JP6124442B2 - DNA cassette, vector, transformed cell, transformed animal, functional gene expressing animal, and analysis device - Google Patents
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Description
本発明は、相同組み換えのためのＤＮＡカセット、ベクター、形質転換細胞、形質転換動物、機能性遺伝子発現動物及び解析装置、さらに詳しくは、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器でのみ特定機能を有する遺伝子を発現させることができるＤＮＡカセット、ベクター、形質転換細胞、及び、機能性遺伝子発現動物と、機能性遺伝子発現動物を大量に精度よく解析することが可能な解析装置と、に関するものである。 The present invention relates to a DNA cassette for homologous recombination, a vector, a transformed cell, a transformed animal, a functional gene-expressing animal, and an analysis device. DNA cassettes, vectors, transformed cells, functional gene-expressing animals that can express a gene having a specific function only in an organ, and an analysis device that can accurately analyze large quantities of functional gene-expressing animals And is about.
生理活性物質、薬剤、毒素、食品など化学物質の生体への影響の評価解析は、さまざまな分野で利用される重要な解析であり、分子生物学的手法を用いた解析により遺伝子レベルでの解析を行うことが可能になってきている。
例えば、特許文献１では、化合物をスクリーニングする方法及び有毒化合物を示す代謝反応の治療法に関連するマイクロアレイを用いて解析する手段が提案されている。
また、他の遺伝子レベルの解析手段としては、トランスジェニック動物などの遺伝子改変動物を用い遺伝子の発現を解析する手段が挙げられ、これらの中でも遺伝子の発現を蛍光タンパク質などで可視化することにより解析する手段は動物が生きたままの状態で遺伝子の発現を解析できる。
このため、例えば、特許文献２では、個体を構成する全ての細胞種でのイノシトールリン脂質（ＰＩｓ）代謝解析を可能とし、様々な内在性あるいは外来性の物質がＰＩｓ動態に与える作用を、非侵襲的な条件下で量的、時間的・空間的な側面から明らかにするために、ＰＩｓ可視化プローブを発現するトランスジェニック動物（ＰＩｓ可視化動物）を作製する。ＰＩｓ可視化プローブ遺伝子としては、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３やＰＩ（３，４）Ｐ２を可視化するＡｋｔプロテインキナーゼＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を可視化するＢｔｋ−ＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡや、ＰＩ（４，５）Ｐ２を可視化する配列番号５で示される塩基配列からなる、ホスフォリパーゼＣδＰＨドメインとＧＦＰとの融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ等を発現するトランスジェニック動物が提案されている。
また、遺伝子発現を可視化した形質転換動物の解析に用いる装置としては、例えば、特許文献３のような、主要部が、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール、励起光をコリメートして偏向を行う走査モジュール、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュールおよび試料からの光線を受け止め検出する検出モジュールから成るレーザ走査型顕微鏡において、試料が第１および第２の照明光によって照明され、その場合第１照明光ＬＱ１が試料の励起を誘起し、第２照明光ＬＱ２が周期性構造におけるコヒーレント光の回折によって生成され、それが照射横方向および照射軸方向に周期性構造を有している、高度な分解能を持つレーザ走査型顕微鏡が提案されている。
Evaluation and analysis of the effects of chemical substances such as bioactive substances, drugs, toxins, and food on the living body is an important analysis used in various fields, and analysis at the gene level by analysis using molecular biological techniques It is becoming possible to do.
For example,
Other gene level analysis means include means for analyzing gene expression using genetically modified animals such as transgenic animals, among which analysis is performed by visualizing gene expression with a fluorescent protein or the like. Means can analyze gene expression while the animal remains alive.
For this reason, for example,
Moreover, as an apparatus used for the analysis of the transgenic animal which visualized gene expression, for example, as in
しかしながら、特許文献１で提案されているようにマイクロアレイを用いた方法の場合、大量の遺伝子発現の解析は可能であるが、解析するために細胞や臓器を摘出することが必要なため、生きたままの動物で解析することができず、生体内での継時的な変化を追うことは不可能である。
また、特許文献２で提案されている手段では、遺伝子が体中に幅広く発現し、遺伝子発現を可視化すると体全体が発光してしまうため、生きたままの状態では体全体での発光がノイズとなり所望の細胞や臓器中での遺伝子の発現の状態を把握することができないという問題がある。
また、特許文献３で提案されている手段を用いて解析する場合、解析に時間がかかるため大量に解析するには多大な量力を要するという問題がある。
このため、所望の細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく経時的に定量化することができるＤＮＡ解析手段の開発が、要望されているのが現状である。
However, in the case of the method using a microarray as proposed in
Further, in the method proposed in
Moreover, when analyzing using the means proposed in
Therefore, it is possible to visualize a target gene in a desired cell or organ, and further develop a DNA analysis means capable of accurately quantifying the visualized genetically modified animal over time in a living state. This is the current situation.
したがって、本発明の目的は、所望の細胞や臓器中で標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく解析することができるように動物の改質を行うことができるＤＮＡカセット、該ＤＮＡカセットを用いてなる形質転換細胞及び形質転換動物、並びにこれらの動物を簡易且つ簡便に、しかも連続的に且つ経時的に定量化することができる解析装置を提供することにある。 Therefore, the object of the present invention is to visualize a target gene in a desired cell or organ, and further to improve the animal so that the visualized genetically modified animal can be analyzed accurately in a living state. Cassette capable of performing quality, transformed cells and transformed animals using the DNA cassette, and analysis device capable of quantifying these animals simply and simply, continuously and over time Is to provide.
本発明者らは、上記課題を解消すべく鋭意検討した結果、
遺伝子改変動物を作成する際に使用するＤＮＡカセットを改良して、特定の組み換え酵素のみに認識される配列を組み込むことで、遺伝子発現の可視化を制御することが可能であることを知見し、さらに最適な配列構造を得るべく改良を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の各発明を提供するものである。
１．所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列とを有することを特徴とするＤＮＡカセット。
２．上記保護配列において、
上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により一対の組み換え酵素認識配列の間のスタッファー配列が除去された後に５’側と３’側との両人工イントロン配列が融合して、融合配列が形成されるようになされている、
１記載のＤＮＡカセット。
３．上記初期機能配列が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を具備する、１または２に記載のＤＮＡカセット。
４．上記初期機能配列が、
さらに選択マーカーの配列を具備する、
１〜３のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
５．上記選択マーカーの配列が、ＧＭＲ−ｗ＋、ｍｉｎｉ−ｗｈｉｔｅ＋、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋である４記載のＤＮＡカセット。
６．上記機能性遺伝子が、ルシフェラーゼである１〜５のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
７．上記組み換え酵素の認識配列がｌｏｘＰである１〜６のいずれかに記載のＤＮＡカセット。
８．３’側の上記人工イントロン配列が、さらに、上記組み換え酵素認識配列の３’側にＣｒｅに認識されるがｌｏｘＰ配列とは相同組み換えを起こさない変異型ｌｏｘＰ配列を具備する７に記載のＤＮＡカセット。
９．１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットを具備してなるベクター。
１０．１〜８のいずれかに記載のＤＮＡカセットが染色体上に存在する形質転換細胞。
１１．１０記載の形質転換細胞を具備する形質転換動物。
１２．１１記載の形質転換動物にさらに上記組み換え酵素認識配列を認識する組み換え酵素が導入されてなる機能性遺伝子発現動物。
１３．上記組み換え酵素が組織特異的に発現する酵素である１２記載の機能性遺伝子発現動物。
１４．上記組み換え酵素がＣｒｅである１２または１３に記載の機能性遺伝子発現動物。
１５．上記機能性遺伝子発現動物が、ショウジョウバエである１２〜１４のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物。
１６．１２〜１５のいずれかに記載の機能性遺伝子発現動物の解析を行う解析装置であって、
動物の保持部と、
画像を取得するための撮像部と、
情報処理を行う情報処理部と、
を具備する解析装置。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors,
We have discovered that it is possible to control the visualization of gene expression by improving the DNA cassette used when creating genetically modified animals and incorporating sequences that are recognized only by specific recombinant enzymes. The present invention has been completed by making repeated improvements to obtain an optimum arrangement structure.
That is, the present invention provides the following inventions.
1. A DNA cassette that undergoes homologous recombination with a predetermined target DNA and can be introduced into a chromosome,
A sequence homologous to the 5 ′ side of the sequence of the target DNA;
A sequence homologous to the 3 ′ side of the sequence of the target DNA,
And a protective sequence comprising an initial functional sequence and a pair of recombination enzyme recognition sequences, which are located between the sequence homologous to the 5 ′ side and the sequence homologous to the 3 ′ side, and which express a function upon chromosome introduction. When,
A functional gene sequence which is located between the protective sequence and a sequence homologous to the 3 ′ side and which exhibits a function only when at least the initial functional sequence in the protective sequence is removed, DNA cassette.
2. In the above protective sequence,
The above recombination enzyme recognition sequence is located within the artificial intron sequence,
After the stuffer sequence between a pair of recombination enzyme recognition sequences is removed by the above recombination enzyme, both artificial intron sequences on the 5 ′ side and 3 ′ side are fused to form a fusion sequence.
1. The DNA cassette according to 1.
3. 3. The DNA cassette according to 1 or 2, wherein the initial functional sequence comprises green fluorescent protein (GFP).
4). The initial function array is
Further comprising a sequence of selectable markers,
The DNA cassette according to any one of 1 to 3.
5. 5. The DNA cassette according to 4, wherein the sequence of the selection marker is GMR-w + , mini-white + , hsp70-white + .
6). The DNA cassette according to any one of 1 to 5, wherein the functional gene is luciferase.
7). The DNA cassette according to any one of 1 to 6, wherein the recombination enzyme recognition sequence is loxP.
8. The artificial intron sequence on the 8.3 ′ side further comprises a mutant loxP sequence that is recognized by Cre on the 3 ′ side of the recombination enzyme recognition sequence but does not cause homologous recombination with the loxP sequence. DNA cassette.
A vector comprising the DNA cassette according to any one of 9.1 to 8.
A transformed cell in which the DNA cassette according to any one of 10.1 to 8 is present on a chromosome.
11. A transformed animal comprising the transformed cell according to 10.10.
12. A functional gene-expressing animal obtained by introducing a recombinant enzyme that recognizes the recombinant enzyme recognition sequence into the transformed animal according to 12.11.
13. 13. The functional gene-expressing animal according to 12, wherein the recombinant enzyme is an enzyme that is expressed in a tissue-specific manner.
14 14. The functional gene-expressing animal according to 12 or 13, wherein the recombinant enzyme is Cre.
15. The functional gene-expressing animal according to any one of 12 to 14, wherein the functional gene-expressing animal is a Drosophila.
