JP6105570B2 - 哺乳動物の胚の生存能力を予測する方法 - Google Patents
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Description
(a)1細胞期で、胚の細胞質内運動および/または胚の形状の周期的な変化を測定すること、および
(b)その測定値を用いて、胚の発生能を予測すること
を含む。
発明者等は、受精後のマウス胚で、細胞質内運動の平均速度における別個の周期的なピーク(本明細書では「速度ピーク(speed peak)」と称する)を観察した。発明者等は、速度ピーク間インターバルの長さが、胚発生の成功の予測に役立つことを見出した。より長い速度ピーク間インターバルと、より優れた発生の成功とが相関する。
本発明のさらなる形態は、複数の胚から1個またはそれより多くの胚を選択する方法を提供し、本方法は、1細胞期における胚中の細胞質内運動および/または胚の形状の周期的な変化を測定することにより各胚の発生能を予測することと、それらの予測された発生能に基づいて1個またはそれより多くの胚を選択することとを含む。また胚(複数可)を選択する際に、その他の要素を考慮に入れてもよい。1個またはそれより多くの胚は、補助繁殖方法で使用するために選択することができる。
図面における色の言及は、単に情報として示されたに過ぎない。カラーの図面はない。
「平均細胞質内速度(average cytoplasmic speed)」は、単一細胞胚を通る単一面で測定された、あるいは細胞質全体で測定された、例えば細胞全体を通過する一続きの面で測定された、いずれかの特定の時間における平均速度を意味する。
また速度ピークまたはFCの拍動は、胚におけるCa2+一過性上昇と同時に起こる可能性がある。「平均基底細胞質内速度」は、記録された最初の速度ピークの前の期間、速度ピーク間の期間、および/または記録された最後の速度ピークの後の経時的な平均細胞質内速度である。平均基底細胞質内速度は、これらの期間の1つまたはそれより多くの間のあらゆる時点で測定することができる。本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、平均細胞質内速度は、記録された最初の速度ピークまで測定されるか、ある別個の速度ピークの直後から次の別個の速度ピークの開始時まで測定されるか、および/または、記録された最後の別個の速度ピークの直後に測定される。平均基底細胞質内速度は、これらの期間全体で決定してもよい。
いくつかのケースにおいて、発生能の予測は、受精丘が存在する期間中になされた細胞質内運動の測定に基づく。マウスにおいて、受精丘は、受精からおよそ1〜1.5時間後からおよそ2時間存在する。典型的には、受精丘は、卵を体外受精させる場合、精子とインキュベートしてから約2時間後に形成が始まると予想される。本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、測定は、精子と卵とを共に2時間インキュベートしてした後になされる。
タイムラプス画像は、単一細胞胚を通る単一面から捕捉することができる。FC形成が完了するステージ2の間、速度ピークは最も速いために最も容易に区別され、速度ピークの細胞質内運動は、典型的にはFCに向かう。また細胞の赤道面でも、速度ピークは最も速い。さらに赤道面は最大なので、最良の品質の画像が得られる。好ましくは、タイムラプス画像は、細胞中心を通る単一面から捕捉される。好ましくは、タイムラプス画像は、FCを赤道で二等分する単一面から捕捉される。
培地は、一定のpHを維持するために、例えばHEPESで緩衝化されていてもよい。あるいは人工気候室を用いて安定したpHを維持してもよい。培地のpHを正しいレベルに維持するために、人工気候室には、CO2、例えば5%CO2が供給されてもよい。
卵および精子の回収
F1(C57Bl6×CBA)マウスの雌を過排卵させ、卵母細胞および接合体を上述したようにして44回収した。単為生殖的活性化は、Ca2+/Mg2+を含まず10mMSrCl2が補充されたM2培地中で卵を4時間インキュベートすることにより行われた。卵核胞(GV)期卵母細胞を卵巣から単離して150μg/mlジブチリル環状AMP(dbcAMP)が補充されたM2培地に入れた。精巣上体精子をF1の雄から単離し、4mg/mlのBSAを含む受精用培地0.5ml中で受精できるようにした45。すでに述べられたようにして44、KSOM培地中で胚を画像化した。イメージング前のいくつかの実験で、胚を、30μMのBAPTA−AM(Ca2+をキレート化するため)、5μg/mlノコダゾール(微小管を脱重合するため)、2μg/mlサイトカラシンD(F−アクチンを脱重合するため)、10μMタキソール(微小管を安定化させるため)または100nMジャスプラキノリド(F−アクチンを安定化させるため)と共に20分プレインキュベートし、続いて純粋なKSOM(BAPTA処理した胚)または各薬物を含むKSOM(上記処理した胚の残り)に移した。(ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)を阻害して、ミオシンIIを活性化するために46)ML−7で処理された胚を、25μMML−7と共に20分プレインキュベートし、続いて、25μMのML−7含有KSOMを含む培養皿中で、ML−7を吸収すると予想されるミネラルオイルで覆わないで画像化した。
