JP6147120B2

JP6147120B2 - Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに対する免疫原としての付着因子

Info

Publication number: JP6147120B2
Application number: JP2013142013A
Authority: JP
Inventors: サヴァリノ，スティーヴン・ジェイ
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2005-01-11
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2026-01-10
Also published as: EP1855718A2; US10501504B2; EP2471549A1; US9079945B2; JP2013253083A; US20190055292A1; ES2610395T3; US20060153878A1; AU2006205128A1; US20150266932A1; EP1855718A4; CA2592444A1; EP1855718B1; JP2008526967A; US10017547B2; WO2006076285A3; AU2006205128B2; JP2016053068A; JP5554471B2; WO2006076285A2

Description

発明の詳細な説明

関連出願の相互参照
本出願は、2005年1月11日に出願したU.S.仮出願60/642,771の基づく優先権を主張し、
その内容を本明細書中に参考文献として援用する。

技術分野
本発明の主題は、バクテリアの線毛または微小繊維の構成成分を使用した、毒素原性Es
cherichia coliを含む下痢性バクテリアに対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発
明の方法は、下痢性バクテリアに対する免疫原として、Escherichia coli付着因子を使用
することを企図する。

背景技術
腸管毒素原性Escherichia coli（ETEC）は、資源の乏しい国々における幼児の下痢の主
要な原因であり、およびこれらの地域への旅行者における下痢の主要な原因でもある（1
、2）。ETECは、小腸上皮細胞への接着および易熱性エンテロトキシン（LT）および／ま
たは耐熱性エンテロトキシン（ST）の発現により、疾患を生じる（3）。ETECは、典型的
には、定着因子（CF）として知られる繊維状のバクテリア表面構造を介して、宿主細胞に
対して接着する。20種類以上のCFが記述され、少数の事例では、明らかに病原性の原因と
なっていた（4）。

病原性に関する確実な証拠が、記述された最初のヒト-特異的ETEC CFである定着因子抗
原I（CFA/I）について存在している。CFA/Iは、遺伝学的特徴および生化学的特徴を共有
する8種類のETEC線毛のファミリーの典型的なものである（5、4、6、7）。このファミリ
ーには、coliの表面抗原1（CS1）、CS2、CS4、CS14、CS17、CS19および推定定着因子O71
（PCFO71）が含まれる。CFA/I、CS1およびCS2をコードする遺伝子クラスタの完全なDNA配
列が、発表された（8、9、10、11、12）。その他の関連する線毛のうちの2種の主要サブ
ユニットについての遺伝子が報告された（13、6）。CFA/I、CS1、およびCS2の4種の遺伝
子からなるバイオアッセンブリオペロンは、同様に構成され、（順番に）ペリプラズムシ
ャペロン、主要線毛性サブユニット、外膜アッシャー（アッシャー）タンパク質、そして
副線毛性サブユニットをコードする。CFA/Iアッセンブリは、代替のシャペロン経路を介
して生じ、I型線毛形成の古典的シャペロン-アッシャー経路およびIV型線毛などのその他
の繊維状の構造の古典的シャペロン-アッシャー経路とは異なる（14、15）。主要線毛性
サブユニットの一次配列に基づき、CFA/Iおよび関連する線毛は、クラス5線毛としてグル
ープ化された（16）。

同様に、しかしクラス5線毛とは異なり、coli 表面抗原3（CS3）は、ETEC定着因子抗原
II（CFA/II）複合体の共通接着性微少繊維を示す。これらの抗原を発現するETECは、世界
の多くの場所で一般的である。微小繊維を含有するCS3の立体構造的性質は、クラス5線毛
よりもあまりよく知られていないが、これらの構造が、企図される抗-ETECワクチンにお
ける重要な構成成分となるだろうと予想される。

CS1の研究により、クラス5線毛の組成および機能的特徴についての詳細が得られた（17
）。CS1線毛性軸は、CooA主要サブユニットの繰り返しから構成される。CooD副サブユニ
ットは、線毛性端部に局在すると考えられており、線毛質量の非常にわずかな割合を含み
、そして線毛形成の開始に必要とされる（18）。主要サブユニットが結合を媒介すること
を示唆する初期の証拠とは対照的に（19）、最近の知見により、副サブユニットが付着因
子として関与するとされ、そしてCS1およびCFA/I線毛のin vitro接着のために必要とされ
る特異的なアミノ酸残基が同定された（20）。配列解析されたそれら主要サブユニットの
推測された一次アミノ酸構造は、広範囲な類似性を共有する。しかしながら、天然の線毛
の血清学的交差反応性は限定的であり、そして交差反応性のパターンは、主要サブユニッ
トの系統発生学的に定義された亜分類群（subtaxon）と創刊する（13）。

クラス5線毛の副サブユニットの実際の付着因子としての関連性は、主要サブユニット
の保存性の程度と比較して、それらの保存性の程度に関する精査を必要とする。CooDおよ
びそのホモログが、リガンド結合要求性および／またはその免疫反応性によりもたらされ
る機能的な制限のためにより高い類似性を保持し、それ自体、線毛性組成に関して、主要
サブユニットの副サブユニットに対する非常に大きな比率に起因していることが推測され
た。クラス5 ETEC線毛および2種のアッセンブリタンパク質の副サブユニットと主要サブ
ユニットの進化的関係を調べるための研究が行われた（21）。進化的な特徴は、クラス5
主要線毛サブユニットおよび副線毛サブユニットとの間に存在し、そして副サブユニット
が付着因子として機能することが示された。これらの知見は、ワクチン関連研究に対する
実務的な関連性を提供する。

CS4、CS14、CS17、CS19およびPCFO71をコードする遺伝子クラスタのヌクレオチド配列
は、モノクローナル抗体による検出によりそれぞれの線毛についての陽性が試験されたE
TECの野生型下痢-関連単離株から決定された（21）。新たに配列決定されたCS4、CS14、C
S17およびCS19 の伝子クラスタの主要サブユニット対立遺伝子はそれぞれ、以前にGenBan
kに寄託された（1または複数の）対応する遺伝子配列と99〜100％のヌクレオチド配列同
一性を示し、1対立遺伝子あたり4つよりも多いヌクレオチドの差異はなかった。各遺伝子
座は、4つのオープンリーディングフレームを有し、CFA/Iクラスシャペロン、主要サブユ
ニット、アッシャー、および副サブユニットと相同性を有するタンパク質をコードした。
以前に報告されたように（13）、一つの例外は、CS14遺伝子クラスタについてのものであ
り、これがシャペロン遺伝子の下流に2つのタンデムのオープンリーディングフレームを
含んだ。それらの予想タンパク質配列は、互いに94％のアミノ酸同一性を共有し、そして
両方ともその他のクラス5線毛主要サブユニットと相同であった。

クラス5線毛生合成に関与するすべてのタンパク質ホモログの予想アミノ酸配列の調査
から、多数の基本的な類似性が示される。属をまたいで、ホモログの各組み合わせは、一
般的に、ポリペプチドの長さ、質量、および理論的な等電点に関して、類似する物理化学
的特性を共有する。すべての関連するタンパク質は、II型分泌経路を介したペリプラズマ
への輸送を促進する、アミノ末端シグナルペプチドを含有する。主要サブユニットタンパ
ク質のいずれも、システイン残基を含有しないが、一方、副サブユニットのすべてについ
て、6個のシステイン残基のうち4個しか含有しないY. pestisホモログ3802を除き、6箇所
のシステイン残基の数および位置は保存されている。

1型およびP線毛は、古典的なシャペロン-アッシャー経路により組み立てられる線毛の
遺伝的な詳細および構造的な詳細を評価する際に、有用なモデルであった（23、24、25）
。この研究の結果は、線毛サブユニットを、重要で失われたβ-鎖の反復性サブユニット
間共有により、隣接するサブユニットと非共有結合する方法である、ドナー鎖相補性の変
形性の原理を開発することであった（22、26）。証拠から、Haemophilus influenzaeヘム
アグルチニン線毛（27）、およびYersinia pestis夾膜タンパク質、非線毛性タンパク質
ポリマー（28）のフォールディングおよび四次構造完全性のこの同一のメカニズムを示し
た。これらの構造の両方は、古典的シャペロン-アッシャー経路により組み立てられる1型
およびP線毛の異なるクラスI相対物である。進化の観点から、このことは、ドナー鎖相補
性のメカニズムが、このクラスの存在する線毛が由来する始原線毛システムにおいて生じ
たことが示唆される。ドナー鎖相補性は、非共有的に結合したポリマー性表面タンパク質
についてのタンパク質フォールディングの問題に対する巧妙な生物学的解決を示す一方、
古典的なアッシャー-シャペロン経路のもの以外の接着性線毛によるその開発は、示され
たなかった。

代替のシャペロン経路および古典的シャペロン-アッシャー経路により組み立てられる
線毛に共通するのは、サブユニットミスフォールディングを排除するためのペリプラズマ
シャペロン、および外膜でのポリマー化を振り付けるアッシャータンパク質についての要
求性である。これらの別個の経路の線毛性アッセンブリおよび構造的構成成分が配列の類
似性を共有しないということは、それらが、収束性の進化経路を通って生じたことが示唆
される。それにもかかわらず、CFA/I構造サブユニットのコンピュータ解析から、ドナー
鎖相補性がシャペロン-サブユニット相互作用およびサブユニット-サブユニット相互作用
を支配しうる可能性が示唆される。

8種類のETECクラス5線毛は、3種の構成成分（CFA/I、CS4、およびCS14）、4種の構成成
分（CS1、PCFO71、CS17およびCS19）、および1種の構成成分（CS2）の3つのサブクラスに
クラスター化された（それぞれ、サブクラス5a、5b、および5cと呼ぶ）（21）。以前の報
告において、ETEC保持性CFA/I、CS2、CS4、CS14およびCS19が、培養Caco-2細胞に対する
接着を明らかにすることが示された（6、22）。しかしながら、CFA/IおよびCS1の構成成
分サブユニットが接着を媒介することに関して、相反するデータがはっぴょうされた（19
、20）。

