病原性を減弱化した鶏感染因子や分離段階で弱毒化されているような鶏感染因子、病原性に関与する遺伝子を除去した鶏感染因子が生ワクチンの有効成分として用いられる。 Thus, chicken infectious agents whose pathogenicity has been attenuated, chicken infectious factors that have been attenuated at the isolation stage, and chicken infectious agents from which genes involved in pathogenicity have been removed are used as active ingredients of live vaccines.
作出された弱毒化鶏感染因子は以下の方法により製剤化・保存される。上記と同様の方法に従って弱毒化鶏感染因子を増殖・培養した後、培養物を破砕し、種々の遠心分離（粗遠心、超遠心）やろ過等を繰り返すことにより、細胞やその破砕物からの分離・回収操作が行われる。得られた弱毒化鶏感染因子は、その有効性を維持するために安定剤（例えば、乳糖）や緩衝剤を加え、凍結、あるいは真空下で凍結乾燥して製剤化・保存される。細胞依存性の強い弱毒化鶏感染因子（例えば、マレック病ウイルス）は、培養細胞で増殖後、その感染細胞をアンプルに封入し、細胞の生存性を保持した状態で凍結した製剤として保存される。 The produced attenuated chicken infectious agent is formulated and stored by the following method. After growing and cultivating the attenuated chicken infectious agent according to the same method as above, the culture is disrupted, and various centrifuges (coarse centrifugation, ultracentrifugation), filtration, etc. are repeated to remove cells from the disrupted product. Separation and recovery operations are performed. The obtained attenuated chicken infectious agent is formulated and stored by adding a stabilizer (for example, lactose) or a buffer and maintaining the effectiveness by freezing or lyophilizing under vacuum. Strongly cell-dependent attenuated chicken infectious agents (for example, Marek's disease virus) are stored in a frozen preparation with the infected cells sealed in ampoules after growth in cultured cells. .
（２）ベクターワクチンの調製
本願発明のベクターワクチンには、ベクターウイルスに鶏感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれた組換ベクターウイルスが用いられる。ベクターウイルスの弱毒化は、生ワクチンの弱毒化と同じ方法が取られる。ベクターウイルスに利用できるウイルスとして、MDV、鶏痘ウイルス及びトリアデノウイルス等が報告されているが（非特許文献２参照）、いずれのウイルスも本願発明に使用できる。好ましくは、弱毒化したMDV、例えば、CVI-988株、61-554株（特開平6-22757号）、Md11/75C株（R.L. Witter；AVIAN DISEASE 31：752-765、1987）が使用される。ベクターウイルスに鶏感染因子由来の感染防御抗原を組み込む場合は、該感染防御抗原をコードするDNA断片がベクターウイルスの複製に影響しないゲノム内の特定領域に挿入される。斯かる特定領域は、転写、翻訳のいずれにも関与しない非翻訳領域内であれば、特に限定されるものではない。オープンリーディングフレーム内に外来遺伝子が挿入される場合においても、例えば、MDVを使用する場合、US10遺伝子（特許第3428666号）、HVTを使用する場合、TK遺伝子（Ross、J Gen Virol., 1993）、等の領域を用いれば良い。(2) Preparation of vector vaccine For the vector vaccine of the present invention, a recombinant vector virus in which an infection protective antigen derived from a chicken infectious agent is incorporated into a vector virus is used. Attenuation of the vector virus takes the same way as attenuation of live vaccines. MDV, fowlpox virus, avian adenovirus, and the like have been reported as viruses that can be used as vector viruses (see Non-Patent Document 2), and any virus can be used in the present invention. Preferably, attenuated MDV, for example, CVI-988 strain, 61-554 strain (JP-A-6-22757), Md11 / 75C strain (RL Witter; AVIAN DISEASE 31: 752-765, 1987) is used. . When an infection protective antigen derived from a chicken infectious agent is incorporated into a vector virus, a DNA fragment encoding the infection protective antigen is inserted into a specific region in the genome that does not affect the replication of the vector virus. Such a specific region is not particularly limited as long as it is in a non-translated region that is not involved in either transcription or translation. Even when a foreign gene is inserted into the open reading frame, for example, when using MDV, US10 gene (patent No. 3428666), when using HVT, TK gene (Ross, J Gen Virol., 1993) , Etc. may be used.
また、鶏感染因子由来の感染防御抗原については、NDVのFタンパク質やHNタンパク質、IBVのS1タンパク質、MDVのgBタンパク質、IBDVのVP2タンパク質、ILTVのgBタンパク質、TRTVのFタンパク質、ALVのEnvタンパク質、REVのEnvタンパク質、CAVのVP1+VP2タンパク質、AIVのHAタンパク質、マイコプラズマ・ガリセプティカムのｐ29タンパク質、ロイコチトゾーン・カウレリーのMSA1タンパク質等が報告されており（非特許文献２参照）、これらのタンパク質及びその一部は、いずれも本願発明の鶏感染因子由来の感染防御抗原として使用できる。したがって、上記の感染因子由来の感染防御抗原を発現する組換えベクターウイルス（ベクターワクチン）と該感染因子を弱毒化した生ワクチンとの組合せが本願発明に使用できる。好ましくは、IBVの生ワクチンとIBVのS1タンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルス、及びNDVの生ワクチンとNDVのFタンパク質が組み込まれた組換えベクターワクチンの組合せである。 In addition, NDV F protein, HN protein, IBV S1 protein, MDV gB protein, IBDV VP2 protein, ILTV gB protein, TRTV F protein, ALV Env protein Env protein of REV, VP1 + VP2 protein of CAV, HA protein of AIV, p29 protein of Mycoplasma gallicepticum, MSA1 protein of Leucochitozone and Cowleri (see Non-patent Document 2), and these proteins have been reported. And a part thereof can be used as an infection protective antigen derived from the chicken infectious agent of the present invention. Therefore, a combination of a recombinant vector virus (vector vaccine) expressing an infection protective antigen derived from the above infectious agent and a live vaccine in which the infectious agent is attenuated can be used in the present invention. Preferably, a combination of a live vaccine of IBV and a recombinant vector virus in which the S1 protein of IBV is incorporated, and a recombinant vector vaccine in which a live vaccine of NDV and an F protein of NDV are incorporated.
上記の組換えベクターウイルスは、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）により調製される。実際には、核酸断片（DNA、RNA）の抽出及びクローニング、核酸断片への変異の導入、核酸断片の宿主内への導入・宿主の培養等は、当該技術に基づき開発された種々の遺伝子操作キットが市販されているので、これらの市販品を用いて行われる。 The above recombinant vector virus is prepared by a general gene recombination technique (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989) described by Sambrook et al. In practice, various gene manipulations developed based on this technology include extraction and cloning of nucleic acid fragments (DNA, RNA), introduction of mutations into nucleic acid fragments, introduction of nucleic acid fragments into a host, and cultivation of a host. Since kits are commercially available, these commercial products are used.