16. An analysis device for analyzing the functional gene-expressing animal according to any one of 12 to 15,
An animal holding part,
An imaging unit for acquiring images;
An information processing unit that performs information processing;
An analysis apparatus comprising:
本発明のＤＮＡカセットは、所望の細胞や臓器中でのみ標的遺伝子を可視化することができ、さらには可視化した遺伝子改変動物を生きたままの状態で精度よく解析することができるように動物の改質を行うことができる。このため、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ特定の機能を有する遺伝子を発現させ、更にはこれを可視化できる機能性遺伝子発現動物の作成が可能であり、また、形質転換動物作成の際のスクリーニングが容易なものである。
また、本発明のＤＮＡカセットは、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現するように構成することで、遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の形質転換動物は、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ特定の機能を有する遺伝子の発現を行い、更にはこれを可視化できる形質転換細胞及び機能性遺伝子発現動物の作製を可能にするものであり、形質転換動物作成の際のスクリーニングが容易なものである。
また、本発明の形質転換動物は、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現する動物の作製を可能にするものであり、遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の機能性遺伝子発現動物は、標的遺伝子の発現制御領域により発現制御を受け所望の細胞や臓器中でのみ遺伝子発現を可視化することができ、所望の細胞や臓器での遺伝子発現の状態を解析することができ、また、体中に幅広く発現するような遺伝子でも特定臓器で機能を発現させて状態解析することができるものである。
また、機能性遺伝子発現動物は、組み換え酵素が発現しない環境で特定の機能を有する遺伝子が発現し、組み換え酵素が発現する環境でのみ上記特定の機能を有する遺伝子と異なる機能を有する遺伝子が発現する動物を作成することができ遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
本発明の解析装置は、遺伝子発現を可視化した遺伝子改変動物を生きたまま精度よく、簡易且つ簡便に、しかも連続的に且つ経時的に定量化することができるものである。
The DNA cassette of the present invention can visualize a target gene only in a desired cell or organ, and further modify the animal so that the visualized genetically modified animal can be analyzed accurately in a living state. Quality can be done. For this reason, it is possible to create a functional gene-expressing animal that can express a gene having a specific function only in a desired cell or organ under expression control by the expression control region of the target gene, and further visualize it. In addition, it is easy to screen when producing transformed animals.
Further, the DNA cassette of the present invention expresses a gene having a specific function in an environment where the recombinant enzyme is not expressed, and expresses a gene having a function different from the gene having the specific function only in an environment where the recombinant enzyme is expressed. By configuring in this way, it can also be used for functional analysis of genes.
The transformed animal of the present invention is a transformed cell and a functional group that are controlled by the expression control region of a target gene, express a gene having a specific function only in a desired cell or organ, and can visualize it. It makes it possible to produce a gene-expressing animal and facilitates screening when producing a transformed animal.
The transformed animal of the present invention expresses a gene having a specific function in an environment where the recombinant enzyme is not expressed, and expresses a gene having a function different from the gene having the specific function only in an environment where the recombinant enzyme is expressed. It is possible to produce an animal that can be used for gene function analysis.
The functional gene-expressing animal of the present invention can be visualized only in a desired cell or organ under expression control by the expression control region of the target gene, and the gene expression state in the desired cell or organ can be visualized. The gene can be analyzed, and even a gene that is widely expressed in the body can be expressed in the function of a specific organ to analyze the state.
In addition, functional gene-expressing animals express a gene having a specific function in an environment where the recombinant enzyme is not expressed, and express a gene having a different function from the gene having the specific function only in an environment where the recombinant enzyme is expressed. Animals can be created and used for gene function analysis.
The analysis apparatus of the present invention is capable of quantifying a genetically modified animal whose gene expression has been visualized accurately, simply, simply, continuously and over time.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まず、本発明のＤＮＡカセットについて説明する。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
First, the DNA cassette of the present invention will be described.
＜全体構成＞
本発明のＤＮＡカセットは、図１に示すように、
所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こして染色体に導入可能なＤＮＡカセットであって、
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列と、
を有することを特徴とする。
<Overall configuration>
As shown in FIG. 1, the DNA cassette of the present invention has
A DNA cassette that undergoes homologous recombination with a predetermined target DNA and can be introduced into a chromosome,
A sequence homologous to the 5 ′ side of the sequence of the target DNA;
A sequence homologous to the 3 ′ side of the sequence of the target DNA,
And a protective sequence comprising an initial functional sequence and a pair of recombination enzyme recognition sequences, which are located between the sequence homologous to the 5 ′ side and the sequence homologous to the 3 ′ side, and which express a function upon chromosome introduction. When,
A sequence of a functional gene that is located between the protection sequence and the sequence homologous to the 3 ′ side, and that exhibits a function only when at least the initial functional sequence in the protection sequence is removed;
It is characterized by having.
以下、詳述する。
本発明のＤＮＡカセットは所定の標的ＤＮＡと相同組み換えを起こしうるものであるが、相同組み換えによる染色体への導入に限らず、ランダムに導入されることにより染色体に導入されてもよい。
＜標的ＤＮＡ＞
標的ＤＮＡは、動物、植物などの真核生物の任意の遺伝子である。
（所定の標的ＤＮＡ）
ここで、所定の標的ＤＮＡとは、本発明のＤＮＡカセットと相同組み換えする５’非翻訳領域から３’非翻訳領域を具備する遺伝子の配列（以下「標的配列」という場合にはこの配列を意味する）を含むＤＮＡであり、標的配列を含んでいればその他の配列は特に制限されず、標的配列のみからなるＤＮＡであってもよく、他の配列を含むＤＮＡであってもよい。
Details will be described below.
The DNA cassette of the present invention can undergo homologous recombination with a predetermined target DNA, but is not limited to introduction into a chromosome by homologous recombination, and may be introduced into a chromosome by random introduction.
<Target DNA>
The target DNA is any gene of eukaryotic organisms such as animals and plants.
(Predetermined target DNA)
Here, the predetermined target DNA means a sequence of a gene having a 5 ′ untranslated region to a 3 ′ untranslated region homologously recombined with the DNA cassette of the present invention (hereinafter referred to as “target sequence” means this sequence). The other sequences are not particularly limited as long as they include the target sequence, and may be DNA consisting of only the target sequence or DNA including other sequences.
（相同な配列）
ここで、相同な配列とは、相同組み換えを起こす程度に高い同一性を有する配列をいう。
(Homologous sequence)
Here, the homologous sequence refers to a sequence having high identity to the extent that homologous recombination occurs.
（標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列）
標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列とは、標的ＤＮＡの５’側に位置する配列と同一性の高い配列をいう。
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列は、５’非翻訳領域〜開始コドンの配列である。
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列の長さとしては、ショウジョウバエでは２〜３ｋｂであるのが、相同組み換えのしやすさの観点から好ましい。
(Sequence homologous to the 5 ′ side of the target DNA sequence)
The sequence homologous to the 5 ′ side of the target DNA sequence is a sequence having high identity with the sequence located on the 5 ′ side of the target DNA.
The sequence homologous to the 5 ′ side of the target DNA sequence is the sequence from the 5 ′ untranslated region to the start codon.
The length of the sequence homologous to the 5 ′ side of the target DNA sequence is preferably 2 to 3 kb in Drosophila from the viewpoint of ease of homologous recombination.
（標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列）
標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列とは、標的遺伝子の３’側に位置する配列と同一性の高い配列をいう。
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列は、終始コドン〜３’非翻訳領域の配列である。
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列の長さとしては、ショウジョウバエでは２〜３ｋｂであるのが、相同組み換えのしやすさの観点から好ましい。
(Sequence homologous to the 3 ′ side of the target DNA sequence)
The sequence homologous to the 3 ′ side of the target DNA sequence is a sequence having high identity with the sequence located 3 ′ side of the target gene.
The sequence homologous to the 3 ′ side of the target DNA sequence is the sequence from the stop codon to the 3 ′ untranslated region.
The length of the sequence homologous to the 3 ′ side of the target DNA sequence is preferably 2 to 3 kb in Drosophila from the viewpoint of ease of homologous recombination.
本発明のＤＮＡカセットは、上記標的ＤＮＡの配列の５’側及び３’側と相同な配列とにより、上記標的ＤＮＡの配列と相同組み換えを起こすことができ、これにより、本発明のＤＮＡカセットの配列は、生体内において標的ＤＮＡの遺伝子と同じ発現の制御を極めて高い可能性で受けることができる。 The DNA cassette of the present invention can cause homologous recombination with the sequence of the target DNA by a sequence homologous to the 5 ′ side and 3 ′ side of the sequence of the target DNA. The sequence can be subjected to the same control of expression in vivo as the gene of the target DNA.
＜保護配列＞
上記保護配列は、図１に示すように、上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する配列である。
上記保護配列は、図１に示すように、上記組換え酵素により、上記一対の組み換え酵素認識配列の間に位置するスタッファー配列を具備し、該スタッファー配列が除去されるようになされている配列である。上記初期機能配列は上記組み換え酵素認識配列間に位置するスタッファー配列の一部として配置されている。
<Protection sequence>
As shown in FIG. 1, the protective sequence is located in a portion sandwiched between a sequence homologous to the 5 ′ side and a sequence homologous to the 3 ′ side, and an initial functional sequence that expresses a function upon chromosome introduction and A sequence comprising a pair of recombination enzyme recognition sequences.
As shown in FIG. 1, the protective sequence comprises a stuffer sequence located between the pair of recombinant enzyme recognition sequences by the recombinant enzyme, and the stuffer sequence is removed. is there. The initial functional sequence is arranged as part of a stuffer sequence located between the recombinant enzyme recognition sequences.
（スタッファー配列）
上記スタッファー配列は、図１に示すように、上記一対の組み換え酵素の認識配列の間に位置し、上記組み換え酵素により除去される配列である。
上記スタッファー配列は、図１に示すように、上記初期機能配列を具備し、初期機能配列としての蛍光タンパク質遺伝子等のレポーター遺伝子や選択マーカーの配列等を少なくとも具備するものであり、これにより所望の機能を発揮する。
このようなスタッファー配列があることにより、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去される環境では後述する機能性遺伝子の配列が発現し、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去されていない環境では、上記初期機能配列の機能が発現し得るようになされている。
このため、例えば、上記組み換え酵素を所望の細胞や臓器特異的に発現させることによって、機能性遺伝子も細胞又は臓器特異的に発現するようになり、所望の細胞や臓器中でのみ機能性遺伝子を発現させることができる。
また、例えば、上記組み換え酵素を所望の細胞や臓器特異的に発現させ且つ機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、所望の細胞や臓器中でのみで標的遺伝子の発現を可視化することができる。
(Staffer arrangement)
As shown in FIG. 1, the stuffer sequence is a sequence located between the recognition sequences of the pair of recombinant enzymes and removed by the recombinant enzymes.
As shown in FIG. 1, the stuffer sequence comprises the above-mentioned initial functional sequence, and at least a reporter gene such as a fluorescent protein gene as an initial functional sequence, a sequence of a selection marker, and the like. Demonstrate the function.
Due to the presence of such a stuffer sequence, the functional gene sequence described below is expressed in an environment where the stuffer sequence is removed by the recombinant enzyme, and in the environment where the stuffer sequence is not removed by the recombinant enzyme, the initial function is described. The function of the sequence can be expressed.
For this reason, for example, by expressing the recombinant enzyme in a desired cell or organ-specific manner, a functional gene is also expressed in a cell or organ-specific manner, and the functional gene is expressed only in the desired cell or organ. Can be expressed.