線毛性構成成分が接着を媒介する役割を果たすというこの問題には、無傷CFA/I線毛、C
faB（主要サブユニット）に対する抗体の接着-阻害活性評価することにより、そして2つ
の異なるin vitro接着モデルにおけるCfaE（副サブユニット）の非-重複性アミノ末端（
残基23〜211）部分およびカルボキシ末端（残基212〜360）部分に対する抗体の接着-阻害
活性を評価することにより、アプローチした（21）。CFA/I接着のためのもっとも重要な
ドメインは、付着因子CfaEアミノ末端部分に存在することが示された（21）。

上記に概略したこの研究は、CFA/Iおよびその他のクラス5線毛の副サブユニットが、受
容体結合性部分であるという証拠を提供する（20）。これらの知見と一致して、線毛性サ
ブクラス5aおよび5bにおいて観察された副サブユニットの低レベルの配列多様性のため（
20）、進化的な関係は、これらの2つのサブクラスのそれぞれのを示す副サブユニットの
アミノ末端部分に対する抗体の交差反応性と相関した（21）。

本発明の側面は、クラス5線毛、または線毛接着またはCS3微小繊維または構造的に安定
なCS3微小繊維構成成分の原因となる構造的に安定な線毛構成成分、のいずれかまたは両
方を組み込む、ETEC系統に対する免疫応答を誘導する方法である。

発明の概要
毒素原性Escherichia coliなどの多数の下痢性バクテリアに対する現在利用可能なワク
チンは、適切なように有効ではない。これらの生物に対する新たなワクチン製剤が、特に
下痢性疾患がもっとも一般的でありそして医学的な施設が限られている開発途上国にとっ
て、重要である。

本発明の目的は、線毛性付着因子または微小繊維の付着因子をコードするポリペプチド
を投与することにより、クラス5 Escherichia coli線毛に対する、抗体反応を含む、免疫
応答を誘導する方法である。

さらなる目的は、線毛または微小繊維の宿主細胞に対する接着を阻害することにより、
Escherichia coliの定着を予防することである。
さらなる目的は、ワクチン製剤において使用するための、構造的に安定なプロテアーゼ
耐性付着因子ポリペプチド構築物を構築することである。

さらに追加的な目的は、付着因子ポリペプチド構築物を使用して、毒素原性E. coliを
含むEscherichia coliの線毛に対する免疫性を誘導することである。
本発明のこれらのおよびその他の目的は、免疫性を誘導するための免疫原性構成成分と
して、Escherichia coli付着因子ポリペプチドを使用することにより達成される。

本発明の開示と、本発明を実施するための最良の態様
本発明は、線毛または線毛付着因子抗生物質を投与することにより、抗-接着性免疫応
答を誘導するための方法および生物学的組成物に関する。ここで、コンピュータ読みとり
可能形式で記録された情報は、記載された配列表と同一であることを述べる。

毒素原性Escherichia coli線毛の末端分子抗生物質である付着因子は、宿主細胞に対す
るバクテリアの接着のためのエフェクターである可能性がある（21）。従って、付着因子
は、バクテリアの定着および病原性のために重要である。

クラス5線毛の接着性サブユニットを用いて免疫化する本発明の方法は、バクテリアの
付着因子に対して特異的に結合し、下痢性バクテリアの定着を妨害する、主としてイムノ
グロブリン媒介性免疫を誘導しうる。従って、この方法は、下痢性バクテリアに対して優
れたそしてより効率的な免疫を提供することができる。さらに、無傷の線毛またはバクテ
リア全体の代わりに線毛性付着因子サブユニットを使用することにより、免疫の効率が改
善された免疫を誘導するために、顕著に少ない抗原しか必要としない。

本発明は、Escherichia coli線毛の先端に構造的に局在する宿主-細胞接着性構成成分
である、Escherichia coli付着因子をコードするポリペプチドを投与することにより、免
疫を誘導するための方法を提供する。典型的な線毛、定着因子抗原I（CFA/I）は、もっと
も重要な毒素原性Escherichia coli（ETEC）系統で見いだされる。しかしながら、ETEC付
着因子が進化的に非常に関連しているため、その他のクラス5線毛を使用することもでき
る。

付着因子ポリペプチドの構造的な安定性および潜在的なプロテアーゼ耐性は、最大の免
疫原性を保証するために重要である。付着因子モノマーの構造的完全性は、隣接する主要
構造的線毛性モノマーによりもたらされた供与β-鎖によりもたらされる。たとえば、CFA
/I付着因子、CfaE、の構造的安定性は、CfaB由来のドナーβ-鎖によりもたらされる。

改良型抗-線毛性付着因子免疫に関して、本発明の側面は、付着因子ポリペプチド配列に対する構造的安定性の授与である。付随的にワクチンの効率性が改良された付着因子ポリペプチド免疫原の構造的安定性を保証するため、本発明の一側面は、ドナーβ-鎖を隣接する付着因子ポリペプチド配列に対して機能可能にもたらすように設計された、ポリペプチド構築物である。構築物は、そのC-末端でリンカーポリペプチドに連結された付着因子ポリペプチドを含み、リンカーポリペプチドが次に、そのC-末端で、主要線毛性構造サブユニット、たとえばCfaB、のすべてまたは一部をコードするポリペプチドに連結される。

実施例1
付着因子は、もっとも重要なワクチン-関連毒素原性Escherchia coliバクテリア構成成
分である

クラス5 Escherchia coli線毛結合
CFA/Iは、遺伝的特徴および生化学的特徴を共有するETEC線毛のファミリーの典型であ
る（5、4、6、7）。遺伝子オペロンは、ペリプラズマシャペロン、主要線毛性サブユニッ
ト、外膜アッシャータンパク質、および副線毛性サブユニットから構成される。主要サブ
ユニット配列に基づいて、CFA/Iおよび関連する線毛を、クラス5線毛と一緒にグループ化
した（16、21）。クラス5主要線毛性サブユニットおよび副線毛性サブユニットの間に機
能的な特徴が確認され、そして副サブユニットが付着因子として機能することが、複数の
研究から確認された。したがって、副サブユニットは、ワクチン構築物のための線毛のも
っとも重要な構成成分である。

クラス5ETEC線毛のそれぞれを個別に発現する型系統は、A型ヒト、ウシ、およびニワ
トリ赤血球とのマンノース-耐性赤血球凝集（MRHA）による赤血球接着に関して、特徴づ
けられた（21）。接着実験において使用されたすべてのETEC系統の表現型は、表1に示さ
れる。CS1、CS4、CS14、CS17、CS19およびPCFO71を発現した型系統は、エジプトにおける
小児期下痢の長期的な研究の一部として、下痢をしている若年の子供の糞便からそれぞれ
単離された（29）。

ETEC系統は、A型ヒト、ウシ、およびニワトリ赤血球のマンノース-耐性赤血球凝集（MR
HA）について試験された。MRHA法は、以前に記載された方法に基づいた（30）。結果は、
表1に示される。

これらの研究において、ルーチンの増殖およびタンパク質発現について、バクテリアを
Luria-Bertani培地（31）またはリッチ培地（1 Lあたり10 gトリプトン、5 g酵母抽出物
、5 g NaCl、および2 gグルコース）中で増殖させた。For 赤血球凝集および組織培養接
着アッセイのため、培養物を、1 Lあたり1.5 gのBacto Bile Salts no. 3（Difco, Detro
it, MI）を添加したかまたは添加しないCFAアガー（32）上で増殖させた。アンピシリン
（62.5μg/ml）およびカナマイシン（50μg/ml）を、選択圧として必要に応じて添加した
。ヒト赤血球を単一のボランティアドナーから必要に応じて回収し、そしてウシおよびニ
ワトリ赤血球はLampire Laboratories（Pipersville, PA）から購入した。赤血球を、Als
ever溶液中4℃で最大2週間、使用するまで保存した。各アッセイの直前に、赤血球を洗
浄し、そして0.5％D-マンノースを含むPBS中に懸濁して、最終濃度3％となるようにした
。バクテリアを、37℃で一晩増殖させ、そして0.5％D-マンノースを含むPBS中に懸濁して
、最終濃度約1×10¹⁰コロニー形成単位（cfu）/mlとなるようにした。等容量（25μl eac
h）の3％赤血球、バクテリア懸濁物、そして0.5％D-マンノースを含むPBSを12-ウェルセ
ラミックタイル（CoorsTec, Golden, CO）上のウェルに添加し、そしてその中で混合し、
氷上で20分間揺らし、目視検査により等級分けし、そして以下の様にスコア化した：陰性
、MRHA活性なしを示す；1+、低、弱反応を示す；2+、中程度反応を示す；3+、強反応を
示す；そして4+、赤血球のすべてが関与するほぼ瞬間的で完全な反応を示す。

本発明者らはまた、Caco-2細胞に対する構成成分サブユニット接着を解析した。これら
の研究の結果は、表1にも示される。接着アッセイを、以前に記載した方法（33、34）に
若干の修正を施して行った。簡単に述べると、Caco-2細胞を、2mM L-グルタミン、20％胎
児ウシ血清、0.1 M非-必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、および1.5 g /L重炭酸
ナトリウムを添加したEMEM培地（Earleの平衡化塩類溶液中Earleの最小必須培地）中、5
％CO₂を添加した空気中で37℃で維持した。細胞を24ウェルプレート（Costar, Corning,
NY）中にまき、組織培養-処理したガラス製のカバースリップ（Fisher Scientific）を載
せ、そして14日間（±1 d）インキュベートしてコンフルエント以上にし、PBSで洗浄し、
そして750μlの添加物入りEMEMでアッセイまで覆った。バクテリア系統を、胆汁酸塩を含
むかまたは含まないCFAアガー上で、37℃で一晩増殖させ、そして1％D-マンノースを含む
添加物入りEMEM中で1×10⁹バクテリア/mlとなるように懸濁した。懸濁物を、組織培養ウ
ェルに対して、最終濃度が2.5×10⁸バクテリア/mlで添加した。プレートを、以前に記載
されたように（34）、インキュベートし、洗浄し、固定し、染色しそしてマウントし、そ
して顕微鏡で観察した。100個の無作為に選択した細胞に対して接着するバクテリアの数
をカウントし、少なくとも1個の接着バクテリアを有する細胞の平均数（接着指標1）、お
よび少なくとも1個の接着バクテリアを有するCaco-2細胞あたりのバクテリア数（接着指
標2）を得た。それぞれのバクテリア系統について、最低でも3回の実験を二重にして行っ
て接着指標を決定し、平均±標準偏差（SD）として表した。

