JP6098973B2

JP6098973B2 - Functional food containing γ-oryzanol and anti-diabetes medicine

Info

Publication number: JP6098973B2
Application number: JP2013009341A
Authority: JP
Inventors: 裕章益崎; 浩市屋比久; 智沙代小塚
Original assignee: University of the Ryukyus
Current assignee: University of the Ryukyus
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: JP2014141423A

Description

本発明は、中枢神経を介さずに膵臓に直接作用して、小胞体ストレスの亢進及びグルカゴンの分泌を抑制し、さらにインスリンの分泌を促進することができる、γ−オリザノールを有効成分とするヒトまたは動物用の医薬及び機能性食品に関する。 The present invention relates to a human comprising γ-oryzanol as an active ingredient, which acts directly on the pancreas without involving the central nervous system, suppresses increased endoplasmic reticulum stress and glucagon secretion, and further promotes insulin secretion. Or it relates to pharmaceuticals for animals and functional foods.

近年、食習慣の欧米化を背景に、肥満症や、２型糖尿病といわれる糖尿病が、世界的規模で増加の一途をたどっており、大きな社会問題となっている。
特に、２型糖尿病患者においては、膵β細胞量が減少していることが明らかにされ、この膵β細胞量の低下の一因として、小胞体ストレスによる細胞死（アポトーシス）が注目されている。
膵β細胞は、膵臓のランゲルハンス島にある細胞であり、血中グルコース濃度の上昇により、血糖量を低下させるホルモンであるインスリンを分泌することで知られているが、インスリンが多量に産生される膵β細胞では、異常な立体構造をとる不良品（変性タンパク質）が産生されることがあり、これが小胞体に蓄積すると、小胞体ストレスと呼ばれる状態を引き起こす。
細胞は、小胞体ストレス応答とよばれる適応反応により対処するが、変性タンパク質が過剰に蓄積し、小胞体ストレスの強さが細胞の回避機能を越えると、細胞死が誘導される。
このようにして、膵β細胞が多数失われる結果、インスリン分泌量が低下し、糖尿病を発症する危険性が高まることから、糖尿病の症状を改善するには、膵β細胞における小胞体ストレス亢進を抑制して、膵β細胞を細胞死から保護し、個々の膵β細胞が含有するインスリン量を積極的に増加させることが有効である。
しかしながら、糖尿病患者の９０％以上を占めるといわれている２型糖尿病に対して、これまで多くの治療薬が開発されてきてはいるものの、十分な臨床結果が得られていないものや、精神症状や心臓に対する副作用を引き起こすものなどがあることから、抗肥満、抗糖尿病作用を発揮する安全性と有効性が保障された天然食品由来の物質の探求が強く求められていた。 In recent years, against the background of westernization of eating habits, obesity and diabetes called type 2 diabetes are steadily increasing on a global scale, which is a major social problem.
In particular, in patients with type 2 diabetes, it has been clarified that the amount of pancreatic β cells is decreased, and cell death (apoptosis) due to endoplasmic reticulum stress has attracted attention as a cause of the decrease in the amount of pancreatic β cells. .
Pancreatic β-cells are cells on the islet of Langerhans in the pancreas and are known to secrete insulin, a hormone that lowers blood glucose levels by increasing blood glucose levels, but a large amount of insulin is produced Pancreatic β cells may produce defective products (denatured proteins) that have an abnormal three-dimensional structure, and when this accumulates in the endoplasmic reticulum, it causes a state called endoplasmic reticulum stress.
Cells deal with an adaptive response called the endoplasmic reticulum stress response, but when the denatured protein accumulates excessively and the strength of the endoplasmic reticulum stress exceeds the avoidance function of the cell, cell death is induced.
In this way, the loss of a large number of pancreatic β cells results in a decrease in the amount of insulin secretion and an increased risk of developing diabetes. It is effective to suppress and protect pancreatic β cells from cell death and to actively increase the amount of insulin contained in each pancreatic β cell.
However, for type 2 diabetes, which is said to account for more than 90% of diabetic patients, many therapeutic agents have been developed so far, but sufficient clinical results have not been obtained, and psychiatric symptoms There is a strong demand for the search for substances derived from natural foods that are safe and effective to exert anti-obesity and anti-diabetic effects.

ところで、沖縄県では、玄米を粥状にして黒糖などで風味を付けたものを飲むなど、古くから玄米を食する習慣があるが、この玄米が血糖値の上昇を抑制することは、従来から知られていた（例えば、特許文献１）。
また、高脂肪食を摂取すると、摂食中枢である視床下部での小胞体ストレスと呼ばれる代謝ストレスが高まり、高脂肪食への依存性がさらに高まることも、従来から知られていた。
そこで、本発明者らは、この玄米に多く含まれるγ−オリザノールに着目し、γ−オリザノールが、高脂肪食習慣によって視床下部で亢進する小胞体ストレスを低下させ、高脂肪食への依存性を軽減させることを明らかにした（非特許文献１）。
γ−オリザノールを摂取することで、高脂肪食への依存性が軽減される結果、低脂肪食を選ぶようになり、血糖値が低下したり、体重が軽減することが期待できるのである。 By the way, in Okinawa Prefecture, there has been a custom of eating brown rice for a long time, such as drinking brown rice with a flavor of brown sugar and so on, but this brown rice has traditionally suppressed the increase in blood sugar levels. It was known (for example, Patent Document 1).
It has also been conventionally known that when a high-fat diet is ingested, metabolic stress called endoplasmic reticulum stress in the hypothalamus, which is the feeding center, increases and the dependence on the high-fat diet further increases.
Therefore, the present inventors paid attention to γ-oryzanol contained in a large amount in this brown rice, and γ-oryzanol reduces endoplasmic reticulum stress that is enhanced in the hypothalamus by high fat diet habits, and is dependent on high fat diet. It has been clarified that this can be reduced (Non-patent Document 1).
As a result of taking γ-oryzanol, the dependence on a high-fat diet is reduced. As a result, a low-fat diet is selected, and it can be expected that the blood sugar level is lowered and the weight is reduced.

そして、本発明者らは、さらにγ−オリザノールについて鋭意研究を行った結果、次のことを明らかにした。
（１）γ−オリザノールは、膵β細胞における小胞体ストレスの亢進を抑制することで、これを原因とする膵β細胞の細胞死を抑制し、膵β細胞の新生または再生を促し、インスリン分泌能を高め、インスリン分泌の低下を抑制する。
（２）γ−オリザノールは、中枢神経を介すことなく、膵β細胞に直接的に作用して、インクレチンに依存することなく、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ回路を経由して、グルコース応答性のインスリン分泌を促進する。
（３）γ−オリザノールは、膵α細胞からのグルカゴンの分泌を抑制する。
なお、特許文献１には、玄米食による血糖値の上昇抑制とともに、インスリンの分泌抑制の効果が書かれているが、本発明者らによる前記知見は、これに反する。 As a result of further intensive studies on γ-oryzanol, the present inventors have clarified the following.
(1) γ-Oryzanol suppresses the increase of endoplasmic reticulum stress in pancreatic β cells, thereby suppressing the death of pancreatic β cells caused by this, promoting the neoplasia or regeneration of pancreatic β cells, and insulin secretion Enhances the ability to suppress the decrease in insulin secretion.
(2) γ-oryzanol acts directly on pancreatic β cells without going through the central nervous system, and does not depend on incretin, but via the cAMP-PKA circuit, glucose-responsive insulin secretion. Promote.
(3) γ-oryzanol suppresses secretion of glucagon from pancreatic α cells.
In addition, although patent document 1 describes the effect of suppressing the secretion of insulin as well as suppressing the increase in blood glucose level by brown rice diet, the above findings by the present inventors are contrary to this.