ほとんどの実験で、倒立共焦点顕微鏡(ツァイス(Zeiss)のLSM510メタ(Meta))下で、37.5℃および5%CO2で、接合体を単一面で画像化した。633nmのHeNeレーザーを用いてDIC画像を10秒毎に捕捉した。遊離Ca2+イオン濃度を測定するために、胚を、5μMのFuraRed−AM(インビトロジェン(Invitrogen))およびFuraRed中で20分プレインキュベートし、DIC画像を488nmのアルゴンレーザーで同時に得た。細胞質内運動と胚の発生能との相関を試験した実験において、接合体を単一面で、透過光中で、標準的な非共焦点顕微鏡(ツァイスのアキシオバート(Axiovert)またはデルタビジョン(Deltavision))で、10秒毎に2.5時間、画像化した。接合体の皮質および中央部分における細胞質内運動を比較した実験において、胚を、デルタビジョン顕微鏡で、11面で、6μm毎に、10秒毎に3時間、画像化した。表7に、用いられた全てのイメージングシステムの光学的な詳細を要約した。FuraRed蛍光の強度を、イメージJ(ImageJ)ソフトウェアを用いて測定した。MatPIV v1.6.1から適用したアルゴリズムを用いたMATLAB(マスワークス社(The Mathworks Inc.)、米国マサチューセッツ州ナティック)で特注のソフトウェアを用いて画像を解析した47。アルゴリズムは、連続的な画像対間の相互関係を示す画像のサブ領域に関連する、流体動力学で広く用いられている標準的な解析技術のPIVで用いられるアルゴリズムをベースとする21〜24。PIV解析において、各画像を四角の検査領域に分け、相互相関係数分布を、順に並んだ次の画像のそれより大きい領域内で計算した。相互相関係数分布のピークから、第一の画像における検査領域の材料の第二の画像における最も可能性が高い配置が得られた。次にこれを用いて、画像間の時間にわたる変位ベクトルを計算した(図1A)。多くのピクセルにわたりピクセル領域のコントラストパターンの変位が測定されるため、この技術を用いてサブピクセルの運動を正確に測定することが可能である22、24、48。
MatPIV v1.6.150から適合させたアルゴリズムを用いたMATLAB(マスワークス社、米国マサチューセッツ州ナティック)で特注のソフトウェアを用いて、受精卵のDIC画像を解析した。このアルゴリズムは、相互関係を示す連続的な画像対間のサブ領域に基づくパターン整合技術の使用に関連する標準的な解析技術であるPIVで用いられるアルゴリズムをベースとする(本文における方法および図1aを参照)。解析されたそれぞれの検査領域に関する変位を計算するために、続いて繰り返し2回のPIVを用いた。第一のより大きい検査領域の変位を計算し、続いてそれを、より小さい検査領域での次の反復のための探索領域の中心をどこにするかの推測値として用いた。アルゴリズムが最良のフィッティングを探す領域は、検査領域それ自身より2倍大きかった。図1aにおいて、この図は、PIVアルゴリズムの1回の反復を示す。ツァイスのLSM510メタ共焦点顕微鏡で行われた実験では、第一の反復に64×64ピクセルの最初の検査領域サイズを用い、続いて第二の反復に32×32ピクセルの検査領域を用いた。このイメージングシステムのピクセルサイズは、0.35μmであった。ツァイスのアキシオバートおよびデルタビジョン顕微鏡で行われたより大きいピクセルサイズ(それぞれ0.64および0.83μm)での実験について、第一の反復に、32×32ピクセルの最初の検査領域サイズを用い、続いて第二の反復に、16×16ピクセルの検査領域を用いた。各細胞の中心における11×11ベクトルの正方形の平均振幅をとることにより、細胞質内運動の平均速度を計算した。
細胞質内速度における振動の変化を示した接合体において、平均基底速度は、事後運動の最後とそれに続く速度ピークの開始時との間のインターバルで、または最後の事後運動の後の期間に測定された(図1D)。速度の振動を提示しなかった接合体について、平均基底速度は全ての記録期間で計算された。ほとんどの場合、細胞質内運動の方向は、接合体でPIVによって生じた全てのベクトルの平均ベクトルに基づいて評価された。いくつかの接合体において、ベクトルは一対の渦流を形成し、続いてその方向に沿って共通の軸が形成された。極めて不規則なベクトルパターンの方向は、高い規則性を有するベクトルの大半の方向から、視覚的に評価した。
ライカ(Leica)の微調整装置およびライカの倒立顕微鏡を用いて、これまでに述べられたようにしてICSIを行った49。いくつかの実験で、新たに単離した精子の代わりに熱不活化した精子(60℃で30分)を用いた。精子懸濁液を10%ポリビニルピロリドン(PVP、Mr=360kDa)を含むM2培地と混合した。圧電マイクロピペット駆動ユニット(IntraCel PMAS-CT150、プライムテック(PrimeTech)、日本)を用いて精子を卵母細胞のサイトゾルに送達した。
細胞質内運動と胚の発生能との相関を試験するために、10μlの受精能のある精子の懸濁液を卵丘細胞で取り囲まれた卵に添加し、続いて配偶子と共に2時間インキュベートした。阻害剤の特異性を試験する実験、またはアクチンおよびミオシンの生きた状態のイメージングを含む実験では、受精前に、卵を酸性タイロード溶液(pH=2.5)で短時間で処理して透明帯を除去し、続いておよそ1μlの受精能のある精子の懸濁液と混合して、一緒に30分インキュベートした。いずれのケースにおいても、受精は、4mg/mlのBSAが補充された受精用培地中で行われた45。2細胞期の胚を、精管切除した雄と交配したレシピエントのF1の雌の卵管に0.5dpcで移した。これらを6.5dpcまたは19.5dpcに解剖した。