In addition, for example, when the recombinant enzyme is expressed specifically in a desired cell or organ and a reporter gene is used as a functional gene, the expression of the target gene can be visualized only in the desired cell or organ.
＜初期機能配列＞
上記初期機能配列は、図１に示すように、上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する配列であり、上記初期機能配列は組み換え酵素が存在しない環境で発現するようになされており、組み換え酵素が存在する環境において、組み換え酵素により除去される配列である。
ここで、上記初期機能配列は機能性を有する配列を意味し、蛍光タンパク質等のレポーター遺伝子、選択マーカーの配列、公知の機能を有するタンパク質やＲＮＡをコードする遺伝子の配列、正常タンパク質を改変し機能の欠損、弱化、強化もしくは融合するなどで改質したタンパク質をコードする遺伝子の配列などの機能を有する配列をいい、それらを複数具備してもよい。
本発明で用いられる上記初期機能配列は、少なくともレポーター遺伝子及び選択マーカーの配列を具備し、レポーター遺伝子としての緑色蛍光タンパク質及び選択マーカーの配列を具備するのが好ましい。
上記初期機能配列を上記組み換え酵素が存在しない環境で発現させるようにするには、例えば、上述した５’側と相同な配列が具備する開始コドンの配列及び初期機能配列の読枠フレームを合わせた構成とする等通常この種のＤＮＡカセットにおいて採用されている構成を適宜用いることができる。
また、例えば、上記初期機能配列を、正常タンパク質をコードする遺伝子で構成し、後述する機能性配列を該正常タンパク質が変異した病気の原因遺伝子で構成した場合、該病気の原因遺伝子を組み換え酵素が発現する環境でのみ発現するようにさせることができ、特定の組織や環境における遺伝子の機能解析などに利用することも可能である。
<Initial function array>
As shown in FIG. 1, the initial functional sequence is a sequence that is located between a sequence homologous to the 5 ′ side and a sequence homologous to the 3 ′ side, and that expresses a function upon chromosome introduction. The initial functional sequence is expressed in an environment where no recombinant enzyme is present, and is a sequence removed by the recombinant enzyme in an environment where the recombinant enzyme is present.
Here, the above-mentioned initial functional sequence means a functional sequence, a reporter gene such as a fluorescent protein, a sequence of a selectable marker, a protein having a known function or a gene encoding RNA, and a normal protein are modified to function. A sequence having a function such as a sequence of a gene encoding a protein modified by deletion, weakening, strengthening, or fusing, and a plurality of such sequences may be provided.
The initial functional sequence used in the present invention comprises at least a reporter gene and a selectable marker sequence, and preferably comprises a green fluorescent protein as a reporter gene and a selectable marker sequence.
In order to express the initial functional sequence in an environment in which the recombinant enzyme does not exist, for example, the start codon sequence and the reading frame of the initial functional sequence, which are the sequences homologous to the 5 ′ side described above, are combined. The structure usually employed in this type of DNA cassette can be used as appropriate.
Further, for example, when the initial functional sequence is composed of a gene encoding a normal protein and the functional sequence described below is composed of a causative gene of a disease in which the normal protein is mutated, It can be expressed only in the environment where it is expressed, and can be used for functional analysis of genes in a specific tissue or environment.
（組み換え酵素）
ここで、組み換え酵素とは、特異的な核酸配列を認識する活性、前記配列を切断する活性、鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性、及び切断された核酸を結合させるリガーゼ活性を具備する酵素をいう。
上記組み換え酵素としては、上記の活性を具備する人工的に改変がなされた酵素や変異体酵素なども含まれる。
本発明で用いられる組み換え酵素としては、Ｃｒｅ、Ｃｒｅ−ＥＢＤ、Ｉｎｔ、Ｆｌｐなどが挙げられ、Ｃｒｅ、及び、Ｃｒｅ−ＥＢＤが好ましく挙げられる。
ここで、ＣｒｅとはＰ１ファージ由来のＣｒｅ遺伝子をいい、Ｉｎｔとはλファージのインテグラーゼ遺伝子（Ｉｎｔ）をいい、ＦｌｐとはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦｌｐ遺伝子をいい、Ｃｒｅ−ＥＢＤとは、Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｓ Ｅｖｏｌ （２００１） ２１１：４５８〜４６５に開示されるようなＣｒｅタンパク質にエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン部分のタンパク質を付加した融合タンパク質で、エストロゲンによりＣｒｅ−ＥＢＤの組み換え活性が発現するようになされているものをいう。
(Recombinant enzyme)
Here, the recombinant enzyme refers to an enzyme having an activity of recognizing a specific nucleic acid sequence, an activity of cleaving the sequence, a topoisomerase activity involved in strand exchange, and a ligase activity for binding the cleaved nucleic acid.
Examples of the recombinant enzyme include an artificially modified enzyme having the above activity, a mutant enzyme, and the like.
Examples of the recombinant enzyme used in the present invention include Cre, Cre-EBD, Int, Flp, and the like, preferably Cre and Cre-EBD.
Here, Cre refers to the Cre gene derived from the P1 phage, Int refers to the integrase gene (Int) of the λ phage, Flp refers to the Flp gene derived from Saccharomyces cerevisiae, and Cre-EBD refers to Dev Genes. Evol (2001) 211: 458-465 is a fusion protein obtained by adding a protein of the ligand binding domain part of the estrogen receptor to Cre protein, and the recombination activity of Cre-EBD is expressed by estrogen. Say what you are.
（組み換え酵素認識配列）
上記組み換え酵素の認識配列とは、上記組み換え酵素に認識される配列をいい、組み換え酵素の種類により認識配列が異なる。
組み換え酵素と、組み換え酵素の認識配列との関係を表１に示す。
即ち、本発明のＤＮＡカセットにおいては、上記組み換え酵素認識配列を認識させるためには、表１に示した組み合わせで組み換え酵素を使用する必要がある。
(Recombinant enzyme recognition sequence)
The recognition sequence of the recombinant enzyme means a sequence recognized by the recombinant enzyme, and the recognition sequence varies depending on the type of the recombinant enzyme.
Table 1 shows the relationship between the recombinant enzyme and the recognition sequence of the recombinant enzyme.
That is, in the DNA cassette of the present invention, it is necessary to use recombinant enzymes in the combinations shown in Table 1 in order to recognize the above-mentioned recombinant enzyme recognition sequence.
上記組み換え酵素の認識配列は、一対で用いられ、少なくとも一対の組み換え酵素の認識配列の間の遺伝子配列が除去するようになされている。
例えば、上記組み換え酵素の認識配列の対の構成については、上記組換え酵素がＣｒｅの場合には上記組換え酵素の認識配列はｌｏｘＰ配列であるが、ｌｏｘＰ配列を同方向の対にすることでＣｒｅによりｌｏｘＰ間の配列が除去されるように構成する。
また、上記の組換え酵素に認識される配列であれば、人工的に改変がなされている配列や変異型配列も使用できる。人工的に改変がなされた配列としては、例えば、特開平１１−１９６８８０に開示される改変型ｌｏｘＰ配列や、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４９９ （２００１）１４７−１５３ページに開示されるＦＡＳ配列などが挙げられる。
The recombination enzyme recognition sequences are used as a pair, and at least a gene sequence between the recognition sequences of the pair of recombination enzymes is removed.
For example, regarding the configuration of the recombination enzyme recognition sequence pair, when the recombination enzyme is Cre, the recombination enzyme recognition sequence is a loxP sequence, but the loxP sequences are paired in the same direction. The arrangement is made such that the sequence between loxP is removed by Cre.
In addition, artificially modified sequences and mutant sequences can be used as long as they are sequences recognized by the above-mentioned recombinant enzyme. Examples of the artificially modified sequence include a modified loxP sequence disclosed in JP-A-11-196880 and a FAS sequence disclosed in FEBS Letters 499 (2001) pages 147-153.
また、上記保護配列において、上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、上記組み換え酵素により上記スタッファー配列が除去された後に５’側と３’側の両人工イントロン配列とが融合して、融合配列が形成されるようになされているのが好ましい。すなわち、図１に示すように、上記保護配列を挟むように且つ上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列及び上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列との間に位置するように、２つの人工イントロン配列が配されて、かかる人工イントロン配列内に上記の組み換え酵素の認識配列が存在するように構成されているのが好ましい。 In the protective sequence, the recognition sequence of the recombinant enzyme is arranged in an artificial intron sequence, and both the 5′-side and 3′-side artificial intron sequences are removed after the stuffer sequence is removed by the recombinant enzyme. Are preferably fused to form a fusion sequence. That is, as shown in FIG. 1, it is located between the sequence homologous to the 5 ′ side of the target DNA sequence and the sequence homologous to the 3 ′ side of the target DNA sequence so as to sandwich the protective sequence. Thus, it is preferable that two artificial intron sequences are arranged so that the above-mentioned recombinant enzyme recognition sequence is present in the artificial intron sequence.
（人工イントロン配列）
ここで、人工イントロン配列は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体、ｐｒｅ−ｍＲＮＡともいう）として転写されたときに、生体内のスプライシング機構により除去されるようになされている配列である。
このような配列としては、転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体）がスプライセオソームによりスプライシングされる配列で、ＤＮＡ配列として記載した場合に５’末端にＧＴ（ここでＧ＝グアニン、Ｔ＝チミン）及び３’末端にＡＧ（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン）のジヌクレオチドを有する配列などが挙げられる。
(Artificial intron sequence)
Here, the artificial intron sequence is a sequence that is removed by an in vivo splicing mechanism when transcribed as RNA (also referred to as mRNA precursor, also referred to as pre-mRNA).
Such a sequence is a sequence in which a transcribed RNA (mRNA precursor) is spliced by a spliceosome. When described as a DNA sequence, GT is located at the 5 ′ end (where G = guanine, T = thymine). And a sequence having a dinucleotide of AG (A = adenine, G = guanine) at the 3 ′ end.
（５’側の人工イントロン配列）
上記５’側の人工イントロン配列は、上記の組み換え酵素の認識配列を有するのが好ましい。
例えば、上記５’側の人工イントロン配列は、配列番号１に示すように構成することができる。
配列番号１：
塩基番号１〜２にスプライシングのドナーサイト、
塩基番号４１〜７４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号２７５〜２７６にスプライシングのアクセプターサイト、
(5 'artificial intron sequence)
It is preferable that the artificial intron sequence on the 5 ′ side has a recognition sequence for the above-mentioned recombinant enzyme.
