JP6116837B2 - Method for distinguishing metallo-β-lactamase producing bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を組み合わせることにより、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に関するものである。さらに本発明は、β−ラクタム薬とメタロ−β−ラクタマーゼ阻害物質を含む、簡便にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを判別する方法に用いるキットおよびこのキットに関するものである。 The present invention relates to a method for discriminating metallo-β-lactamase producing bacteria. More specifically, the present invention relates to a method for easily determining whether or not a metallo-β-lactamase producing bacterium is obtained by combining a β-lactam drug and a metallo-β-lactamase inhibitor. The present invention further relates to a kit comprising a β-lactam drug and a metallo-β-lactamase inhibitor, and a kit for use in a method for simply determining whether or not a metallo-β-lactamase producing bacterium is present.
１９４０年代に抗菌薬としてペニシリンが使用されるようになり、細菌により引き起こされる感染症を制御できると考えられた。しかし、まもなく抗菌薬の不活化酵素や抗菌薬の排出機構を有する薬剤耐性菌が分離され始めた。そこで、これらの耐性細菌により引き起こされる感染症を制御するため、より幅広く安定な抗菌力を有する新型の抗菌薬が開発され、使用された。 In the 1940s, penicillin was used as an antibacterial agent, and it was thought that it was possible to control infections caused by bacteria. However, soon, drug-resistant bacteria having an inactivating enzyme for antibacterial drugs and a mechanism for discharging antibacterial drugs began to be isolated. Therefore, in order to control infections caused by these resistant bacteria, a new type of antibacterial agent having a broader and more stable antibacterial activity has been developed and used.
この中で、ペニシリン、セフェム等のβ−ラクタム薬に関しては、β−ラクタマーゼと呼ばれる加水分解酵素の存在が古くから知られている。このβ−ラクタマーゼは、酵素の活性中心にセリン残基を持つセリン−β−ラクタマーゼ及び亜鉛原子を活性発現に必要とするメタロ−β−ラクタマーゼの２種類が知られている。 Among these, regarding β-lactam drugs such as penicillin and cephem, the presence of a hydrolase called β-lactamase has long been known. There are two known β-lactamases, serine-β-lactamase having a serine residue at the active center of the enzyme and metallo-β-lactamase that requires a zinc atom for active expression.
一方、１９８０年代に開発された、広域な抗菌スペクトルを有するカルバペネム系薬剤に対して耐性を獲得した緑膿菌やセラチア菌が分離されるようになった。これらの耐性菌の性状を詳細に検討したところ、後者のメタロ−β−ラクタマーゼを産生することが明らかになった。 On the other hand, Pseudomonas aeruginosa and Serratia bacteria that have acquired resistance to carbapenem drugs having a broad antibacterial spectrum developed in the 1980s have been isolated. Detailed examination of the properties of these resistant bacteria revealed that the latter metallo-β-lactamase was produced.
このメタロ−β−ラクタマーゼは、その活性中心に存在する亜鉛原子に結合した不安定なＨ２Ｏ分子がβ−ラクタム環を攻撃し、加水分解するとされている。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼは、グラム陰性桿菌が通常産生するセリン−β−ラクタマーゼにより分解されにくいカルバペネム系薬剤やβ-ラクタマーゼ阻害剤をも容易に分解・不活化してしまうという憂慮すべき性質を示している（非特許文献１）。 In this metallo-β-lactamase, an unstable H 2 O molecule bonded to a zinc atom existing in the active center attacks the β-lactam ring and is hydrolyzed. Therefore, metallo-β-lactamase can be easily degraded and inactivated by carbapenems and β-lactamase inhibitors that are not easily degraded by serine-β-lactamase normally produced by Gram-negative bacilli. The property is shown (nonpatent literature 1).
なお、メタロ−β−ラクタマーゼの阻害剤である有機チオール化合物のメルカプト酢酸またはメルカプトプロピオン酸を含浸したディスクとセフタジジム（ＣＡＺ）ディスクを、菌を接種した培地上に置くことにより、培養後に有機チオール化合物を含浸したディスクと隣接したＣＡＺディスクの発育阻止円が生じることによって、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌であると簡便に判別できる（特許文献１）。 In addition, the organic thiol compound after culture | cultivation is put by putting the disc impregnated with the mercaptoacetic acid or mercaptopropionic acid of the organic thiol compound which is an inhibitor of metallo-β-lactamase and the ceftazidime (CAZ) disc on the medium inoculated with the bacteria. When the growth-inhibiting circle of the CAZ disk adjacent to the disk impregnated with is produced, it can be easily identified as a metallo-β-lactamase-producing bacterium (Patent Document 1).
また、液体のメルカプト酢酸に代えて、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）を含浸したディスクを用いることにより、保存安定性に優れたキットを提供することが可能となった（特許文献２）。 Further, by using a disc impregnated with sodium mercaptoacetate (SMA) in place of liquid mercaptoacetic acid, a kit having excellent storage stability can be provided (Patent Document 2).
しかし、これらの方法では判別できないＮＤＭ−１型のメタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌が多くの国で分離されるようになった。それゆえ、メタロ−β−ラクタマーゼを産生する多剤耐性菌であるかどうかを判別することが感染症の治療するための重要な情報となるため、ＮＤＭ−１型も含めたメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の検出方法が必要不可欠となっている。 However, multidrug-resistant bacteria that produce NDM-1 type metallo-β-lactamases that cannot be distinguished by these methods have been isolated in many countries. Therefore, since it becomes important information for treating infectious diseases to determine whether it is a multi-drug resistant bacterium that produces metallo-β-lactamase, metallo-β-lactamase including NDM-1 type Methods for detecting producers are indispensable.