EGFPに融合したユートロフィンのアクチン結合ドメイン(UtrCH−EGFP26)、GFPに融合したミオシンII調節軽鎖(MyoRLC−GFP27)、およびRFPでタグ付けされたタンパク質マーカーGap43をコードするコンストラクト50を、pBluescriptRN3Pベクターにクローニングし、mメッセージmマシーン(mMessage mMachine)T3キット(アンビオン(Ambion))を用いてT3プロモーターからmRNAを合成した。mRNA(ピペット濃度は、UtrCH−EGFPおよびMyoRLC−GFPの場合、0.5μg/μlであり、Gap43−RFPの場合は、0.36μg/μlである)を、GV卵母細胞に注入し、続いてこれを150μg/mlのdbcAMPを含むM2中でおよそ5時間培養し、続いて洗浄し、M16培地に移して成熟させた。16時間後にMII期に達した卵母細胞を体外受精用に選択し、続いて倒立型回転円盤共焦点顕微鏡(ツァイス)で10〜15秒毎に画像化した。UtrCH−EGFP、MyoRLC−GFP、およびGap43−RFPの蛍光強度を、イメージJソフトウェアを用いてFC皮質および細胞質中で測定した。皮質のUtrCH−EGFP、MyoRLC−GFP、およびGap43−RFPについて得られた値を細胞質について得られたそれぞれの強度で標準化して、例えばレーザーパワーの変動などのイメージングにおけるアーティファクトによって引き起こされるあらゆる強度変化を除去した。続いて最終結果を、強度を標準化したUtrCH−EGFPとGap43−RFPとの比率またはMyoRLC−GFPとGap43−RFPとの比率として示して、焦点のシフトによって引き起こされるあらゆる強度変化を除去した。
以前に説明された通りにして、胚を4%PFA中で固定し、透過化した44。倒立共焦点顕微鏡(ツァイスのLSM510メタ)を用いて胚をスキャンした。
1)FITCで標識したマウス抗チューブリンβ抗体(シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich);3%BSAで1:50に希釈、室温で1.5時間);
2)マウス抗アクチンベータ抗体(シグマ−アルドリッチ;3%BSAで1:100に希釈、室温で1.5時間)
3)ヤギ抗Gata4一次抗体(サンタクルーズ(Santa Cruz);10%FCSで1:200、4℃で一晩)、続いてアレクサフルオロ(Alexafluor)568で標識した二次抗体(モレキュラープローブス;10%FCSで1:1000、室温で1.5時間);
4)テキサスレッド(TexasRed)またはオレゴングリーン(OregonGreen)で標識したファロイジン(インビトロジェン(Invitrogen);1:100、室温で30分、または4℃で一晩);
5)ヘキスト(Hoechst)33342(モレキュラープローブス(Molecular Probes);PBS中で100ng/μl、室温で30分、または4℃で一晩)。
統計的分析
スチューデントのt検定、カイ二乗検定または適切な回帰モデルのいずれかを用いて統計的分析を行った。行われた実験の連続的な性質および我々が取り組もうとしている質問のアプリオリな性質のために、我々は、統計的有意性を5%レベルで評価した。平均基底速度または速度ピーク間平均インターバルと、発生4日後に生産された細胞の総数(すなわち4日齢の細胞数)との関係を決定するために、我々は、平均細胞数と説明変数の線形結合とを関連付ける対数リンク関数:平均基底速度、平均基底速度の二乗、速度ピーク間平均インターバル、速度ピーク間平均インターバルの二乗、および基底速度と速度ピーク変数との様々な相互作用を用いて負の二項モデルを胚の細胞数にフィッティングした。我々の最初の解析において、我々は、胚発生で使用されたイメージングシステム(ツァイスまたはデルタビジョン)の起こり得る交絡作用を考慮した。しかしながら、我々は、解析されたパラメーター、すなわち速度ピーク間の平均インターバルの二次効果と、画像システムとの相互作用は統計学的に有意ではなく、さらに説明能力にまったく寄与しないことを見出したために、我々はそれらを我々の最終的な解析から排除した。最終モデルと比較して記載された上記全ての変数を用いたフルモデルの尤度比検定により、対数尤度において統計学的に有意ではない変化が生じた(p=0.53)。細胞数データ51で観察されたバリエーションを説明するために、より標準的な細胞数のポアソン回帰モデリングに対して細胞数の負の二項モデリングを選択した。
マウス卵の受精により周期的な細胞質内の動きのバーストが起こる
マウス卵の受精の際の細胞質内運動を特徴付けて、それらが受精に関連する他の現象に関連するのか、加えて関連する場合はどのようにして関連するのかを評価するために、我々はまず、受精直後から前核形成までの時間、卵を撮影した。続いて我々はPIV法21〜24に基づく高度画像分析用いて、これらの運動を解析し、定量した(図1A)。それにより、マウス卵が受精した後、細胞質内運動の速度が劇的に周期的増加および減少を起こす(我々は、速度ピークと名付けた;図1B〜D、n=55の未受精の卵母細胞、およびn=125の体外受精卵)ことが明らかになった。この一連の卵の細胞質中の迅速な繰り返し運動は、前核形成までおよそ4時間続いた。速度ピークは、最初のうちは比較的低い振幅を示したが(減数第二分裂の分裂後期から、初期のFC伸長までの間;ステージ1)、その後、FCが完全に伸張したらそれよりも有意に大きい振幅になった(ステージ2)。最後に、FC退縮中およびその後に、それらの振幅は減少した(ステージ3)(図1B、D、表1)。ステージ2において、急速な細胞質内運動はFCを二等分する赤道面で最大であり、そこから外側の面では、外に向かうほど遅くなった(図9)。PIV解析から、各速度ピークの後に、通常は4分より長く持続し、より低い振幅を示す事後運動になったことが明らかになった。ステージ3の間の運動は、速度ピークが事後運動とあまり異なっていないことが多いという点で、この規則の例外であった(図1D、表1)。さらに我々は、受精は、未受精の卵母細胞の休止レベルと比較して、平均の基底細胞質内速度(ピーク間インターバルの間、または最後に記録されたピークの後の速度)の2倍以上の増加をもたらしたことに留意した(図1C〜D、表2)。
高振幅の細胞質内速度ピークは、FCの拍動と相関し、アクトミオシン細胞骨格に依存する