For example, the artificial intron sequence on the 5 ′ side can be constructed as shown in SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1:
Splicing donor sites at base numbers 1-2
A sequence (loxP) recognized by a recombinant enzyme at base numbers 41 to 74;
Splicing acceptor sites at base numbers 275-276,
（３’側の人工イントロン配列）
上記３’側の人工イントロン配列は、上記の組み換え酵素の認識配列を有するのが好ましい。
また、上記組み換え酵素の認識配列がｌｏｘＰであるとき、上記３’側の人工イントロン配列は、さらに、上記組み換え酵素の認識配列の３’側にＣｒｅに認識されるがｌｏｘＰ配列とは相同組み換えを起こさない変異型ｌｏｘＰ配列を具備するのが好ましく、ＦＡＳ配列を具備するのが特に好ましい。
ここで、 ＦＡＳ配列とはＳｉｅｇｅｌら著のＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４９９（２００１）、１４７−１５３ページに開示されるＣｒｅの標的配列のうちの一つである配列をいう。ＦＡＳ配列は、ｌｏｘＰ配列と配列が異なり、ｌｏｘＰ配列とは組換えをおこさない。
この構成により、ｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列とで挟んだ外来ＤＮＡ配列を、本発明のＤＮＡカセット内のｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列との間に正確に導入することが可能となる。
例えば、ｌｏｘＰ配列とＦＡＳ配列との間の配列をヒト遺伝子のコーディング領域の配列に置換しヒトタンパク質を発現させた場合、それを標的としたｉｎ ｖｉｖｏ薬剤スクリーニングが可能になる。また、変異型遺伝子で置換して、その変異がどのような機能的影響をもたらすのかを、素早く検証できる。
例えば、上記３’側の人工イントロン配列は、配列番号２のように構成することができる。
配列番号２：
塩基番号１〜３４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号１１５〜１４８にＦＡＳ配列、
塩基番号２６９〜２７０にスプライシングのアクセプターサイト、
(3 'artificial intron sequence)
The 3 ′ artificial intron sequence preferably has a recognition sequence for the above-mentioned recombinant enzyme.
When the recombination enzyme recognition sequence is loxP, the 3 ′ artificial intron sequence is further recognized by Cre on the 3 ′ side of the recombination enzyme recognition sequence, but homologous recombination with the loxP sequence. It preferably has a mutant loxP sequence that does not occur, and particularly preferably has a FAS sequence.
Here, the FAS sequence refers to a sequence that is one of the target sequences of Cre disclosed in FEBS Letters 499 (2001), pages 147 to 153 by Siegel et al. The FAS sequence differs from the loxP sequence and does not recombine with the loxP sequence.
With this configuration, a foreign DNA sequence sandwiched between a loxP sequence and a FAS sequence can be accurately introduced between the loxP sequence and the FAS sequence in the DNA cassette of the present invention.
For example, when the sequence between the loxP sequence and the FAS sequence is replaced with the sequence of the coding region of a human gene and a human protein is expressed, in vivo drug screening targeting it can be performed. In addition, it is possible to quickly verify the functional effect of the mutation by substituting it with a mutant gene.
For example, the artificial intron sequence on the 3 ′ side can be configured as SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2:
A sequence (loxP) recognized by a recombinant enzyme at
FAS sequence at base numbers 115-148,
Splicing acceptor sites at base numbers 269-270,
（融合配列）
上記の組み換え酵素認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により上記スタッファー配列が除去された後に５’側と３’側の両人工イントロン配列とが融合して、融合配列が形成されるようになされている。
融合配列はｍＲＮＡ前駆体として転写され、ｍＲＮＡになるときに生体内のスプライシング機構により除去されるようになされている。
これにより、標的遺伝子の配列の５’側と相同な配列と、機能性遺伝子の配列とが、ＲＮＡにおいてスプライシングにより連結され、機能性遺伝子が発現する。
上記融合配列の一例として配列番号１と２が融合した配列を、配列番号３に示す。
配列番号：３
塩基番号１〜２にスプライシングのドナーサイト（５’側の人工イントロン配列由来）、
塩基番号４１〜７４に組み換え酵素で認識される配列（ｌｏｘＰ）、
塩基番号１５５〜１８８にＦＡＳ配列、
塩基番号３０９〜３１０にスプライシングのアクセプターサイト、（３’側の人工イントロン配列由来）
(Fusion sequence)
The above recombination enzyme recognition sequence is located in the artificial intron sequence,
After the stuffer sequence is removed by the recombinant enzyme, the artificial intron sequences on both the 5 'side and the 3' side are fused to form a fused sequence.
The fusion sequence is transcribed as an mRNA precursor and removed by an in vivo splicing mechanism when it becomes mRNA.
Thereby, the sequence homologous to the 5 ′ side of the sequence of the target gene and the sequence of the functional gene are linked by splicing in RNA, and the functional gene is expressed.
As an example of the fusion sequence, a sequence in which SEQ ID NOs: 1 and 2 are fused is shown in SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 3
Splicing donor site (derived from artificial intron sequence on the 5 ′ side) at
A sequence (loxP) recognized by a recombinant enzyme at base numbers 41 to 74;
FAS sequence at base numbers 155 to 188,
Splicing acceptor sites at base numbers 309 to 310 (derived from the artificial intron sequence on the 3 ′ side)
＜レポーター遺伝子＞
上記初期機能配列は、図１に示すように、少なくともレポーター遺伝子及び選択マーカーの配列を具備する。
上記レポーター遺伝子とは、遺伝子の発現を確認するために用いる遺伝子をいい、蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼなどの発光反応を触媒するタンパク質の遺伝子、β−ガラクトシターゼなどの発色反応を触媒するタンパク質の遺伝子が挙げられる。
上記初期機能配列として上記レポーター遺伝子を用いる場合、上記レポーター遺伝子の配列は、５’側の人工イントロン配列の３’側に配置されるのが好ましい。これにより、転写後のＲＮＡにおいて、５’側の人工イントロン配列は、スプライシングにより除去され、上記標的遺伝子の配列の５’側と相同な配列と、上記レポーター遺伝子の配列とが連結される。
また、この構成により、上記初期機能配列としてのレポーター遺伝子は、組み換え酵素が存在しない環境で標的遺伝子の発現パターンを示す。
（蛍光タンパク質遺伝子）
上記蛍光タンパク質遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）が挙げられ、緑色蛍光タンパク質が好ましく挙げられる。
また、本発明で用いることができる上記蛍光タンパク質は、人工的に改変されたものも含まれる。
<Reporter gene>
As shown in FIG. 1, the initial functional sequence includes at least a reporter gene and a selectable marker sequence.
The above reporter gene refers to a gene used for confirming gene expression, such as a fluorescent protein gene, a protein gene that catalyzes a luminescence reaction such as luciferase, and a protein gene that catalyzes a chromogenic reaction such as β-galactosidase. Is mentioned.
When the reporter gene is used as the initial functional sequence, the reporter gene sequence is preferably arranged on the 3 ′ side of the 5 ′ artificial intron sequence. Thereby, in the RNA after transcription, the 5′-side artificial intron sequence is removed by splicing, and the sequence homologous to the 5′-side of the target gene sequence and the sequence of the reporter gene are linked.
In addition, with this configuration, the reporter gene as the initial functional sequence shows the expression pattern of the target gene in an environment where no recombinant enzyme is present.
(Fluorescent protein gene)
Examples of the fluorescent protein gene include green fluorescent protein (GFP), red fluorescent protein (RFP), cyan fluorescent protein (CFP), and yellow fluorescent protein (YFP), with green fluorescent protein being preferred.
The fluorescent protein that can be used in the present invention includes those artificially modified.
（選択マーカーの配列）
上記選択マーカーの配列は、本発明のＤＮＡカセットで動物を形質転換した際に該ＤＮＡカセットの移入があった個体を外部から判別しやすくするために使用するための機能をもつ配列であり、組織特異的な発現を示す遺伝子、体色や体の組織に変化を及ぼす遺伝子、薬剤選択マーカーとしての遺伝子などの配列やそれらの融合配列なども用いることができる。
例えば、上記選択マーカーの配列としては、ＧＭＲ−ｗ＋、ｍｉｎｉ−ｗｈｉｔｅ＋、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋などの配列が好ましく挙げられる。
ここで、ＧＭＲ−ｗ＋とは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．（２００８）Ｓｅｐ；１８０（１）：７０３−７ページに開示されるＧＭＲの下流にショウジョウバエのｗｈｉｔｅ＋遺伝子を連結させた配列をいう。
ＧＭＲはショウジョウバエの複眼原基特異的プロモーター配列をいい、ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ１遺伝子のプロモーターに由来する配列を５コピー隣接して並べた配列である。また、ｗｈｉｔｅ＋はショウジョウバエのｗｈｉｔｅ＋遺伝子をいい、それらを改変した配列を用いてもよい。
ここで、ｍｉｎｉ―ｗｈｉｔｅ＋とは、Ｚｈａｎｇら著Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（９２）５５２５−５５２９ページに開示されるｗｈｉｔｅ＋遺伝子をコンパクトに改変した配列である。
また、ｈｓｐ７０−ｗｈｉｔｅ＋とは、ショウジョウバエのｈｓｐ７０遺伝子のプロモーターの配列の下流に上記のｗｈｉｔｅ＋遺伝子を連結させた配列をいう。
例えば、上記保護配列がＧＭＲ−ｗ＋を具備する本発明のＤＮＡカセットの配列を白眼のショウジョウバエの系統に移入した場合、ショウジョウバエの眼はＧＭＲ−ｗ＋により赤くなる。
これにより、移入ＤＮＡの検出や顕微鏡などを使用することなしに肉眼で、本発明のＤＮＡカセットが染色体上に移入された個体を選別することができるため、遺伝子改変動物作成の労力を大きく減らすことができる。
また、本発明のＤＮＡカセットによる形質転換動物は、上記選択マーカーを生殖細胞で保護配列が切り出されたものをみわける際に便利なマーカーとして利用することができる。
(Selection marker array)
The sequence of the selectable marker is a sequence having a function to be used for facilitating discrimination of an individual having transferred the DNA cassette from the outside when the animal is transformed with the DNA cassette of the present invention. A gene exhibiting specific expression, a gene that changes in body color or body tissue, a gene as a drug selection marker, a fusion sequence thereof, or the like can also be used.
For example, the sequence of the selection marker is preferably a sequence such as GMR-w + , mini-white + , hsp70-white + .
Here, GMR-w + means Genetics. (2008) Sep; 180 (1): Refers to a sequence in which a Drosophila white + gene is linked downstream of the GMR disclosed on pages 703-7.
GMR refers to a Drosophila compound eye primordium-specific promoter sequence, and is a sequence in which 5 copies of a sequence derived from the
Here, “mini-white +” refers to Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (92) 5525-5529 is a sequence obtained by compactly modifying the white + gene disclosed in pages 525-5529.
Hsp70-white + refers to a sequence in which the above white + gene is linked downstream of the promoter of the Drosophila hsp70 gene.
For example, when the sequence of the DNA cassette of the present invention in which the protective sequence comprises GMR-w + is transferred into a white-eye Drosophila strain, the Drosophila eye becomes red due to GMR-w + .
This makes it possible to select individuals with the DNA cassette of the present invention transferred onto the chromosome with the naked eye without detecting the transferred DNA or using a microscope. Can do.
In addition, the animal transformed with the DNA cassette of the present invention can be used as a convenient marker when the above selectable marker is separated from germ cells whose protective sequence has been excised.