メタロ−β−ラクタマーゼを産生する菌は、多剤耐性菌であることが多いため、感染のごく早い時期にメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌か否かを調べることが必要である。それゆえ、簡便な方法を用いて全ての型のメタロ−β−ラクタマーゼを検出することが、この細菌に対する治療に重要となるため、この検出方法が不可欠になっている。 Bacteria that produce metallo-β-lactamase are often multi-drug resistant bacteria, so it is necessary to examine whether they are metallo-β-lactamase-producing bacteria at an extremely early stage of infection. Therefore, detection of all types of metallo-β-lactamases using a simple method is important for the treatment of this bacterium, and this detection method is indispensable.
発明者は、メタロ−β−ラクタマーゼに対して阻害効果を有するが、細菌の発育を抑制するエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に着目し、メタロ−β−ラクタマーゼを検出する方法の検討を進めた。すると、金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることにより、細菌の増殖を阻害せず、メタロ−β−ラクタマーゼの活性を阻害することが判った。 The inventor has focused on ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), which has an inhibitory effect on metallo-β-lactamase but suppresses bacterial growth, and has studied a method for detecting metallo-β-lactamase. Then, it was found that by using a metal-EDTA chelate complex, the growth of metallo-β-lactamase was inhibited without inhibiting bacterial growth.
さらに、金属−ＥＤＴＡキレート錯体に有機チオール化合物を加えることにより、より効果が高くなることが判明した。具体的には、β−ラクタム薬の抗菌効果を測る際に、金属−ＥＤＴＡキレート錯体単独、もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体とメルカプト酢酸ナトリウムの混合物を添加することにより、メタロ−β−ラクタマーゼを検出することができる。 Furthermore, it has been found that the effect is further enhanced by adding an organic thiol compound to the metal-EDTA chelate complex. Specifically, when measuring the antibacterial effect of β-lactam drug, metallo-β-lactamase is detected by adding metal-EDTA chelate complex alone or a mixture of metal-EDTA chelate complex and mercaptoacetate sodium. be able to.
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を用いることによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（２）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（３）平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスク並びにβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを並べて置き、培養後の阻止円の形状を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（４）β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（５）金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、該培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置き、培養後の阻止円の大きさを観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（６）β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することによる（１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（７）前記β−ラクタム薬がカルバペネム系薬剤、セファマイシン系薬剤、およびセファロスポリン系薬剤から選ばれる１以上の薬剤である（１）〜（６）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（８）前記カルバペネム系薬剤がイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（９）前記セファマイシン系薬剤がセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１０）前記セファロスポリン系薬剤がセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムから選ばれる少なくとも１以上の薬剤である（１）〜（７）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１１）前記金属−ＥＤＴＡキレート錯体がＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡから選ばれる少なくとも１以上の化合物である（１）〜（１０）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１２）金属−ＥＤＴＡキレート錯体にさらに有機チオール化合物を添加する（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１３）前記有機チオール化合物がメルカプト酢酸ナトリウムである（１）〜（１２）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法。
（１４）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含む、（１）〜（１１）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
（１５）β−ラクタム薬と金属−ＥＤＴＡキレート錯体および有機チオール化合物を含む、（１２）〜（１３）記載のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別方法に用いるキット。
That is, the present invention has the following configuration.
(1) A method for discriminating a metallo-β-lactamase producing bacterium by using a β-lactam drug and a metal-EDTA chelate complex.
(2) Inoculating a test medium on a plate medium, placing a disk impregnated with a β-lactam drug and a disk impregnated with a metal-EDTA chelate complex on the medium, and observing the shape of the inhibition circle after the culture. (1) The method for discriminating metallo-β-lactamase producing bacteria according to (1).
(3) The test bacteria are inoculated on a plate medium, and a disk impregnated with β-lactam drug and a disk impregnated with β-lactam drug and a metal-EDTA chelate complex are placed side by side on the medium. The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (1) by observing the shape.
(4) By inoculating a test bacteria on a plate medium containing β-lactam drug, placing a disk impregnated with a metal-EDTA chelate complex on the medium, and observing the size of the inhibition circle after culture (1) The method for discriminating a metallo-β-lactamase producing bacterium as described.
(5) By inoculating a test bacteria on a metal-EDTA chelate complex-containing plate medium, placing a disk impregnated with β-lactam drug on the medium, and observing the size of the inhibition circle after culture (1) The method for discriminating a metallo-β-lactamase producing bacterium as described.
(6) The metallo described in (1) by inoculating a test bacterium by combining a β-lactam drug-containing liquid medium and a metal-EDTA chelate complex-containing liquid medium, and observing the presence or absence of growth of the test bacterium after culture. A method for discriminating β-lactamase producing bacteria.
(7) The metallo-β-lactamase-producing bacterium according to any one of (1) to (6), wherein the β-lactam drug is one or more drugs selected from carbapenem drugs, cephamycin drugs, and cephalosporin drugs. How to determine.
(8) The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (1) to (7), wherein the carbapenem-based drug is at least one drug selected from imipenem, panipenem, meropenem, biapenem, doripenem, and tevipenem.
(9) The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (1) to (7), wherein the cephamycin-based drug is at least one drug selected from cefoxitin, cefmetazole, cefbuperazone, and cefminox.
(10) The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to any one of (1) to (7), wherein the cephalosporin-based drug is at least one drug selected from ceftazidime, cefepime, ceftriaxone, and cefotaxime.
(11) The metal-EDTA chelate complex is at least one compound selected from Mg-EDTA, Cu-EDTA, Ca-EDTA, Co-EDTA, Mn-EDTA, and Fe-EDTA (1) to (10 ) Method for discriminating metallo-β-lactamase-producing bacteria according to the above.
(12) The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (1) to (11), wherein an organic thiol compound is further added to the metal-EDTA chelate complex.
(13) The method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to any one of (1) to (12), wherein the organic thiol compound is sodium mercaptoacetate.
(14) A kit for use in the method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (1) to (11), comprising a β-lactam drug and a metal-EDTA chelate complex.