ステージ2における急な運動の方向は、FCがこのような運動の発生に関与する可能性があることを示唆することから、次に我々はこの期間にわたるFCの形態を試験した(69の速度ピーク、14の接合体)。それにより、各速度ピークにおいて、FCの頂点は中心に向かって埋まり、FCが沈み込んで凸型になった接合体の領域が広くなることが示された。結果として、FCの軸に沿った接合体の直径(以下、「FC直径」と証する)は、1.28±0.66μmに減少した(その長さの1.55±0.79%)(図2A、C)。FCの形状はピーク間インターバル中に回復した(図2C)。興味深いことに、FC直径の減少の程度は、速度ピークの振幅と直線的な関連を示した(20の接合体、71の解析された速度ピーク)(図2B)。
細胞質内運動はCa 2+ 一過性上昇と相関があり、それに依存する
受精は、遊離Ca2+の振動を開始させることが知られているため10、29、我々は次に、アクトミオシンが介在する速度ピークは、これらのCa2+パルスに依存するのかどうかについて取り組もうと考えた。この目的を達成するために、我々は、Ca2+感受性の蛍光色素のFuraRedを含む受精卵をローディングし、FuraRedの蛍光およびDIC画像を同時に回収した。32の接合体において、Ca2+の増加に伴い全ての121の速度ピークが発生した。Ca2+レベルがピークになると細胞質内速度は(我々の記録のインターバルの解像度の範囲内で)正確に増加した(図3A)。異常に頻繁なCa2+振動を示す一つの接合体においてのみ、一部のCa2+スパイク(4/17)が速度ピークに反映されていなかった。ICSIで受精させたいくつかの卵で、我々は、最初のCa2+一過性上昇に伴う速度ピークの記録を達成した。これらの速度ピークは、最初のCa2+一過性上昇に相当するステージ1の速度ピークの残りよりも高振幅を示し、その後の速度ピークよりも大きかった(図9)。
細胞質内運動を開始させるのに機能的な精子タンパク質が必要である
細胞質内速度ピークおよびCa2+振動の両方において精子それ自体またはFCのいずれかによってなされる相対的な寄与をさらに特徴付けるために、我々は、卵の皮質の直下または細胞の中心のいずれかに精子を直接注入した。FC形成は精子クロマチンと皮質アクチンとの相互作用に依存し、さらに距離に依存するために33、FCは、注入された卵の前者のグループにのみ形成された。いずれのケースにおいても、注入された精子は、Ca2+振動および卵の活性化をもたらした。しかしながら、FCを形成した卵ではCa2+一過性上昇の97%(101/104)が速度ピークを伴うのに対して(n=17、図4A)、FCがない卵では、Ca2+一過性上昇の71%(207/290)が速度ピークを示した(n=35;図4B)。重要なことには、速度ピークの平均振幅は、FCがない卵の平均振幅よりも有意に低かったが、それに対してFCを有する卵では、振幅は、自然に受精した卵の振幅と類似していた(図4AB、表1、3)。しかしながら、前核形成中の速度ピークおよび全てのステージからの事後運動の平均振幅は、両方のグループにおいて類似していたことから(表3)、これらの特定の運動のメカニズムはFCとは無関係である可能性があることが示唆される。
細胞質内運動は、胚の生命力の指標を提供する
我々が、細胞質内運動がCa2+振動のパターンと細胞骨格の品質とに関連することを見出してから、我々は、このような運動の解析により発生の成功を予測することができるのかどうかについて興味を持った。これに取り組むために、我々は、71個の卵を体外受精させ、FCが存在する期間中ずっとそれらの細胞質内運動を記録し、続いて胚を4日間培養した。まず第一に、我々は、各胚中の細胞質内運動のパターンと、そのステージでの細胞総数とを関連付けた。このから、速度ピーク間の平均インターバルの様々な値について、平均基底速度と、胚中の細胞数との間に統計学的に有意な線形および二次効果があったこと(それぞれp=0.0005および0.0001)が明らかになった(対数スケールで;図5C)。発生4日目における平均細胞数は、横ばい状態かまたは減少した後に、平均基底速度(平均基底速度値12.2nm/秒の平均から最大1.7の標準偏差(SD=6.7nm/秒))で増加した(図5A、C)。さらに、平均基底速度の様々な値またはその二乗について、発生4日後の平均細胞数は、速度ピーク間の平均インターバルに比例して増加した(1SD毎に、すなわちおよそ7分毎に1.3倍高い(95%CI:1.07〜1.47);p=0.0045、図5B、D)。我々は、胚盤胞期まで発達する確率を評価することによって発生の成功を調べたところ、同様の発見が観察された(図13A)。この解析から、平均基底速度(p=0.009)と、発生4日後に胚が胚盤胞期に達する確率の対数とは線形的な関係を有することが示唆される:胚盤胞まで発達する確率は、平均基底速度が増加するにつれて増加する。さらに我々は、1SD毎に速度ピーク間の平均インターバルが増加するにつれて、胚が胚盤胞まで発達する確率は、2.3倍増加する(95%CI:1.10〜4.89;p=0.027)(図13B)ことを見出した。
ヒト卵母細胞においてPLCζによって誘導されたCa 2+ 振動は、同調する細胞質内運動を引き起こす。
ヒト卵母細胞