特開２００５−１１０５８３公報JP 2005-110583 A

益崎裕章、外１４名、「Brown Rice and Its Component,g-Oryzanol,Attenuate the Preference for High-Fat Diet by Decreasing Hypothalamic Endoplasmic Reticulum Stress in Mice」、米国糖尿病学会（American Diabetes Association）、Diabetes誌、平成２４年１２月、ＶＯＬ６１Hiroaki Masaki, 14 others, “Brown Rice and Its Component, g-Oryzanol, Attenuate the Preference for High-Fat Diet by Decreasing Hypothalamic Endoplasmic Reticulum Stress in Mice”, American Diabetes Association, Diabetes, 2012 December, VOL61

従来、γ−オリザノールが、前記（１）乃至（３）の知見のように作用することは知られていなかった。
そこで、本発明は、膵島細胞における小胞体ストレスの亢進及びグルカゴンの分泌を抑制し、膵β細胞におけるインスリンの分泌を促進することができる、γ−オリザノールを有効成分とするヒトまたは動物用の医薬及び機能性食品を提供することを課題とする。 Conventionally, it has not been known that γ-oryzanol acts like the findings of (1) to (3) above.
Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical for humans or animals comprising γ-oryzanol as an active ingredient, which can suppress the increase of endoplasmic reticulum stress and the secretion of glucagon in pancreatic islet cells and promote the secretion of insulin in pancreatic β cells. And providing functional foods.

本発明者らは、上記課題を解決する手段として、次の発明をなした。
（１）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物の膵β細胞において小胞体ストレスの亢進を抑制するための医薬。
（２）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物の膵β細胞において小胞体ストレスが生じることによって発現するChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)のいずれか１以上の遺伝子の発現を抑制するための医薬。
（３）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物の小胞体ストレス亢進を原因とする膵β細胞の細胞死を抑制するためのアポトーシス抑制剤。
（４）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物の膵β細胞の新生または再生を促進するための医薬。
（５）ヒトまたは動物の膵臓に局所投与することによる、前記（１）乃至（４）のいずれかの医薬。
（６）ヒトまたは動物に１日２０μｇ／g体重以上を経口投与することを特徴とする、前記（１）乃至（５）のいずれかの医薬。
（７）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物用のインスリン分泌促進剤。
（８）ヒトまたは動物の膵臓に局所投与することによる、前記のインスリン分泌促進剤。
（９）ヒトまたは動物に１日２０μｇ／g体重以上を経口投与することを特徴とする、前記（７）または（８）のインスリン分泌促進剤。
（１０）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物用のグルカゴン分泌抑制剤。
（１１）ヒトまたは動物の膵臓に局所投与することによる、前記のグルカゴン分泌抑制剤。
（１２）ヒトまたは動物に１日２０μｇ／g体重以上を経口投与することを特徴とする、前記（１０）または（１１）のグルカゴン分泌抑制剤。
（１３）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物用の血糖値上昇抑制剤。
（１４）γ−オリザノールを有効成分とする、ヒトまたは動物用の糖尿病治療薬。
（１５）ヒトまたは動物の膵臓に局所投与することによる前記（１３）または（１４）の医薬。
（１６）ヒトまたは動物に１日２０μｇ／g体重以上を経口投与することを特徴とする前記（１３）乃至（１５）の医薬。
（１７）γ−オリザノールを含有する、ヒトまたは動物用の機能性食品である。
（１８）γ−オリザノールを含有する、ヒトまたは動物用の食品添加物である。
（１９）γ−オリザノールをヒトまたは動物に投与することにより糖尿病を治療する方法。 The present inventors made the following invention as means for solving the above-mentioned problems.
(1) A medicament for suppressing an increase in endoplasmic reticulum stress in human or animal pancreatic β cells, comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(2) Suppresses expression of one or more genes of Chop, ERdj4, and splice type Xbp1 (Xbp1s) expressed by endoplasmic reticulum stress in human or animal pancreatic β cells containing γ-oryzanol as an active ingredient Medicine to do.
(3) An apoptosis inhibitor for suppressing cell death of pancreatic β cells caused by increased endoplasmic reticulum stress in humans or animals, comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(4) A medicament for promoting the neoplasia or regeneration of human or animal pancreatic β cells, comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(5) The medicament according to any one of (1) to (4) above, which is locally administered to human or animal pancreas.
(6) The medicament according to any one of (1) to (5) above, wherein 20 μg / g body weight or more is orally administered to a human or an animal per day.
(7) A human or animal insulin secretagogue comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(8) The aforementioned insulin secretion promoter by local administration to the pancreas of a human or animal.
(9) The insulin secretion promoter according to (7) or (8) above, wherein 20 μg / g body weight or more is orally administered to a human or an animal per day.
(10) A glucagon secretion inhibitor for humans or animals containing γ-oryzanol as an active ingredient.
(11) The aforementioned glucagon secretion inhibitor, which is locally administered to human or animal pancreas.
(12) The glucagon secretion inhibitor according to the above (10) or (11), wherein 20 μg / g body weight or more is orally administered to a human or an animal per day.
(13) A blood sugar level increase inhibitor for humans or animals, comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(14) A therapeutic drug for diabetes for humans or animals, comprising γ-oryzanol as an active ingredient.
(15) The medicament according to (13) or (14) above, which is locally administered to human or animal pancreas.
(16) The medicament according to the above (13) to (15), wherein 20 μg / g body weight or more per day is orally administered to a human or an animal.
(17) A functional food for humans or animals containing γ-oryzanol.
(18) A food additive for humans or animals containing γ-oryzanol.
(19) A method for treating diabetes by administering γ-oryzanol to humans or animals.

「γ−オリザノール（γ-oryzanol）」は、フェルラ酸とステロールとが縮合したエステル類の総称であり、天然由来のものでは、米（米糠等）から得られる米油から抽出及び精製することができるが、本発明におけるγ−オリザノールは、その由来や抽出方法、精製方法については限定されない。
例えば、天然物から抽出、精製して得られたもの以外でも、その全部もしくは一部が合成して得られたもの、または、市販品を使用したものでも良い。
γ−オリザノールに含まれる成分としては、例えば、フェルラ酸シクロアルテニル（CAF）、24-メチレンシクロアルタニルフェルレート、ベーターシトステリルフェルレート、及びカンペステリルフェルレート等が挙げられ、一般には、γ−オリザノールは、CAF及びその他のフェルラ酸エステル体を含む複数成分からなる。 “Γ-oryzanol” is a general term for esters obtained by condensing ferulic acid and sterol, and naturally derived from rice oil obtained from rice (rice bran, etc.) However, the origin, extraction method, and purification method of γ-oryzanol in the present invention are not limited.
For example, in addition to those obtained by extraction and purification from natural products, those obtained by synthesizing all or part thereof, or those using commercially available products may be used.
Examples of the component contained in γ-oryzanol include cycloartenyl ferulate (CAF), 24-methylenecycloartanyl ferrate, beta-sitosteryl ferrate, campesteryl ferrate, and the like. γ-oryzanol is composed of a plurality of components including CAF and other ferulic acid ester compounds.