(15) A kit for use in the method for discriminating a metallo-β-lactamase-producing bacterium according to (12) to (13), comprising a β-lactam drug, a metal-EDTA chelate complex, and an organic thiol compound.
本発明を実施することにより、臨床の場で発生する多剤耐性菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかを容易に判別することが可能となり、その後の治療方針を決定するための一助となる。 By practicing the present invention, it is possible to easily determine whether a multidrug-resistant bacterium that occurs in the clinical field is producing metallo-β-lactamase, and to help determine subsequent treatment strategies. It becomes.
本発明を、一例として被検菌の培養にはミュラーヒントン寒天培地を用い、β−ラクタム薬のイミペネムおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体のＭｇ−ＥＤＴＡによる被検菌の発育への影響によりメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法を説明するが、本例に限定されることはない。 As an example of the present invention, Müller Hinton agar medium is used for culturing the test bacteria, and metallo-β- is produced by the effect of imipenem of the β-lactam drug and the growth of the test bacteria by Mg-EDTA of the metal-EDTA chelate complex. Although the method for discriminating lactamase-producing bacteria will be described, it is not limited to this example.
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、ミュラーヒントン寒天培地に接種した。 The test bacteria were prepared in sterilized physiological saline with the same turbidity as McFarland standard turbidity 0.5 and inoculated on Mueller Hinton agar medium.
次に、同一平板培地上にイミペネムを含浸したディスクを３ｃｍ以上離して２枚置き、その１枚のイミペネムを含浸したディスクの中心から１．５〜２．０ｃｍ離してＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを置いた。 Next, two discs impregnated with imipenem on the same plate medium were placed 3 cm or more apart, and a disc impregnated with Mg-EDTA 1.5 to 2.0 cm away from the center of the disc impregnated with one imipenem. Placed.
３５℃で１６〜１８時間培養後にＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状と単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止円の形状の違いを観察した。 The difference between the shape of the blocking circle of the disc impregnated with imipenem and the disc of impregnated imipenem placed alone after the disc impregnated with Mg-EDTA after culturing for 16 to 18 hours at 35 ° C. Observed.
被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、図１に示すとおり、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯（ｂ）が、独立して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止体（ａ）に比べて、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクとイミペネムを含浸したディスクの中心をつないだ軸方向に対して垂直方向に拡大を認めた。 When a metallo-β-lactamase-producing bacterium is used as a test bacterium, as shown in FIG. 1, the inhibition band (b) of the disc impregnated with imipenem adjacent to the disc impregnated with Mg-EDTA is independent. As compared with the blocker (a) of the disk impregnated with imipenem, the enlargement was observed in the direction perpendicular to the axial direction connecting the center of the disk impregnated with Mg-EDTA and the disk impregnated with imipenem.
被検菌として別のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は認められないものの、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクは阻止帯の形成が認められた。 When another metallo-β-lactamase-producing bacterium was used as a test bacterium, a disc impregnated with imipenem placed alone was not observed, but an imipenem placed adjacent to a disc impregnated with Mg-EDTA In the disk impregnated with, formation of a stop band was observed.
一方、被検菌としてメタロ−β−ラクタマーゼ非産生菌を用いた場合、単独で置いたイミペネムを含浸したディスクとＭｇ−ＥＤＴＡを含浸したディスクを隣接して置いたイミペネムを含浸したディスクの阻止帯は同等であった。 On the other hand, when a metallo-β-lactamase non-producing bacterium was used as the test bacterium, the inhibition band of the disc impregnated with imipenem placed adjacent to the disc impregnated with imipenem placed alone and the disc impregnated with Mg-EDTA Were equivalent.
以上、本例の試験を実施することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を容易に判別することが可能となる As described above, by carrying out the test of this example, it becomes possible to easily distinguish the metallo-β-lactamase producing bacteria.
すなわち、細菌のβ−ラクタム薬に対する感受性試験を実施する際に、被験対象のβ−ラクタム薬の他に金属−ＥＤＴＡキレート錯体もしくは金属−ＥＤＴＡキレート錯体と有機チオール化合物の混合物を添加することにより、その細菌がメタロ−β−ラクタマーゼを産生しているかどうかの判別が出来る。 That is, when performing a susceptibility test for bacterial β-lactam drugs, by adding a metal-EDTA chelate complex or a mixture of a metal-EDTA chelate complex and an organic thiol compound in addition to the β-lactam drug to be tested, It is possible to determine whether the bacterium produces metallo-β-lactamase.
本発明のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する方法が適用出来る被検菌としては腸内細菌、緑膿菌が挙げられるが、これらの菌に限定されない。また、本試験に用いる培地としては、平板培地ではミュラーヒントン寒天培地を、液体培地としてはミュラーヒントンブイヨンを使用することが好ましい。 Examples of test bacteria to which the method for discriminating metallo-β-lactamase producing bacteria of the present invention can be applied include enteric bacteria and Pseudomonas aeruginosa, but are not limited to these bacteria. Moreover, as a culture medium used for this test, it is preferable to use Mueller Hinton agar medium for a flat plate culture medium and Mueller Hinton bouillon as a liquid culture medium.
使用するβ−ラクタム薬は、カルバペネム系薬剤としてはイミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、およびテビペネムが、セファマイシン系薬剤としてはセフォキシチン、セフメタゾール、セフブペラゾン、およびセフミノクスが、セファロスポリン系薬剤としてはセフタジジム、セフェピム、セフトリアキソン、およびセフォタキシムが各々挙げられるが、これらの薬剤に限定されない。 The β-lactams used are imipenem, panipenem, meropenem, biapenem, doripenem, and tevipenem as carbapenems, cefoxitin, cefmetazole, cefbuperazone, and cefminox as cephalosporins, and cephalosporins as cephalosporins Examples include, but are not limited to, ceftazidime, cefepime, ceftriaxone, and cefotaxime.