（ア）ベクターウイルスゲノムの調製
まず、生ワクチンと同様の方法によるベクターウイルスの調製、ウイルスゲノムの抽出、該ウイルスゲノムのBAC配列を有するプラスミド（BACmid；ニュー・イングランド・バイオラボ社）への挿入、及び大腸菌での該BACmidのクローニングと量産が行われる。次に、大腸菌から該BACmidを抽出し、これをBAC配列切断酵素産生細胞中で培養することにより、BAC配列が除去されたベクターウイルスゲノムが抽出される。この一連の操作は、添付のプロトコールに従って行われる。こうして得られたベクターウイルスゲノムは、組換えベクターウイルスの調製に使用される。本願発明のMDVゲノムは、より具体的には、Messerleら（Proc Natl Acad Sci U S A., 1997）、Wussowら（PLoS One, 2009）報告等に開示されている方法に従って調製される。(A) Preparation of vector virus genome First, preparation of a vector virus by a method similar to that for a live vaccine, extraction of the virus genome, insertion of the virus genome into a plasmid having a BAC sequence (BACmid; New England Biolabs), And cloning and mass production of the BACmid in E. coli. Next, the BACmid is extracted from Escherichia coli and cultured in a BAC sequence-cleaving enzyme-producing cell, thereby extracting a vector virus genome from which the BAC sequence has been removed. This series of operations is performed according to the attached protocol. The vector virus genome thus obtained is used for the preparation of recombinant vector viruses. More specifically, the MDV genome of the present invention is prepared according to a method disclosed in a report by Messerle et al. (Proc Natl Acad Sci US A., 1997), Wussow et al. (PLoS One, 2009) and the like.
（イ）鶏感染因子由来の感染防御抗原をコードする遺伝子の調製
鶏感染因子由来の感染防御抗原をコードする遺伝子（以下、「感染防御遺伝子」と称することもある）は、ベクターウイルスゲノムの調製と同様の方法により、鶏感染因子のゲノムを抽出した後、例えば、該ゲノムを鋳型としてPCR法により感染防御遺伝子を増幅・クローニングすることにより得られる。このとき、感染防御抗原遺伝子が鶏体内で作用するように、例えば、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスIE、βアクチン等のプロモーターが付加され、更にベクターウイルスゲノム内で鶏感染因子由来の感染防御抗原遺伝子の相同組換えが行われるように、該感染防御抗原遺伝子の両末端にベクターウイルスゲノムの挿入部位の塩基配列（以下、「相同組換え配列領域」と称することもある）が付加される。また、発現量や組換え体構築の利便性を上げることを目的として、エンハンサー配列、シグナル配列、制限酵素認識配列、トランスメンブレン領域の付加や宿主依存性の塩基配列への置換が行われることもある。前記の塩基配列の置換（変異）には、サイトダイレクティドミュータジェネシス法を用いるのが一般的である。鶏感染因子の感染防御抗原遺伝子は、例えば、IBVのS1タンパク質は文献（Songら、J Gen Virol., 1998）、NDVのFタンパク質は文献（Morganら、Avian Disease, 1992）、等に開示されている方法に従ってプラスミド等にクローニングされる。目的のDNA断片の確認は、DNAシークエンサー（ABI Prism 377 アプライドバイオシステムズ社）により塩基配列を決定し、既存の塩基配列と比較することにより行われる。なお、ここでいう既存の配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）等のデータベースで検索を行うことにより、容易に入手することができる。(I) Preparation of a gene encoding an infection protective antigen derived from a chicken infectious agent A gene encoding an infection protective antigen derived from a chicken infectious agent (hereinafter sometimes referred to as “infection protective gene”) is prepared from a vector virus genome. After extracting the genome of a chicken infectious agent by the same method as described above, for example, it is obtained by amplifying and cloning an infection protection gene by PCR using the genome as a template. At this time, promoters such as early SV40, late SV40, cytomegalovirus IE, β-actin, etc. are added so that the infection protective antigen gene acts in the chicken body, and further infection from chicken infectious agents in the vector virus genome The base sequence of the insertion site of the vector virus genome (hereinafter also referred to as “homologous recombination sequence region”) is added to both ends of the protective antigen gene so that homologous recombination of the protective antigen gene is performed. The In addition, for the purpose of increasing the expression level and convenience of recombinant construction, an enhancer sequence, a signal sequence, a restriction enzyme recognition sequence, a transmembrane region may be added or a host-dependent base sequence may be substituted. is there. The site-directed mutagenesis method is generally used for the substitution (mutation) of the base sequence. For example, the IBV S1 protein is disclosed in the literature (Song et al., J Gen Virol., 1998), the NDV F protein is disclosed in the literature (Morgan et al., Avian Disease, 1992), etc. In accordance with existing methods. Confirmation of the target DNA fragment is performed by determining the base sequence with a DNA sequencer (ABI Prism 377 Applied Biosystems) and comparing it with the existing base sequence. The existing sequences referred to here can be easily obtained by searching a database such as NCBI (National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). it can.
本願発明の組換えベクターウイルスは、上記のベクターウイルスゲノムと感染防御抗原遺伝子が挿入されたプラスミドとの間で相同組換えを起こすことにより得られる。例えば、MDVを接種したCEF細胞を、NDV-Fタンパク質が挿入されたプラスミドを含む培地で培養することにより、MDVゲノムの相同組換え配列領域で相同組換えが起こり、MDVゲノムにNDVのFタンパク質が組み込まれた組換えベクターウイルスが作出される。培養方法及び条件は、上記の鶏感染因子を取得するときに用いた方法及び条件が用いられる。また、組換えベクターウイルスは、生ワクチンと同様に組換えベクターウイルスの性状に合わせて凍結乾燥製剤又は凍結液状製剤として製剤化・保存される。このとき、ベクターワクチン及び生ワクチンの有効性や性状等が互いに影響されない場合は、両ワクチンを混合した形態で製剤化・保存しても良い。 The recombinant vector virus of the present invention can be obtained by causing homologous recombination between the above-described vector virus genome and a plasmid into which an infection protective antigen gene has been inserted. For example, CEF cells inoculated with MDV are cultured in a medium containing a plasmid in which the NDV-F protein is inserted, so that homologous recombination occurs in the MDV genome homologous recombination sequence region, and the NDV F protein in the MDV genome. A recombinant vector virus in which is incorporated is produced. As the culture method and conditions, the method and conditions used for obtaining the above chicken infectious agent are used. The recombinant vector virus is formulated and stored as a lyophilized preparation or a frozen liquid preparation in accordance with the properties of the recombinant vector virus in the same manner as the live vaccine. At this time, if the effectiveness and properties of the vector vaccine and the live vaccine are not affected by each other, the vaccine may be formulated and stored in a mixed form.