ウェールズ大学病院(University Hospital of Wales)、カーディフのIVFウェールズクリニックで、患者からヒト卵母細胞の提供を受けた。現行のプロジェクトおよび関連する全ての手法は、南東ウェールズ研究倫理委員会(South East Wales Research Ethics Committee)およびヒトの受精および胚研究認可局(Human Fertilisation and Embryology Authority)で承認されている(R0161、K.SwannおよびN.Amsoの管理下)。老化した「ICSI不能の」卵母細胞および卵胞の減数分裂過程から誘導された新鮮な卵母細胞を用いた。標準条件下でICSIを行い、卵母細胞をさらに16〜18時間培養した後、それらが受精したかまたは受精していないかを判断した。「新鮮な卵母細胞」は卵胞の減数分裂から誘導され、回収してから5時間以内に用いた。活性化されていないと確認された卵母細胞だけを実験に用いた。その後の1〜4時間の間に、これらの卵母細胞をクリニックから研究所に移し、そこで上述したようにして卵母細胞に約10〜20plのヒトPLCζのcRNAをマイクロインジェクションした54,55。簡単に言えば、cRNAを、Ca2+感受性色素の0.5mMオレゴングリーンBAPTAデキストラン(OGBD、インビトロジェン)と混合した。次にこの混合物を、マイクロピペットを用いてマイクロインジェクションした(約1μMのチップ直径)。マイクロピペットの針と同じラインに連結された増幅器からの短い電気振動のパルスを利用して、マイクロピペットを卵母細胞に挿入した。次に、マイクロピペット後部に圧力パルス(20psiで約1秒間)をかけて、注入混合物の1回適用量を卵母細胞に押し出した。cRNAを、Ca2+感受性色素の0.5mMオレゴングリーンBAPTAデキストラン(OGBD、インビトロジェン)と混合した。PLCζのcRNAを上述したようにして調製した54。データ回収中に、CL−100温度制御装置(ワーナー・インスツルメンツ(Warner Instruments))を備えたシリーズ40クイック・チェンジ(Quick Change)イメージングチャンバーを用いて、卵母細胞を油で覆った培地の液滴中で37℃に維持した。M2培地(シグマ)中で卵母細胞をマイクロインジェクションし、続いて以前に説明されているようにしてHEPESで緩衝化したKSOM培地中で記録をとった59。
マイクロインジェクション後に、卵母細胞または接合体を、ニコン(Nikon)のTiU落射型顕微鏡(対物20×0.75NA)を用いて数時間にわたり画像化した。490nmのバンドパスフィルターにハロゲンランプからの蛍光励起を通過させ、505nmのダイクロイックで反射させ、530nmのバンドパスフィルターで回収した。その他のハロゲンランプからの白色光を用いて、卵母細胞を微分干渉位相コントラスト(DIC)顕微鏡で可視化した。これらの光源の軌道にシャッターを置き、フィルターのホイールを蛍光励起および放出光の両方の軌道上に置いて、画像獲得中に卵母細胞が光に晒される時間がごく短くなるようにした。シャッターおよびフィルターホイールをラムダ−10(Lambda-10)制御器(サッター・インスツルメンツ(Sutter Instruments))によって制御した。クールスナップHQ2(Coolsnap HQ2)CCDカメラ(フォトメトリクス(Photometrics))を用いて、10秒毎に高速で連続的に100〜200ミリ秒の曝露で画像を取った。インビボ(InVivo)ソフトウェア(メディア・サイバーネティックス(Media Cybernetics))用いて、ラムダ−10、画像回収、および最初の解析を制御し、画像をtiffの積層画像として保存した。
ICSI後に活性化できなかったヒト卵母細胞へのPLCζのcRNAのマイクロインジェクションにより、図6Aで説明された持続的な一連のCa2+振動が起こった。遊離Ca2+上昇を示すスパイクの特定のパターンは卵母細胞間で多少の違いが示されたが、全般的な応答は、最初の大きいCa2+増加、それに続いて、時間が経つに連れて次第に頻度が増加する一連のそれより小さいCa2+一過性上昇からなっていた。この全般的なCa2+振動パターンは、PLCζのcRNA55が注入されたヒト卵母細胞で以前に報告されたパターンに類似している。cRNA注入(記録開始の15〜20分前)からCa2+スパイクの最初の出現への比較的長い潜伏時間、およびその後のCa2+スパイク頻度の上昇は恐らく、時間経過によるPLCζタンパク質発現の段階的な増加を反映しており、これは、これまでにもPLCζのルシフェラーゼタグを有する融合コンストラクトで経験的に実証されている54、60〜62。
ここで説明された受精後における細胞質内現象の、非侵襲的な急速なタイムラプスイメージングとPIV解析との併用により、マウス卵への精子の侵入が、細胞質内運動と関連する一連の予測外の周期的なアクトミオシン収縮を誘発させることが明らかになる。その最大速度において、これらの細胞質内運動により、同調して拍動を受ける精子の侵入部位の上に形成された突起に向かってベクトルが方向付けられる。細胞質内運動の速度ピークは、受精によって誘導されたCa2+一過性上昇とタイミングが一致しており、さらにカルシウム振動に依存する。我々は、ピーク間インターバルの解析は、非侵襲的で極めて迅速な、胚の生命力およびその発生を進行させる能力を評価する新規の方法を提供することを示す。
上述した詳細な説明は、当業者により本発明が実施可能になるのに十分であるとみなされる。実施例は本発明の一形態の単なる説明を目的としているため、本発明は示された実施例に限定されることはなく、その他の機能的に同等な実施態様は本発明の範囲内である。本明細書において示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
本発明の各実施態様に、本発明の利点および目的が包含されていなくてもよい。
1. Roegiers, F., McDougall, A. & Sardet, C. The sperm entry point defines the orientation of the calcium-induced contraction wave that directs the first phase of cytoplasmic reorganization in the ascidian egg. Development 121, 3457-3466 (1995).