上記スタッファー配列には、図１に示すように、上記初期機能配列に加えてさらにポリＡシグナル配列等の初期機能配列の転写の終結やｍＲＮＡの安定化等種々機能付加のための機能付加配列をさらに配置することができる。
（ポリＡシグナル配列）
ポリＡシグナル配列は、上記蛍光タンパク質遺伝子の３’側に配置されるのが好ましい。
ここで、ポリＡシグナル配列は、転写されたｍＲＮＡにポリＡを付加する機能を有する配列をいう。
具体的には、ポリＡシグナル配列としては、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列などの配列が挙げられる。
ポリＡシグナル配列は、図１に示すように、上記蛍光タンパク質遺伝子の配列と、上記選択マーカーの配列との間に位置するのが好ましい。
これにより、蛍光タンパク質遺伝子の配列の転写を停止させることができ、かつ、蛍光タンパク質遺伝子のｍＲＮＡを安定化させ蛍光タンパク質の発現効率を高めることができる。
As shown in FIG. 1, the stuffer sequence includes functional addition sequences for adding various functions such as termination of transcription of an initial functional sequence such as a poly A signal sequence and stabilization of mRNA in addition to the initial functional sequence. Further arrangements can be made.
(Poly A signal sequence)
The poly A signal sequence is preferably arranged on the 3 ′ side of the fluorescent protein gene.
Here, the poly A signal sequence refers to a sequence having a function of adding poly A to transcribed mRNA.
Specifically, examples of the poly A signal sequence include sequences such as the SV40 polyA sequence.
As shown in FIG. 1, the poly A signal sequence is preferably located between the fluorescent protein gene sequence and the selectable marker sequence.
As a result, transcription of the fluorescent protein gene sequence can be stopped, and mRNA of the fluorescent protein gene can be stabilized to increase the expression efficiency of the fluorescent protein.
＜機能性遺伝子＞
本発明のＤＮＡカセットにおいて、機能性遺伝子は、上記組み換え酵素によりスタッファー配列が除去される環境で、発現するようになされている。
上記機能性遺伝子としては、初期機能配列と同様の遺伝子が挙げられ、中でもレポーター遺伝子が好ましく挙げられる。
ただし、上記機能性遺伝子は上記初期機能配列と異なる遺伝子を選択する必要がある。
上記レポーター遺伝子としては、上記初期機能配列と同様に、ルシフェラーゼ遺伝子を好ましく挙げることができるが、この他に蛍光タンパク質の遺伝子、β−ガラクトシターゼなどの発色反応を触媒するタンパク質の遺伝子等を用いることもできる。
機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を定量的に解析することができ、特に機能性遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いることにより、遺伝子発現を可視光領域で定量的に解析することができる。
ここで、ルシフェラーゼとは、ホタルや発光バクテリアなどの生物発光において、発光物質が光を放つ化学反応を触媒する作用を持つ酵素の総称をいい、上記の特徴を具備した酵素や人工的に改変がなされた酵素も含まれる。
また、励起光を必要とせず可視光領域にて観察を行うことができるため高価な設備を必要とせずに観察できる。また、励起光の照射による動物への悪影響を低減することができる。
機能性遺伝子発現動物の機能性遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合は、基質であるルシフェリンを餌などに混合し動物に与えることなどで、ルシフェラーゼ遺伝子が発現する組織や細胞を発光させることができる。
<Functional genes>
In the DNA cassette of the present invention, the functional gene is expressed in an environment where the stuffer sequence is removed by the recombinant enzyme.
Examples of the functional gene include genes similar to the initial functional sequence, and a reporter gene is particularly preferable.
However, it is necessary to select a gene different from the initial functional sequence as the functional gene.
As the reporter gene, a luciferase gene can be preferably mentioned as in the case of the above-mentioned initial functional sequence. In addition to this, a fluorescent protein gene, a gene of a protein that catalyzes a coloring reaction such as β-galactosidase, and the like are used. You can also.
By using a reporter gene as a functional gene, gene expression can be quantitatively analyzed. In particular, by using a luciferase gene as a functional gene, gene expression can be quantitatively analyzed in the visible light region. .
Here, luciferase is a general term for enzymes that have a function of catalyzing a chemical reaction in which a luminescent substance emits light in bioluminescence such as fireflies and luminescent bacteria. Enzymes having the above characteristics or artificially modified can be used. Also included are enzymes made.
Further, since observation can be performed in the visible light region without requiring excitation light, observation can be performed without requiring expensive equipment. In addition, adverse effects on animals due to irradiation with excitation light can be reduced.
When a luciferase gene is used as a functional gene of a functional gene-expressing animal, the tissue or cells in which the luciferase gene is expressed can be caused to emit light by mixing the substrate luciferin with food or the like and feeding it to the animal.
（製造方法）
本発明のＤＮＡカセットは、プラスミド、ファージ、ＢＡＣなどのＤＮＡの断片や、ＰＣＲなどによるＤＮＡの増幅産物、化学合成などにより得られるＤＮＡを用いて、ライゲーション反応や、組み換え反応などによる連結、または制限酵素処理による切断などの公知の手法を応用して作製することができる。
(Production method)
The DNA cassette of the present invention uses DNA fragments such as plasmids, phages and BACs, DNA amplification products by PCR, DNA obtained by chemical synthesis, etc., and is linked or restricted by ligation reaction or recombination reaction. It can be produced by applying a known method such as cleavage by enzyme treatment.
次に、本発明のベクターについて説明する。
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡカセットを具備するベクターである。
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡカセットを公知のベクターに、ライゲーション反応や、組み換え反応などの公知の方法で連結させることにより作製することができる。
本発明のベクターの作製には、公知のプラスミド、ファージなどのベクターを用いることができる。
Next, the vector of the present invention will be described.
The vector of the present invention is a vector comprising the DNA cassette of the present invention.
The vector of the present invention can be prepared by ligating the DNA cassette of the present invention to a known vector by a known method such as a ligation reaction or a recombination reaction.
For the production of the vector of the present invention, known vectors such as plasmids and phages can be used.
次に、本発明の形質転換細胞について説明する。
本発明の形質転換細胞は、本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する細胞をいう。
本発明の形質転換細胞は、細胞に本発明のＤＮＡカセットや本発明のベクターををリン酸カルシウム法、リポフェクション法やエレクトロポレーション法などの公知の方法で導入し形質転換させることにより得ることができる。
また、形質転換動物や後述する機能性遺伝子発現動物の組織などから細胞を採取しても得ることができる。
Next, the transformed cell of the present invention will be described.
The transformed cell of the present invention refers to a cell having one or more of the above DNA cassettes of the present invention on a chromosome.
The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the DNA cassette of the present invention or the vector of the present invention into a cell by a known method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, or an electroporation method, and transforming the cell.
It can also be obtained by collecting cells from tissues of transformed animals or functional gene-expressing animals described later.
＜形質転換動物＞
次に、本発明の形質転換動物について説明する。
本発明の形質転換動物は、本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する上記形質転換細胞を含有するヒト以外の動物をいい、後述する組み換え酵素が導入される以前のＤＮＡカセットが染色体上に導入された段階の動物である。
動物としては、昆虫、哺乳類（マウス、ラット、ハムスターなど）、魚類など形質転換が可能な動物が挙げられるが、本発明のＤＮＡカセットがレポーター遺伝子を具備する場合は胚や成体において体内の発光が体外に透過する動物が好ましい。
例えば、昆虫であればショウジョウバエ、魚類であればメダカやゼブラフィッシュ、尾索動物のカタユウレイボヤなどが好ましく挙げられ、ショウジョウバエが特に好ましく挙げられる。
ショウジョウバエは、体色が薄いためレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼや蛍光タンパク質の体内の発光を体外へ透過しやすく、微弱な発光も観察できるため好ましい。
また、ショウジョウバエは、ヒトと相同な遺伝子を多数有し、遺伝子の研究材料として古くから研究され高度な解析技術が確立されているため、組織特異的に遺伝子を発現させるための系統も充実しており好ましい。
また、ショウジョウバエは、飼育が容易で、体型も小さく、生活環も約１０日余りと短く、低コスト化が可能であることから好ましい。
<Transformed animals>
Next, the transformed animal of the present invention will be described.
The transformed animal of the present invention refers to a non-human animal containing the transformed cell having one or more of the DNA cassettes of the present invention on the chromosome, and the DNA cassette before the introduction of the recombinant enzyme described later is the chromosome. It is the animal at the stage introduced above.
Examples of animals include animals that can be transformed, such as insects, mammals (mouse, rat, hamster, etc.), fish, and the like. When the DNA cassette of the present invention has a reporter gene, luminescence in the body is produced in embryos and adults. Animals that penetrate outside the body are preferred.
For example, Drosophila is preferred for insects, and medaka and zebrafish for fishes, and caudate flyfish are preferred, and Drosophila is particularly preferred.
Drosophila is preferable because it has a light body color and can easily transmit luminescence in the body of luciferase as a reporter gene and fluorescent protein to the outside of the body, and weak light emission can be observed.
Drosophila has many genes that are homologous to humans and has been studied as a genetic research material since ancient times, and advanced analysis techniques have been established. It is preferable.
Drosophila is preferable because it is easy to breed, has a small body shape, has a short life cycle of about 10 days, and can be reduced in cost.
本発明の形質転換動物は、本発明のＤＮＡカセットをインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法で移入し、移入後の動物を初期機能性配列の発現（眼色や、蛍光タンパク質の発現）を指標に選抜することにより得ることができる。 In the transformed animal of the present invention, the DNA cassette of the present invention is transferred by a known method such as an injection method or an electroporation method, and the animal after transfer is expressed with an initial functional sequence (expression of eye color or fluorescent protein). Can be obtained by selecting as an index.
＜機能性遺伝子発現動物＞
次に、本発明の機能性遺伝子発現動物について説明する。
ここで、機能性遺伝子発現動物とは、本発明の形質転換動物（本発明の本発明の上記ＤＮＡカセットを１つ以上染色体上に有する動物）にさらに上記組み換え酵素の認識配列を認識する組み換え酵素が発現する動物をいう。
上記機能性遺伝子発現動物は、標的遺伝子が発現する組織で且つ上記の組み換え酵素が発現する部位において、上記機能性遺伝子が発現するようになされている。
上記の組み換え酵素は、組織特異的に発現するようになされているのが好ましい。
例えば、上記組み換え酵素が組織特異的に発現するようになされている場合、上記組み換え酵素が発現する組織でのみ機能性遺伝子を発現させることができる。
また、例えば、機能性遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、標的遺伝子が体全体に発現し体全体が発光するなどの理由で観察ができなかったものが、特定の組織に限定してレポーター遺伝子を発現させることで観察できるようになる。
<Functional gene expressing animals>
Next, the functional gene-expressing animal of the present invention will be described.
Here, the functional gene-expressing animal is a recombinant enzyme that further recognizes the recognition sequence of the recombinant enzyme in the transformed animal of the present invention (an animal having one or more of the DNA cassettes of the present invention on the chromosome). Refers to animals that express
The functional gene-expressing animal expresses the functional gene in a tissue where the target gene is expressed and in a site where the recombinant enzyme is expressed.
The recombinant enzyme is preferably expressed in a tissue-specific manner.
For example, when the recombinant enzyme is expressed in a tissue-specific manner, a functional gene can be expressed only in a tissue where the recombinant enzyme is expressed.
In addition, for example, when a reporter gene is used as a functional gene, the reporter gene is limited to a specific tissue that cannot be observed because the target gene is expressed throughout the body and the whole body emits light. It becomes possible to observe by expressing.