こうして得られた感染因子由来の感染防御抗原がベクターウイルスに組み込まれた組換えベクターウイルスを有効成分とするベクターワクチン及び該弱毒化感染因子を有効成分とする生ワクチンは、あらゆる公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等への注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、点眼、経口投与により鶏体内に導入することができる。本願発明の生ワクチン及びベクターワクチンを鶏卵（in ovo）に投与する場合は、注射による奨尿膜、羊膜腔、胎児への接種が行われるが、該ワクチンを鶏雛に投与する場合は、点眼・点鼻、噴霧接種、飲水投与による方法が好ましい。 A vector vaccine comprising a recombinant vector virus in which an infection protective antigen derived from an infectious agent thus obtained is incorporated into a vector virus as an active ingredient and a live vaccine comprising the attenuated infectious agent as an active ingredient can be obtained by any known method, for example, It can be introduced into chickens by injection into muscles, intraperitoneally, intradermally or subcutaneously, or by inhalation through the nasal cavity, oral cavity or lung, instillation, or oral administration. When the live vaccine and vector vaccine of the present invention are administered to ovo eggs (in ovo), the urinary membrane, amniotic cavity and fetus are inoculated by injection, but when the vaccine is administered to chicken chicks, it is instilled. -The method by nasal spray, spray inoculation, and drinking water administration is preferable.
投与量としては、有効成分の種類、投与経路、投与対象、体重、症状その他の条件により適宜選択されるが、一回の投与量としては以下の通りである。本願発明の生ワクチンは、ワクチン株の種類によってそれぞれ異なり、各ワクチンの製剤基準に記載されている1ドーズの最小有効量以上において使用される。また、本願発明のベクターワクチンは、MDワクチンの製剤基準に記載されている1ドーズの最小有効量以上において使用され、具体的には、in ovoの場合に1000-10000PFU（plaque forming units）/羽、好ましくは、2000-6000PFU/羽の範囲、雛体内への接種の場合に1000-10000PFU/羽、好ましくは、2000-6000PFU/羽の範囲で使用される。 The dose is appropriately selected according to the type of active ingredient, administration route, administration subject, body weight, symptom, and other conditions, and a single dose is as follows. The live vaccine of the present invention varies depending on the type of vaccine strain, and is used in a minimum effective amount of 1 dose or more described in the formulation standard of each vaccine. Further, the vector vaccine of the present invention is used at a minimum effective dose of 1 dose or more described in the MD vaccine formulation standard. Specifically, in the case of in vivo, 1000-10000 PFU (plaque forming units) / feather It is preferably used in the range of 2000-6000 PFU / feather, in the case of inoculation into the chick, 1000-10000 PFU / feather, preferably 2000-6000 PFU / feather.
鶏感染因子には、血清型が異なる多種の亜型や変異株が存在する。例えば、IBVに関しては、C-78株、AK-01株、練馬株、TM86株等が分離されている。このような場合において本願発明の生ワクチン及びベクターワクチンを併用するときは、生ワクチンに使用した鶏感染因子と同一の株が組み込まれた組換えベクターウイルスを用いてもよく、異なる血清型の株が組み込まれた組換えベクターウイルスを用いても良い。また、生ワクチン及びベクターワクチンをそれぞれ複数併用して用いることもできる。 There are various subtypes and mutant strains with different serotypes in chicken infectious agents. For example, with regard to IBV, C-78 strain, AK-01 strain, Nerima strain, TM86 strain and the like have been separated. In such a case, when the live vaccine and vector vaccine of the present invention are used in combination, a recombinant vector virus incorporating the same strain as the chicken infectious agent used in the live vaccine may be used, and strains of different serotypes may be used. Recombinant vector viruses in which are incorporated may also be used. A plurality of live vaccines and vector vaccines can be used in combination.
本願発明を対象（鶏卵、雛）に投与する場合、ベクターワクチン及び生ワクチンを同時に投与してもよく、時期を変えて別々に投与しても良い。両ワクチンを同時に投与する場合には、上述した混合ワクチンを使用しても良く、独立した二つの該ワクチンを使用直前に混合して投与しても良い。この場合、独立した二つのワクチンは、キットまたはセットとして提供される。独立した状態で同時期に投与する場合も本願発明では同時投与を意味するものとする。 When administering the present invention to a subject (egg eggs, chicks), the vector vaccine and the live vaccine may be administered simultaneously, or may be administered separately at different times. When both vaccines are administered simultaneously, the above-described mixed vaccine may be used, or two independent vaccines may be mixed and administered immediately before use. In this case, two independent vaccines are provided as a kit or set. In the present invention, simultaneous administration is also meant for administration in the same period in an independent state.
両ワクチンを別々に投与する場合は、生ワクチンとベクターワクチンのいずれを先に投与しても良いが、好ましくは、ベクターワクチンを投与後に生ワクチンが投与される。この場合、生ワクチンは１回の投与で十分な効果を有するが、更に追加投与をしても良い。生ワクチンの投与は、ベクターワクチンを投与後、１-200日の間に行われる。好ましくは、４-126日の間である。 When both vaccines are administered separately, either the live vaccine or the vector vaccine may be administered first, but preferably the live vaccine is administered after the vector vaccine is administered. In this case, the live vaccine has a sufficient effect by a single administration, but may be further administered. The live vaccine is administered for 1 to 200 days after the vector vaccine is administered. Preferably between 4 and 126 days.
本願発明のワクチンとしての評価は、in vitroの系においては、免疫鶏から採血後、血清を分離し、当該血清中の本願発明の生ワクチンに対する抗体力価や鶏感染因子に対する中和抗体価を測定することにより、また、in vivoの系においては、前記免疫鶏に鶏感染因子の強毒株を投与し、その後免疫鶏の生死、病状等を観察することにより行われる。in vitroの系における抗体の測定には、ELISA法、PHA法、プラークアッセイ法などが常用される。 In the in vitro system, the serum of the present invention is evaluated by separating the serum from the immunized chicken and then determining the antibody titer against the live vaccine of the present invention and the neutralizing antibody titer against the chicken infectious factor in the serum. In an in vivo system, the measurement is performed by administering a virulent strain of a chicken infectious agent to the immunized chicken, and then observing the life and death of the immunized chicken, a disease state, and the like. ELISA, PHA, plaque assay, etc. are commonly used for antibody measurement in an in vitro system.
鶏に投与されるワクチンは、飼養場所ごとの状況（病原体の汚染状態、周囲の鶏病流行状況、採卵鶏又は肉用鶏、種鶏又は実用鶏）によって異なるので、それらの状況を考慮したワクチネーションプログラムが組まれる。本願発明の生ワクチンとベクターワクチンは、他の鶏感染症用ワクチンと一緒に投与するワクチネーションプログラムを策定しても良い。このような鶏感染症用ワクチンとして、生ワクチンの場合、ARV、NDV、IBV、IBDV、MDV及びAEVに対する生ワクチン群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることができる。不活化ワクチンの場合、ARV、NDV、IBV、EDS、IBDV、細菌（例えば、大腸菌及びサルモネラ菌、ヘモフィルス・パラガリナラム菌など）、マイコプラズマ（例えばマイコプラズマ・ガリセプティカム及びマイコプラズマ・シノビエなど）及び寄生虫（例えばアイメリア属）に対する不活化ワクチン群から選択される少なくとも１種類のワクチンと組み合わせることができる。 Vaccines administered to chickens vary depending on the situation at each breeding place (contamination status of pathogens, surrounding chicken disease epidemic situation, egg-laying chicken or meat chicken, breeder chicken, or practical chicken). A nation program is organized. The live vaccine and vector vaccine of the present invention may be formulated as a vaccine program to be administered together with other chicken infection vaccines. As such a chicken infection vaccine, in the case of a live vaccine, it can be combined with at least one vaccine selected from a live vaccine group for ARV, NDV, IBV, IBDV, MDV and AEV. In the case of inactivated vaccines, ARV, NDV, IBV, EDS, IBDV, bacteria (eg, E. coli and Salmonella, Haemophilus paragalinarum, etc.), mycoplasma (eg, Mycoplasma gallicepticum and Mycoplasma sinobiae) and parasites (eg, Eimeria) ) To at least one vaccine selected from the group of inactivated vaccines.