2. Sardet, C., Paix, A., Prodon, F., Dru, P. & Chenevert, J. From oocyte to 16-cell stage: cytoplasmic and cortical reorganizations that pattern the ascidian embryo. Dev Dyn 236, 1716-1731 (2007).
3. Speksnijder, J.E., Sardet, C. & Jaffe, L.F. The activation wave of calcium in the ascidian egg and its role in ooplasmic segregation. J Cell Biol 110, 1589-1598 (1990).
4. Stack, C., Lucero, A.J. & Shuster, C.B. Calcium-responsive contractility during fertilization in sea urchin eggs. Dev Dyn 235, 1042-1052 (2006).
5. Weaver, C. & Kimelman, D. Move it or lose it: axis specification in Xenopus. Development 131, 3491-3499 (2004).
6. Gerhart, J. et al. Cortical rotation of the Xenopus egg: consequences for the anteroposterior pattern of embryonic dorsal development. Development 107 Suppl, 37-51 (1989).
7. Abbott, A.L. & Ducibella, T. Calcium and the control of mammalian cortical granule exocytosis. Front Biosci 6, D792-806 (2001).
8. FitzHarris, G., Marangos, P. & Carroll, J. Cell cycle-dependent regulation of structure of endoplasmic reticulum and inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release in mouse oocytes and embryos. Mol Biol Cell 14, 288-301 (2003).
9. Sun, Q.Y. et al. Translocation of active mitochondria during pig oocyte maturation, fertilization and early embryo development in vitro. Reproduction 122, 155-163 (2001).
10. Ducibella, T. & Fissore, R. The roles of Ca2+, downstream protein kinases, and oscillatory signaling in regulating fertilization and the activation of development. Dev Biol 315, 257-279 (2008).
11. Tombes, R.M., Simerly, C., Borisy, G.G. & Schatten, G. Meiosis, egg activation, and nuclear envelope breakdown are differentially reliant on Ca2+, whereas germinal vesicle breakdown is Ca2+ independent in the mouse oocyte. J Cell Biol 117, 799-811 (1992).
12. Toth, S., Huneau, D., Banrezes, B. & Ozil, J.P. Egg activation is the result of calcium signal summation in the mouse. Reproduction 131, 27-34 (2006).
13. Ozil, J.P. et al. Egg activation events are regulated by the duration of a sustained [Ca2+]cyt signal in the mouse. Dev Biol 282, 39-54 (2005).
14. Ducibella, T. et al. Egg-to-embryo transition is driven by differential responses to Ca(2+) oscillation number. Dev Biol 250, 280-291 (2002).
15. Ozil, J.P., Banrezes, B., Toth, S., Pan, H. & Schultz, R.M. Ca2+ oscillatory pattern in fertilized mouse eggs affects gene expression and development to term. Dev Biol 300, 534-544 (2006).
16. Ozil, J.P. & Huneau, D. Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca2+ signal regime on development. Development 128, 917-928 (2001).
17. Maro, B., Johnson, M.H., Pickering, S.J. & Flach, G. Changes in actin distribution during fertilization of the mouse egg. J Embryol Exp Morphol 81, 211-237 (1984).
18. Maro, B., Johnson, M.H., Webb, M. & Flach, G. Mechanism of polar body formation in the mouse oocyte: an interaction between the chromosomes, the cytoskeleton and the plasma membrane. J Embryol Exp Morphol 92, 11-32 (1986).
19. Gray, D. et al. First cleavage of the mouse embryo responds to change in egg shape at fertilization. Curr Biol 14, 397-405 (2004).
20. Deguchi, R., Shirakawa, H., Oda, S., Mohri, T. & Miyazaki, S. Spatiotemporal analysis of Ca(2+) waves in relation to the sperm entry site and animal-vegetal axis during Ca(2+) oscillations in fertilized mouse eggs. Dev Biol 218, 299-313 (2000).
21. Raffel, M., Willert, C.E. & Kompenhans, J. (Springer, 1998).
22. Willert, C.E. & Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Exp Fluids 10, 181-193 (1991).
23. Keane, R.D. & Adrian, R.J. Theory of cross-correlation analysis of PIV images. Appl Sci Res 49, 191-215 (1992).
24. Westerweel, J. Fundamentals of digital particle image velocimetry. Measurement Science and Technology 8, 1379-1392 (1997).
25. Simerly, C., Nowak, G., de Lanerolle, P. & Schatten, G. Differential expression and functions of cortical myosin IIA and IIB isotypes during meiotic maturation, fertilization, and mitosis in mouse oocytes and embryos. Mol Biol Cell 9, 2509-2525 (1998).
26. Schuh, M. & Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Curr Biol 18, 1986-1992 (2008).
27. Tinevez, J.Y. et al. Role of cortical tension in bleb growth. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18581-18586 (2009).
28. Deng, M., Williams, C.J. & Schultz, R.M. Role of MAP kinase and myosin light chain kinase in chromosome-induced development of mouse egg polarity. Dev Biol 278, 358-366 (2005).
29. Swann, K. & Ozil, J.P. Dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation. Int Rev Cytol 152, 183-222 (1994).