CFA/I、CS2、CS4、およびCS14とCS19とを有するETEC は、培養Caco-2細胞に対する接着
を示すことが以前に報告された（6、22）。クラス5線毛を有するETEC型系統のそれぞれに
対するCaco-2細胞接着アッセイを行って、これらの知見を確認し、そして各系統について
の接着のレベルを定量した。結果（表1）から、CFA/I、CS4、CS14およびCS2を有する系統
はそれぞれ、中程度ないし高レベルのCaco-2細胞接着を実際に示し、一方より低レベルの
接着がCS19-を有する系統については観察されることが示された。対照的に、CS1、CS17お
よびPCFO71を発現する系統は、限界レベルの接着を示す。サブクラス5b線毛を有する系統
をCFA/I陽性レギュレータcfaDを含有するプラスミドによりトランスフェクションすると
、CS19-ETEC系統WS0115Aに関してのみ、Caco-2細胞接着の増加が伴った。

クラス5 ETEC線毛の進化的関係を考慮すると、それらの系統発生と相関するいくつかの
特徴的な機能的特徴が存在することを示すことができる。サブクラス5a線毛は、ヒトA型
赤血球のMRHAを引き起こす能力を有するため、その他のものとは異なる。CS19-ETECを除
き、サブクラス5b線毛は、培養Caco-2細胞に対して何らかの接着性を有しても弱いことが
示され、それらがその他の2種類のサブクラスと区別される。

付着因子 are responsible for線毛 binding.
宿主細胞結合の原因となる線毛構成成分を決定するため、付着因子に対する特異的抗体
がCFA/1およびCS1線毛接着を阻害する能力を解析した（21）。我々はさらに、これらの部
分に対する抗体が、進化的関係に従って、交差反応をするかどうかという問題を評価した
。このことは、無傷CFA/I線毛、CfaB（主要サブユニット）に対する抗体の接着-阻害活性
、無傷CFA/I線毛、CfaB（主要サブユニット）に対する抗体の接着-阻害活性、、そして2
種の異なるin vitro接着モデルCfaE（副サブユニット）非-重複性アミノ-末端（残基23-2
11）およびカルボキシ-末端（残基212-360）部分（CfaEの配列についてはSEQ ID No. 4を
参照）に対する抗体の接着-阻害活性、を測定することにより、間接的に評価した。

CFA/IおよびCS17線毛は、以前に記載されたように生成ｈした（35、36）。ウサギポリ
クローナル抗体調製物は、MBP-CfaB_24-170、MBP-CfaE_23-211、MBP-CfaE_212-360、MBP-Csb
D_19-214に対して、そして天然CFA/IおよびCS17線毛に対して調整した（21）。これらの上
述したE. coli type系統のそれぞれは、CFA/I、CS1およびCS2を発現したものを除き、of
対応する線毛性オペロンの配列解析に対するDNAの供給源でもあった。E. coli BL21（F^-
ompT hsdSB（rB^-mB^-） gal dcm）を、商業的供給源（New England Biolabs, Beverly, MA
）から取得し、そしてマルトース-結合タンパク質（MBP）融合物のクローニングおよび発
現のために使用した。ウサギの免疫化および抗血清回収を、Harlan Bioproducts for Sci
ence, Inc. （Indianapolis, IN）により行った。生成されたIgGは、製造会社（Amersham
Pharmacia, Piscataway, NJ）により指示されたように、Hi-Trapタンパク質Gカラムを使
用して各抗血清から取得した。これらの調製物のそれぞれから、Pierce ImmunoPure F_ab
調製キット（Pierce, Rockford, IL）を使用して、F_abフラグメントを作成した。

ETEC系統を、マンノース-耐性赤血球凝集（MRHA）について試験した。赤血球凝集阻害
（HAI）アッセイのため、各バクテリア系統を、最小赤血球凝集力価の2倍（2×MHT）に対
応する濃度で使用した。MHTを、各HAIアッセイ日の開始時点で、PBS中でバクテリア懸濁
物の連続2倍希釈物を作製することにより（1×10¹⁰cfu/ml開始濃度から）決定した。各
希釈物計25μlを、3％赤血球懸濁物および0.5％D-マンノースを含むPBSの等量に対して添
加し、そして氷上で揺らした。MHTを、少なくとも1+ MRHAを示すバクテリアの最低濃度の
逆数として定義した。各F_ab抗体調製物のHAI力価を決定するため、2倍希釈列を、ストッ
ク抗体溶液（2 mg/ml）により開始した。25μl容量の各F_ab希釈物を、セラミックタイル
ウェル中の等量の2×MHTバクテリア懸濁物に対して添加し、室温で揺らしながら20分間、
プレインキュベートした。次に、等量の赤血球懸濁物（3％）を、各ウェルに添加し、タ
イルを氷上で20分間揺らし、そしてMRHAを上記の通りスコア化した。HAI力価は、MRHAを
完全に阻害した抗血清の最高希釈の逆数として表した。

Caco-2細胞接着阻害実験のため、120μl分のF_ab抗体調製物（2 mg/ml開始濃度）を480
μlのバクテリア懸濁物に対して添加し、室温で20分間プレインキュベートした。抗体調
製物の代わりにPBSを添加したものを、各実験における陰性対照として使用した。250μl
分のバクテリア／抗体混合物（2.5×0⁸ バクテリア/ml）を、組織培養ウェルに対して添
加した。細胞をインキュベートし、処理し、そして上述したように解析した。阻害レベル
は、抗体を含む場合および含まない場合の初期接着指標を比較することにより決定した。
各試験バクテリア／抗体調製物について、最低3回の実験を2重にして行った。Caco-2接着
研究において、各抗体調製物の存在下にて行った接着を、PBSを添加したものと、片側Stu
dent Tテストを使用して比較し、サンプル間の不等分散（unequal variance）を推測した
。HAI実験に関して、実験群間の相互関係の力価を、対サンプルについてのWilcoxon符号
付き順位検定（片側）を使用して、XLSTATデータ解析ソフトウェアを使用して、比較した
。

4種の抗体調製物のそれぞれを、MRHA中およびCaco-2細胞接着アッセイ中の系統H10407
（CFA/I）の接着を阻害する能力について評価した。図1（A）は、MBP、CFA/I、CfaB、Cfa
E_23-211（CfaE_Nと表記）、およびCfaE_212-360（CfaE_Cと表記）に対して特異的なF_ab抗体
の中央値逆数赤血球凝集阻害（HAI）力価を示し、log₂目盛り上にプロットした。2の逆数
（検出限界）以下の値を、グラフの目的のために1.05として任意にプロットした。図1（B
）は、同一の特異性を有するF_ab抗体とともにバクテリアをプレインキュベーションした
後の、H10407の平均Caco-2細胞接着指標（少なくとも1つの接着バクテリアを有する％Cac
o-2細胞、±SD）を示す。すべての調製物を、それぞれ2重にして行った少なくとも3回の
実験で試験した。

最高のヒトA赤血球赤血球凝集阻害（HAI）活性は、CfaE_23-211に対して特異的なF_abを
用いて観察されたが、一方、CfaB抗体は、ずっと低いレベルのHAI活性を示した（図1（A
））。CFA/IまたはCfaE_212-360に対するF_ab抗体を用いて、HAI活性は検出されなかった。
一貫した知見がCaco-2細胞接着阻害アッセイにおいて観察され、最高の阻害活性が抗-Cfa
E_23-211 F_ab画分に起因していた（図1（B））。このアッセイにおいて、抗-CFA/I F_ab抗
体は、より低いレベルの阻害を示し、そしてCfaBおよびCfaE_212-360に対して特異的な調
製物は、検出可能な効果を示さなかった。あわせると、これらの知見から、CFA/I 接着の
ためにもっとも重要なドメインは、CfaEのアミノ-末端半分に存在することが示唆される
。

進化的関係が5aおよび5bサブクラスを示す副サブユニットのアミノ-末端半分に対する
抗体の交差反応性と相関するという仮説を試験するため、抗-CfaE_23-211 F_abの異種クラ
ス5線毛を発現する野生型系統の接着に対する阻害効果を評価した。我々の予想と一致し
て、抗-CfaE_23-211は、CS4-ETECおよびCS14-ETECのウシMRHAを阻害した（図2（A））。対
照的に、抗-CFA/I F_ab抗体は、CFA/I-ETEC のウシMRHAを、抗-CfaE_23-211よりも低い程度
で阻害したが、一方CS4またはCS14を有するETECのMRHAを阻害することはできなかった。
同一の結果が、抗-CFA/I F_abがCFA/I-ETEC HAIを提示することができないことを除き、ヒ
ト赤血球を使用して得られた。どの抗体調製物も、他の2種のサブクラスの異種CFを有す
るのウシMRHAを阻害しなかった。

これらの知見は、Caco-2細胞接着アッセイにおける各F_ab調製物の阻害効果を測定する
ことにより、裏付けられた。抗-CfaE_23-211抗体は、バクテリアをPBS（図3）または抗-MB
P抗体（データは示さず）とプレインキュベートした場合の接着レベルと比較した場合、C
S4-ETECとCS14-ETECの接着を阻害した。しかしながら、CS14-ETECの消失した接着は、統
計的な有意性を示さなかった。同一濃度において、抗-CFA/I抗体は、抗-CfaE_23-211 F_ab
が阻害した程度よりも顕著に低い程度ではあったが、H10407（CFA/I）のCaco-2細胞接着
を阻害した。しかしながら、抗-CFA/I F_abは、同一のサブクラス（図3）または異なるサ
ブクラス（データは示さず）の異種CFを有するETECの結合を阻害しなかった。