使用する金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてはＭｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されず、Ｚｎ−ＥＤＴＡを除く金属−ＥＤＴＡ錯体であれば良い。好ましくは、Ｍｇ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、およびＣａ−ＥＤＴＡである。 Examples of metal-EDTA chelate complexes used include, but are not limited to, Mg-EDTA, Cu-EDTA, Ca-EDTA, Co-EDTA, Mn-EDTA, and Fe-EDTA. Any EDTA complex may be used. Mg-EDTA, Cu-EDTA, and Ca-EDTA are preferable.
１．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例１］金属−ＥＤＴＡキレート錯体によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
1. Test in which β-lactam drug-impregnated disc and metal-EDTA chelate complex-impregnated disc are arranged side by side [Example 1] Confirmation test of metallo-β-lactamase-producing bacteria by metal-EDTA chelate complex Test bacterium in sterile saline and McFarland standard The turbidity was adjusted to the same turbidity of 0.5, and uniformly inoculated on Mueller Hinton agar using a sterile cotton swab.
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。 Next, two β-lactam drug-impregnated disks were placed on the same plate medium at a distance of 3 cm or more, and a metal-EDTA chelate complex-impregnated disk was placed 1.5 cm away from the center of one of the disks.
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。 After culturing at 35 ° C. for 16 to 18 hours, the shape of the inhibition circle of the β-lactam drug-impregnated disk and the difference in the shape of the inhibition circle when the β-lactam drug-impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex-impregnated disk were arranged were observed. .
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。 Specifically, the blocking circle of the β-lactam drug impregnated disk is formed by arranging the β-lactam drug impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex impregnated disk so that the β-lactam drug impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex impregnated disk are aligned. It was confirmed whether to expand in the direction perpendicular to the axial direction connecting the centers.
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。 By arranging the β-lactam drug-impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex-impregnated disk, the value of d shown in FIG. 1 is + when the expansion is 5 mm or more, and the expansion is less than 5 mm. ± and those in which no enlargement was observed were determined to be −. For the β-lactam-impregnated discs where no inhibition circle was observed, the formation of the inhibition band of 12 mm or more was +, the formation of the inhibition band was less than 12 mm, and the inhibition band was formed. What was not done was determined to be-.
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０３）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１７）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用いた。 As test bacteria, Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Pseudomonas aeruginosa (EKN7102), Pseudomonas aeruginosa (EKN7103), Acinetobacter baumannii (EKN7108), Acinetobacter baumannii (EKN7109), Pseudomonas aeruginosa (EKN7116), Pseudomonas aeruginosa (EKN7117), and Acinetobacter baumannii (EKN7170) were used.
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。 As the β-lactam drug, imipenem (IPM: 10 μg titer / disk), meropenem (MEPM: 10 μg titer / disk), and ceftazidime (CAZ: 30 μg titer / disk) impregnated disk were used.
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡ（１２．５ｍｇ／ディスク）、Ｃｏ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｍｎ−ＥＤＴＡ（１０ｍｇ／ディスク）、Ｍｇ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、Ｃｕ−ＥＤＴＡ（１５ｍｇ／ディスク）、Ｚｎ−ＥＤＴＡ（１２ｍｇ／ディスク）、およびＦｅ−ＥＤＴＡ（２ｍｇ／ディスク）を用いた。なお、対照として、メルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクを用いた。 As metal-EDTA chelate complexes, Ca-EDTA (12.5 mg / disk), Co-EDTA (12 mg / disk), Mn-EDTA (10 mg / disk), Mg-EDTA (12 mg / disk), Cu-EDTA (15 mg) / Disk), Zn-EDTA (12 mg / disk), and Fe-EDTA (2 mg / disk) were used. As a control, a sodium mercaptoacetate (SMA) impregnated disk was used.
表１に示す結果より、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別する上で、Ｍｇ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクを用いることが最も有効と判断された。しかしながら、Ｃａ−ＥＤＴＡ、Ｃｕ−ＥＤＴＡ、Ｃｏ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、およびＦｅ−ＥＤＴＡを含浸させたディスクにおいても、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別に有効であった。一方、Ｚｎ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを用いた場合には、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することは出来なかった。 From the results shown in Table 1, it was determined that the use of a disk impregnated with Mg-EDTA was most effective in discriminating metallo-β-lactamase producing bacteria. However, the disk impregnated with Ca-EDTA, Cu-EDTA, Co-EDTA, Mn-EDTA, and Fe-EDTA was also effective in discriminating metallo-β-lactamase producing bacteria. On the other hand, when a Zn-EDTA impregnated disk was used, the metallo-β-lactamase producing bacteria could not be discriminated.
［比較例１］メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌
メタロ−β−ラクタマーゼとは異なるβ−ラクタマーゼを産生していると確認しているＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
[Comparative Example 1] β-lactamase producing bacteria other than metallo-β-lactamase Klebsiella pneumoniae (EKN9491), Escherichia coli (EKN6663), which has been confirmed to produce β-lactamase different from metallo-β-lactamase, Using Pseudomonas aeruginosa (EKN7149), other conditions were tested in the same manner as in [Example 1].
表２に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクおよび金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを組み合わせて試験を行なったが、阻止円の変化は認められず、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌ではないと判別された。 From the results shown in Table 2, a test was performed using a combination of a β-lactam drug-impregnated disk and a metal-EDTA chelate complex-impregnated disk, but no change in the inhibition circle was observed, and it was determined that it was not a metallo-β-lactamase producing bacterium. It was done.
［実施例２］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７１）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１０ｍｇ／ディスク、８ｍｇ／ディスク、および６ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
[Example 2] Effect on test result due to difference in Mg-EDTA concentration As test bacteria, Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Acinetobacter baumani (EKNc7bE 71Ne 71Ne 71Ne 71Ne 71NeB Using a combination of imipenem (IPM: 10 μg titer / disk) and ceftazidime (CAZ: 30 μg titer / disk) impregnated disk and 10 mg / disk, 8 mg / disk, and 6 mg / disk Mg-EDTA impregnated disk. The test was conducted in the same manner as in [Example 1] under other conditions.