本願発明のベクターワクチン及び生ワクチンを併用することによる鶏感染症の予防方法は、広く一般に適用可能な方法であり、単に鶏に限らず、鶏以外の鳥類や動物の感染症に対しても同様の効果が期待される。したがって、本発明の予防方法は、ヒトを除く動物に使用することができ、また、本願発明のベクターワクチン及び生ワクチンを有効成分とするワクチンは広く動物に使用することができる。好ましくは、インフルエンザウイルス、マレック病ウイルス（ヘルペスウイルス）、ニューカッスル病ウイルス等は、鶏や七面鳥に限らず多く鳥類に感染することから、広く鳥類に対して使用される。鶏以外の鳥類としては、商用又は非商用目的で飼育されている鳥類が含まれ、その一例として、キジ目（例えば、ニワトリ、ウズラ類、シチメンチョウ）、カモ目（例えば、アヒル、ガチョウ）、チドリ目（例えば、カモメ、ミフウズラ、チドリ）、ハト目（例えば、ハト）、ダチョウ目（例えば、ダチョウ）、スズメ目（例えば、カラス、フィンチ、スズメ、スターリング、ツバメ）、オウム目（例えば、オウム）、タカ目（例えば、イーグル、タカ）、フクロウ目（例えば、フクロウ）、ペンギン目（例えば、ペンギン）、オウム目（例えば、インコ、オウム）が挙げられる。好ましくは、七面鳥、アヒル、ウズラ、カモである。 The method for preventing chicken infection by using the vector vaccine and the live vaccine of the present invention in combination is a method that can be widely applied generally, and is not limited to chickens, but also for infections of birds and animals other than chickens. The effect is expected. Therefore, the prevention method of the present invention can be used for animals other than humans, and the vaccines comprising the vector vaccine and the live vaccine of the present invention as active ingredients can be widely used for animals. Preferably, influenza virus, Marek's disease virus (herpes virus), Newcastle disease virus, etc. are not limited to chickens and turkeys, and are widely used for birds. Birds other than chickens include birds bred for commercial or non-commercial purposes, examples of which include pheasants (eg chickens, quails, turkeys), ducks (eg ducks, geese), plovers Eyes (eg, gulls, quail, plover), pigeons (eg, pigeons), ostriches (eg, ostriches), sparrows (eg, crows, finch, sparrows, sterling, swallows), parrots (eg, parrots) , Hawks (for example, eagle, hawk), owls (for example, owl), penguins (for example, penguin), parrots (for example, parakeet, parrot). Preferred are turkey, duck, quail and duck.
鶏以外の動物に適用する場合は、ベクターウイルスとして、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ポックスウイルス及びアデノウイルスなどが挙げられるが、何れを使用しても良い。また、狂犬病ウイルスのG蛋白遺伝子（Espositoら、Virus Genes, 1987）やインフルエンザウイルスのHA蛋白遺伝子（Tangら、Arch Virol., 2002）等の、鶏感染因子以外の動物感染因子の感染防御抗原をコードする遺伝子、該遺伝子が組み込まれたベクターワクチン、及び該動物感染因子を弱毒化して得られる生ワクチンは、種々の特許公報や技術文献に開示された情報に基づいて、鶏感染症に対するベクターワクチン及び生ワクチンを作製した方法と同様の方法により作製することができる。 When applied to animals other than chickens, herpes viruses, paramyxoviruses, rhabdoviruses, poxviruses, adenoviruses and the like can be used as vector viruses. Any of these may be used. In addition, infection antigens of animal infectious agents other than chicken infectious agents such as G protein gene of rabies virus (Esposito et al., Virus Genes, 1987) and HA protein gene of influenza virus (Tang et al., Arch Virol., 2002) Based on information disclosed in various patent publications and technical literature, a vector vaccine for chicken infection is obtained by encoding a gene, a vector vaccine incorporating the gene, and a live vaccine obtained by attenuating the animal infectious agent. And it can produce by the method similar to the method of producing a live vaccine.
以下、実施例に従い、本願発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
《BAC配列を有する組換えマレック病ウイルス１型ゲノムDNA（rMDV1-BACmid）の作製》
（１）BAC配列をMDV1（CVI988株）に挿入するためのプラスミドpUC-nTK-gpt-BACの構築
下記（イ）〜（ホ）の工程により、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子の下流にgpt（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子、その下流にBAC配列をpUC119に挿入したプラスミドpUC-nTK-BACを構築した。<< Preparation of recombinant Marek's
(1) Construction of plasmid pUC-nTK-gpt-BAC for inserting BAC sequence into MDV1 (CVI988 strain) The gpt (xanthine) is downstream of the thymidine kinase (TK) gene by the following steps (a) to (e). A plasmid pUC-nTK-BAC was constructed by inserting a -guanine phosphoribosyl transferase) gene and a BAC sequence downstream thereof into pUC119.
（イ）MDV1ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号1及び２のプライマーを用いたPCRによりチミジンキナーゼ（TK）遺伝子全長を含む断片を増幅した。
5'側：ATGGTGTTTTAAGCTTGGTGATTAC（下線部はHindIII認識配列）（配列番号1）
3'側：CCCAAGCTTCTCCCCGGCCAATCATACA（下線部はHindIII認識配列）（配列番号2）(A) A fragment containing the entire thymidine kinase (TK) gene was amplified by PCR using the MDV1 genomic DNA as a template and the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2.
5 'side: ATGGTGTTTT AAGCTT GGTGATTAC (underlined part is HindIII recognition sequence) (SEQ ID NO: 1)
3 'side: CCC AAGCTT CTCCCCGGCCAATCATACA (underlined part is HindIII recognition sequence) (SEQ ID NO: 2)
該断片をHindIIIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpUC119（タカラバイオ社、製品コード；3319）に挿入し、プラスミドpUC119-TKを得た。次いで、pUC119-TKを鋳型として、TK遺伝子のオープンリーディングフレームの直後の領域においてプラスミド全長を増幅するよう逆向きに設計した、配列番号3及び４のプライマーを用いたPCRを行い、末端のリン酸化処理及びself-ligationを行うことにより、PacIサイトを付加したプラスミドpUC-nTKを得た（図１−１）。
5'側：TTAATTAATACCCATTCATATCGCGCTTCTA（下線部はPacI認識配列）（配列番号3）
3'側：GTTTTACATAGCCATCTCTTTATTATAGG（配列番号4）The fragment was cleaved with HindIII and then inserted into pUC119 (Takara Bio Inc., product code: 3319) previously cleaved with the same restriction enzyme to obtain plasmid pUC119-TK. Next, using pUC119-TK as a template, PCR was carried out using primers of SEQ ID NOs: 3 and 4, which were designed in reverse so as to amplify the entire length of the plasmid in the region immediately after the open reading frame of the TK gene. By carrying out the treatment and self-ligation, a plasmid pUC-nTK added with a PacI site was obtained (FIG. 1-1).