これらの知見をさらに強化するため、我々は、CS17（サブクラス5b）副サブユニットC
sbDのアミノ-末端半分に対する抗体を作製し、そしてMRHAおよびCaco-2組織培養細胞モデ
ルシステムにおいて、その阻害活性を、抗-CS17線毛性抗体の阻害活性とともに評価した
。抗-CS17および抗-CsbD_19-214 F_ab抗体の両方とも、CS17を有するETECについてのウシ赤
血球HAI活性を示した、抗-CsbD_19-214のHAI力価は有意に高かった（図2B）。抗-CS17 F_ab
抗体とは異なり、抗-CsbD_19-214 F_ab画分もまた、その他のサブクラス5b線毛のそれぞれ
を有するETECについて、有意なHAI活性を示す。とりわけ、抗-CsbD_19-214抗体のサブクラ
ス内CF-異種HAI活性は、抗-CfaE_23-211抗体の同程度の効果に対するよりも、そのCS17-ET
EC HAI活性とより近い程度であった。この知見は、サブクラス5b内の副サブユニットのよ
り高い程度の同一性をもたらすことが予想された。どの調製物も、その他の2種のサブク
ラスのCFを有するETECのウシMRHAを阻害しなかった。

Caco-2細胞接着アッセイにおいて、我々は、Caco-2細胞に対して特異的に接着する様で
ある唯一のサブクラス5b線毛であるCS19-ETECに対する同一の抗体調製物の阻害効果を評
価した。ここで、我々はまた、抗-CsbD_19-214（抗-CS17抗体ではなく）が、CS19-ETEC接
着の有意な阻害を示すことを見いだした（図3）。図3において、実験において使用した系
統が、上記の各グラフに示される。y-軸は、Caco-2細胞接着指標（少なくとも1つの接着
バクテリアを有するCaco-2細胞の％）を示す。結果は、それぞれ2重にして行った少なく
とも3回の実験の平均（±SD）を示す。P値は、陰性対照（PBS）と示された抗体調製物と
の間での差異についてのものである。どの調製物も、代表的なサブクラス5aまたは5c線毛
を発現するETECのCaco-2細胞接着を阻害しなかった（データは示さず）。

実施例2
クラス5接着線毛に相補的な構造的に安定なドナー-鎖〜付着因子免疫原性構築物
CFA/I構造サブユニットのコンピュータ解析から、ドナー鎖相補性がシャペロン-サブユ
ニットおよびサブユニット-サブユニット相互作用を支配することが示唆される。従って
、我々は、構造的に安定な構築物を構築した。ここで、CfaBのアミノ-末端ドナーβ-鎖が
、CfaE のcisカルボキシ-末端伸長部をもたらし、この分子に対して構造的安定性および
プロテアーゼ耐性を付与し、ヒト赤血球に結合する能力を有する可溶性モノマーを形成し
た。

我々は、クラス5 ETEC線毛の主要サブユニットおよび副サブユニットの8種類のホモロ
グのアミノ酸配列についてのマルチアラインメントを作成し、共通構造モチーフを同定し
た。二次構造予想アルゴリズムから、両サブユニットが、全長にわたり分布するβ-鎖が
豊富な両親媒性構造を形成することが示された。26％のコンセンサス副サブユニット配列
が、疎水性コアを形成することが予想される17個の散在性β-鎖を含むβ-構造中に折り畳
まれると予想される。

cfaEのcisドナー鎖相補性
2種の高度に保存された構造モチーフを同定した。そのうちの一つは、主要サブユニッ
トのカルボキシ末端と副サブユニットのカルボキシ末端の間で共有されており、そしても
う一方は、成熟後（シグナルペプチド切断後）のアミノ-末端で主要サブユニットの形態
であることが見いだされた。主要サブユニットおよび副サブユニットを一緒にマルチアラ
インメントすると、各タンパク質のカルボキシ末端で、配列モチーフAGxYxGxUxUxUT（x）
_3-6-COOHを示す共通モチーフが示された。ここで、Uは疎水性残基のいずれかを示し、そ
してxは未同定の性質の残基を示す（図4）。Sakellarisらは、この範囲が線毛性サブユニ
ット-シャペロン相互作用において役割を果たす可能性があるクラスI線毛性サブユニット
に類似する、β-ジッパーモチーフを意味すると、以前に示唆した（37）。

クラス5線毛の主要サブユニットは、β-鎖を形成すると予想された、非常に高度に保存
されたアミノ-末端範囲を共有し（図4）、この点で副サブユニットと異なっている。その
予想された構造および位置に基づいて、この範囲は、β-鎖-様構造として機能し、これは
α-ヘリックスの柄に沿ってCfaB サブユニットに隣接するものを意味し、そして線毛性先
端でのCfaEを意味する。CfaB主要サブユニットドナー鎖として機能する配列としては、SE
Q ID No. 7を参照。その他の付着因子モノマーに対するドナー鎖としては、SEQ ID No. 8
〜15を参照。

CfaBおよびそのホモログのアミノ-末端β-鎖の高度の保存された性質は、1型線毛性サ
ブユニットのアミノ-末端がフィラメントの組み立てにおいて交換ドナー鎖として機能す
るという前例とともに、これがCFA/Iサブユニットを非共有的に連結するドナーβ鎖のた
めのよい候補であることを示唆した。副接着サブユニットに関するこの仮説を試験するた
め、我々はプラスミドを操作して、柔軟なヘアピンリンカー（DNKQ（SEQ ID No. 1）およ
びその後に成熟CfaB最初の13個のアミノ酸残基からなるC-末端伸長部を含有するCfaE変異
体を発現させた（図5）。図5（A）は、概略的に、10〜19残基まで長さが異なるCfaBのN-
末端β-鎖範囲を含むC-末端伸長部を有する、独立したCfaE変異体構築物のドメインを示
す。各構築物は、天然のCfaE配列のC-末端とドナーβ-鎖との間に挿入された短い柔軟性
のあるリンカーペプチド（DNKQ）を含有する。縦の矢印は、二次β-鎖モチーフを分断す
る、プロリンに修飾されたドナー鎖バリン（V7P）を特定する。図5（B）は、CfaEを発現
する様に操作された系統のシリーズに由来するペリプラズマ濃縮物のウェスタンブロット
解析を示し、そして変異体は、成熟CfaB様々な長さのアミノ-末端範囲とcisで相補性であ
った。使用された一次抗体調製物は、CfaEに対するポリクローナルウサギ抗体であった。
レーンは、以下の構築物に由来する調製物に対応する：レーン1、dsc₁₀CfaE；レーン2、d
sc₁₁CfaE；レーン3、dsc₁₂CfaE；レーン4、dsc₁₃CfaE；レーン5、dsc₁₃CfaE[V7P]；レー
ン6、dsc₁₄CfaE；レーン7、dsc₁₆CfaE；レーン8、dsc₁₉CfaE；そしてレーン9、CfaE。分
子量マーカー（kD）は、左側に示される。図5（C）は、天然のCfaE配列（そのSec-依存性
N-末端シグナル配列を含む）を、短いリンカー配列（すなわち、DNKQ）、成熟CfaB N-末
端に由来する19残基のドナー鎖、および末端6ヒスチジン親和性タグからなるそのC-末端
の伸長部とともに含有する、dsc19CfaE（His）6の操作された構成成分のスキーム図であ
る。

cfaEのPCR生成物は、Gateway（商標）システム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用し
たin vitro組換えにより、プラスミドベクター中に挿入した。以下の配列を有するプライ
マーを、pDONR207^TM中に初期クローニングするために使用した：dsc-CfaE 13-1（フォワ
ード）、5'-TCG ACA ATA AAC AAG TAG AGA AAA ATA TTA CTG TAA CAG CTA GTG TTG ATC C
TT AGC-3'（SEQ ID No. 16）；およびdsc-CfaE 13-2（リバース）、5'-TCG AGC TAA GGA
TCA ACA CTA GCT GTT ACA GTA ATA TTT TTC TCT ACT TGT TTA TTG-3'（SEQ ID No 17）。
attB組換え部位が隣接したPCR生成物を、Gateway BP（商標）反応を使用して、エントリ
ーベクターpRA13.3を作成することにより、ドナーベクターpDONR201^TM（Gateway（商標）
Technology, Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローニングした。Gateway LR（商標）反
応において、遺伝子配列をさらにpRA13.3から修飾された発現ベクターpDEST14-Kn^r（T7プ
ロモータからの天然の発現のためのベクター）中にサブクローニングし、プラスミドpRA1
4.2を作製した。pDEST14-Kn^rベクターを、アンピシリン耐性をカナマイシン耐性に置換す
ることによりpDEST14（商標）（Gateway（商標）Technology, Invitrogen, Carlsbad, CA
）を修飾することにより、構築した。正しいcfaEの存在は、配列解析により確認された。
E. coli系統BL21SI^TM（Invitrogen, Carlsbad, CA）を、pRA14.1の発現のために使用し
、そして関連するCfaEドナー鎖は、構築物に相補的であった。培養物を、NaCl（LBON）な
しで50μg/mlカナマイシンを含有するLB培地中、30℃で一晩増殖させた。一晩培養物の一
部を、LBON培地中で1：50に希釈し、そして30℃で増殖させた。OD₆₀₀が0.5のとき、NaCl
を200 mMの最終濃度となるように添加し、そして細胞を30℃で3時間増殖させた。誘導さ
れた細胞を回収し、洗浄し、そして遠心分離により回収した。タンパク質発現の誘導は、
NaClを添加することにより行い、その後分画およびペリプラズマ内容物の解析を行って、
各タンパク質の相対的回収を調べた。

我々は、天然のCfaEを発現する親系統からはほとんどCfaEが回収できなかったが、dsc₁
₃CfaE構築物は、ペリプラズマ画分のウェスタンブロット解析上で、明確なバンドを得た
ことを見いだした（図5（B））。安定性の改善がC-末端伸長部のβ鎖モチーフに特異的に
関連するものであることを確認するため、我々は、中央部バリンに部位特異的変異生成を
行い、それをβ鎖を破壊すると予想された2つの残基のいずれかに変化させた。得られた
構築物、dsc₁₃CfaE[V7P]およびdsc₁₃CfaE[V7S]、からは、ほとんど回収可能なタンパク質
が得られず、13 アミノ酸C-末端伸長部により達成された観察された安定性に対して、β
鎖が重要であることが示唆された（図5（B））。