表３に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が６〜１０ｍｇ／ディスクの間で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。 From the results shown in Table 3, when the β-lactam drug-impregnated disk and the Mg-EDTA-impregnated disk are combined to discriminate metallo-β-lactamase producing bacteria, the amount of Mg-EDTA impregnation is between 6 and 10 mg / disk. It was possible to distinguish metallo-β-lactamase producing bacteria.
［実施例３］Ｍｇ−ＥＤＴＡの濃度の違いによる試験結果への影響（低濃度）
被検菌として、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）を用い、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびパニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと６０μｇ／ディスク、３０μｇ／ディスク、１０μｇ／ディスク、および５μｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
[Example 3] Influence on test results due to difference in Mg-EDTA concentration (low concentration)
As test bacteria, Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146) was used, meropenem (MEPM: 10 μg titer / disk), tepenem (TBPM: 10 μg titer / disk), dripenem (DRPM: 10 μg titer / disk), and Example 1 with a combination of panipenem (PAPM: 10 μg titer / disk) impregnated disk and 60 μg / disk, 30 μg / disk, 10 μg / disk, and 5 μg / disk Mg-EDTA impregnated disk. The test was conducted in the same manner as above.
表４に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、Ｍｇ−ＥＤＴＡの含浸量が３０μｇ／ディスク以上で、メタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。 From the results shown in Table 4, when the β-lactam drug-impregnated disk and the Mg-EDTA-impregnated disk were combined to determine the metallo-β-lactamase producing bacteria, the amount of Mg-EDTA impregnated was 30 μg / disk or more. It was possible to discriminate β-lactamase producing bacteria.
［実施例４］β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの距離の違いによる試験結果への影響
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと９ｍｇ／ディスクおよび１０ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍ、１．５ｃｍ、および１．０ｃｍとし、加えてディスク同士を接触させた試験を実施した。なお、その他の条件は［実施例１］と同様に試験を実施した。
[Example 4] Influence on test results due to difference in distance between β-lactam drug-impregnated disc and Mg-EDTA-impregnated disc As test bacteria, Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae ( EKN4635) and Acinetobacter baumannii (EKN7170), imipenem (IPM: 10 μg titer / disk), meropenem (MEPM: 10 μg titer / disk), and ceftazidime (CAZ: 30 μg titer / disk) impregnated disk and 9 mg / Using a combination of disc and 10 mg / disc Mg-EDTA impregnated disc, the distance between the centers of the discs was 2.0 cm, 1.5 cm, And a 1.0 cm, the test was carried out contacting the disk between added. The other conditions were the same as in [Example 1].
表５に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせてメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別するときに、β−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの中心間の距離を２．０ｃｍとしてもメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、その距離を１．５ｃｍ以下にすることによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。 From the results shown in Table 5, when the metallo-β-lactamase-producing bacteria are discriminated by combining the β-lactam drug-impregnated disk and the Mg-EDTA-impregnated disk, the center between the β-lactam drug-impregnated disk and the Mg-EDTA-impregnated disk is determined. It was possible to discriminate metallo-β-lactamase-producing bacteria even when the distance was 2.0 cm, but it was possible to clearly distinguish metallo-β-lactamase-producing bacteria by setting the distance to 1.5 cm or less. Became.
［実施例５］種々のβ−ラクタム薬含浸ディスクを用いた検討
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（ＥＫＮ７１７３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）を用い、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクと１２ｍｇ／ディスクのＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの組合せを用いて、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。
[Example 5] Examination using various β-lactam drug impregnated discs As test bacteria, Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Enterac73 Using Pseudomonas aeruginosa (EKN7102), imipenem (IPM: 10 μg titer / disc), meropenem (MEPM: 10 μg titer / disc), doripenem (DRPM: 10 μg titer / disc), tevipenem (TBPM: 10 μg titer / disc) ), Biapenem (BIPM: 10 μg titer / disc), Panipenem (PAPM: 10 μg titer / disc) Cefbuperazone (CBPZ: 75 μg titer / disc), cefmethazole (CMZ: 30 μg titer / disc), cefminox (CMNX: 30 μg titer / disc), cefoxitin (CFX: 30 μg titer / disc), ceftazidime (CAZ: 30 μg strength) Titer / disc), ceftriaxone (CTRX: 30 μg titer / disc), cefotaxime (CTX: 30 μg titer / disc), and cefepime (CFPM: 30 μg titer / disc) impregnated disc and 12 mg / disc Mg-EDTA Using the combination of impregnated discs, tests were carried out under the same conditions as in [Example 1].
表６に示す結果より、多くのβ−ラクタム薬含浸ディスクとＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクを組み合わせることにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。 From the results shown in Table 6, it was possible to discriminate metallo-β-lactamase-producing bacteria by combining many β-lactam drug-impregnated disks and Mg-EDTA-impregnated disks.
２．β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを並べた試験
［実施例６］β−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
2. Test in which β-lactam drug-impregnated disk and β-lactam drug and metal-EDTA chelate complex-impregnated disk are arranged side by side [Example 6] Confirmation of metallo-β-lactamase-producing bacteria by β-lactam drug and metal-EDTA chelate complex-impregnated disk Test The test bacteria were prepared in sterile saline to the same turbidity as McFarland standard turbidity 0.5, and uniformly inoculated on Mueller Hinton agar using a sterile cotton swab.
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離してβ−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを置いた。 Next, a β-lactam drug-impregnated disk, a β-lactam drug and a metal-EDTA chelate complex-impregnated disk were placed on the same plate medium at a distance of 3 cm or more.
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の大きさとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさの違いを観察した。 After culturing at 35 ° C. for 16 to 18 hours, the difference between the size of the inhibition circle of the β-lactam drug-impregnated disk and the size of the inhibition circle of the β-lactam drug and metal-EDTA chelate complex-impregnated disk was observed.