また、本発明の機能性遺伝子発現動物が同一個体に複数のＤＮＡカセットを持ち、且つ、それらのＤＮＡカセットが機能性遺伝子として波長が異なるレポーター遺伝子を持つように構成した場合、同時に複数の遺伝子の発現をモニターすることも可能である。
また、例えば、標的遺伝子としてショウジョウバエのゲノムの全ての遺伝子において、本発明の機能性遺伝子発現動物を作製しライブラリー化すれば、マイクロアレイと同様にゲノムの全遺伝子の発現データを解析ができ高い時間空間分解能で取得可能な網羅的解析が可能になる。
In addition, when the functional gene-expressing animal of the present invention has a plurality of DNA cassettes in the same individual, and these DNA cassettes are configured to have reporter genes having different wavelengths as functional genes, It is also possible to monitor expression.
In addition, for example, if all the genes in the Drosophila genome are used as target genes and the functional gene-expressing animals of the present invention are prepared and libraryed, the expression data of all genes in the genome can be analyzed in the same way as in the microarray. Comprehensive analysis that can be acquired with spatial resolution becomes possible.
本発明の機能性遺伝子発現動物の作製手段としては、例えば、本発明の形質転換動物に、組織特異的プロモーターの下流に上記組み換え酵素を組み込み、組織特異的に上記組み換え酵素が発現するようにした配列をもつＤＮＡを移入することなどが挙げられる。
また、例えば、本発明の機能性遺伝子発現動物に、ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムを用い組織特異的にＧＡＬ４を発現しＵＡＳの下流に上記組み換え酵素を組み込んだＤＮＡを有する系統と交配しその子孫を得ることが挙げられる。
As a means for producing the functional gene-expressing animal of the present invention, for example, the recombinant enzyme is incorporated into the transformed animal of the present invention downstream of a tissue-specific promoter so that the recombinant enzyme is expressed in a tissue-specific manner. For example, transferring DNA having a sequence.
In addition, for example, the functional gene-expressing animal of the present invention is crossed with a strain having a GAL4-UAS system that expresses GAL4 tissue-specifically and incorporates the above-mentioned recombinant enzyme downstream of UAS to obtain its progeny. Is mentioned.
上記組み換え酵素の認識配列を認識する組み換え酵素としては、Ｃｒｅが好ましく、中でもＣｒｅ−ＥＢＤが好ましい。
Ｃｒｅ−ＥＢＤを用いた場合、動物にエストロゲンを与えることでＣｒｅ−ＥＢＤが活性をもち、スタッファー配列を除去することができる。
また、Ｃｒｅは細胞毒性を示すことが知られており、エストロゲンの投与を必要最小限にとどめることでＣｒｅ−ＥＢＤの組み換え活性の発現の時間も最小限になり、細胞毒性を大きく減らすことができる。
As a recombinant enzyme that recognizes the recognition sequence of the above recombinant enzyme, Cre is preferable, and Cre-EBD is particularly preferable.
When Cre-EBD is used, Cre-EBD has activity by supplying estrogen to the animal, and the stuffer sequence can be removed.
Cre is also known to exhibit cytotoxicity, and by minimizing the administration of estrogen, the time required for expression of the recombination activity of Cre-EBD is minimized, and the cytotoxicity can be greatly reduced. .
次に、本発明の機能性遺伝子発現動物の利用方法について説明する。
本発明の機能性遺伝子発現動物が具備する本発明のＤＮＡカセットの機能性遺伝子がルシフェラーゼである場合を例にして説明する。
本発明の形質転換動物であり上記組み換え酵素が発現する可能性のあるショウジョウバエの成虫を、交配や遺伝子導入などの手段で準備する。
得られたショウジョウバエの成虫に、ルシフェリンを混合した餌を与え、上記組み換え酵素が発現する部位を発光させる。
上記組み換え酵素が発現する部位の発光を観察し、発光している個体を選別することで、本発明のＤＮＡカセットが導入され且つ所望の臓器で上記組み換え酵素が発現する機能性遺伝子発現動物を得る。
なお、上記組み換え酵素がＣｒｅ−ＥＢＤの場合、餌にさらにエストロゲンを添加することで、Ｃｒｅ−ＥＢＤが発現する部位を発光させることができる。
なお、ルシフェリン及びエストロゲンを混合した餌は、たとえば、餌１ｍＬに対し、ルシフェリン０．１〜１ｍｇ及びエストロゲン０．１〜１ｍｇを添加したものである。
そして、得られた機能性遺伝子発現動物を顕微鏡やルミノメーターなどの発光定量装置や後述する解析装置により、種々条件下における発光の有無や強度を測定することで、環境や投与物質による生体への影響を定性的且つ定量的に分析することができる。
Next, a method for using the functional gene-expressing animal of the present invention will be described.
The case where the functional gene of the DNA cassette of the present invention provided in the functional gene-expressing animal of the present invention is luciferase will be described as an example.
A Drosophila adult that is a transformed animal of the present invention and is likely to express the above-mentioned recombinant enzyme is prepared by means such as mating or gene transfer.
The resulting adult Drosophila is fed with a diet mixed with luciferin, and the site where the recombinant enzyme is expressed is allowed to emit light.
By observing luminescence at the site where the recombinant enzyme is expressed and selecting individuals that emit light, a functional gene-expressing animal in which the DNA cassette of the present invention is introduced and the recombinant enzyme is expressed in a desired organ is obtained. .
In addition, when the said recombinant enzyme is Cre-EBD, the site | part which Cre-EBD expresses can be light-emitted by adding an estrogen further to a bait | feed.
In addition, the bait | mixed luciferin and the estrogen are what added 0.1-1 mg of luciferins and 0.1-1 mg of estrogen with respect to 1 mL of baits, for example.
The resulting functional gene-expressing animal is measured for the presence or intensity of light emission under various conditions by means of a luminescence quantification device such as a microscope or a luminometer, or an analysis device described later. The impact can be analyzed qualitatively and quantitatively.
上記機能性遺伝子発現動物解析装置について図面を参照して説明する。
図２に示す解析装置１０１は、機能性遺伝子発現動物の解析を行う解析装置であって、
動物の保持部１１０と、画像を取得するための撮像部１２０と、情報処理を行う情報処理部１３０と、を具備する。
さらに詳細には、保持部１１０は、縦長の試験管状の部屋１１１が複数個連設されて形成されており、本実施形態では縦６室×横８室の計４８室からなる。そして、各部屋の上部開口はそれぞれ透明で内部が撮影可能な蓋材（図示せず）により封止可能となされている。
撮像部１２０は、各部屋の内部が個別に、複数個を同時にもしくはすべてを同時に撮影できるようになっているカメラからなる。そして、保持部１１０の上部に、公知の移動用機器を介して配置されており、上方から撮影するように構成されている。
情報処理部１３０は、カメラで撮影した画像を入力して保存するメモリー部１３１と、入力した情報を処理するＣＰＵ１３２と、処理するためのプログラムを保存すると共にＣＰＵ１３２で処理して得られた情報を保存する保存部１３３とからなる。これらの各部はハウジング１３４内に設置されており、撮像部１２０とはケーブル１２２を介して連結されている。
そして、本実施形態の解析装置を用いて機能性遺伝子発現動物の解析を行うには、まず、各部屋１１１内に機能性遺伝子発現動物を入れて蓋で封止する。この状態でそれぞれの部屋内の動物に所望の処理を行いその際の作用を、撮像部１２０で映像を取得することで観察する。この際、観察は撮像部１２０を順次移動させながら各部屋１１１の上部から各部屋１１１を順次撮影することで行う。ついで撮影した画像を時間とともに記録しつつ、撮影した画像の処理を行い、経時的な変化を記録し、保存部に保存する。そして、これらの画像を部屋ごとに経時的に並べて観察することで機能性遺伝子発現動物に対する影響を分析できる。
なお、上述した例では、撮像部１２０が各部屋の内部を個別に撮影できるようになっているカメラを用い順次移動させながら各部屋１１１を順次撮影する場合の例を示したがこれらに限定されるものではない。
例えば、部屋全体の画像を一度に取得可能なカメラを用いて画像の取得をし、解析時に各部屋のデータを分離して解析をしてもよい。また、複数のカメラを用いて同時に各部屋の内部を撮影し、個別に解析するようにしてもよい。
The functional gene expression animal analyzing apparatus will be described with reference to the drawings.
An
An animal holding unit 110, an
More specifically, the holding unit 110 is formed by connecting a plurality of vertically long test tubular chambers 111, and in the present embodiment, the holding unit 110 includes a total of 48 chambers of 6 vertical chambers × 8 horizontal chambers. The upper opening of each room is transparent and can be sealed with a cover material (not shown) that can photograph the inside.
The
The
And in order to analyze a functional gene expression animal using the analyzer of this embodiment, first, a functional gene expression animal is put in each room 111, and it seals with a lid | cover. In this state, a desired process is performed on the animals in each room, and the action at that time is observed by acquiring an image with the
In the above-described example, the example in which the
For example, an image may be acquired using a camera that can acquire an image of the entire room at once, and the data of each room may be separated and analyzed at the time of analysis. Further, the inside of each room may be photographed simultaneously using a plurality of cameras and individually analyzed.
以下、本発明について実施例及び比較例を示してさらに具体的に説明するが本発明はこれらに何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example are shown and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not restrict | limited to these at all.