我々は次いで、ドナー鎖長制限が、CfaEの安定化のために機能するかどうかを確認した
。一連のプラスミドは、CfaE の変異体を、同一の一般的フォーマットで、しかしはじめ
の10〜多くて19アミノ酸まで変化する添加されたCfaB N-末端β-鎖とともに、発現するよ
うに構築された。図5Bにおいて示される様に、少なくとも最初の12アミノ酸のドナーβ鎖
長が、CfaEの測定可能な回収を達成するために必要とされた。β鎖長の上流側末端で、我
々は、最大で19アミノ酸が、CfaEの回収を達成するために必要な情報をもたらすことを見
いだした。

シャペロン-付着因子複合体形成およびcisドナー鎖相補性.
CooD（CfaEのCS1ホモログ）は、その同起源のシャペロンCooBとペリプラズマ複合体を
形成するだけではなく、およびCooA主要線毛性サブユニットともペリプラズマ複合体を形
成することが示された。1型線毛性サブユニットに類似して、CooDとCfaEとの別個の疎水
性グルーブが、ドナー鎖相補性および置換のメカニズムにより、生物発生のプロセスにお
いて、それらの対応するシャペロンと非共有的に相互作用することができる。そのような
モデルを試験するため、我々は、CfaAのC-末端6ヒスチジン-タグ化変異体を、天然のCfaE
またはdsc₁₉CfaEのいずれかと同時発現させ、そして二分子シャペロン-付着因子複合体の
形成を探した。天然のCfaEをCfaA（His）₆とともに同時発現した場合、2種のタンパク質
がニッケル親和性クロマトグラフィーで同時精製され、このことから複合体の形成が示唆
された。対照的に、dsc₁₉CfaEのCfaA（His）₆との同時発現の後、親和性クロマトグラフ
ィーを行ったところ、CfaA（His）₆のみが得られた。このことから、cisでCfaBにより寄
与されたC-末端β鎖は、シャペロン-付着因子複合体形成を排除することが示唆された。

dsc ₁₉ CfaE（His） ₆ の精製と特性決定
13〜19個のCfaB 残基を含有する様々なdscCfaE 構築物のウェスタンブロットの濃度解
析から、優れた適合（fit）に関して変異体ごとに示唆される回収にはほとんど変化が存
在しないことが示された。我々が覆われたその疎水性の裂け目をできるだけ多く有するCf
aE変異体を用いて研究を行うことを確実にするため、我々は、精製および特性決定のため
に、dsc₁₉CfaEを選択した。精製を容易にするため、我々は、図5（C）において概略を示
したように、カルボキシ-末端に対して6ヒスチジンタグを付加して、dsc₁₉CfaE（His）₆
を得た。

図6において、クロマトグラフィー解析により、dsc₁₉CfaE（His）₆の溶出容量（矢印）
、並びに（A）アルブミン、67,000 D；（B）オボアルブミン、43,000 D；（C）キモトリ
プシノーゲンA、25,000 D；および（D）リボヌクレアーゼA、13,700 Dを含む分子量対照
を示す。対照は、dsc₁₉CfaE（His）₆と同様に、2回の異なる実行（BおよびD；およびAお
よびC）において分離し、そして3回のクロマトグラムを重ね合わせた。差し込み図は、種
の分子量標準に由来する較正曲線を示し、それぞれはモノマーとして実行した。dsc₁₉Cfa
E（His）₆の分子量を、式K_av＝-0.1437Ln（MW）＋1.6973を使用して、38,961 Dと決定さ
れた（点線のドロップダウンを参照）。ここで、傾きおよび切片は、対数適合により生成
された標準全体から得た（R²=0.977）。これは、成熟dsc₁₉CfaE（His）₆の計算分子量（M
_r、40940）と近似的に適合する。

2工程クロマトグラフィー生成プロセスを開発し、そしてニッケル親和性、その後カチ
オン交換を使用して精製し、約94％の純度の可溶性dsc₁₉CfaE（His）₆を得た（図6）。N-
末端配列解析の結果（DKNPGSENMTNTIGPHDRGG）（SEQ ID No. 18を参照）により、dsc₁₉Cf
aE（His）₆の同一性が確認され、そしてvon Heijneのシグナルペプチド切断部位予測方法
（38）の正確性もまた確認された。ゲル濾過上では、成熟dsc₁₉CfaE（His）₆が40,869ダ
ルトンのサイズと一致した溶出プロファイルを示し、これからdsc₁₉CfaE（His）₆がモノ
マー状態で存在することが示される。

公開された証拠は、CfaEがCFA/I線毛の接着構成成分であると間接的に示した（20、21
）。この仮定を直接的に試験するため、我々は、dsc₁₉CfaE（His）₆を3μmのラテックス
ビーズ上に吸着させ、そしてこれらの粒子の赤血球凝集特性を、マンノースの存在下にて
MRHAにより試験した（図7）。図7において、上のグラフはウシ赤血球による2種の抗血清
のHAI力価を示し、そして下のパネルは、ヒトA型赤血球による2種の抗血清のHAI力価を示
す。結果は、それぞれ2重にして行った少なくとも5回の実験の中央値を示す。他の2種の
サブクラスのその他のクラス5線毛を発現する原型のETECとともにプレインキュベートし
た場合に、どの抗血清も、HAI活性を示さない。dsc₁₉CfaE（His）₆でコーティング下ビー
ズは、ヒトおよびウシ赤血球のMRHAを誘導した。対照的に、精製CfaB（主要サブユニット
）でコーティングしたビーズは、ヒト、ウシ、またはニワトリ赤血球のMRHAを誘導しなか
った。

dsc₁₉CfaE（His）₆の赤血球凝集効果の特異性を確認するため、我々は、野生型 CFA/I-
ETECに対するウサギポリクローナル抗-dsc₁₉CfaE（His）₆血清の赤血球凝集阻害（HAI）
力価を決定した（図8）。図8において、各精製タンパク質調製物をグリシンでブロッキン
グした3-μmポリスチレンビーズに吸着させ、そして磁器製タイルウェル中の3％（vol/vo
l）の新鮮ヒトA型（列1）、ウシ（列2）、そしてニワトリ赤血球（列3）の懸濁物に対し
て添加した。MRHAを、氷上で20分間揺らした後に視覚的に決定した。カラム2は、dsc₁₉Cf
aE（His）₆のヒトおよびウシMRHA陽性表現型を示し、そしてカラム3は、CFA/I主要サブユ
ニットdsc₁₉CfaB（His）₆の対応する陰性MRHA表現型を示す。CFA/I天然線毛（カラム1）
およびCFA/Iペリプラズマシャペロンタンパク質CfaA（His）₆（カラム4）は、それぞれ陽
性対照および陰性対照として機能した。

図8に示される様に、抗-dsc₁₉CfaE（His）₆血清は、1：12,288の中央値HAI力価を示し
、これは、抗-CFA/I血清の中央値HAI力価よりも6倍高いが、統計的に差異があるわけでは
なかった。抗-dsc₁₉CfaE（His）₆の血清は、CFA/Iと同一のサブクラスの2種のクラス5線
毛であるCS4およびCS14を発現するバクテリアに対するCFA/I 抗血清の力価を越えるHAI力
価を示した（図8）。これらのどの抗血清も、2種のその他の定義されたクラス5サブグル
ープの線毛を発現するバクテリアに対する検出可能なHAI力価を示さなかった。

CFA/I線毛におけるCfaEの電顕的局在
遺伝子操作および生のバクテリアの表面画分研究からの推測に基づいて、CfaEが、CFA/
I線毛の遠位先端に位置することが、以前に示唆された（34）しかしながら、これらのア
プローチの不正確性が、議論の余地があるCfaE局在化の問題に残された。免疫電子顕微鏡
（IEM）における一次抗体として、CfaEに対して生じさせた高力価ポリクローナル抗血清
を使用して、周毛性CFA/I線毛の一番外側に局在していることを決定的にサポートする装
飾パターンを見いだした。

実施例3
構造的に安定なクラス5 付着因子構築物に対する免疫を誘導するための方法
特定のE. coliの線毛の遠位先端に局在する付着因子は、下痢性E. coliバクテリア免疫
の誘導のためのもっとも重要な構成成分である。しかしながら、線毛付着因子は、本質的
に不安定であり、そして主要サブユニット線毛性構成成分に対してそれらが非共有的結合
をしていない場合には分解の対象となる。従って、プロテアーゼ耐性および構造的安定性
をもたらす改良は、毒素原性E. coliを含むE. coliに対する抗-接着免疫をもたらすこと
ができる、B細胞活性の最高に効果的な誘導の生成のために重要である。

本発明の側面は、実施例2に示すように、安定なポリペプチド構築物の構築である。実
施例1において教示する様に、E. coliにより引き起こされる病原性を防御することは、線
毛のそして従ってバクテリアの接着を立体的に妨害することによりバクテリアの定着を阻
害することにより、付着因子ポリペプチド領域に対する特異的B細胞応答を誘導すること
により、媒介することができる。従って、本発明の別の側面は、構造的に安定なポリペプ
チド構築物を投与することにより、免疫を誘導することである。

この構築物は、そのC-末端で主要構造線毛性サブユニット（たとえばCfaB）のポリペプ
チドに対してそれ自体が機能可能に連結するリンカーに対してC-末端領域で連結した、付
着因子ポリペプチドを含む抗原性フラグメントを含む。抗原性フラグメントは、いずれか
のE. coli付着因子または付着因子フラグメント、または代わりに付着因子ポリペプチド
のポリマーをコードする付着因子ポリペプチド配列からなってもよい。付着因子は、CfaE
、CsfD、CsuD、CooD、CosD、CsdD、CsbDおよびCotDからなる群から選択される。