5 'side: TTAATTAA TACCCATTCATATCGCGCTTCTA (underlined PacI recognition sequence) (SEQ ID NO: 3)
3 'side: GTTTTACATAGCCATCTCTTTATTATAGG (SEQ ID NO: 4)
（ロ）BAC配列を含むpBeloBAC11（ニュー・イングランド・バイオラボ社、製品コード；E4154）をNotIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpBlueScriptII KS+（Stratagene社）にクローニングし、プラスミドpBSII-BACを得た。 なお、BAC配列を封するプラスミドを「BACmid」と称することもある。 (B) pBeloBAC11 (New England Biolabs, product code; E4154) containing the BAC sequence was cleaved with NotI and then cloned into pBlueScriptII KS + (Stratagene) previously cleaved with the same restriction enzyme to obtain plasmid pBSII-BAC It was. In addition, the plasmid that seals the BAC sequence may be referred to as “BACmid”.
（ハ）大腸菌ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号5及び6のプライマーを用いてPCRを行い、gpt（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase）遺伝子全長を含む断片を増幅した。
5'側：TGGGACACAGCTGATGAGCGAAAAATACATCGT（下線部はPvuII認識配列）（配列番号5）
3'側：CGGGATCCTTAGCGACCGGAGATTGGC（下線部はBamHI認識配列）（配列番号6）
該断片をPvuIIおよびBamHIで切断後、予め同じ制限酵素で切断したpCEP4（インビトロジェン社、製品コード；V044-50）に挿入し、プラスミドpCEP4-gptを得た（図１−２）。(C) PCR was performed using Escherichia coli genomic DNA as a template and the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6 to amplify a fragment containing the entire gpt (xanthine-guanine phosphoribosyl transferase) gene.
5 'side: TGGGACA CAGCTG ATGAGCGAAAAATACATCGT (underlined part is PvuII recognition sequence) (SEQ ID NO: 5)
3 'side: CG GGATCC TTAGCGACCGGAGATTGGC (underlined part is BamHI recognition sequence) (SEQ ID NO: 6)
The fragment was cleaved with PvuII and BamHI and then inserted into pCEP4 (Invitrogen, product code: V044-50) previously cleaved with the same restriction enzyme to obtain plasmid pCEP4-gpt (FIG. 1-2).
（二）前記（ハ）のpCEP4-gptをSalIで切断後に平滑末端処理して得た断片を、予めBamHIで切断後に平滑末端処理した前記（ロ）のpBSII-BACにクローニングし、プラスミドpBSII-gpt-BACを得た（図１−３）。 (2) A fragment obtained by cleaving pCEP4-gpt of (C) with SalI and then blunt-ended was cloned into the pBSII-BAC of (B) previously cleaved with BamHI and blunt-ended, to obtain plasmid pBSII- gpt-BAC was obtained (FIGS. 1-3).
（ホ）前記（二）のpBSII-gpt-BACを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを用いてPCRを行い、gpt遺伝子およびBAC配列を含む約8.7kbpの断片を増幅した。
5'側：
3'側：TCCCCGCGGCGCATCGAATATAACTTCGTA（下線部はSacII認識配列）（配列番号8）
該断片をSacIIで切断後に平滑末端処理を行い、予めPacIで切断後に平滑末端処理した前記（イ）のpUC-nTKに挿入し、gpt-BACの両末端にloxP配列を有するプラスミドpUC-nTK-gpt-BACを得た（図１−４）。(E) PCR was carried out using the pBSII-gpt-BAC of (2) above as a template and the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, and an about 8.7 kbp fragment containing the gpt gene and the BAC sequence was amplified.
5 'side:
3 'side: TCC CCGCGG CGCATCGAATATAACTTCGTA (underlined part is SacII recognition sequence) (SEQ ID NO: 8)
The fragment was digested with SacII and then blunt-ended, inserted into the pUC-nTK of (a) previously digested with PacI and blunt-ended, and the plasmid pUC-nTK- having loxP sequences at both ends of gpt-BAC gpt-BAC was obtained (FIGS. 1-4).
（２）BAC配列のMDV1ゲノムDNAへの挿入
前記（１）で得たpUC-nTK-gpt-BACとMDV１感染細胞を用いて相同組換えを行うことにより、BAC配列が挿入された組換えMDV1ゲノムDNA（rMDV1-BACmid）を有する細胞を作製した（Messerleら、Proc Natl Acad Sci U S A., 1997）。具体的には、HindIIIで線状化したpUC-nTK-BACとMDV1(CVI988株)を感染させたCEF細胞をジーンパルサー用キュベット内で混合し、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いてパルスを行った後、該MDV1感染細胞を25μg/mLミコフェノール酸を含むGPT Selection Reagent（Chemicon International社）添加培地で培養し、環状のrMDV1-BACmidを保持する細胞を選択した。(2) Insertion of BAC sequence into MDV1 genomic DNA Recombinant MDV1 with BAC sequence inserted by homologous recombination using pUC-nTK-gpt-BAC obtained in (1) above and MDV1-infected cells Cells with genomic DNA (rMDV1-BACmid) were generated (Messerle et al., Proc Natl Acad Sci US A., 1997). Specifically, CEF cells infected with pUC-nTK-BAC linearized with HindIII and MDV1 (CVI988 strain) were mixed in a gene pulser cuvette and pulsed using Gene Pulser (Bio-Rad). Thereafter, the MDV1-infected cells were cultured in a medium supplemented with GPT Selection Reagent (Chemicon International) containing 25 μg / mL mycophenolic acid, and cells retaining cyclic rMDV1-BACmid were selected.
（３）rMDV1-BACmidの大腸菌へのクローニング
前記（２）で得たrMDV1-BACmid保持細胞からHirt法（Hirt、J Mol Biol., 1967）によりrMDV1-BACmidを抽出し、該DNAをエレクトロポレーション法により大腸菌DH10B（インビトロジェン社、製品コード；18290-015）に導入した。該大腸菌をクロラムフェニコール添加培地で培養し、rMDV1-BACmidを保持する大腸菌をクローニングした。rMDV1-BACmid中のMDV1ゲノムDNAは、該rMDV1-BACmidと親株MDV1のゲノムDNAの制限酵素（EcoRI、BamHI、HindIII）切断パターンを比較することにより同定した。その結果、BACmid挿入領域を除く両者の切断パターンが一致し、全長MDV1ゲノムのBACmidへの挿入が確認された。(3) Cloning of rMDV1-BACmid into Escherichia coli rMDV1-BACmid was extracted from the rMDV1-BACmid-retaining cells obtained in (2) above by the Hirt method (Hirt, J Mol Biol., 1967), and the DNA was electroporated. It was introduced into E. coli DH10B (Invitrogen, product code: 18290-015) by the method. The Escherichia coli was cultured in a medium supplemented with chloramphenicol, and Escherichia coli retaining rMDV1-BACmid was cloned. The MDV1 genomic DNA in rMDV1-BACmid was identified by comparing the restriction enzyme (EcoRI, BamHI, HindIII) cleavage patterns of the genomic DNA of the rMDV1-BACmid and the parent strain MDV1. As a result, the cleavage patterns of both were identical except for the BACmid insertion region, and insertion of the full-length MDV1 genome into BACmid was confirmed.