本発明における「中枢神経を介さない」とは、中枢神経を介して膵臓に作用する経路によらず、膵臓に直接作用する経路によって、γ−オリザノールが作用することを意味する。
また、γ−オリザノールの作用とは、本発明におけるγ−オリザノールによる効果を意味し、γ−オリザノールが膵臓、膵島、膵β細胞または膵α細胞に直接働きかけて、その効果を生じさせることを意味する。 In the present invention, “not via the central nerve” means that γ-oryzanol acts by a pathway that directly acts on the pancreas, regardless of a pathway that acts on the pancreas via the central nerve.
The action of γ-oryzanol means the effect of γ-oryzanol in the present invention, and means that γ-oryzanol works directly on the pancreas, pancreatic islet, pancreatic β cell or pancreatic α cell to produce the effect. To do.

１）γ−オリザノールは、米糠等から抽出することができるため、天然由来の安全性と有効性が保障された抗肥満作用、抗糖尿病作用を発揮するヒトまたは動物用の医薬を提供できる。 1) Since γ-oryzanol can be extracted from rice bran and the like, it is possible to provide a human or veterinary drug that exhibits anti-obesity and anti-diabetic effects with safety and effectiveness that are naturally derived.

２）γ−オリザノールの、膵β細胞における小胞体ストレス亢進抑制作用、グルコース応答性のインスリン分泌促進作用により、ヒトまたは動物の食後血糖値の上昇を抑制できる。 2) The increase in postprandial blood glucose level in humans or animals can be suppressed by the action of γ-oryzanol to suppress endoplasmic reticulum stress increase in pancreatic β cells and the action of glucose-responsive insulin secretion.

３）γ−オリザノールが、中枢神経を介さずに、膵臓に直接的に作用してインスリン分泌を促進し、血糖値を下げることから、ヒトまたは動物の膵臓に対して直接的な投与または治療が可能になる。 3) Since γ-oryzanol acts directly on the pancreas without going through the central nerve to promote insulin secretion and lower blood glucose level, direct administration or treatment to human or animal pancreas is possible. It becomes possible.

４）γ−オリザノールは、安全性と有効性が保障された天然食品由来であり、経口投与しても効果が得られるものであるため、γ−オリザノールを含有するヒトまたは動物用の機能性食品、食品添加物として利用できる。 4) Since γ-oryzanol is derived from natural foods with guaranteed safety and effectiveness and can be effective even when administered orally, functional food for humans or animals containing γ-oryzanol. Can be used as a food additive.

膵島における小胞体ストレス応答遺伝子の発現レベルを調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the expression level of the endoplasmic reticulum stress response gene in a pancreatic islet. 膵島におけるアポトーシスが起こると発現が上昇する遺伝子の発現率を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the expression rate of the gene which an expression rises when apoptosis in a pancreatic islet occurs. MIN6細胞における小胞体ストレス応答遺伝子の発現レベルを調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the expression level of the endoplasmic reticulum stress response gene in MIN6 cell. 小胞体ストレス亢進後の細胞死を起こしたMIN6細胞の顕微鏡写真である。It is a microscope picture of the MIN6 cell which caused the cell death after endoplasmic reticulum stress enhancement. 図４でした試験の細胞生存率を表すグラフである。It is a graph showing the cell survival rate of the test which was made in FIG. 小胞体ストレスを亢進させた状況下でのMIN6細胞のインスリン分泌量を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the amount of insulin secretion of the MIN6 cell in the condition where endoplasmic reticulum stress was promoted. 小胞体ストレスを亢進させた状況下でのマウスのプロインスリン及びインスリンの分泌量を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the secretion amount of the proinsulin and insulin of the mouse | mouth under the condition where endoplasmic reticulum stress was promoted. 高脂肪食を給餌したマウスの膵島を撮影した顕微鏡写真である。It is the microscope picture which image | photographed the pancreatic islet of the mouse | mouth which fed the high fat diet. 図８の膵島の大きさを表したグラフである。It is a graph showing the size of the islet of FIG. 図８の膵島に占める膵α細胞の割合を表したグラフである。It is a graph showing the ratio of the pancreatic alpha cell which occupies for the islet of FIG. グルコース投与下における膵島のインスリン分泌量を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the amount of insulin secretion of the islet under glucose administration. グルコース投与下におけるMIN6細胞のインスリン分泌量を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the amount of insulin secretion of the MIN6 cell under glucose administration. マウスのブドウ糖負荷試験における血糖値を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the blood glucose level in the glucose tolerance test of a mouse | mouth. マウスのブドウ糖負荷試験におけるインスリン値を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the insulin level in the glucose tolerance test of a mouse | mouth. 迷走神経を切断したマウスのブドウ糖負荷試験における血糖値を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the blood glucose level in the glucose tolerance test of the mouse | mouth which cut | disconnected the vagus nerve. 迷走神経を切断したマウスのブドウ糖負荷試験におけるインスリン値を調べた試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the insulin level in the glucose tolerance test of the mouse | mouth which cut | disconnected the vagus nerve. マウスのブドウ糖負荷試験における血糖値を調べてγ−オリザノールの有効量を確認した試験結果を表すグラフである。It is a graph showing the test result which investigated the blood glucose level in the glucose tolerance test of a mouse | mouth, and confirmed the effective amount of (gamma)-oryzanol. マウスの膵島におけるグルカゴン分泌量を調べた試験結果を表したグラフである。It is the graph showing the test result which investigated the glucagon secretion amount in the pancreatic islet of a mouse | mouth. マウスの血中のグルカゴン分泌量を調べた試験結果を表したグラフである。It is the graph showing the test result which investigated the amount of glucagon secretion in the blood of a mouse | mouth.

γ−オリザノールが、これを含む、もしくは有効成分とする各発明（小胞体ストレス亢進抑制剤、小胞体ストレスが生じることによって発現するChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)のいずれか１以上の遺伝子に対する発現抑制剤、膵β細胞に対するアポトーシス抑制剤、膵β細胞の新生または再生を促進するための医薬、インスリン分泌促進剤、グルカゴン分泌抑制剤、血糖値上昇抑制剤、糖尿病治療薬、機能性食品、食品添加物）として有効であることを、次の各試験結果をもって示す。 Each invention comprising γ-oryzanol or containing it as an active ingredient (one or more genes of endoplasmic reticulum stress enhancement inhibitor, Chop, ERdj4, splice type Xbp1 (Xbp1s) expressed by endoplasmic reticulum stress) Expression inhibitor, anti-apoptotic agent for pancreatic β-cell, drug for promoting neoplasia or regeneration of pancreatic β-cell, insulin secretagogue, glucagon secretion inhibitor, blood sugar level increase inhibitor, antidiabetic agent, functional food The following test results show that it is effective as a food additive).

１．小胞体ストレス抑制効果 1. ER stress suppression effect

（試験１）
膵島において、小胞体ストレスが亢進した際に発現上昇がみられる小胞体ストレス応答遺伝子と呼ばれる遺伝子の発現レベルについて試験した。 (Test 1)
In pancreatic islets, we tested the expression level of a gene called endoplasmic reticulum stress response gene whose expression is increased when endoplasmic reticulum stress is enhanced.

生後８週目のマウス（雄性,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）を３群に分けて、１２週間（生後２０週目まで）、次のＡからＣのとおり給餌した。
Ａ）chow群：通常食（CE-2（日本クレア,東京）、１日８kcal）
Ｂ）HFD-Veh群：高脂肪食（Western diet（Research Diet,New Brunswick,NJ）、１日１１kcal）
Ｃ）HFD-Orz群：高脂肪食（Ｂに同じ）に加え、Orz（γ−オリザノール（和光純薬,大阪）、１日３２０μｇ／ｇ体重）をゾンデを用いて経口投与 8 weeks old mice (male, C57BL / 6J, Charles River Japan Co., Ltd.) were divided into 3 groups and fed for 12 weeks (up to 20 weeks after birth) as A to C below.
A) chow group: normal meal (CE-2 (Claire Japan, Tokyo), 8 kcal per day)
B) HFD-Veh group: high-fat diet (Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ), 11 kcal per day)
C) HFD-Orz group: In addition to high-fat diet (same as B), Orz (γ-oryzanol (Wako Pure Chemicals, Osaka), 320 μg / g body weight per day) was administered orally using a sonde.