下痢性バクテリア抗-付着因子-媒介性定着を誘導するための方法は、以下の工程を含有
する：
a. 前記構造的に安定な付着因子ポリペプチド構築物を含有する免疫原を投与すること
により、プライミングを行う。免疫原は、経口、経鼻、皮下、経皮、経皮、経皮膚筋肉
内、または直腸から投与することができる。免疫原の単位用量の範囲は、50μg〜1 mgの
免疫原である。免疫原は、キャリアタンパク質またはアジュバントを含むかまたは含まな
いいくつかの溶液中で投与し、またはミクロスフェアなどの粒子中に吸着させる；
b. プライミングの投与に続いて、2〜4回の追加抗原もまた、平衡水溶液中、50μg〜1
mgの単位用量範囲の免疫原を用いて投与する。

代わりのワクチンアプローチは、実施例2において記載されたDNA構築物を投与するが、
宿主バクテリア細胞中に挿入されその中で発現させる。次いで、組換え宿主細胞を宿主細
胞に対する免疫だけではなく、発現されたETEC組換え付着因子ポリペプチドに対する免疫
も付与するため、全細胞ワクチンとして投与することができる。代表的な宿主細胞には、
Escherichia coli、Shigella属の構成バクテリア、Campylobacter属の構成バクテリア、S
almonella属の構成バクテリア、Vibrio choleraeを含むVibrio属の構成バクテリアが含ま
れるが、これらには限定されない。

全細胞免疫の誘導のための方法は、以下の工程を含有する：
a. Escherchia coli、Shigella spp、Camplylobacter spp、Vibrio sppおよびVibrio
choleraeからなる群から選択される、適切な数の全細胞バクテリアを含む初回抗原量を投
与し、それにより発現された組換え付着因子ポリペプチドが投与あたり50μg〜1 mgとな
るようにする；
b. プライミングの投与に続いて、Escherchia coli、Shigella spp、Camplylobacter
spp、Vibrio sppおよびVibrio choleraeからなる群から選択される、全細胞バクテリアの
1〜4回の追加抗原を投与し、それにより発現された組換え付着因子ポリペプチドが、投与
あたり50μg〜1 mgの範囲となるようにする。あるいは、追加抗原は、平衡水溶液中、50
μg〜1 mgの単位用量範囲の免疫原であるプロテアーゼ耐性付着因子ペプチド構築物を含
有する免疫原であってもよい。

この方法を説明するための具体的な例として、実施例2に記載された構築物を使用して
、マウスにおいて免疫応答を誘導した。図9は、CfaE、CfaE＋mLT、CFA/IまたはCFA/I＋mL
Tの口胃（orogastric）投与または鼻内投与のいずれかにより、ELISAにおいて類似抗原に
対するIgGおよびIgA応答が示される。図9において、マウスのグループ（n＝6）に対して
、線毛（CFA/I）（250μg）、CFA/I（250μg）＋mLT（mLT = E. coli耐熱性毒素LTR192G
）（10μg）、dscCfaE（250μg）またはdscCfaE（250μg）＋mLT mLT=LTR 192G（10μg）
のいずれかを、2週間間隔で3回投与した。初回免疫後約42時間後に、血清を回収した。図
9に示される様に、CfaEまたは線毛（CFA/I）は、激しいIgG応答およびIgA応答を誘導し、
そしてmLTの同時投与により有意に亢進された。興味深いことに、mLTをCfaEまたは線毛（
CFA/I）とともに、経鼻内または口胃的に同時投与すると、CFA/Iに対するよりもCfaE対し
て、より高い全体抗体応答が得られた。

図10は、いずれかはmLTとともに、CfaE対CFA/Iの投与により誘導された、CfaEまたはCF
A/Iのいずれかに対して特異的な抗体力価を示す。図9に示される様に、マウスのグループ
（n＝6）に対して、CFA/I（250μg）＋mLT（mLT = E. coli耐熱性毒素LTR192G）（10μg
）またはdscCfaE（250μg）＋mLT mLT=LTR 192G（10μg）のいずれかを、2週間間隔で3回
投与した。免疫後、血清抗体力価を、類似抗原を使用してELISAにより測定した。図10（a
）および（b）は、CfaE＋mLTのいずれかの口胃投与により誘導された抗体力価を示し、図
10（c）および（d）は、鼻内投与により誘導された抗体力価を示す。CfaEおよびCFA/I＋m
LTの口胃投与または鼻内投与のいずれかの後、dscCfaEでの免疫化の結果、より高力価の
特異的IgG抗体応答が得られた。これらのデータは、免疫応答を誘導する際に、少なくと
も鼻内経路および口胃経路を介して投与する場合に、dscCfaEが効果的であることを示唆
している。

図10に示される様に、dscCfaEは、高力価の抗体を効果的に誘導することができる。抗
体が機能的であるかどうかを確認するため、血清抗体の解析を図11に説明する。図11（a
）は、CFA/IまたはCfaEのいずれかの鼻内投与後に得られた血清のHAI力価を示し、そして
図11（b）は、口胃投与後に得られた血清のHAI応答を示す。図11に示される様に、CfaE
を用いた免疫化により、投与経路に関わらず、CFA/Iの場合よりも非常に頑健な阻害活性
が誘導された。機能的活性の上昇は、血清中で示された抗-CfaE抗体の力価と相関してい
る。まとめると、これらのデータはdscCfaE構築物が、高力価の機能的抗体を誘導するこ
とができることを示す。

実施例4
クラス5線毛付着因子に対する免疫を誘導するための方法
本発明の側面は、バクテリアの病原性を効果的に阻害することができるE. coliに対す
る免疫応答を誘導するためのE. coli線毛のもっとも重要な構成成分が、付着因子で或と
いうことである（実施例1に示した通りである）。これらの分子は、天然の線毛の遠位先
端に局在する。従って、宿主細胞への付着因子の接着を阻害することができる付着因子分
子領域に対して特異的なイムノグロブリンを生成することと付随して、免疫、主としてB
細胞応答を誘導することが重要である（実施例1における付着因子の阻害を参照）。

イムノグロブリン-媒介性免疫は、活性な宿主細胞結合部位でまたはそのそばでの結合
により、または付着因子宿主細胞結合部位からは離れたエピトープに結合することにより
、立体的妨害により効果を発揮することができる。下痢性バクテリアの抗-付着因子媒介
性定着を誘導するための方法は、以下の工程を含有する：
a. 付着因子を含有する全線毛を含む免疫原を投与することによりプライミングを行う
。あるいは、付着因子または付着因子ポリペプチドのみを含有する、単離された線毛フラ
グメントを、無傷線毛の代わりに使用することができる。免疫原は、経口、経鼻、皮下、
経皮、経皮、経皮膚筋肉内、または直腸的に投与することができる。免疫原単位用量の
範囲は、50μg〜1 mgの免疫原である。免疫原は、キャリアタンパク質またはアジュバン
トを含むかまたは含まないいずれかの数の水溶性緩衝化溶液中で投与される；
b. プライミングの投与に引き続いて、2〜4回の追加抗原もまた、平衡水溶液中50μg
〜1 mgの単位用量範囲の免疫原により、投与される。

図9を参照すると、CFA/Iの口胃投与または鼻内投与のいずれか（アジュバントmLTを含
むかまたは含まない）により、3回投与計画により、有意な血清IgG応答が誘導された。以
前に記載された様に、マウスのグループ（n＝6）に対して、CFA/I（250μg）、CFA/I（25
0μg）＋mLT（mLT =LTR192G）（10μg）、dscCfaE（250μg）またはdscCfaE（250μg）＋
mLT mLT=LTR 192G（10μg）のいずれかを、2週間間隔で3回投与した。図9および図10に示
される様に、線毛（すなわちCFA/I）による免疫化による頑健な抗体応答にも関わらず、
抗-CFA/I血清は、図10に示される様に、中程度の抗-CfaE活性が含有された。この観察と
一致して、図11を参照して、有意なHAI力価もまた、血清抗体を使用して、CFA/I投与後に
得られることがわかった。それにもかかわらず、付着因子先端を含有するCFA/Iに対する
抗体およびHAI応答は、図10および図11に示される様に、安定なCfaE（dscCfaE）を免疫源
として使用する場合に得られたものよりもかなり低かった。

実施例5
抗-CS3構築物を使用した抗-ETEC 免疫の誘導
CS3は、2つの異なるサブユニット、CstHおよびCstGから構成される（Savarino, 未発表
）。この結論は、以前に発表された知見、そして結論とは反している（39、40）。野生型
ETEC系統M424C1由来の生成CS3（LTST-CS1+CS3-O6：H16）は、SDS-PAGE上で2つの近くに移
動するタンパク質バンドに分離され、それぞれは異なるN-末端アミノ酸配列を有する。M4
24C1 CS3遺伝子クラスターのDNA配列解析の結果、クラスターの3'末端で2つの隣接するオ
ープンリーディングフレーム（ORF）を示し、それがそれぞれのN-末端領域が2種の実験的
に誘導されたCS3のN-末端配列と完全にマッチするタンパク質CstHおよびCstGをコードし
た（Savarino SJ, 未発表データ）。これらの2種のサブユニットは、46％の類似性を共有
し、そしてCFA/IのCfaE/CfaB副サブユニットと主要サブユニットはそれぞれ1：1000の推
定比率であることと比較して、ほぼ1：1.5の比率で精製線毛中に存在する様である（37）
。

変異および相補性実験により、我々は、CstHサブユニットおよびCstGサブユニットの両
方が、CS3微小繊維の発現に必要であることを見いだした。組換えプラスミドは、CstHお
よびCstGのシグナルペプチド-切断型に対するMBPの融合物を発現する様に操作され、そし
てそれぞれを使用して、ウサギポリクローナル抗体を生成した。生成IgGおよびFab画分の
プレインキュベーションは、ウシ赤血球MRHAを阻害したが、しかしCS3の代わりのin vitr
o結合表現型である野生型CS3-ETEC（系統WS2010A）による抗-MBPCstGでは阻害されなかっ
た。我々はまた、CstHおよびCstGのインテインキャリアに対する融合物を操作して（41）
、そしてこれらのパッセンジャータンパク質をキチン親和性クロマトグラフィー（New En
gland Biolabs, Ipwich, MA）により精製し、そしてインテリン-パッセンジャータンパク
質結合部でのカラム内自動切断を行った。精製CstHに対して精製されたがCstGに対しては
精製されなかったウサギポリクローナル抗血清は、赤血球凝集阻害（HAI）活性を示し、
対応するMBP融合物に対する抗体により観察された結果を確認した（図12を参照）。図12
において、PCF039線毛に対する反応性は、陰性対照として含まれた。我々の結果は、CstH
は、CS3の実際の結合サブユニットであり、従って抗-接着体液性免疫応答を生成するため
の正確なワクチン標的として機能することができる、という主張を裏付けるものである。