30. Kline, D. & Kline, J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev Biol 149, 80-89 (1992).
31. Furuta, A. et al. Microtubule disruption with BAPTA and dimethyl BAPTA by a calcium chelation-independent mechanism in 3T3-L1 adipocytes. Endocr J 56, 235-243 (2009).
32. Xu, N., Luo, K.Q. & Chang, D.C. Ca2+ signal blockers can inhibit M/A transition in mammalian cells by interfering with the spindle checkpoint. Biochem Biophys Res Commun 306, 737-745 (2003).
33. Deng, M., Suraneni, P., Schultz, R.M. & Li, R. The Ran GTPase mediates chromatin signaling to control cortical polarity during polar body extrusion in mouse oocytes. Dev Cell 12, 301-308 (2007).
34. Halet, G., Tunwell, R., Parkinson, S.J. & Carroll, J. Conventional PKCs regulate the temporal pattern of Ca2+ oscillations at fertilization in mouse eggs. J Cell Biol 164, 1033-1044 (2004).
35. Markoulaki, S., Matson, S. & Ducibella, T. Fertilization stimulates long-lasting oscillations of CaMKII activity in mouse eggs. Dev Biol 272, 15-25 (2004).
36. Markoulaki, S., Matson, S., Abbott, A.L. & Ducibella, T. Oscillatory CaMKII activity in mouse egg activation. Dev Biol 258, 464-474 (2003).
37. Shawlot, W., Deng, J.M., Fohn, L.E. & Behringer, R.R. Restricted beta-galactosidase expression of a hygromycin-lacZ gene targeted to the beta-actin locus and embryonic lethality of beta-actin mutant mice. Transgenic Res 7, 95-103 (1998).
38. Shmerling, D. et al. Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. Genesis 42, 229-235 (2005).
39. Bunnell, T.M. & Ervasti, J.M. Delayed embryonic development and impaired cell growth and survival in Actg1 null mice. Cytoskeleton (Hoboken) 67, 564-572.
40. Scott, L. Embryological strategies for overcoming recurrent assisted reproductive technology treatment failure. Hum Fertil (Camb) 5, 206-214 (2002).
41. Bromer, J.G. & Seli, E. Assessment of embryo viability in assisted reproductive technology: shortcomings of current approaches and the emerging role of metabolomics. Curr Opin Obstet Gynecol 20, 234-241 (2008).
42. Scott, L. The biological basis of non-invasive strategies for selection of human oocytes and embryos. Hum Reprod Update 9, 237-249 (2003).
43. Wong, C.C. et al. Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotechnol 28, 1115-1121.
44. Plusa, B. et al. Downregulation of Par3 and aPKC function directs cells towards the ICM in the preimplantation mouse embryo. J Cell Sci 118, 505-515 (2005).
45. Fraser, L. Ca2+ is required for mouse sperm capacitation and fertilization in vitro. J Androl 3, 412-419 (1982).
46. Kamm, K.E. & Stull, J.T. Dedicated myosin light chain kinases with diverse cellular functions. J Biol Chem 276, 4527-4530 (2001).
47. Sveen, J. An introduction to MatPIV v.1.6.1. Mechanics and Applied Mathematics 27 (2004).
48. Westerweel, J. Theoretical analysis of the measurement precision in particle image velocimetry. Exp Fluids 29, S3-S12 (2000).
49. Kimura, Y. & Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 52, 709-720 (1995).
50. Meilhac, S.M. et al. Active cell movements coupled to positional induction are involved in lineage segregation in the mouse blastocyst. Dev Biol 331, 210-221 (2009).
51. Lawless, J. Negative binomial and mixed Poisson regression. Canadian Journal of Statistics 15, 209-225 (1987).
52. Saunders CM, Larman MG, Parrington J, Cox LJ, Royse J,
Blayney LM, Swann K, Lai FA. PLCζ: a sperm-specific trigger of Ca2+ oscillations in eggs and embryo development. Development 2002;129:3533-3544.
53. Swann K, Saunders CM, Rogers N, Lai FA. PLCζ (zeta): A sperm protein that triggers Ca2+ oscillations and egg activation in mammals. Sem Cell & Dev. Biol. 2006;17:264-73.
54. Yu Y, Saunders CM, Lai FA, Swann K. Preimplantation development of mouse oocytes activated by different levels of human phospholipase Czeta. Hum Reprod 2008;23:365-373.
55. Rogers NT, Hobson E, Pickering S., Lai FA, Braude P, Swann K. PLCζ causes Ca2+ oscillations and parthenogenetic activation of human oocytes. Reproduction 2004;128:697-702.
56. Yoneda A, Kashima M, Yoshida S, Terada K, Nakagwa S, Sakamoto A, Hayakawa K, Suzuki K, Ueda J, Watanabe,T. Molecular cloning, testicular expression and oocyte activation potential of porcine phospholipase C zeta. Reproduction 2006;132:393-401.
57. Ross PJ, Beyhan Z, Iager AE, Yoon SY, Schellander K, Fissore RA, Cibelli JB. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol 2008;8:16.
58. Ajduk A, Ilozue T, Windsor S, Yu Y, Seres KB, Bomphrey RJ, Tom BD, Swann K, Thomas A, Graham C, Zernicka-Goetz M. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nature Commun 2011;2:417.
59. Summers MC, Bhatnagar PR, Lawitts JA, Biggers JD. Fertilization in vitro of mouse ova from inbred and outbred strains: complete preimplantation embryo development in glucose-supplemented KSOM. Biol Reprod 1995;53:431-7.