「Orz」の語は、本明細書において「γ−オリザノール」の意味で用いている。
また、γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。 The term “Orz” is used herein to mean “γ-oryzanol”.
Further, γ-oryzanol is suspended at a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 cP of 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).

各群のマウスから採取した膵島をもとに、小胞体ストレス応答遺伝子と呼ばれる遺伝子群（Chop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)）の発現レベルを調べた。
遺伝子発現レベルの試験は、TRIzol(登録商標) RNA Isolation Reagents (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA)、iScriptTM cDNA Synthesis Kit (BIO RAD, Hercules, CA, USA)を用いてRNAを抽出し、cDNAを合成した後、StepOnePlus Real-Time PCR Systems及び Fast SYBR(登録商標) Green Master Mix (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA)を使用し、合成したcDNAより遺伝子発現量を比較解析した。 Based on the islets collected from each group of mice, the expression levels of gene groups (Chop, ERdj4, splice type Xbp1 (Xbp1s)) called endoplasmic reticulum stress response genes were examined.
For gene expression level testing, RNA was extracted using TRIzol® RNA Isolation Reagents (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) and iScriptTM cDNA Synthesis Kit (BIO RAD, Hercules, CA, USA). After cDNA synthesis, use StepOnePlus Real-Time PCR Systems and Fast SYBR (registered trademark) Green Master Mix (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) to compare and analyze gene expression levels from the synthesized cDNA did.

結果を表１及び図１（左のグラフからChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)）に示す。
表１中の値は、平均値（ｎ＝６）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 1 and FIG. 1 (from the left graph, Chop, ERdj4, splice type Xbp1 (Xbp1s)).
The values in Table 1 represent mean values (n = 6) ± standard deviation.

HFD-Veh群は、chow群に比べて、いずれの遺伝子も発現が上昇した。
したがって、HFD-Veh群は、高脂肪食を摂食したことによって、膵島の小胞体ストレスが亢進していることが確認できる。
しかし、HFD-Orz群は、HFD-Veh群と同じように高脂肪食を摂食したにもかかわらず、chow群と同程度にまで遺伝子の発現が抑えられている。
したがって、HFD-Orz群は、高脂肪食を摂食したことによって亢進した膵島の小胞体ストレスが、γ−オリザノールによって抑制されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、膵島に対する小胞体ストレスの亢進を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島において小胞体ストレスの亢進を抑制するための医薬として効果があることが認められる。
また、γ−オリザノールが、膵島において小胞体ストレスが生じることによって発現するChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)のいずれか１以上の遺伝子の発現を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 In the HFD-Veh group, the expression of any gene was increased compared to the chow group.
Therefore, it can be confirmed that in the HFD-Veh group, the endoplasmic reticulum stress of the islets is increased by eating a high fat diet.
However, in the HFD-Orz group, gene expression is suppressed to the same extent as in the chow group, despite having a high fat diet in the same way as the HFD-Veh group.
Therefore, in the HFD-Orz group, it can be confirmed that the endoplasmic reticulum stress of pancreatic islets that was enhanced by eating a high fat diet was suppressed by γ-oryzanol.
From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress on the islets.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress in pancreatic islets.
In addition, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a drug for suppressing the expression of one or more genes of Chop, ERdj4, and splice type Xbp1 (Xbp1s) expressed by endoplasmic reticulum stress in pancreatic islets. It is done.

さらに、試験１の膵島に対して、アポトーシスが起こると発現が上昇する遺伝子(Bcl2、Casp3、Casp8、CAD)の各発現率を調べた。 Furthermore, the expression rates of genes (Bcl2, Casp3, Casp8, CAD) whose expression increases when apoptosis occurs in the islets of Test 1 were examined.

結果を表２及び図２（左のグラフからBcl2、Casp3、Casp8、CAD）に示す。
表２中の値は、平均値（ｎ＝６）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 2 and FIG. 2 (from the left graph, Bcl2, Casp3, Casp8, CAD).
The values in Table 2 represent average values (n = 6) ± standard deviation.

HFD-Veh群は、chow群に比べて、いずれの遺伝子も発現率が上昇した。
したがって、HFD-Veh群は、高脂肪食を摂食したことによって亢進した小胞体ストレスが原因として、膵島細胞の細胞死が起きていることが確認できる。
しかし、HFD-Orz群は、HFD-Veh群と同じように高脂肪食を摂食したにもかかわらず、chow群と同程度にしか遺伝子が発現していない。
したがって、HFD-Orz群は、高脂肪食を摂食し、膵島細胞内の小胞体ストレスが亢進したことを原因として生じる膵島細胞の細胞死が、γ−オリザノールによって抑制されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、高脂肪食を摂食して亢進した膵島細胞内の小胞体ストレスを原因として生じる膵島細胞の細胞死を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、小胞体ストレス亢進を原因とする膵島細胞の細胞死を抑制するためのアポトーシス抑制剤として効果があることが認められる。 In the HFD-Veh group, the expression rate of all genes increased compared to the chow group.
Therefore, HFD-Veh group can confirm that cell death of islet cells is caused by endoplasmic reticulum stress enhanced by eating a high fat diet.
However, the HFD-Orz group expressed genes only to the same extent as the chow group, despite having eaten a high-fat diet as in the HFD-Veh group.
Therefore, it can be confirmed that the HFD-Orz group is fed with a high fat diet, and islet cell death caused by increased endoplasmic reticulum stress in the islet cells is suppressed by γ-oryzanol.
From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing cell death of islet cells caused by endoplasmic reticulum stress in pancreatic islet cells enhanced by eating a high fat diet.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as an apoptosis inhibitor for suppressing cell death of islet cells caused by increased endoplasmic reticulum stress.

（試験２）
膵β細胞において、小胞体ストレスが亢進した際に発現上昇がみられる小胞体ストレス応答遺伝子と呼ばれる遺伝子の発現レベルについて試験した。 (Test 2)
In pancreatic β-cells, the expression level of a gene called endoplasmic reticulum stress response gene whose expression was increased when endoplasmic reticulum stress was increased was examined.

マウス膵β細胞由来の培養細胞株MIN6細胞（大阪大学;MTA11-155）に対して、次のＡからＥのとおり、小胞体ストレス惹起剤「tunicamycin(ツニカマイシン)」、γ−オリザノール（Orz）、４−フェニル酪酸（4-PBA）をそれぞれ添加した。
Ａ）Cont群：無添加
Ｂ）Veh群：ツニカマイシン（0.5μｇ／ｍｌ）
Ｃ）Orz0.2群：ツニカマイシン（0.5μｇ／ｍｌ)＋Orz（0.2μｇ／ｍｌ）
Ｄ）Orz2群：ツニカマイシン(0.5μｇ／ｍｌ)＋Orz（2μｇ／ｍｌ）
Ｅ）PBA群：ツニカマイシン(0.5μｇ／ｍｌ)＋4-PBA（５ｍＭ）
γ-オリザノールは、ジメチルスルホキシド（DMSO）(ナカライテスク,京都)に溶かして添加した。 For cultured cell line MIN6 cells derived from mouse pancreatic β cells (Osaka University; MTA11-155), as shown in the following A to E, endoplasmic reticulum stress inducer “tunicamycin”, γ-oryzanol (Orz), 4-Phenylbutyric acid (4-PBA) was added respectively.
A) Cont group: no addition B) Veh group: tunicamycin (0.5 μg / ml)
C) Orz0.2 group: Tunicamycin (0.5 μg / ml) + Orz (0.2 μg / ml)
D) Orz2 group: Tunicamycin (0.5 μg / ml) + Orz (2 μg / ml)
E) PBA group: Tunicamycin (0.5 μg / ml) + 4-PBA (5 mM)
γ-Oryzanol was added after being dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Nacalai Tesque, Kyoto).