《鶏伝染性気管支炎ウイルスのS1タンパク質(IBV-S1)遺伝子及びBACmidが組み込まれたrMDV1ゲノムDNA（rMDV1-BACmid/S1）の作製》
（１）IBV-S1遺伝子を有するプラスミドpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmの構築
IBV-S1（TM86株）を発現するプラスミドpKA4BP-LgAsS1Ftm（特許4691495号参照）を用いて、配列番号9及び10のプライマーを用いたPCRを行い、IBV-S1遺伝子上のATリッチな領域におけるGC含量が高くなるようにコドンを最適化したDNA断片を得た。
5'側：ACATGCATGCGTGAACAACTATACATCTGTCTATTTGAATGG（下線部はSphI認識配列）（配列番号9）
3'側：CGAGCTCCGAGATACGTATATGATTCCGTGGAAC（下線部はSacI認識配列）（配列番号10）《Preparation of rMDV1 genomic DNA (rMDV1-BACmid / S1) containing chicken infectious bronchitis virus S1 protein (IBV-S1) gene and BACmid》
(1) Construction of plasmid pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm carrying IBV-S1 gene
Using plasmid pKA4BP-LgAsS1Ftm (see Patent No. 46911495) expressing IBV-S1 (TM86 strain), PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, and GC in an AT-rich region on the IBV-S1 gene A DNA fragment in which the codon was optimized so as to increase the content was obtained.
5 'side: ACAT GCATGC GTGAACAACTATACATCTGTCTATTTGAATGG (underlined part is SphI recognition sequence) (SEQ ID NO: 9)
3 'side: C GAGCTC CGAGATACGTATATGATTCCGTGGAAC (underlined part is SacI recognition sequence) (SEQ ID NO: 10)
次いで、配列番号11及び12の合成オリゴヌクレオチドを混合し、94℃・1分、70℃・10分の反応を行った後に室温で冷却させることでアニールした二本鎖ヌクレオチド断片と、予めSphIおよびSacIで切断し、平滑末端処理を行った上記DNA断片を連結することにより、改変S1遺伝子を有するプラスミドpKA4BP-LgAsGC292Ftmを得た（図２−１）。
5'側：CTATGAAGAACGGCTCGCTGTTCTACAACCTGACGATCAGCGTGTCCAAGCACCCTAAGTTCAAGTCGTT CCAGTGCATG（配列番号11）
3'側：CACTGGAACGACTTGAACTTAGGGTGCTTGGACACGCTGATCGTCAGGTTGTAGAACAGCGAGCCGTTCT
TCATAGAGCT（配列番号12）Next, the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 11 and 12 were mixed, reacted at 94 ° C. for 1 minute, 70 ° C. for 10 minutes, and then cooled at room temperature, and then annealed to a double-stranded nucleotide fragment in advance, and SphI and A plasmid pKA4BP-LgAsGC292Ftm having a modified S1 gene was obtained by ligating the above DNA fragments cut with SacI and subjected to blunt end treatment (FIG. 2-1).
5 'side: CTATGAAGAACGGCTCGCTGTTCTACAACCTGACGATCAGCGTGTCCAAGCACCCTAAGTTCAAGTCGTT CCAGTGCATG (SEQ ID NO: 11)
3 'side: CACTGGAACGACTTGAACTTAGGGTGCTTGGACACGCTGATCGTCAGGTTGTAGAACAGCGAGCCGTTCT
TCATAGAGCT (SEQ ID NO: 12)
該pKA4BP-LgAsGC292Ftmを予めSnaBIで部分切断したものに、pACYC177（ニッポンジーン社、製品コード；310-02191）を鋳型として、配列番号13及び14のプライマーを用いたPCRにより増幅し、末端リン酸化処理したカナマイシン耐性遺伝子配列を含む約1.0kbpの断片を挿入し、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmを得た（図２−２）。
5'側：
3’側：CAACCAATTAACCAATTCTGATTAGA（配列番号14）The pKA4BP-LgAsGC292Ftm was partially cleaved with SnaBI in advance and amplified by PCR using pACYC177 (Nippon Gene, product code: 310-02191) as a template and primers of SEQ ID NOs: 13 and 14. A fragment of about 1.0 kbp containing the kanamycin resistance gene sequence was inserted to obtain a plasmid pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm having the kanamycin resistance gene (FIG. 2-2).
5 'side:
3 'side: CAACCAATTAACCAATTCTGATTAGA (SEQ ID NO: 14)
（２）pKA4BPKmI-LgAsGC292FtmのrMDV1-BACmidへの挿入
実施例１-(３）で得たrMDV1-BACmidを保持する大腸菌（DH10B）からrMDV1-BACmidを抽出し、λ-Red組換え酵素および制限酵素I-SceI遺伝子が組み込まれたゲノムを有する大腸菌GS1783に導入し、rMDV1-BACmidを有する大腸菌GS1783（GS1783/rMDV1-BACmid）をクローニングした（Wussowら、PLoS One, 2009）。該GS1783/rMDV1-BACmidを増殖後、培養温度を32℃から42℃にシフトし、λ-Red組換え酵素を発現させた状態で定法に従ってコンピテントセルを調製した。(2) Insertion of pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm into rMDV1-BACmid Extracting rMDV1-BACmid from Escherichia coli (DH10B) retaining rMDV1-BACmid obtained in Example 1- (3), λ-Red recombinase and restriction enzyme It was introduced into Escherichia coli GS1783 having a genome integrated with the I-SceI gene, and Escherichia coli GS1783 (GS1783 / rMDV1-BACmid) having rMDV1-BACmid was cloned (Wussow et al., PLoS One, 2009). After growing the GS1783 / rMDV1-BACmid, the culture temperature was shifted from 32 ° C. to 42 ° C., and competent cells were prepared according to a standard method in a state where λ-Red recombinase was expressed.
該コンピテントセルに、予め制限酵素KpnIおよびBglIにより線状化した前記（１）のpKA4BPKmI-LgAsGC292Ftmを導入し、クロラムフェニコールおよびカナマイシン添加培地で培養し、IBV-S1発現プラスミドが挿入されたrMDV1-BACmidを保持する大腸菌（GS1783/rMDV1-BACmid/S1+Km）をクローニングした（Wussowら、PLoS One, 2009）。 The competent cell was introduced with pKA4BPKmI-LgAsGC292Ftm of (1) previously linearized with restriction enzymes KpnI and BglI, cultured in a medium supplemented with chloramphenicol and kanamycin, and inserted with an IBV-S1 expression plasmid E. coli harboring rMDV1-BACmid (GS1783 / rMDV1-BACmid / S1 + Km) was cloned (Wussow et al., PLoS One, 2009).