〔実施例１〕
＜ＤＮＡカセットの製造＞
標的遺伝子としてのショウジョウバエのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分を特異的に増幅しＤＮＡの増副産物を得る（ＰＣＲ）ため、以下のプライマー１及び２を設計した。
プライマー１（配列番号４）：
ＡＴＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧ
プライマー２（配列番号５）：
ＡＧＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＡＴＴＧ
なお、プライマー１には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の４２６〜４４４の部分の配列をアダプターとして導入し、プライマー２には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の３４０９〜３４２１の部分の配列をアダプターとして導入した。
標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の３’末端の部分を特異的に増幅するため、
以下のプライマー３及び４を設計した。
プライマー３（配列番号６）：
ＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣ
プライマー４（配列番号７）：
ＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＣＧＡＧＡＣＣ
なお、プライマー３には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の９６１３〜９６２２の部分の配列をアダプターとして導入し、プライマー４には、形質転換用ベクター配列である配列番号８の１１５８８〜１１６０２の部分の配列をアダプターとして導入した。
設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分及び３’末端の部分ＤＮＡ断片を増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従いＣｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒにより処理した。
処理後の標的遺伝子としてのＴｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ）の５’末端の部分及び３’末端の部分ＤＮＡ断片と、予め作成したＤＮＡ断片５’側の人工イントロン、初期機能性配列としての緑色蛍光タンパク質、ＧＭＲ−ｗ＋を具備する保護配列、３’側の人工イントロン配列および機能性配列としてのルシフェラーゼ遺伝子を具備するＤＮＡ断片（配列番号８の３４０９〜９６２２部分）と、予めｐＵＣ５７に、相同組換えに必要な配列（Ｉ−ＳｃｅＩ，ＦＲＴ，ａｔｔＢ）を導入し作成した形質転換用ベクターの断片（配列番号８の１１５６６〜１４００５に１〜４４４が連結した配列）と、を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、組み換え反応を行い、本発明のＤＮＡカセットを含むベクターを得た。
得られたＤＮＡを大腸菌に形質転換し、ＬＢ培地で、３７℃で１６時間培養後、大腸菌を集菌し、プラスミド精製キットによりプラスミドを精製した。
得られたＤＮＡカセットを具備する本発明のベクターを図３に示し、その配列を配列番号８に示す。
配列番号８：
塩基番号１〜４４０：形質転換用ベクターの配列
塩基番号４４１〜３４０８：標的ＤＮＡ（Ｔｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ））の５’非翻訳領域〜開始コドン。
塩基番号３４１２〜３４１３：保護配列の５’側の人工イントロン配列のスプライシングのドナーサイト。
塩基番号３４５２〜３４８５：保護配列の組み換え酵素認識配列（５’側の人工イントロン配列の組み換え酵素認識配列（ｌｏｘＰ）。）
塩基番号３６８６〜３６８７：保護配列の５’側の人工イントロン配列のスプライシングのアクセプターサイト。
塩基番号３６８８〜３７０５：保護配列の初期機能配列としての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の第２コドン〜終始コドン直前の塩基。
塩基番号３７０６〜４４０４：保護配列のポリＡシグナル配列（ＳＶ４０のポリＡシグナルを含む３’非翻訳領域。）
塩基番号４６９３〜７７０９：保護配列の初期機能配列としての選択マーカーの配列（ＧＭＲ−ｗｈｉｔｅ＋）の遺伝子領域
塩基番号７７３２〜７７６５：保護配列の組み換え酵素認識配列（３’側の人工イントロン配列の組み換え酵素認識配列（ｌｏｘＰ）。
塩基番号７８４６〜７８７９：保護配列の３’側の人工イントロン配列のＦＡＳ配列。
塩基番号８０００〜８００１：保護配列の３’側の人工イントロン配列のスプライシングのアクセプターサイト。
塩基番号８００２〜９６２４：機能性遺伝子としてのレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の第２コドン〜終始コドン直前の塩基。
塩基番号９６２５〜１１５８７：標的ＤＮＡ（Ｔｈｏｒ（４Ｅ−ＢＰ））の終始コドン〜３’非翻訳領域。
塩基番号１１５８８〜１４００５：形質転換用ベクターの配列
＜形質転換動物作製＞
得られたＤＮＡカセットをリン酸緩衝液で、濃度４００ｎｇ／ｕＬに調整した。
濃度調整後のＤＮＡカセット、約１ｎＬを実体顕微鏡下でマイクロインジェクション装置を用いショウジョウバエの１細胞期の受精卵２００個にマイクロインジェクションした。
（形質転換動物の１次スクリーニング）
マイクロインジェクションを行った受精卵を２５℃、１２日間の条件でインキュベーションし、ショウジョウバエの成虫約５０匹を得た。
これを個体ごとにｗｈｉｔｅ系統と交配し、得られた次代のショウジョウバエの成虫の眼を観察し、眼色が赤いもの２０匹を選別した。
選別したショウジョウバエをバランサー系統に交配させ、本発明の形質転換動物としてのショウジョウバエを得た。
＜機能性遺伝子発現動物の作製＞
組み換え酵素Ｃｒｅを生殖細胞でのみ発現するｎｏｓ−Ｃｒｅ系統と、得られた形質転換動物としてのショウジョウバエとを交配させた。
ここで、ｎｏｓ−Ｃｒｅ系統とは、ショウジョウバエのｎｏｓ遺伝子プロモーターの下流にＣｒｅを連結した配列を染色体上に有する系統で、生殖細胞でＣｒｅが発現するようになされている系統である。
その結果、Ｔｈｏｒ（４−ＥＢＰ）遺伝子を標的にした本発明のＤＮＡカセットを染色体上に有し、生殖細胞の組織特異的にＣｒｅを発現する本発明の機能性遺伝子発現動物としてのショウジョウバエを得た。
＜機能性遺伝子発現動物の観察＞
得られた本発明の機能性遺伝子発現動物としてのショウジョウバエに、ルシフェリンを混合した餌を与え、生殖細胞の発光を、発光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製、「装置名：Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＬＶ２００」）を用いて観察した。
その結果を図４に示す。
なお、ルシフェリンを混合した餌は、餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇを添加したものである。
[Example 1]
<Manufacture of DNA cassette>
In order to specifically amplify the 5 ′ end portion of Drosophila Thor (4E-BP) as a target gene to obtain a DNA by-product (PCR), the following
Primer 1 (SEQ ID NO: 4):
ATGGGGTTATAACTCGACTGGATGAATTGTGGATGGATG
Primer 2 (SEQ ID NO: 5):
AGATGCTCACCTGCATCTTAGCTGATTGATTGGATTG
In addition, the sequence of 426 to 444 of SEQ ID NO: 8 which is a transformation vector sequence is introduced as an adapter into
In order to specifically amplify the 3 ′ end portion of Thor (4E-BP) as a target gene,
The following
Primer 3 (SEQ ID NO: 6):
GCTCTCAAGCTGTAAGGGGGTGGGCGGTTACAC
Primer 4 (SEQ ID NO: 7):
GGGCCCCAAAGGATCTGCAACGACATAGACGAGACC
In addition, the sequence of 9613 to 9622 of SEQ ID NO: 8 which is a vector sequence for transformation was introduced as an adapter into
Using the designed primer, the 5′-end portion and 3′-end partial DNA fragments of Thor (4E-BP) as a target gene were amplified by PCR, and the In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) Processed by Cloning Enhancer according to the manual.
Thor (4E-BP) 5′-end and 3′-end partial DNA fragments as target genes after treatment, pre-prepared artificial introns on the DNA fragments 5 ′ side, green fluorescent protein as an initial functional sequence Homologous recombination with a DNA fragment (3409-9622 part of SEQ ID NO: 8) comprising a protective sequence comprising GMR-w + , a 3′-side artificial intron sequence and a luciferase gene as a functional sequence, in advance in pUC57 And a vector fragment for transformation prepared by introducing the necessary sequences (I-SceI, FRT, and attB) (sequence obtained by linking 1 to 444 to 11566 to 14005 of SEQ ID NO: 8), and mixing In-Fusion Recombination reaction was performed using Advantage PCR Cloning Kit (Clontech), and the DNA of the present invention Resulting in the vector that contains a set.
The obtained DNA was transformed into E. coli, cultured in LB medium at 37 ° C. for 16 hours, E. coli was collected, and the plasmid was purified with a plasmid purification kit.
The vector of the present invention comprising the obtained DNA cassette is shown in FIG. 3, and its sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 8
Base numbers 3412 to 3413: donor site for splicing of an
Base numbers 3452 to 3485: Recombinant enzyme recognition sequence of protective sequence (recombinant enzyme recognition sequence (loxP) of artificial intron sequence on the 5 ′ side).
Base numbers 3686 to 3687: acceptor site for splicing of an
Base numbers 3688 to 3705: Bases immediately before the second codon to the end codon of green fluorescent protein (GFP) as an initial functional sequence of the protective sequence.
Base numbers 3706 to 4404: Poly A signal sequence of protective sequence (3 ′ untranslated region containing SV40 poly A signal)
Base numbers 4673 to 7709: gene region of a selectable marker sequence (GMR-white + ) as an initial functional sequence of the protective sequence Base numbers 7732 to 7765: Recombinant enzyme recognition sequence of the protective sequence (recombination of the artificial intron sequence on the 3 ′ side) Enzyme recognition sequence (loxP).
Base numbers 7846 to 7879: FAS sequence of the
Base numbers 8000 to 8001: Acceptor site for splicing of an artificial intron sequence on the 3 ′ side of the protective sequence.
Base numbers 8002 to 9624: Bases immediately before the second codon to the start codon of the reporter gene (luciferase) as a functional gene.
Base numbers 9625 to 11587: the start codon to 3 ′ untranslated region of the target DNA (Thor (4E-BP)).
Base numbers 11588 to 14005: Sequence of transformation vector <Construction of transformed animal>
The obtained DNA cassette was adjusted to a concentration of 400 ng / uL with a phosphate buffer.
About 1 nL of the DNA cassette after concentration adjustment was microinjected into 200 fertilized eggs of the Drosophila 1-cell stage using a microinjection apparatus.
(Primary screening of transformed animals)
The fertilized eggs subjected to microinjection were incubated at 25 ° C. for 12 days to obtain about 50 adults of Drosophila.
This was crossed with a white strain for each individual, and the eyes of adult adults of the next generation Drosophila obtained were observed, and 20 animals with red eyes were selected.
The selected Drosophila was crossed to a balancer strain to obtain Drosophila as a transformed animal of the present invention.
<Production of functional gene expressing animals>
The nos-Cre line that expresses the recombinant enzyme Cre only in germ cells was crossed with Drosophila as the resulting transformed animal.
Here, the nos-Cre line is a line having a sequence in which Cre is linked downstream of the Drosophila nos gene promoter on the chromosome, and Cre is expressed in germ cells.
As a result, Drosophila is obtained as a functional gene-expressing animal of the present invention which has the DNA cassette of the present invention targeting the Thor (4-EBP) gene on the chromosome and expresses Cre specifically in germ cell tissues. It was.
<Observation of functional gene-expressing animals>
Drosophila obtained as a functional gene-expressing animal of the present invention was fed with luciferin-mixed food, and germ cells were luminescent using a luminescence microscope (Olympus, “Device name: Bioluminescence Imaging System LV200”). Observed.
The result is shown in FIG.
In addition, the bait mixed with luciferin is obtained by adding 640 ng of luciferin to 1 g of bait.
〔比較例１〕（野生型）
機能性遺伝子発現動物の観察において、観察に供する動物を野生型のショウジョウバエに変えた以外は、実施例１と同様にして、生殖細胞の発光を、発光顕微鏡を用いて観察した。
その結果を図４に示す。
[Comparative Example 1] (wild type)
In the observation of functional gene-expressing animals, germ cell luminescence was observed using a luminescence microscope in the same manner as in Example 1 except that the animals used for observation were changed to wild-type Drosophila.
The result is shown in FIG.
〔試験例１〕（飢餓ストレス）
実施例１で得られた機能性遺伝子発現動物に飢餓ストレスを与えた。それ以外の条件は実施例１と同様にして、生殖細胞の発光を発光顕微鏡で観察した。
なお、飢餓ストレスの誘導は、飢餓用培地（アガロース１％、グルコース１０％、イーストエキストラクト４％ ルシフェリン６４０ｎｇ／ｇ）で２日間飼育した形質転換動物を、低栄養培地（通常培地の組成のうち、グルコースとイーストエキストラクトを共に１％に減じたもの）に移し替えることにより行った。
その結果を図４に示す。
[Test Example 1] (Hunger stress)
Starvation stress was applied to the functional gene-expressing animal obtained in Example 1. Other conditions were the same as in Example 1, and germ cell luminescence was observed with a luminescence microscope.
Induction of starvation stress was performed by transforming an animal that had been bred for 2 days in a starvation medium (agarose 1%,
The result is shown in FIG.