各群のMIN6細胞を４時間培養した後、小胞体ストレス応答遺伝子と呼ばれる遺伝子群（Chop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)）の発現レベルを調べた。
遺伝子発現レベルの試験は、TRIzol(登録商標) RNA Isolation Reagents (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA)、iScriptTM cDNA Synthesis Kit (BIO RAD, Hercules, CA, USA)を用いてRNAを抽出し、cDNAを合成した後、StepOnePlus Real-Time PCR Systems及び Fast SYBR(登録商標) Green Master Mix (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA)を使用し、合成したcDNAより遺伝子発現量を比較解析した。 After culturing MIN6 cells of each group for 4 hours, expression levels of gene groups (Chop, ERdj4, splice type Xbp1 (Xbp1s)) called endoplasmic reticulum stress response genes were examined.
For gene expression level testing, RNA was extracted using TRIzol® RNA Isolation Reagents (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) and iScriptTM cDNA Synthesis Kit (BIO RAD, Hercules, CA, USA). After cDNA synthesis, use StepOnePlus Real-Time PCR Systems and Fast SYBR (registered trademark) Green Master Mix (Life technologies, Inc., Carlsbad, CA, USA) to compare and analyze gene expression levels from the synthesized cDNA did.

結果を表３及び図３に示す。
表３中の値は、平均値（ｎ＝７）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 3 and FIG.
The values in Table 3 represent mean values (n = 7) ± standard deviation.

Veh群は、Cont群に比べて、遺伝子発現が上昇した。
したがって、Veh群は、ツニカマイシンを添加することによって、膵β細胞の小胞体ストレスが亢進していることが確認できる。
しかし、PBA群は、Veh群と同じように、ツニカマイシンを添加したにもかかわらず、Veh群に比べて遺伝子の発現が抑えられている。
つまり、PBA群は、ツニカマイシン添加が原因として生じた膵β細胞の小胞体ストレスの亢進が、４−フェニル酪酸によって抑制されていることが確認できる。
もともと４−フェニル酪酸は、小胞体ストレスの亢進を抑制する効果を有することが知られているが、Orz0.2群、Orz2群でも、４−フェニル酪酸を添加したBA群と同様に、Veh群に比べて遺伝子の発現が抑えられている。
したがって、Orz0.2群、Orz2群は、ツニカマイシンの添加が原因として生じた膵β細胞の小胞体ストレスの亢進が、γ−オリザノールによって抑制されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、膵β細胞に対するツニカマイシン添加を原因として生じる小胞体ストレスの亢進を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵β細胞において小胞体ストレスの亢進を抑制するための医薬として効果があることが認められる。
また、γ−オリザノールが、膵β細胞において小胞体ストレスが生じることによって発現するChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)のいずれか１以上の遺伝子の発現を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 In the Veh group, gene expression increased compared to the Cont group.
Therefore, the Veh group can confirm that endoplasmic reticulum stress of pancreatic β cells is enhanced by adding tunicamycin.
However, the expression of genes in the PBA group is suppressed compared to the Veh group, despite the addition of tunicamycin, as in the Veh group.
That is, the PBA group can confirm that the enhancement of endoplasmic reticulum stress of pancreatic β cells caused by the addition of tunicamycin is suppressed by 4-phenylbutyric acid.
Originally, 4-phenylbutyric acid is known to have an effect of suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress, but in the Orz0.2 group and the Orz2 group as well as the BA group to which 4-phenylbutyric acid was added, the Veh group Gene expression is suppressed compared to.
Therefore, the Orz0.2 group and the Orz2 group can confirm that the enhancement of endoplasmic reticulum stress of pancreatic β cells caused by the addition of tunicamycin is suppressed by γ-oryzanol.
From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress caused by the addition of tunicamycin to pancreatic β cells.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress in pancreatic β cells.
In addition, γ-oryzanol is effective as a drug for suppressing the expression of one or more genes of Chop, ERdj4, and splice type Xbp1 (Xbp1s) expressed by endoplasmic reticulum stress in pancreatic β cells. Is recognized.

（試験３）
小胞体ストレス亢進後の細胞死を起こした膵β細胞を観察することで、γ−オリザノールの膵β細胞に対する小胞体ストレス亢進の抑制効果について試験した。 (Test 3)
By observing pancreatic β cells that caused cell death after increased endoplasmic reticulum stress, the effect of γ-oryzanol on the suppression of increased endoplasmic reticulum stress on pancreatic β cells was examined.

各群のMIN6細胞を２４時間培養した後、小胞体ストレスが亢進したことでMIN6細胞がどのくらい細胞死を起こしているか調べた。
Hoechst 33342（Dosindo,熊本県）を培養液中に添加し、３７℃で１５分反応させることで各細胞の核を染色し、クロマチンの凝集を蛍光顕微鏡下で観察、撮影した。
このときの顕微鏡写真を図４に示す。 After culturing MIN6 cells of each group for 24 hours, it was examined how much MIN6 cells caused cell death due to increased endoplasmic reticulum stress.
Hoechst 33342 (Dosindo, Kumamoto Prefecture) was added to the culture solution and reacted at 37 ° C. for 15 minutes to stain the nucleus of each cell, and the aggregation of chromatin was observed and photographed under a fluorescence microscope.
A photomicrograph at this time is shown in FIG.

図４において白く染まって見えるのが細胞である（図４はモノクロのため白く見えるが、実際は青く染まって見えている）。
その中でも、濃い白色（実際は濃い青色）に染まって見えるのが細胞死を起こしている細胞である（傍に白の矢印を打ってあるもの）。
Cont群では細胞死を起こしている細胞が見られないのに対し、Veh群では複数個見られる。
これに対し、Orz0.2群、Orz2群、PBA群では、細胞死を起こしている細胞が見られないか、またはごく僅かである。 In FIG. 4, cells appear to be stained white (FIG. 4 is white because it is monochrome, but it actually appears blue).
Among them, the cells that appear to die are dark white (actually dark blue) (those with white arrows next to them).
In the Cont group, there are no cells that cause cell death, whereas in the Veh group, there are multiple cells.
On the other hand, in the Orz0.2 group, the Orz2 group, and the PBA group, cells causing cell death are not seen or very few.

さらに、このときの細胞生存率を、Cell Count Reagent SF（ナカライテスク,京都）を用いて調べた。
上記培養液中にCell Count Reagent SF試薬を添加し、試薬が生細胞により代謝されて生じる蛍光色素を、蛍光プレートリーダーを用いて検出した。 Furthermore, the cell viability at this time was examined using Cell Count Reagent SF (Nacalai Tesque, Kyoto).
Cell Count Reagent SF reagent was added to the culture medium, and the fluorescent dye produced by the metabolism of the reagent by living cells was detected using a fluorescent plate reader.