次いで、該GS1783/MDV1-BACmid/S1+Kmを終濃度1.6%のアラビノース添加培地で培養した後、培養温度を32℃から42℃へシフトして30分間保温した。続いて、クロラムフェニコール添加培地又はカナマイシン添加培地で培養し、クロラムフェニコール添加培地のみで増殖するクローンを選択した（Wussowら、PLoS One, 2009）。こうしてIBV-S1発現プラスミドがrMDV1-BACmidに挿入された組換えMDVゲノムDNA（rMDV1-BACmid/S1）を保持する大腸菌（GS1783/rMDV1-BACmid/S1）を得た。 Subsequently, the GS1783 / MDV1-BACmid / S1 + Km was cultured in an arabinose-added medium having a final concentration of 1.6%, and then the culture temperature was shifted from 32 ° C. to 42 ° C. and kept for 30 minutes. Subsequently, the cells were cultured in a chloramphenicol-added medium or a kanamycin-added medium, and clones that grew only on the chloramphenicol-added medium were selected (Wussow et al., PLoS One, 2009). Thus, Escherichia coli (GS1783 / rMDV1-BACmid / S1) carrying the recombinant MDV genomic DNA (rMDV1-BACmid / S1) in which the IBV-S1 expression plasmid was inserted into rMDV1-BACmid was obtained.
《IBV-S1発現MDV1の調製》
実施例２-（２）のMDV1-BACmid/S1からgpt-BAC配列を除くためにCre酵素処理を行った。具体的には、実施例２-（２）で得たGS1783/MDV1-BACmid/S1からPureYield Maxiprep Kit（プロメガ社、製品コード；A2393）を用いてrMDV1-BACmid/S1を 抽出し、この1μgをCre酵素を発現するプラスミドpCAGGS-Cre（Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jan 3;92(1):160-4.）30ng、Fugene HD Transfection Reagent（プロメガ社、製品コード；E2311）3.3μLと混合し、CEF細胞に添加し、37℃、5%CO2条件下にてMDV1特有のプラークが出現するまで培養した。<< Preparation of MDV1 expressing IBV-S1 >>
In order to remove the gpt-BAC sequence from MDV1-BACmid / S1 in Example 2- (2), Cre enzyme treatment was performed. Specifically, rMDV1-BACmid / S1 was extracted from GS1783 / MDV1-BACmid / S1 obtained in Example 2- (2) using PureYield Maxiprep Kit (Promega, product code: A2393), and 1 μg of this was extracted. 30 ng of plasmid pCAGGS-Cre (Proc Natl Acad Sci US A. 1995
次いで、0.125%トリプシン処理したプラーク形成細胞を限外希釈し、未感染CEF細胞と共に培養し、単一のプラークが出現したウェルについてgpt+BAC配列の有無を確認するためにnested-PCRを行った。こうして、gpt-BAC配列が除かれたIBV-S1遺伝子のみを有するrMDV1ゲノムDNA（24/gBGC292Ftm）を得た。24/gBGC292FtmによるIBV-S1の発現は、IBV-S1に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法により確認した。 Subsequently, 0.125% trypsin-treated plaque-forming cells were ultradiluted and cultured with uninfected CEF cells, and nested-PCR was performed to confirm the presence of gpt + BAC sequences in wells in which single plaques appeared. . Thus, rMDV1 genomic DNA (24 / gBGC292Ftm) having only the IBV-S1 gene from which the gpt-BAC sequence was removed was obtained. The expression of IBV-S1 by 24 / gBGC292Ftm was confirmed by a fluorescent antibody method using a monoclonal antibody against IBV-S1.
《IBV-S1発現MDV1の免疫試験》
実施例３で得た24/gBGC292Ftm（3200 PFU/羽）を有効成分とするベクターワクチン（以下、「rMDV1、rMDV1-S1」と称することもある。）を、孵化場より購入した19日齢発育鶏卵（ジュリア種、坪井種鶏孵化場、山鹿市）（各群5羽）に接種し、孵化後18週齢時の雛にIBV生ワクチン３株（AK01株；化学及血清療法研究所、練馬株；化学及血清療法研究所、C78株；日生研株式会社）をそれぞれ追加的に点眼接種した。コントロールとして、rMDV1-S1のみを卵内接種した群（1群5羽）、孵化後18週齢時の雛に生ワクチンのみを投与した群（各群4羽）、非免疫群（１群4羽）を設定した。生ワクチン接種時を0ウイーク（0W）として、経時的に採血し、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価を調べることで評価を行った。表１は、使用したIBVワクチン株と群編成を示す。<Immunoassay of IBV-S1-expressing MDV1>
19-day-old growth in which a vector vaccine (hereinafter sometimes referred to as “rMDV1, rMDV1-S1”) containing 24 / g BGC292Ftm (3200 PFU / feather) obtained in Example 3 as an active ingredient was purchased from an hatchery. Inoculate chicken eggs (Julia, Tsuboi breeding hatchery, Yamaga City) (5 birds in each group), and three IBV live vaccines (AK01; Chemistry and Serum Therapy Research Institute, Nerima) at 18 weeks of age after hatching Strain; Chemo-Serum Therapy Laboratory, C78 strain; Nissei Laboratories Co., Ltd.) As a control, the group inoculated only with rMDV1-S1 (5 birds per group), the group administered live vaccine only to chicks at 18 weeks of age after hatching (4 birds each group), the non-immunized group (4 groups per group) Feather) was set. Blood was collected over time at 0 week (0W) at the time of live vaccination, and evaluation was performed by examining the neutralizing antibody titer against each IBV strain (TM86 strain, AK01 strain, Nerima strain, C78 strain). Table 1 shows the IBV vaccine strains used and the group organization.
ベクターワクチン（rMDV1-S1）を接種した後、追加的にIBV生ワクチンを投与した群では、いずれもベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群には見られない、異なる血清型のIBV株に対して中和抗体を誘導した（図３−１〜図３−４）。特に、TM株のS1を発現するrMDV1にAK01株を投与した場合において、いずれの血清型に対しても高い抗体応答が惹起されることが確認された。また、追加投与群では、ベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群に比較して、早期に高い中和抗体価が惹起され、かつ誘導された抗体価は長期亘って持続することが確認された。 After inoculating the vector vaccine (rMDV1-S1), the IBV strains with different serotypes were not seen in the group that received additional live IBV vaccine, but were not found in the group administered either vector vaccine or live IBV vaccine alone. Thus, neutralizing antibodies were induced (FIGS. 3-1 to 3-4). In particular, when AK01 strain was administered to rMDV1 expressing TM strain S1, it was confirmed that a high antibody response was elicited against any serotype. In addition, it was confirmed that in the additional administration group, a high neutralizing antibody titer was induced earlier and the induced antibody titer persisted over a long period of time compared to the single administration group of vector vaccine or IBV live vaccine. .