〔実施例２〕
実施例１で得られた形質転換動物に、組み換え酵素Ｃｒｅ−ＥＢＤを筋肉で発現する２４Ｂ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統を交配させて、本発明の機能性遺伝子発現動物を得た。
ここで、２４Ｂ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統とは、ショウジョウバエの２４Ｂ遺伝子のプロモーターにＧＡＬ４遺伝子を連結した配列およびＵＡＳプロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＢＤを連結した配列を染色体上に有するショウジョウバエの系統をいう。
得られた機能性遺伝子発現動物にルシフェリン及びエストロゲンを混合した餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン０．３ｍｇ）を与え、餌を与えた後の２，３，４，５及び６日後の機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
[Example 2]
The transgenic animal obtained in Example 1 was crossed with a 24B-Gal4 / UASp-Cre-EBD line expressing recombinant enzyme Cre-EBD in muscle to obtain a functional gene-expressing animal of the present invention.
Here, the 24B-Gal4 / UASp-Cre-EBD strain is a Drosophila strain having on the chromosome a sequence in which the GAL4 gene is linked to the Drosophila 24B gene promoter and a sequence in which Cre-EBD is linked downstream of the UAS promoter. Say.
The obtained functional gene-expressing animal was fed with luciferin and estrogen mixed (640 ng of luciferin and 0.3 mg of estrogen for 1 g of food), 2, 3, 4, 5 and 6 days after feeding. Luminescence of the functional gene expressing animal was measured with a luminometer.
The result is shown in FIG.
なお、ルミノメーターを用いた経時的な発光の測定は、以下の条件で行った。
ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製、「装置名Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ」）
測定条件：
測定温度：２５℃
測定時間：３０ｓｅｃ／ｗｅｌｌ
測定用プレート：９６ウェル マイクロプレート白（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）
培地量：４０μＬ／ｗｅｌｌ
プレート用シール：Ｘ−Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標） Ｆｉｌｍ（Ｅｘｃｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
測定用ソフトウェア：Ｍｉｃｒｏｗｉｎ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）
Note that measurement of luminescence over time using a luminometer was performed under the following conditions.
Luminometer (manufactured by BERTHOLD TECHNOLOGIES, “Device name Centro LB 960 Microplate Luminometer”)
Measurement condition:
Measurement temperature: 25 ° C
Measurement time: 30 sec / well
Plate for measurement: 96-well microplate white (Berthold)
Medium volume: 40 μL / well
Plate seal: X-Pierce (registered trademark) Film (Excel Scientific)
Measurement software: Microwin (Berthold)
〔試験例２〕
実施例２で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲン含有量が高い餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン１ｍｇ）に変更した。それ以外は、実施例２と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
[Test Example 2]
Luminescence of the functional gene-expressing animal obtained in Example 2 was observed.
The bait given at the time of observation was changed to a bait having a high estrogen content (luciferin 640 ng and
The result is shown in FIG.
〔比較試験例２〕
実施例２で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲンを除いた餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ）に変更した。それ以外は、実施例２と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図５に示す。
[Comparative Test Example 2]
Luminescence of the functional gene-expressing animal obtained in Example 2 was observed.
The food given at the time of observation was changed to a food from which estrogen was removed (luciferin 640 ng per 1 g of food). Otherwise, the luminescence of the functional gene-expressing animal was measured with a luminometer in the same manner as in Example 2.
The result is shown in FIG.
〔実施例３〕
実施例１で得られた形質転換動物に、交配するショウジョウバエを組み換え酵素Ｃｒｅ−ＥＢＤを神経で発現するｅｌａｖ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統に変更して、本発明の機能性遺伝子発現動物を得た。
ここで、ｅｌａｖ−Ｇａｌ４／ＵＡＳｐ−Ｃｒｅ−ＥＢＤ系統とは、ショウジョウバエのｅｌａｖ遺伝子のプロモーターにＧＡＬ４遺伝子を連結した配列およびＵＡＳプロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＢＤを連結した配列を染色体上に有するショウジョウバエの系統をいう。
得られた機能性遺伝子発現動物に与えた餌及び観察は実施例２と同様にして行い機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
Example 3
In the transformed animal obtained in Example 1, the Drosophila to be mated is changed to the elav-Gal4 / UASp-Cre-EBD strain that expresses the recombinant enzyme Cre-EBD in the nerve, and the functional gene-expressing animal of the present invention is used. Obtained.
Here, the elav-Gal4 / UASp-Cre-EBD strain is a Drosophila strain having on the chromosome a sequence in which the GAL4 gene is linked to the Drosophila elav gene promoter and a sequence in which Cre-EBD is linked downstream of the UAS promoter. Say.
The food and observation given to the functional gene-expressing animal were performed in the same manner as in Example 2, and the luminescence of the functional gene-expressing animal was measured with a luminometer.
The result is shown in FIG.
〔試験例３〕
実施例３で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲン含有量が高い餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ及びエストロゲン１ｍｇ）に変更した。それ以外は、実施例３と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
[Test Example 3]
Luminescence of the functional gene-expressing animal obtained in Example 3 was observed.
The bait given at the time of observation was changed to a bait having a high estrogen content (luciferin 640 ng and
The result is shown in FIG.
〔比較試験例３〕
実施例３で得られた機能性遺伝子発現動物の発光を観察した。
観察時に与えた餌をエストロゲンを除いた餌（餌１ｇに対し、ルシフェリン６４０ｎｇ）に変更した。それ以外は、実施例３と同様にして機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで測定した。
その結果を図６に示す。
[Comparative Test Example 3]
Luminescence of the functional gene-expressing animal obtained in Example 3 was observed.
The food given at the time of observation was changed to a food from which estrogen was removed (luciferin 640 ng per 1 g of food). Otherwise, the luminescence of the functional gene-expressing animal was measured with a luminometer in the same manner as in Example 3.
The result is shown in FIG.
以下、結果を説明する。
図４は、本発明の機能性遺伝子発現動物の生殖細胞の発光を、発光顕微鏡を用いて観察した結果である。
図４に示す結果から、Ｔｈｏｒ（４−ＥＢＰ）遺伝子を標的にした本発明のＤＮＡカセットを染色体上に有し、生殖細胞特異的にＣｒｅを発現する本発明の機能性遺伝子発現動物（実施例１）は、Ｃｒｅが発現する組織生殖細胞（卵巣）でのみ強く発光していた。また、飢餓ストレスをかけた個体（試験例１）では発光強度が強くなった。
野生型ショウジョウバエ（比較例１）及びＣｒｅを発現しないショウジョウバエ（比較試験例１）は、発光が検出できなかった。
Hereinafter, the results will be described.
FIG. 4 shows the results of observation of luminescence of germ cells of the functional gene-expressing animal of the present invention using a luminescence microscope.
From the results shown in FIG. 4, the functional gene-expressing animal of the present invention having the DNA cassette of the present invention targeting the Thor (4-EBP) gene on the chromosome and expressing Cre specifically in germ cells (Examples) 1) was strongly luminescent only in tissue germ cells (ovary) in which Cre was expressed. In addition, the luminescence intensity increased in the individual (Test Example 1) subjected to starvation stress.
The wild-type Drosophila (Comparative Example 1) and Drosophila not expressing Cre (Comparative Test Example 1) could not detect luminescence.
図５及び図６は、本発明の機能性遺伝子発現動物の発光をルミノメーターで経時的に測定した結果である。
図５及び図６に示す結果から、筋肉または神経でＣｒｅ−ＥＢＤを発現するショウジョウバエで（実施例２及び３、試験例２及び３）、餌を与えてから３日目以降に発光が観察された。また、発光強度の上昇はエストロゲンの濃度依存的であった。エストロゲンを含まない餌を与えたものは発光が検出できなかった（比較試験例２及び３）。
5 and 6 show the results of measuring the luminescence of the functional gene-expressing animal of the present invention over time using a luminometer.
From the results shown in FIG. 5 and FIG. 6, luminescence was observed after 3 days after feeding in Drosophila expressing Cre-EBD in muscle or nerve (Examples 2 and 3, Test Examples 2 and 3). It was. In addition, the increase in emission intensity was dependent on the concentration of estrogen. No luminescence was detected in those fed with estrogen-free food (Comparative Test Examples 2 and 3).
これらの結果から、本発明の機能性遺伝子発現動物の発光を測定することで、目的の遺伝子を経時的に高精度で定量化ができることがわかる。 These results show that the target gene can be quantified with high accuracy over time by measuring the luminescence of the functional gene-expressing animal of the present invention.
１０１ 解析装置
１１０ 保持部
１１１ 部屋
１２０ 撮像部
１２２ ケーブル
１３０ 情報処理部
１３１ メモリー部
１３２ ＣＰＵ
１３３ 保存部
１３４ ハウジング
101 Analysis Device 110 Holding
133
Claims (15)
上記標的ＤＮＡの配列の５’側と相同な配列と、
上記標的ＤＮＡの配列の３’側と相同な配列と、を有し、
且つ
上記５’側と相同な配列と上記３’側と相同な配列とに挟まれた部分に位置し、染色体導入時に機能を発現する初期機能配列及び一対の組み換え酵素認識配列を具備する保護配列と、
上記保護配列及び上記３’側と相同な配列の間に位置し、上記保護配列における少なくとも上記初期機能配列が除去された場合に初めて機能を発現する機能性遺伝子の配列とを有し、
上記保護配列において、
上記の組み換え酵素の認識配列は人工イントロン配列内に配置されており、
上記組み換え酵素により一対の組み換え酵素認識配列の間のスタッファー配列が除去された後に５’側と３’側との両人工イントロン配列が融合して、融合配列が形成されるようになされている、
ＤＮＡカセット。 A DNA cassette that undergoes homologous recombination with a predetermined target DNA and can be introduced into a chromosome,
A sequence homologous to the 5 ′ side of the sequence of the target DNA;
A sequence homologous to the 3 ′ side of the sequence of the target DNA,
And a protective sequence comprising an initial functional sequence and a pair of recombination enzyme recognition sequences, which are located between the sequence homologous to the 5 ′ side and the sequence homologous to the 3 ′ side, and which express a function upon chromosome introduction. When,
Located between the protective sequences and the 3 'side sequence homologous, it possesses a sequence of a functional gene expressing the first function if at least the initial function sequences have been removed in the protective arrangement,
In the above protective sequence,
The above recombination enzyme recognition sequence is located within the artificial intron sequence,
After the stuffer sequence between a pair of recombination enzyme recognition sequences is removed by the above recombination enzyme, both artificial intron sequences on the 5 ′ side and 3 ′ side are fused to form a fusion sequence.
D NA cassette.
さらに選択マーカーの配列を具備する、
請求項１又は２に記載のＤＮＡカセット。 The initial function array is
Further comprising a sequence of selectable markers,
The DNA cassette according to claim 1 or 2 .
動物の保持部と、
画像を取得するための撮像部と、
情報処理を行う情報処理部と、
を具備する解析装置。 An analyzer for analyzing the functional gene-expressing animal according to any one of claims 11 to 14 ,
An animal holding part,
An imaging unit for acquiring images;
An information processing unit that performs information processing;
An analysis apparatus comprising:
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