Cont群を基準として細胞の生存率を示したものを表４及び図５に示す。
表４中の値は、平均値（ｎ＝７）±標準偏差を示す。 Table 4 and FIG. 5 show the cell viability based on the Cont group.
The values in Table 4 represent average values (n = 7) ± standard deviation.

Veh群は、細胞死を起こしている細胞が複数個見られ、細胞生存率が他の群に比べて最も低い。
したがって、Veh群は、ツニカマイシンの添加によって亢進したMIN6細胞の小胞体ストレスが原因として、MIN6細胞の細胞死が起きていることが確認できる。
しかし、PBA群は、Veh群と同じように、ツニカマイシンを添加したにもかかわらず、Veh群に比べて細胞死が見られず、細胞生存率が高い。
つまり、PBA群は、ツニカマイシン添加によって亢進したMIN6細胞の小胞体ストレスを原因とするMIN6細胞の細胞死が、４−フェニル酪酸によって抑制されていることが確認できる。
もともと４−フェニル酪酸は、小胞体ストレスの亢進を抑制する効果を有することが知られているが、Orz0.2群、Orz2群でも、４−フェニル酪酸を添加したPBA群と同様に、Veh群に比べて細胞死が見られず、細胞生存率が高い。
したがって、Orz0.2群、Orz2群は、ツニカマイシン添加によって亢進した小胞体ストレスを原因とするMIN6細胞の細胞死が、γ−オリザノールによって抑制されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、膵β細胞に対するツニカマイシン添加によって亢進した小胞体ストレスを原因とする膵β細胞の細胞死を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、小胞体ストレス亢進を原因とする膵β細胞の細胞死を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 In the Veh group, a plurality of cells undergoing cell death are seen, and the cell survival rate is the lowest compared to the other groups.
Therefore, in the Veh group, it can be confirmed that cell death of MIN6 cells occurs due to ER stress of MIN6 cells enhanced by the addition of tunicamycin.
However, as in the Veh group, the PBA group shows no cell death and a higher cell survival rate than the Veh group despite the addition of tunicamycin.
That is, in the PBA group, it can be confirmed that 4-phenylbutyric acid suppresses cell death of MIN6 cells caused by endoplasmic reticulum stress of MIN6 cells enhanced by the addition of tunicamycin.
Originally, 4-phenylbutyric acid is known to have an effect of suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress, but in the Orz0.2 group and the Orz2 group as well as the PBA group to which 4-phenylbutyric acid was added, the Veh group Cell death is not observed and cell survival rate is high.
Therefore, the Orz0.2 group and the Orz2 group can confirm that the cell death of MIN6 cells caused by endoplasmic reticulum stress enhanced by the addition of tunicamycin is suppressed by γ-oryzanol.
From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing cell death of pancreatic β cells caused by endoplasmic reticulum stress enhanced by the addition of tunicamycin to pancreatic β cells.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a drug for suppressing cell death of pancreatic β cells caused by increased endoplasmic reticulum stress.

（試験４）
膵β細胞の小胞体ストレスを亢進させた状況下で、膵β細胞のインスリン分泌量を調べることで、γ−オリザノールの膵β細胞に対する、小胞体ストレス亢進を原因とするインスリン分泌の低下を抑制する効果について試験した。 (Test 4)
Suppressing the decrease in insulin secretion caused by increased endoplasmic reticulum stress in pancreatic β cells by examining the amount of insulin secreted by pancreatic β cells in the situation where the endoplasmic reticulum stress of pancreatic β cells was increased The effect was tested.

マウス膵β細胞由来の培養細胞株MIN6細胞（大阪大学;MTA11-155）に対して、次のＡからＥのとおり、小胞体ストレス惹起剤「tunicamycin(ツニカマイシン)」、γ−オリザノール（Orz）、４−フェニル酪酸（4-PBA）をそれぞれ添加し、グルコースを添加したときのインスリン分泌量を調べた。
Ａ）Cont群：無添加
Ｂ）Veh群：ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）
Ｃ）Orz0.2群：ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ)＋Orz（0.2μｇ／ｍｌ）
Ｄ）Orz2群：ツニカマイシン(１μｇ／ｍｌ)＋Orz（2μｇ／ｍｌ）
Ｅ）PBA群：ツニカマイシン(１μｇ／ｍｌ)＋4-PBA（５ｍＭ）
γ-オリザノールは、ジメチルスルホキシド（DMSO）(ナカライテスク,京都)に溶かして添加した。 For cultured cell line MIN6 cells derived from mouse pancreatic β cells (Osaka University; MTA11-155), as shown in the following A to E, endoplasmic reticulum stress inducer “tunicamycin”, γ-oryzanol (Orz), 4-Phenylbutyric acid (4-PBA) was added, and the amount of insulin secreted when glucose was added was examined.
A) Cont group: no addition B) Veh group: tunicamycin (1 μg / ml)
C) Orz0.2 group: Tunicamycin (1 μg / ml) + Orz (0.2 μg / ml)
D) Orz2 group: Tunicamycin (1 μg / ml) + Orz (2 μg / ml)
E) PBA group: Tunicamycin (1 μg / ml) + 4-PBA (5 mM)
γ-Oryzanol was added after being dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Nacalai Tesque, Kyoto).

グルコース（２．５ｍＭ）を加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、Ｂ〜Ｅ群にツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加したあと、さらにＣ、Ｄ群にはγ−オリザノール（０．２、２μｇ／ｍｌ）を、Ｅ群には４−フェニル酪酸（５ｍＭ）をそれぞれ添加して、４時間放置した。
その後、２．５ｍＭ、２５ｍＭのグルコースをそれぞれ加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、Ｃ及びＤ群にγ−オリザノール（０．２、２μｇ／ｍｌ）を添加し、２時間で緩衝液中に分泌されるインスリン量を調べた。
インスリンは、超高感度マウスインスリン測定キット(森永生化学研究所、神奈川)を用いて測定した。 After adding tunicamycin (1 μg / ml) to groups B to E in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer to which glucose (2.5 mM) was added, γ-oryzanol (0.2) was added to groups C and D. 2-phenylbutyric acid (5 mM) was added to group E and left for 4 hours.
Thereafter, γ-oryzanol (0.2, 2 μg / ml) was added to C and D groups in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer added with 2.5 mM and 25 mM glucose, respectively, and the buffer was added in 2 hours. The amount of insulin secreted in was examined.
Insulin was measured using an ultrasensitive mouse insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Laboratory, Kanagawa).

結果を表５及び図６に示す。
表５中の値は、平均値（ｎ＝4〜5）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 5 and FIG.
The values in Table 5 represent average values (n = 4 to 5) ± standard deviation.