β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクを比較することにより、図２に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。 By comparing the β-lactam drug-impregnated disk with the β-lactam drug and metal-EDTA chelate complex-impregnated disk, an increase in the value of d shown in FIG. Those having a diameter of less than 5 mm were judged as ±, and those having no enlargement were judged as-. For the β-lactam-impregnated discs where no inhibition circle was observed, the formation of the inhibition band of 12 mm or more was +, the formation of the inhibition band was less than 12 mm, and the inhibition band was formed. What was not done was determined to be-.
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）を用いた。 Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Pseudomonas aeruginosa (EKN7102u, EKN7102)
β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、メロペネム（ＭＥＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ビアペネム（ＢＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、ドリペネム（ＤＲＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、テビペネム（ＴＢＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、パニペネム（ＰＡＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）、セフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）、セフトリアキソン（ＣＴＲＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォタキシム（ＣＴＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフブペラゾン（ＣＢＰＺ：７５μｇ力価／ディスク）、セフミノクス（ＣＭＮＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフォキシチン（ＣＦＸ：３０μｇ力価／ディスク）、セフメタゾール（ＣＭＺ：３０μｇ力価／ディスク）、およびセフェピム（ＣＦＰＭ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。 As β-lactam drugs, imipenem (IPM: 10 μg titer / disc), meropenem (MEPM: 10 μg titer / disc), biapenem (BIPM: 10 μg titer / disc), doripenem (DRPM: 10 μg titer / disc), Tebipenem (TBPM: 10 μg titer / disc), Panipenem (PAPM: 10 μg titer / disc), Ceftadidim (CAZ: 30 μg titer / disc), Ceftriaxone (CTRX: 30 μg titer / disc), Cefotaxime (CTX: 30 μg titer / disc), cefbuperazone (CBPZ: 75 μg titer / disc), cefminox (CMNX: 30 μg titer / disc), cefoxitin (CFX: 30 μg titer / disc), cefmethazole (CMZ: 30 μg titer / disc) , And cefepi (CFPM: 30 μg titer / disk) impregnated disk was used.
金属−ＥＤＴＡキレート錯体として、Ｃａ−ＥＤＴＡおよびＭｇ−ＥＤＴＡを用い、各々１２ｍｇ／ディスクとなるようにβ−ラクタム薬含浸ディスクに添加した。 Ca-EDTA and Mg-EDTA were used as metal-EDTA chelate complexes, and each was added to a β-lactam drug-impregnated disk so as to be 12 mg / disk.
表７に示す結果より、β−ラクタム薬含浸ディスクとβ−ラクタム薬および金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクの阻止円の大きさを比較することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であった。 From the results shown in Table 7, it is possible to distinguish the metallo-β-lactamase-producing bacteria by comparing the size of the inhibition circles of the β-lactam drug impregnated disk and the β-lactam drug and metal-EDTA chelate complex impregnated disk. there were.
３．β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた試験
［実施例７］金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム（ＳＭＡ）含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
3. Test in which β-lactam drug impregnated disk and metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate impregnated disk are arranged side by side [Example 7] Metallo- β- by metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate (SMA) impregnated disk Confirmation Test for Lactamase-Producing Bacteria Test bacteria were prepared in sterilized physiological saline with the same turbidity as McFarland standard turbidity 0.5, and uniformly inoculated on Mueller Hinton agar medium using a sterile cotton swab.
次に、同一平板培地上に３ｃｍ以上離して二枚のβ−ラクタム薬含浸ディスクを置き、その中の一枚のディスクの中心から１．５ｃｍ離して金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを置いた。 Next, two β-lactam drug impregnated disks are placed on the same plate medium at a distance of 3 cm or more, and the metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate is separated 1.5 cm from the center of one of the disks. An impregnated disc was placed.
３５℃で１６〜１８時間培養した後にβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円の形状およびβ−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べた場合の阻止円の形状の違いを観察した。 Inhibition circle shape of β-lactam drug impregnated disk after incubation at 35 ° C. for 16 to 18 hours and inhibition circle when β-lactam drug impregnated disk and metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate impregnated disk are arranged side by side The difference in shape was observed.
具体的には、β−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円が、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクの中心を繋いだ軸方向に対して垂直方向に拡大するかを確認した。 Specifically, the β-lactam drug-impregnated disk has a blocking circle formed by aligning the β-lactam drug-impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate-impregnated disk. It was confirmed whether or not the EDTA chelate complex and / or the mercaptoacetate sodium impregnated disc expanded in the direction perpendicular to the axial direction connecting the centers.
β−ラクタム薬含浸ディスクと金属−ＥＤＴＡキレート錯体および／またはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを並べることにより、図１に示すｄの値が５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、β−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。 When the β-lactam drug-impregnated disk and the metal-EDTA chelate complex and / or sodium mercaptoacetate-impregnated disk are arranged side by side, an increase in the value of d shown in FIG. Those having a diameter of less than 5 mm were judged as ±, and those having no enlargement were judged as-. For the β-lactam-impregnated discs where no inhibition circle was observed, the formation of the inhibition band of 12 mm or more was +, the formation of the inhibition band was less than 12 mm, and the inhibition band was formed. What was not done was determined to be-.
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ９１５６）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（ＥＫＮ９９９５）を用い、β−ラクタム薬として、イミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを用いた。 As test bacteria, Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Acinetobacter baumannii (EKN7108), Acinetobacter baumannii (EKN7109), Acinetobacter baumannii (EKN7170), Pseudomonas aeruginosa (EKN9156), and Pseudomonas sp. (EKN9995) was used, and imipenem (IPM: 10 μg titer / disk) and ceftazidime (CAZ: 30 μg titer / disk) impregnated disk were used as β-lactam drugs.