CstHがCS3付着因子であることを示す利用可能な証拠に基づいて、我々は、安定なCstH
構築物を作製する試みを行った。上述したように、我々は、インテリンに対するC-末端融
合物としてCstHをクローニングした（IMPACT-CN^TM発現システム、New England Biolabs^TM
）。このシステムは、適度な収率をもたらし、そして1 Lフラスコ培養レベルで適度なCst
Hの純度をもたらした。10 Lファーメンターへのスケールアップの結果、インテリン-CstH
融合物生成物の高レベルの発現がもたらされたが、しかしながら、細胞破壊後に不溶性画
分に大部分が含まれ、このことのために、中程度スケールまたは大スケールの生成労力の
ためのシステムとしてはあまり適切ではなくなっている。しかしながら、このシステムを
使用するすることにより取得したタグをつけていない成熟型のCstHは、実際にタンパク質
特性決定が可能であった。

天然のゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、CstHが、（CstH 4-1
6mersの形成を示唆する分子量範囲で）順番に非共有的相互作用によりオリゴマーに自己
集合化することが示された。高解像度電子顕微鏡により、2つの異なる形態が示された。C
stHオリゴマーは、球体粒子または線状粒子のいずれかとして観察され、そしてそれぞれ
の型は、サイズと配置にいくつかのバリエーションを示した。

CstH粒子形成はいくつかの好ましい免疫学的特性をもたらす可能性があるが、そのよう
な調製物の一見したところ不均質性は、それが規定された最終生成物の特性を用いた再現
性のある製造方法を開発することに関連するため、潜在的な困難性を引き起こす。従って
、安定なCstH 構築物を設計するために、ドナー鎖相補性を使用した。

CS3微小繊維の組み立ては、CS3ペリプラズマシャペロンのPapDスーパーファミリーとの
遺伝的関連性に基づいて、古典的シャペロン-アッシャー（CU）経路の構成分子として分
類された（42）。興味深いことに、細い微小繊維のまたは線毛性接着オルガネラの組み立
てを媒介するシャペロンの特徴的な構造的特性を参照して、それはFGL（F1-G1ロング）サ
ブファミリーに含まれた（43）。CstHのN-末端アミノ酸範囲をYersinia pestis F1夾膜サ
ブユニットとアラインメントすると、アミノ酸16（成熟CstHポリペプチドに関して）を介
した交互の疎水性残基の共通モチーフを示す。F1夾膜サブユニット（Caf1）のこの範囲は
、ドナー鎖として機能し、Caf1Mシャペロンと相互作用しそして夾構成およびサブユニッ
ト調節のあいだF1タンパク質サブユニットに隣接する（44）。

対応するCstH部分が同様の様式で機能することができる論理は、CstH構築物と相補的な2つのin-cisドナー鎖を、作製した。完全長CstH配列（SEQ ID No. 19）は、22アミノ酸のシグナル配列を含み、これが通常はペリプラズマに入る際に切断されて、成熟CstH配列（SEQ ID No. 23）が得られる。成熟配列はまた、SEQ ID No. 20に開示される16個のアミノ酸末端β-鎖も含有する。図13は、概略的に構築物のデザインを示す。図13（A）および図13（C）は、成熟CstHアミノ酸配列を示すが、22個のアミノ酸リーダー配列は除去されそしてHis-タグが挿入されている。図13（A）において、[His]₁₀タグが成熟CstHのN-末端に対して挿入される。図13（C）において、[His]₆タグが成熟CstHのC-末端に対して挿入される。

図13（B）および（D）は、さらなる修飾を示す。図13（B）は、SEQ ID No. 21中に開示される構築物[His]₁₀dsc₁₆CstHを示す。[His]₁₀dsc₁₆CstHは、図13（A）に示される様にN-末端His₁₀を含有するが、成熟CstHのC-末端に融合され、次いでそのC-末端でSEQ ID No. 21において開示されたCstH末端に由来する最初の16アミノ酸から得られた2重にされたドナー鎖に対して融合されている、短いヘアピンリンカーを有する（SEQ ID No 1、2または3）。図13（D）は、概略的に、dsc₁₆CstH[His]₆を示し、これはSEQ ID No. 22として開示される。この構築物は、[His]₁₀dsc₁₆CstH中に、C-末端でのHis-タグ、対N-末端でのHis-タグを含有する。in-cisドナー鎖のC-末端とHis-タグの間の2種のアミノ酸は、発現ベクターマルチクローニング部位コード配列から得る。[His]₁₀dsc₁₆CstH構築物は、T7発現プラスミドpET 19中に挿入されたものであり、そしてpET19/[His]₁₀dsc₁₆CstHと呼ばれる。同様に、dsc₁₆CstH[His]₆構築物は、pET24中に挿入されたものであり、そしてpET24/dsc₁₆CstH[His]₆と呼ばれる。dsc₁₆CstH[His]₆構築物は、高い可溶性を示す。

電気泳動解析は、発現構築物が、図14に示される様なモノマーの特徴を示すものである
ことが示された。図14（A）において、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE
）により、明瞭な顕著なバンドが示される。抗-CstHおよび抗-CS3をそれぞれ使用したウ
ェスタンブロット解析（図14（B）および（C））は、明らかに顕著なモノマーのバンドを
示す。

CS3構築物は、実施例3に記載された方法と類似する方法により用いられることを企図さ
れる。従って、dsc₁₆CstH-[His]6またはその他の変異体を使用した免疫の誘導、は、以下
の工程を含む方法により行われる：
a. 構造的に安定な付着因子ポリペプチド構築物を含有する、[His]₁₀dsc₁₆CstH また
はdsc₁₆CstH-[His]6（すなわち、SEQ ID No. 22またはSEQ ID No. 23）の免疫原または変
異体（図13に示される様に）を投与することにより、プライミングを行う。免疫原を、経
口、経鼻、皮下、経皮、経皮、経皮膚、筋肉内、または直腸的に投与することができる。
免疫原の単位用量の範囲は、50μg〜1 mgの免疫原である。免疫原は、キャリアタンパク
質またはアジュバントを含むかまたは含まないいくつかの数の溶液中で投与され、または
マイクロスフェアなどの粒子に吸着される；
b. プライミングの投与に続いて、2〜4回の追加抗原を、平衡水溶液中、50μg〜1 mg
の単位用量範囲の免疫原とともに投与する。

実施例3においてクラス5付着因子構築物について記載した通り、Escherichia coli、Sh
igella属の構成バクテリア、Campylobacter属の構成バクテリア、Salmonella属の構成バ
クテリア、Vibrio choleraeを含むVibrio属の構成バクテリアを含む、宿主バクテリア細
胞中で発現されるCstH構築物を、使用することもできる。

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本発明を記載したが、当業者であれば添附されるクレームにおいて、本発明の多数の修
飾および変化が、上述の教示に照らして可能であることを理解するだろう。従って、添付
されるクレームの範囲内で、本発明は、具体的に記載された以外にも実施され得ることが
理解されるべきである。

図1は、2種類のin vitro接着モデルにおいて、異なるF_ab抗体調製物の系統H10407（CFA/I）の接着に対する阻害性効果を示す。図2は、定着因子を発現するETEC型系統において、全線毛またはCFA/Iの副線毛性サブユニットのアミノ末端ドメイン（Panel A）、およびCS17のアミノ末端ドメイン（Panel B）に対する、F_ab抗体調製物の中央値相補的ウシヘムアグルチニン阻害（HAI）力価（log₂スケールにプロットした）を、x軸に示した。結果は、少なくとも4回の実験の中央値を示し、それぞれ2重にして行った。P値は、全線毛と副サブユニット抗体調製物との間でのHAI力価の差異についてのものである。図3は、無傷線毛とCFA/Iの副サブユニットのN-末端側半分に対するF_ab抗体（白棒グラフ）および無傷線毛とCS17の半分に対するF_ab抗体（黒棒グラフ）の、with ETEC保持ホモログ（CFA/Iのみ、上左パネル）および異種線毛を用いたCaco-2細胞接着アッセイにおける阻害作用を示す。図4は、クラス5線毛の主要サブユニットおよび構造性サブユニットにおける、非常に保存されたβ-鎖モチーフを示す。これは、成熟型の主要サブユニットのアミノ末端と、以下に示すコンセンサス配列とのマルチプルアラインメントである。この範囲は、残基5〜19（コンセンサスの下の黄色の矢印により区別される）の範囲の中断されたβ-鎖モチーフを形成することが示される。保存された残基の陰は、以下のクラスを示す：青色、疎水性残基；赤色、負荷電の残基；ターコイズ色、正荷電の残基；および緑色、プロリン。略語：Bcep、Burkholderia cepacia；Styp、Salmonella typhi。U、疎水性残基；x、いずれかの残基；Z、EまたはQ。図5は、CfaE構築物のスキーム図である。図6は、20 mM MESおよび100 mM NaCl中でのSuperdex 75（16/60）を用いたゲル濾過での、dsc₁₉CfaE（His）₆の溶出プロファイルである。図7は、抗-CFA/Iおよび抗-dsc₁₉CfaE[His]₆抗血清の、CFA/I-ETEC（プロトタイプ系統H10407；LTST、CFAI、O78：H11）および関連するサブクラス5a線毛CS4（系統WS2560B；LTST、CS4+CS6、O25：H-）およびCS14（系統WS3294A；ST、CS14、O78：H18）を発現するETECのマンノース-耐性赤血球凝集（MRHA）に対する、阻害作用を示す。図8は、粒子形状における精製dsc₁₉CfaE（His）₆が、ヒトA型およびウシ赤血球のマンノース-耐性赤血球凝集（MRHA）を誘導することを示す。図9は、dscCfaE＋mLTまたはCFA/I＋mLTのマウスにおける、orogastric投与または鼻内投与の後の抗体誘導を示す。図10は、dscCfaEまたはCFA/Iのいずれかを抗原として使用するELISAによる、抗-CfaEおよび抗-CFA/I ELISA結合活性を示す。図11は、dscCfaE＋mLTまたはCFA/I＋mLTで免疫したマウス由来の血清のHAI活性を示す。図12は、天然CS3、精製CstH、CstGおよびPCF039線毛に対して精製された、ウサギポリクローナル抗血清の赤血球凝集阻害を示す。図13は、CstH構築物の構成成分の概略図である。パネルAは、そのN-末端で接着されるヒスチジンタグを有するCS3の成熟CstHを示す。パネルBは、成熟CstH構築物のC-末端に短いリンカーポリペプチドを有し、それが次にそのC-末端に接着される複製された16個のアミノ酸CstH N-末端領域を有する、パネルAの構築物を示す。パネルCは、N-末端と比較して、C-末端に挿入された（His）₆タグを有する、パネルAの構築物を示す。パネルDは、N-末端での（His）₁₀と比較して、複製されたCstH領域ドナー鎖C-末端により小さな（His）₆を有する、パネルBにおけるものと同様の構築物を示す。図14は、精製dsc₁₆CstH[His]₆のSDS PAGEおよびウェスタンブロット解析を示す。