２．５ｍＭグルコース下においては、Veh群、Orz0.2群、Orz2群、PBA群のいずれも、Cont群に比して、インスリン分泌量の低下は見られない。
しかし、２５ｍＭグルコース下においては、次のような違いが見られた。
Veh群は、Cont群に比して、顕著にインスリン分泌量が低下している。
したがって、Veh群は、ツニカマイシンの添加によって亢進したMIN6細胞の小胞体ストレスや、さらには小胞体ストレス亢進を原因とするMIN6細胞の細胞死に起因して、インスリン分泌量（分泌能）の低下が起きていることが確認できる。
しかし、PBA群は、Veh群と同じように、ツニカマイシンを添加したにもかかわらず、Veh群に比べてインスリン分泌量の低下が見られず、Cont群に近い量のインスリンが分泌されていることが確認できる。
つまり、PBA群は、ツニカマイシンの添加を原因として生じたMIN6細胞の小胞体ストレスの亢進が、４−フェニル酪酸によって抑制されていることが確認できる。
もともと４−フェニル酪酸は、小胞体ストレスの亢進を抑制する効果を有することが知られているが、Orz0.2群、Orz2群でも、４−フェニル酪酸を添加したPBA群と同様に、Veh群に比べてインスリン分泌量の低下が見られず、Cont群に近い量（PBA群とほぼ同量）のインスリンが分泌されていることが確認できる。
したがって、Orz0.2群、Orz2群は、ツニカマイシン添加によって亢進したMIN6細胞の小胞体ストレスや、さらには小胞体ストレス亢進を原因とするMIN6細胞の細胞死に起因して低下するインスリン分泌が、γ−オリザノールによって抑制されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、ツニカマイシン添加によって亢進した小胞体ストレスを原因とする膵β細胞のインスリン分泌量の低下、もしくは、小胞体ストレス亢進を原因とした膵β細胞の細胞死に起因する膵β細胞のインスリン分泌の低下を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵β細胞において小胞体ストレスの亢進を原因として生じるインスリン分泌量の低下を抑制するための医薬として効果があることが認められる。
また、γ−オリザノールが、膵β細胞の小胞体ストレス亢進によって生じる膵β細胞の細胞死に起因するインスリン分泌量の低下を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 Under 2.5 mM glucose, the decrease in insulin secretion is not observed in any of the Veh group, Orz0.2 group, Orz2 group, and PBA group compared to the Cont group.
However, the following differences were observed under 25 mM glucose.
In the Veh group, the amount of insulin secretion is significantly reduced compared to the Cont group.
Therefore, in the Veh group, insulin secretion (secretory capacity) decreased due to ER stress of MIN6 cells increased by the addition of tunicamycin, and also due to cell death of MIN6 cells caused by increased ER stress. Can be confirmed.
However, in the PBA group, as with the Veh group, despite the addition of tunicamycin, there was no decrease in insulin secretion compared to the Veh group, and an amount of insulin close to that of the Cont group was secreted. Can be confirmed.
That is, in the PBA group, it can be confirmed that 4-phenylbutyric acid suppresses the enhancement of endoplasmic reticulum stress in MIN6 cells caused by the addition of tunicamycin.
Originally, 4-phenylbutyric acid is known to have an effect of suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress, but in the Orz0.2 group and the Orz2 group as well as the PBA group to which 4-phenylbutyric acid was added, the Veh group In comparison with, no decrease in insulin secretion was observed, and it was confirmed that an amount of insulin close to that of the Cont group (approximately the same amount as in the PBA group) was secreted.
Therefore, the Orz0.2 group and the Orz2 group have a decrease in insulin secretion decreased due to ER stress of MIN6 cells increased by addition of tunicamycin, and further due to cell death of MIN6 cells caused by increased ER stress. It can be confirmed that it is suppressed by oryzanol.
From this test result, γ-oryzanol is caused by a decrease in pancreatic β cell insulin secretion caused by endoplasmic reticulum stress enhanced by addition of tunicamycin, or pancreatic β cell death caused by increased endoplasmic reticulum stress. It is recognized that there is an effect of suppressing a decrease in insulin secretion of pancreatic β cells.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a pharmaceutical agent for suppressing a decrease in the amount of insulin secreted due to increased endoplasmic reticulum stress in pancreatic β cells.
In addition, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing a decrease in the amount of insulin secretion caused by cell death of pancreatic β cells caused by increased endoplasmic reticulum stress of pancreatic β cells.

（試験５）
マウスのP/I比を調べることで、γ−オリザノールの小胞体の機能障害に対する改善効果（小胞体ストレス抑制効果）を試験した。 (Test 5)
By examining the P / I ratio of mice, the effect of γ-oryzanol on the dysfunction of the endoplasmic reticulum (endoplasmic reticulum stress inhibitory effect) was tested.

マウス（8週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）に10週間、高脂肪食（Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ)、１日１１ｋｃａｌ）を給餌したVeh群と、高脂肪食（同）に加えてγ−オリザノール（和光純薬,大阪、１日２０、８０、３２０μｇ／ｇ体重）をゾンデを用いて連日経口投与したOrz群（20、80、320）とによるプロインスリン及びインスリンの分泌量を調べた。
なお、γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。 Veh group fed high-fat diet (Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ), 11 kcal / day) to mice (8-week-old male, C57BL / 6J, Charles River Japan) for 10 weeks, In addition to fat diet (same as above), γ-oryzanol (Wako Pure Chemicals, Osaka, 20, 80, 320 μg / g body weight per day) was orally administered daily using a sonde with Orz group (20, 80, 320) Insulin and insulin secretion were examined.
Note that γ-oryzanol is suspended at a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 cP of 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).

４時間絶食後、採血して、抗凝固剤EDTAで処理し、タンパク分解阻害剤アプロチニンで処理して血漿を分離し、血漿中のプロインスリン量、インスリン量を測定した。
プロインスリンは、レビス（登録商標）プロインスリン‐マウス/ラット（シバヤギ,群馬)、インスリンは、超高感度マウスインスリン測定キット（森永生化学研究所,神奈川）をそれぞれ用いて測定し、濃度比をとった。 After fasting for 4 hours, blood was collected, treated with the anticoagulant EDTA, treated with the proteolytic inhibitor aprotinin to separate plasma, and the amount of proinsulin and insulin in the plasma were measured.
Proinsulin was measured using Levis (registered trademark) proinsulin-mouse / rat (Shiba goat, Gunma), and insulin was measured using the ultrasensitive mouse insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Research Institute, Kanagawa). I took it.

結果を表６及び図７に示す。
表６中の値は、平均値（ｎ＝６）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 6 and FIG.
The values in Table 6 represent average values (n = 6) ± standard deviation.

γ−オリザノールを投与していないVeh群は、γ−オリザノールを投与した他の群に比べて、最もP/I比が高い。
これは、高脂肪食の摂取を原因として、プロインスリンからインスリンに加工される過程でプロインスリンが異常タンパク質として小胞体に蓄積し、小胞体ストレスが悪化して小胞体の機能障害が起きていることが想定される。
しかし、γ−オリザノールを投与した群は、P/I比が低い。
したがって、γ−オリザノールを経口投与することで、小胞体の機能障害が改善されている（小胞体ストレスが抑制されている）と想定される。
この試験結果から、γ−オリザノールは、経口摂取しても、高脂肪食の摂取を原因とする小胞体の機能障害を抑制する効果、または、高脂肪食の摂取によって亢進した小胞体ストレスを抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、経口摂取により、高脂肪食に起因する小胞体の機能障害を抑制するための医薬、または、高脂肪食に起因する小胞体ストレスの亢進を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 The Veh group not administered with γ-oryzanol has the highest P / I ratio compared to other groups administered with γ-oryzanol.
This is due to the intake of a high-fat diet, and proinsulin accumulates in the endoplasmic reticulum as an abnormal protein in the process of proinsulin being processed into insulin, and the endoplasmic reticulum stress deteriorates, resulting in dysfunction of the endoplasmic reticulum. It is assumed that
However, the group administered with γ-oryzanol has a low P / I ratio.
Therefore, it is assumed that the dysfunction of the endoplasmic reticulum is improved (or endoplasmic reticulum stress is suppressed) by orally administering γ-oryzanol.
From this test result, γ-oryzanol, even when taken orally, suppresses the dysfunction of the endoplasmic reticulum caused by the intake of a high fat diet, or suppresses endoplasmic reticulum stress enhanced by the intake of a high fat diet. It is recognized that there is an effect.
Therefore, γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing dysfunction of the endoplasmic reticulum caused by a high fat diet or a medicine for suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress caused by a high fat diet by oral ingestion. It is recognized that there is.