金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＣａ−ＥＤＴＡを用い、ディスクに１２ｍｇのＣａ−ＥＤＴＡおよび１ｍｇのメルカプト酢酸ナトリウムを含浸させて試験に用いた。なお、各々Ｃａ−ＥＤＴＡおよびメルカプト酢酸ナトリウムを単独で含浸したディスクも準備し、その他の条件を［実施例１］と同様に試験を実施した。 Ca-EDTA was used as the metal-EDTA chelate complex, and the disk was impregnated with 12 mg Ca-EDTA and 1 mg sodium mercaptoacetate and used for the test. Disks impregnated with Ca-EDTA and sodium mercaptoacetate alone were also prepared, and other conditions were tested in the same manner as in [Example 1].
表８に示す結果より、Ｃａ−ＥＤＴＡ含浸ディスクまたはメルカプト酢酸ナトリウム含浸ディスクを用いてもメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能であったが、両者を混合してディスクに含浸することによりメタロ―β―ラクタマーゼ産生菌の明瞭な判別が行なえるようになった。 From the results shown in Table 8, it was possible to discriminate metallo-β-lactamase-producing bacteria using a Ca-EDTA impregnated disc or a sodium mercaptoacetate impregnated disc. -Β-lactamase producing bacteria can now be clearly distinguished.
４．β−ラクタム薬含有平板培地を用いた試験
［実施例８］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地およびイミペネム（ＩＰＭ：５０μｇ力価／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１０μｇ／ディスク）含浸ディスクを置いた。
4). Test using plate medium containing β-lactam drug [Example 8] Confirmation test of metallo-β-lactamase producing bacteria using metal-EDTA chelate complex impregnated disk Test bacteria in sterile physiological saline and McFarland standard turbidity 0.5 The same turbidity was prepared, and the mixture was uniformly inoculated on a Mueller Hinton agar medium and an imipenem (IPM: 50 μg titer / mL) -containing Mueller Hinton agar medium using a sterile cotton swab.
Next, an Mg-EDTA (10 μg / disk) impregnated disk was placed as a metal-EDTA chelate complex on each plate medium.
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたＭｇ−ＥＤＴＡ含浸ディスクの阻止円を計測し、その大きさに変化が認められたものを＋、変化が認められなかったものを−と判定した。 The inhibition circle of the Mg-EDTA impregnated disk placed on each plate medium after culturing at 35 ° C. for 16 to 18 hours was measured, and the change was recognized in the size +, and the change was not recognized. -Was determined.
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。 Examples of test bacteria include Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), and Klebsiella pneumoniae (EKN4635), which are metallo-β-lactamase-producing bacteria, and metallo-β-lactamase b (EKN9491), Escherichia coli (EKN6663), and Pseudomonas aeruginosa (EKN7149) were used.
その結果、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌は全て＋となり、メタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌は全て−となった。これらと表１および表２が同じ結果を示していることより、β−ラクタム薬含有平板培地に被検菌を接種し、培地上に金属−ＥＤＴＡキレート錯体を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。 As a result, all metallo-β-lactamase-producing bacteria became +, and all β-lactamase-producing bacteria other than metallo-β-lactamase became-. Since Table 1 and Table 2 show the same results as above, the test bacteria were inoculated on a plate medium containing β-lactam drug, and a disk impregnated with a metal-EDTA chelate complex was placed on the medium. By observing the size of the inhibition circle, it is possible to discriminate metallo-β-lactamase producing bacteria.
５．金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地を用いた試験
［実施例９］β−ラクタム薬含浸ディスクによるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
被検菌を滅菌生理食塩水にＭｃＦａｒｌａｎｄ標準濁度０．５と同じ濁度に調製し、滅菌綿棒を用いてミュラーヒントン寒天培地および金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（１００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントン寒天培地上に均一に接種した。
次に、各々の平板培地上にイミペネム（ＩＰＭ：１０μｇ力価／ディスク）およびセフタジジム（ＣＡＺ：３０μｇ力価／ディスク）含浸ディスクを置いた。
5. Test using metal-EDTA chelate complex-containing plate medium [Example 9] Confirmation test of metallo-β-lactamase producing bacteria using β-lactam drug impregnated disk Test bacteria in sterile saline and McFarland standard turbidity 0.5 The same turbidity was prepared, and a sterile swab was used to uniformly inoculate Mueller Hinton agar medium and Mueller Hinton agar medium containing Mg-EDTA (100 μg / mL) as a metal-EDTA chelate complex.
Next, imipenem (IPM: 10 μg titer / disk) and ceftazidime (CAZ: 30 μg titer / disk) impregnated disk were placed on each plate medium.
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の平板培地に置いたβ−ラクタム薬含浸ディスクの阻止円を計測し、５ｍｍ以上の拡大が認められたものを＋、拡大が認められたものの５ｍｍ未満のものを±、および拡大が認められなかったものを−と判定した。なお、ミュラーヒントン寒天培地においてβ−ラクタム薬含浸ディスクで阻止円が認められなかったものについては、Ｍｇ−ＥＤＴＡ含有ミュラーヒントン寒天培地において１２ｍｍ以上の阻止帯を形成したものを＋、阻止帯を形成したものの１２ｍｍ未満のものを±、および阻止帯を形成しなかったものを−と判定した。 Inhibition circle of β-lactam drug impregnated disk placed on each plate medium after culturing at 35 ° C. for 16 to 18 hours was measured, + when expansion of 5 mm or more was recognized, less than 5 mm when expansion was observed Were determined as ±, and those in which no enlargement was observed as −. In the case of the Muller Hinton agar medium where the inhibition circle was not observed with the β-lactam-impregnated disk, the Mg-EDTA-containing Muller Hinton agar medium was formed with the inhibition band of 12 mm or more, and the inhibition band was formed. What was less than 12 mm was determined to be ±, and those that did not form a blocking band were determined to be −.