Claims

免疫応答を誘導するための、免疫原性組成物を含有する医薬組成物であって、
前記免疫原性組成物は、大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子の全体または抗原性ポリペプチドフラグメントを含み、その線毛性付着因子の全体または抗原性ポリペプチドフラグメントのC-末端でリンカーに結合し、
前記大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子は、CfaE, CsfD, CsuD, CooD, CosD, CsdD, CsbD 及び CotDからなる群から選択され、
前記リンカーは、そのC-末端で、大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニット、又は、前記大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットの少なくとも最初の１２アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドフラグメントに対して、機能可能に連結しており、
前記大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットは、CfaB, CsfA, CsuA1, CsuA2, CooA, CosA, CsbA, CsdA, 及びCotBからなる群から選択され、
但し、前記大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子及び大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットの組み合せとして、CfaE及びCfaBを選択する場合を除く、
前記医薬組成物。
前記免疫応答が、毒素原性大腸菌（Escherichia coli）線毛または微小繊維に対して結合することができるイムノグロブリン分子が生成することによって誘導される、請求項1に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒト細胞に対する毒素原性大腸菌（Escherichia coli）線毛または微小繊維の接着を阻害する、請求項1に記載の医薬組成物。
前記ヒト細胞が、粘膜上皮細胞である、請求項３に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を減少させまたは予防する、請求項1に記載の医薬組成物。
免疫原が、皮下、経皮、筋肉内、経口、経皮膚または経鼻で投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
前記リンカーが、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2またはSEQ ID No. 3またはそれらの機能可能なフラグメントのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の医薬組成物。
前記ポリペプチドフラグメントが、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14およびSEQ ID No. 15からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
大腸菌（Escherichia coli）線毛主要構造サブユニットの全体または抗原性ポリペプチドフラグメントが、大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子の化学構造的安定性およびプロテアーゼ耐性をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物は、以下：
a. 平衡水溶液中の免疫原性組成物の50μg〜1 mgの単位用量範囲での初回投与であって、免疫応答が引き起こされ；及び
b. 初回投与の後少なくとも1週間後に、平衡水溶液中の免疫原性組成物を50μg〜1 mgの単位用量範囲での追加投与であって免疫応答が引き起こされる；
に使用される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒトにおける下痢を減少させまたは予防する、請求項10に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒト細胞に対する下痢性バクテリアの接着を阻害する、請求項10に記載の医薬組成物。
免疫性が、下痢性バクテリアのコロニー形成を減少させる、請求項10に記載の医薬組成物。
免疫原性組成物を含有する宿主バクテリア細胞を含む医薬組成物であって、
前記免疫原性組成物は、大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子の全体または抗原性ポリペプチドフラグメントを含み、その線毛性付着因子の全体または抗原性ポリペプチドフラグメントのC-末端でリンカーに結合し、
前記大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子は、CfaE , CsfD, CsuD, CooD, CosD, CsdD, CsbD 及び CotDからなる群から選択され、
前記リンカーは、そのC-末端で、大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットに対して、又は、前記大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットの少なくとも最初の１２アミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドフラグメントに対して、機能可能に連結しており、
前記大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットは、CfaB ,CsfA, CsuA1, CsuA2, CooA, CosA, CsbA, CsdA, 及びCotBからなる群から選択され、
但し、前記大腸菌（Escherichia coli）線毛性付着因子及び大腸菌（Escherichia coli）の主要構造線毛性サブユニットの組み合せとして、CfaE及びCfaBを選択する場合を除く、
前記医薬組成物。
宿主バクテリア細胞を殺すか、または生きたまま減弱化されたバクテリアとする、請求項14に記載の医薬組成物。
前記宿主バクテリア細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Shigella）属のバクテリア、カンピロバクター（Campylobacter）属のバクテリア、サルモネラ（Salmonella）属のバクテリア、ビブリオ（Vibrio）属のバクテリアからなる群から選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物を、以下：
（a）前記免疫原性組成物の発現された組換え付着因子ポリペプチドが投与あたり50μg〜1 mgとなるように、適切な数の宿主バクテリア細胞を投与するように使用し；及び
（b）前記免疫原性組成物を含有する宿主バクテリア細胞の追加投与を、前記医薬組成物の初回抗原投与後少なくとも1週間後に初回追加投与となるように、1〜4回投与し、それにより免疫原を投与あたり適切な数の宿主バクテリア細胞で投与し、それにより免疫原性組成物の発現された組換え付着因子ポリペプチドが、投与あたり50μg〜1 mgであり、そして免疫応答を引き起こす、
請求項１４に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、大腸菌（Escherichia coli）線毛に対して結合することができるイムノグロブリン分子が生成することによって誘導される、請求項17に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒト細胞に対する大腸菌（Escherichia coli）線毛接着を阻害する、請求項17に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒト細胞に対する大腸菌（Escherichia coli）のコロニー形成を阻害する、請求項17に記載の医薬組成物。
前記ヒト細胞が、粘膜上皮細胞である、請求項17に記載の医薬組成物。
免疫原が、経口で投与される、請求項17に記載の医薬組成物。
免疫性により、ヒトの下痢が予防される、請求項17に記載の医薬組成物。
免疫性により、大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Shigella）属のバクテリア、カンピロバクター（Campylobacter）属のバクテリア、サルモネラ（Salmonella）属のバクテリア、ビブリオ（Vibrio）属のバクテリアからなる群から選択されるバクテリアにより引き起こされるヒトの下痢を予防する、請求項17に記載の医薬組成物。
大腸菌（Escherichia coli） CstHの抗原性ポリペプチドフラグメントを含み、そのCstHのC-末端でリンカーに結合し、そしてそのリンカーのC-末端で、CstHのＮ−末端のβ−鎖の少なくとも最初の１６アミノ酸を有する、CstHフラグメントに対して、機能可能に連結している、免疫応答を誘導するための、免疫原性組成物を有する医薬組成物。
前記CstHフラグメントが、SEQ ID No. 23またはその抗原性ポリペプチドフラグメントからなる、請求項25に記載の医薬組成物。
前記リンカーが、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2またはSEQ ID No. 3またはそれらの機能可能なフラグメントのアミノ酸配列からなる、請求項25に記載の医薬組成物。
前記CstHのＮ−末端のβ−鎖の少なくとも最初の１６アミノ酸を有する、CstHフラグメントが、配列SEQ ID No. 20の配列を含む、請求項25に記載の医薬組成物。
免疫原性組成物のアミノ酸配列が、SEQ ID No. 21又は22である、請求項25に記載の医薬組成物。
免疫原性組成物のアミノ酸配列が、SEQ ID No. 22である、請求項25に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物を、
a. 適切な数の宿主バクテリア細胞を投与して、前記免疫原性組成物の発現された組換え付着因子ポリペプチドが投与あたり50μg〜1 mgとなるように使用し；および
b. 前記免疫原性組成物を含有する宿主バクテリア細胞の追加投与を、免疫原の初回抗原投与後少なくとも1週間後に初回追加投与となるように1〜4回投与し、それにより免疫原を投与あたり適切な数の宿主バクテリア細胞で投与し、それにより免疫原性組成物の発現された組換え付着因子ポリペプチドが、投与あたり50μg〜1 mgであり、そして免疫応答を引き起こす、；
請求項２５に記載の医薬組成物。
宿主バクテリア細胞を殺すか、または生きたまま減弱化されたバクテリアとする、請求項31に記載の医薬組成物。
前記宿主バクテリア細胞が、大腸菌（Escherichia coli）、赤痢菌（Shigella）属のバクテリア、カンピロバクター（Campylobacter）属のバクテリア、サルモネラ（Salmonella）属のバクテリア、ビブリオ（Vibrio）属のバクテリアからなる群から選択される、請求項31に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、大腸菌（Escherichia coli）線毛に結合することができるイムノグロブリン分子が生成することによって誘導される、請求項31に記載の医薬組成物。
前記免疫応答は、ヒト細胞に対する大腸菌（Escherichia coli）線毛の接着を阻害する、請求項31に記載の医薬組成物。
前記免疫応答が、ヒト細胞に対する大腸菌（Escherichia coli）のコロニー形成を阻害する、請求項31に記載の医薬組成物。
前記ヒト細胞が、粘膜上皮細胞である、請求項36に記載の医薬組成物。
免疫原が、経口で投与される、請求項31に記載の医薬組成物。
免疫性により、ヒトにおける下痢が予防される、請求項31に記載の医薬組成物。