更に、rMDV1＋AK01株の投与群では、抗体価の持続を調べたTM株に対しては、追加免疫後、少なくとも22週間に亘って中和抗体価が維持された（図４）。 Furthermore, in the rMDV1 + AK01 strain administration group, the neutralizing antibody titer was maintained for at least 22 weeks after the booster against the TM strain examined for the persistence of the antibody titer (FIG. 4).
《IBV-S1発現MDV1を接種後、雛にIBV生ワクチンを追加した場合の併用効果》
実施例３で得たrMDV1-S1（2040 PFU/羽）を、18日齢発育鶏卵（SPF、化学及血清療法研究所）（19羽）に接種し、孵化後4日齢または21日齢時の雛にIBV生ワクチンAK01株(化学及血清療法研究所)を追加的に点眼接種した（それぞれ1群5羽、1群4羽）。コントロールとして、rMDV1-S1のみを卵内接種した群、孵化後4日齢時の雛に生ワクチンのみを投与した群を設定した（各群5羽）。経時的に採血し、IBV各株（TM86株、AK01株、練馬株、C78株）に対する中和抗体価を調べることで評価を行った。《Combination effect when IBV live vaccine is added to chicks after inoculation with IBV-S1-expressing MDV1》
RMDV1-S1 (2040 PFU / feather) obtained in Example 3 was inoculated into 18-day-old chicken eggs (SPF, Institute of Chemo- and Serological Therapy) (19 chicks), 4 days or 21 days after hatching The chicks were additionally instilled with live IBV vaccine AK01 strain (Chemical and Serum Therapy Laboratory) (5 birds per group, 4 birds per group). As a control, a group in which only rMDV1-S1 was inoculated in the ovum and a group in which only the live vaccine was administered to chicks at the age of 4 days after hatching were set (5 birds in each group). Blood was collected over time and evaluated by examining the neutralizing antibody titer against each IBV strain (TM86 strain, AK01 strain, Nerima strain, C78 strain).
ベクターワクチン（rMDV1-S1）を接種した後、追加的にIBV（AK01株）生ワクチンを投与した群では、いずれもベクターワクチン又はIBV（AK01株）生ワクチンの単独投与群には見られない、異なる血清型のIBV株に対して中和抗体を誘導した（図５−１〜図５−４）。また、追加投与群では、ベクターワクチン又はIBV生ワクチンの単独投与群に比較して、高い中和抗体価が惹起され、かつ誘導された抗体価は、少なくとも孵化後9か月間に亘って高いレベルで持続することが確認された。 After inoculating the vector vaccine (rMDV1-S1), in addition to the group administered with the IBV (AK01 strain) live vaccine, neither is seen in the vector vaccine or the IBV (AK01 strain) live vaccine alone administration group, Neutralizing antibodies were induced against serotype IBV strains (FIGS. 5-1 to 5-4). Further, in the additional administration group, a high neutralizing antibody titer was induced and the induced antibody titer was at a high level for at least 9 months after hatching, as compared to the single administration group of vector vaccine or IBV live vaccine. It was confirmed that it will last.
《NDV-F発現MDV1（207株）とND生ワクチンB1株の同時投与における免疫効果》
ニューカッスル病（ND）ウイルスのFタンパク質（NDV-F）がMDV1のUS10遺伝子領域に挿入された組換えベクターウイルス207株（Journal of Virology, 2000, 74, 3217-26）を有効成分とするベクターワクチンとND生ワクチンB1株（化学及血清療法研究所）を表２に記載の割合で混合して、この0.2ml／羽（一群21羽）を、孵化場より購入した一日齢ヒナ（イサブラウン、坪井種鶏孵化場、山鹿市）の頸部皮下に接種した。経時的に採血し、得られた血清についてELISAにより、NDV-Fに対する抗体価を測定した。《Immune effect in simultaneous administration of NDV-F expressing MDV1 (207 strain) and ND live vaccine B1 strain》
A vector vaccine comprising the recombinant vector virus 207 strain (Journal of Virology, 2000, 74, 3217-26) in which the F protein (NDV-F) of Newcastle disease (ND) virus is inserted in the US10 gene region of MDV1 And ND live vaccine B1 strain (Chemistry and Serum Therapy Research Institute) were mixed at the rate shown in Table 2, and 0.2 ml / wing (21 birds per group) was purchased from the hatchery. Inoculated subcutaneously in the neck of Tsuboi breeder hatchery, Yamaga City). Blood was collected over time, and the antibody titer against NDV-F was measured by ELISA for the obtained serum.
具体的には、NDV石井株を1%オクチルゴルコシド（DOJINDO）で溶解した後、PBE(-)で希釈し、96 wellマイクロプレートに一穴あたり約100HA（赤血球凝集価）/100μLを分注し4℃一夜放置して固相化した。これに希釈液（PBS-に脱脂粉乳を5%、ポリソルベート20を0.5%添加）で100倍に希釈した鶏血清を室温で１時間反応させ、洗浄後、HRPで標識したNDV-Fに対するモノクローナル抗体（Journal of Virology, 1990, 71, 1189-1197）を適当濃度（OD値が1〜2程度になるように希釈液で調整）添加し、o-フェニレンジアミン二塩酸塩（片山化学）を基質として発色させた。ELISA値で20.0以上を示したものをNDV-F抗体陽性とした。
Specifically, the NDV Ishii strain was dissolved in 1% octyl gorcoside (DOJINDO), diluted with PBE (-), and approximately 100 HA (red blood cell agglutination) / 100 μL per well was dispensed into a 96-well microplate. Then, it was left to stand at 4 ° C. overnight to be solid-phased. Chicken serum diluted 100-fold with diluted solution (5% skim milk powder and 0.5
その結果、ベクターワクチンとND生ワクチンを同時接種した群は、移行抗体の力価が低下する時期の4週齢以降において、ベクターワクチン（207株）を単独で投与した群より高い陽性率を示した（表２）。表２は、207株及びND生ワクチンB1株投与鶏群におけるNDV-F抗体陽性率（％）の推移を示す（n=21:ただし2群の2週齢のみn=20）。 As a result, the group vaccinated with vector vaccine and ND live vaccine showed a higher positive rate than the group administered vector vaccine (207 strains) alone after 4 weeks of age when the titer of the transfer antibody decreased. (Table 2). Table 2 shows the transition of the NDV-F antibody positive rate (%) in the 207 strain and the ND live vaccine B1 strain-treated chicken group (n = 21: However, 2 groups of 2 weeks of age only n = 20).
本願発明の感染因子由来の感染防御抗原が組み込まれたベクターワクチン及び該感染因子の弱毒化生ワクチン、並びにこれらを併用する方法は、ヒト以外の感染症を阻止するためのワクチネーションに効果的に利用され得る。 The vector vaccine in which the infection protective antigen derived from the infectious agent of the present invention is incorporated, the live attenuated vaccine of the infectious agent, and the method of using these in combination are effective for vaccination for preventing non-human infectious diseases. Can be used.
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