被検菌として、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１０２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１１６）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１７０）並びにメタロ−β−ラクタマーゼ以外のβ−ラクタマーゼ産生菌のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ９４９１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ６６６３）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＫＮ７１４９）を用いた。 As test bacteria, Escherichia coli metallo -β- lactamase producing bacteria (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Pseudomonas aeruginosa (EKN7102), Pseudomonas aeruginosa (EKN7116), and Acinetobacter baumannii ( EKN7170) and β-lactamase producing bacteria other than metallo-β-lactamase, such as Klebsiella pneumoniae (EKN9491), Escherichia coli (EKN6663), and Pseudomonas aeruginosa (EKN7149) It was used.
表９と表１および表２が同等の結果を示していることより、金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有平板培地に被検菌を接種し、培地上にβ−ラクタム薬を含浸したディスクを置いて培養後の阻止円の大きさを観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。 Since Table 9 and Tables 1 and 2 show equivalent results, the test bacteria are inoculated on a plate medium containing a metal-EDTA chelate complex, and a disk impregnated with β-lactam drug is placed on the medium and cultured. By observing the size of the later inhibition circle, it is possible to discriminate metallo-β-lactamase producing bacteria.
６．微量液体希釈法を用いた試験
［実施例１０］金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地によるメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の確認試験
ミュラーヒントンブロス培地並びに金属−ＥＤＴＡキレート錯体としてＭｇ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）およびＣａ−ＥＤＴＡ（５００μｇ／ｍＬ）含有ミュラーヒントンブロス培地を用いてイミペネム（ＩＰＭ）の希釈系列を作製した。
次に、各々の希釈系列のウェルに最終接種菌液量が約５×１０４ＣＦＵ／ウェルとなるように被検菌を接種した。
6). Test using a micro liquid dilution method [Example 10] Confirmation test of metallo-β-lactamase producing bacteria using metal-EDTA chelate complex-containing liquid medium Muller Hinton broth medium and Mg-EDTA (500 μg / mL as metal-EDTA chelate complex) ) And Ca-EDTA (500 μg / mL) -containing Muller Hinton broth medium was used to prepare a dilution series of imipenem (IPM).
Next, the test bacteria were inoculated so that the final inoculum volume was about 5 × 10 4 CFU / well in each dilution series well.
３５℃で１６〜１８時間培養した後に各々の希釈系列での被検菌の増殖よりＭＩＣ値を求め、金属−ＥＤＴＡキレート錯体の有無により３管以上のＭＩＣ値の低下が認められたものを＋、認められなかったものを−と判定した。 After culturing at 35 ° C. for 16 to 18 hours, the MIC value was determined from the growth of the test bacteria in each dilution series, and the MIC value decreased by 3 tubes or more depending on the presence or absence of the metal-EDTA chelate complex + Those that were not recognized were determined to be-.
被検菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＫＮ９９８１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−２１４６）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＫＮ４６３５）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０８）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ（ＥＫＮ７１０９）を用いた。 As test bacteria, Escherichia coli (EKN9981), Klebsiella pneumoniae (ATCC BAA-2146), Klebsiella pneumoniae (EKN4635), Acinetobacter baumani (EKN7108), and EkN7108 (KN7108) and EkN7108 (KN7108).
表１０と表１が同等の結果を示していることより、β−ラクタム薬含有液体培地と金属−ＥＤＴＡキレート錯体含有液体培地とを組み合わせて被検菌を接種し、培養後の被験菌の増殖の有無を観察することにより、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別が可能である。 Since Table 10 and Table 1 show equivalent results, the test bacteria are inoculated by combining the β-lactam drug-containing liquid medium and the metal-EDTA chelate complex-containing liquid medium, and the growth of the test bacteria after culturing. By observing the presence or absence of metallo, it is possible to discriminate metallo-β-lactamase producing bacteria.
従来、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌の判別に、β−ラクタム薬と有機チオール化合物であるメルカプト酢酸ナトリウムを組み合わせて、被検菌の発育抑制効果の変化の有無が用いられてきた。 Conventionally, the presence or absence of a change in the growth inhibitory effect of a test bacterium has been used in combination with a β-lactam drug and an organic thiol compound, mercaptoacetate sodium, to discriminate a metallo-β-lactamase producing bacterium.
しかしながら、メタロ−β−ラクタマーゼの遺伝子型の中で、メルカプト酢酸ナトリウムを用いてもそのβ−ラクタマーゼ活性が抑制されないＮＤＭ−１と呼ばれる遺伝子型のメタロ−β−ラクタマーゼを発現する細菌が検出されるようになった。 However, among the metallo-β-lactamase genotypes, bacteria expressing a genotype metallo-β-lactamase called NDM-1 are detected whose sodium β-lactamase activity is not suppressed even when sodium mercaptoacetate is used. It became so.
すなわち、従来の方法ではメタロ−β−ラクタマーゼを産生している菌の全てを検出できないこととなった。その結果、医療行為を行なう上で、治療薬としての抗菌薬の選択に支障を来たす虞が生じている。 That is, all the bacteria producing metallo-β-lactamase cannot be detected by the conventional method. As a result, there is a possibility that the selection of an antibacterial agent as a therapeutic agent may be hindered in performing medical practice.
そこで、本願発明の技術を用いることにより、より広範囲のメタロ−β−ラクタマーゼ産生菌を判別することが出来るようになり、メタロ−β−ラクタマーゼ産生菌による感染症を治療する上で有用な情報を得ることが可能となり、早期に治療薬としての抗菌薬を選択出来、感染症の治癒に寄与する。 Therefore, by using the technique of the present invention, a wider range of metallo-β-lactamase producing bacteria can be discriminated, and useful information for treating infections caused by metallo-β-lactamase producing bacteria. It becomes possible to obtain antibacterial drugs as therapeutic agents at an early stage, and contributes to the cure of infectious diseases.
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