60. Nomikos M, Blayney LM, Larman MG, Campbell K, Rossbach A, Saunders CM, Swann K, Lai FA. Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations. J Biol Chem. 2011:280:31011-31018.
61. Nomikos M, Elgmati K, Theodoridou M, Calver BL, Cumbes B, Nounesis G, Swann K, Lai FA. Male infertility-linked point mutation disrupts the Ca2+ oscillation-inducing and PIP(2) hydrolysis activity of sperm PLCzeta. Biochem J 2011;434:211-217.
62. Nomikos M, Elgmati K, Theodoridou M, Calver BL, Nounesis G, Swann K, Lai FA. Phospholipase Cζ binding to PtdIns(4,5)P2 requires the XY-linker region. J Cell Sci 2011;124:2582-90.
Claims (17)
- 哺乳動物の単一細胞胚の発生能を評価するインビトロの方法であって、該方法は、
(a)1細胞期における胚中の細胞質内運動および/または1細胞期における胚の受精丘の拍動(FCの拍動)の間のインターバルを測定すること、および
(b)その測定値を用いて、胚の発生能を予測すること
を含み、
細胞質内運動の測定が、1細胞期における胚中の平均細胞質内速度の測定、または1細胞期における胚中の2つの連続した速度ピーク間のインターバルの測定から選択される、上記方法。 - 速度ピーク間もしくはFCの拍動間の、より長いインターバルまたはより長い平均インターバルが、より優れた発生能の予測と相関する、請求項1に記載の方法。
- 速度ピーク間もしくはFCの拍動間のインターバルまたは平均インターバルと、1つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって、前記胚の発生能が予測される、請求項2に記載の方法。
- 前記平均細胞質内速度が、記録された最初の速度ピークの前、速度ピークの間で、および/または記録された最後の速度ピークの後に測定され、ここで平均速度は経時的に計算され、それにより計算された速度が、平均基底細胞質内速度である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- より速い平均基底細胞質内速度が、より優れた発生能の予測と相関し、および場合により、前記胚の発生能が、平均基底細胞質内速度と、1つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって予測される、請求項4に記載の方法。
- 前記単一細胞胚が、受精と前核の形成との間の発生ステージにある、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 測定を行うことが、タイムラプス画像の捕捉、それに続く定量的な画像解析を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚が培地の小液滴中に保持された状態で画像化される、請求項7に記載の方法。
- 前記画像の捕捉が、受精の4時間以内に完了する、請求項7または請求項8に記載の方法。
- (i)前記定量的な画像解析が、粒子画像速度測定法(PIV)を使用する;および/または
(ii)前記測定が、非侵襲的になされる;および/または
(iii)前記測定が、胚中に細胞内色素の非存在下でなされる;および/または
(iv)前記測定が、細胞骨格の機能に干渉することなくなされる;および/または
(v)前記測定が、受精丘の形成に干渉することなくなされる;および/または
(vi)前記発生能を予測することが、胚が胚盤胞期まで発達すると予測される確率を決定することを含む;および/または
(vii)前記発生能が、その後の培養における胚の細胞分裂の速度を含む;および/または
(viii)前記発生能が、その後の4日の培養後に生じると予測される胚中の細胞数を含む;および/または
(ix)前記発生能を予測することが、胚が母となるレシピエントに移植された後に臨月まで発達すると予測される確率を決定することを含む;および/または
(x)前記方法が、受精の24時間以内に完了する;および/または
(xi)前記方法が、受精の4時間以内に完了する;および/または
(xii)前記胚の発生能を評価するのに、胚中の細胞質内運動および/または受精丘の拍動の測定値だけが使用される
請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記胚が、さらに培養される、および場合により前記胚の発生能を評価するのに、培養中の前記胚の発生の程度および/または形態がさらに使用される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物の胚が、(i)ヒト以外の哺乳動物の胚である、(ii)マウス胚である、(iii)家畜の胚である、または(iv)ヒト胚である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト以外の哺乳動物の卵を受精させること、および請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って結果得られた胚の発生能を評価することを含む、体外受精方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従ってヒト以外の哺乳動物の胚の発生能を評価すること、および胚を母となるレシピエントに移植することを含む、補助繁殖方法。
- 複数の胚から1個またはそれより多くのヒト以外の哺乳動物の胚を選択する方法であって、該方法は、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って各胚の発生能を評価すること、およびそれらの予測された発生能に基づいて1個またはそれより多くの胚を選択することを含む、上記方法。
- 胚の集合体中の1個またはそれより多くのヒト以外の哺乳動物の胚を発生能に従って格付けする方法であって、該方法は、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法に従って集合体中の各胚の発生能を評価すること、およびその予測された発生能に基づいて各胚を格付けすること、および場合により、予測された発生能に基づいて複数の胚から1個またはそれより多くの胚を選択することをさらに含む、
上記方法。 - 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を行うための装置であって、該装置は、胚のタイムラプス画像を捕捉するための1個またはそれより多くのセンサーと、少なくとも1つの該センサーと連携する少なくとも1個のプロセッサーとを含み、ここで該プロセッサーは、前記画像を捕捉し、該画像が胚の発生能の予測値に変換されるように、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を実施するためのコンピューターで読取り可能なインストラクションでプログラム化されており、
さらに前記装置は、
(i)前記胚の温度および/またはpH曝露を制御するための人工気候室;および/または
(ii)胚の温度を制御するための加熱台
を含み、そして、1個またはそれより多くの前記センサーが、白色の透過光を使用してタイムラプス画像を捕捉するように配置されている、上記装置。
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