（試験６）
膵島内に占めるβ細胞とα細胞の分布、割合を調べることで、高脂肪食を給餌したマウスに対するγ−オリザノールの小胞体ストレス抑制、インスリン分泌促進、グルカゴン分泌抑制の各効果について試験した。 (Test 6)
By examining the distribution and ratio of β cells and α cells in the islets, the effects of γ-oryzanol on endoplasmic reticulum stress suppression, insulin secretion promotion, and glucagon secretion suppression on mice fed with a high fat diet were tested.

マウス（8週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）を３群に分けて、１０週間、次のＡからＣのとおり給餌した。
Ａ）chow群：通常食（CE-2（日本クレア,東京）、１日８kcal）
Ｂ）HFD群：高脂肪食（Western diet（Research Diet,New Brunswick,NJ）、１日１１kcal）
Ｃ）HFD+Orz320群：高脂肪食（Ｂに同じ）に加え、Orz（γ−オリザノール（和光純薬,大阪）、１日３２０μｇ／ｇ体重）をゾンデを用いて経口投与
なお、γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。 Mice (8-week-old male, C57BL / 6J, Charles River Japan Co., Ltd.) were divided into 3 groups and fed for 10 weeks according to the following A to C.
A) chow group: normal meal (CE-2 (Claire Japan, Tokyo), 8 kcal per day)
B) HFD group: High-fat diet (Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ), 11 kcal per day)
C) HFD + Orz320 group: In addition to high-fat diet (same as B), Orz (γ-oryzanol (Wako Pure Chemicals, Osaka), 320 μg / g body weight per day) is orally administered using a sonde. Is suspended in a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 wP of a 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).

各群のマウスから採取した膵臓を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋して連続切片を作成したのち、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色、及び、抗インスリン抗体（DAKO：A0564,東京都）、抗グルカゴン抗体（DAKO：A0565,東京都）を用いて免疫染色を行い、顕微鏡（倍率200倍）で観察、撮影した。
このときの顕微鏡写真を図８に示す。
また、上記各群の膵島サイズの平均値を比較したグラフを図９に、上記各群の膵島に占めるα細胞の割合の平均値を比較したグラフを図１０に、それぞれ示す。
図９、１０の結果は、各群100個以上の膵島の平均値をとったもので、WinROOF V7.0 software (三谷商事株式会社,福井県)を使って解析した。 The pancreas collected from each group of mice was fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, and serial sections were prepared. Then, hematoxylin and eosin (HE) staining and anti-insulin antibody (DAKO: A0564, Tokyo) Then, immunostaining was performed using an anti-glucagon antibody (DAKO: A0565, Tokyo), and observed and photographed with a microscope (magnification 200 times).
A photomicrograph at this time is shown in FIG.
Further, FIG. 9 shows a graph comparing the average values of the islet sizes of the respective groups, and FIG. 10 shows a graph comparing the average values of the ratio of α cells in the islets of the respective groups.
The results of FIGS. 9 and 10 are the average values of 100 or more islets in each group, and were analyzed using WinROOF V7.0 software (Mitani Corporation, Fukui Prefecture).

高脂肪食下や糖尿病の病態では、小胞体ストレスの亢進によって、膵島内のα細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ産生細胞などが増殖、肥大化して膵島が大きくなることが知られているが、HFD群はchow群に比べて膵島が大きくなっていることが確認できる。
これに対して、HFD+Orz320群は、chow群と同程度の大きさであり、γ−オリザノールが膵島の肥大化（小胞体ストレスの亢進）を抑制していることが確認できる。 It is known that α cells, β cells, δ cells, PP-producing cells, etc. in the islets grow and enlarge due to increased endoplasmic reticulum stress in high fat diet and diabetic conditions. In the HFD group, it can be confirmed that the islets are larger than the chow group.
On the other hand, the HFD + Orz320 group has the same size as the chow group, and it can be confirmed that γ-oryzanol suppresses the enlargement of pancreatic islets (enhancement of endoplasmic reticulum stress).

また、HFD群は、形態的には大きくなっているものの、機能的には廃絶し、インスリンの産生能力は低下しているため、インスリン免疫染色に染まりにくくなっていることが確認できる。
これに対して、HFD+Orz320群は、chow群と同じように、インスリン免疫染色に染まっており、γ−オリザノールが小胞体ストレスの亢進を抑制してインスリンの分泌を促進（インスリン分泌機能が回復）していることが確認できる。 In addition, although the HFD group is morphologically larger, it is functionally abolished and the ability to produce insulin is reduced, so that it can be confirmed that it is less likely to be stained with insulin immunostaining.
In contrast, the HFD + Orz320 group, like the chow group, is stained with insulin immunostaining, and γ-oryzanol suppresses the enhancement of endoplasmic reticulum stress and promotes insulin secretion (insulin secretion function is restored). ) Can be confirmed.

さらに、HFD群は、グルカゴン免疫染色に染まっていることからも分かるとおり、小胞体ストレスの亢進によって膵島細胞の機能が低下し、低血糖状態に陥り、グルカゴンの分泌が促進されていることが確認できる。
これに対して、HFD+Orz320群は、chow群と同じように、グルカゴン免疫染色に染まっておらず、γ−オリザノールが小胞体ストレスの亢進を抑制して膵島細胞の機能を正常化させ、グルカゴンの分泌を抑制していることが確認できる。 Furthermore, as can be seen from the fact that the HFD group is stained with glucagon immunostaining, it is confirmed that the function of the islet cells is reduced due to increased endoplasmic reticulum stress, resulting in a hypoglycemic state, and secretion of glucagon is promoted it can.
In contrast, the HFD + Orz320 group, like the chow group, was not stained with glucagon immunostaining, and γ-oryzanol suppressed the increase in endoplasmic reticulum stress and normalized the function of islet cells. Can be confirmed.

この試験結果から、γ−オリザノールは、膵島細胞における高脂肪食の摂取に起因して亢進した小胞体ストレスを抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島細胞における高脂肪食の摂取に起因して亢進した小胞体ストレスを抑制するための医薬として効果があることが認められる。
また、γ−オリザノールは、膵島細胞における高脂肪食の摂取に起因する小胞体ストレスの亢進を抑制してインスリンの分泌を促進（インスリン分泌機能が回復）する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島細胞における高脂肪食の摂取に起因する小胞体ストレスの亢進を抑制して膵島細胞の新生または再生を促進するための医薬として効果があることが認められる。
また、γ−オリザノールは、膵島細胞の小胞体ストレスの亢進を抑制して膵島細胞の機能を正常化させ、グルカゴンの分泌を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島細胞の小胞体ストレスの亢進を抑制して膵島細胞の機能を正常化させ、グルカゴンの分泌を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing endoplasmic reticulum stress enhanced due to the intake of a high fat diet in islet cells.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing endoplasmic reticulum stress enhanced due to intake of a high fat diet in islet cells.
Moreover, it is recognized that (gamma)-oryzanol has the effect which suppresses the increase of endoplasmic reticulum stress resulting from ingestion of a high-fat diet in an islet cell, and promotes the secretion of insulin (insulin secretion function is restored).
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing the increase in endoplasmic reticulum stress caused by the intake of a high fat diet in the islet cells and promoting the generation or regeneration of the islet cells.
Moreover, it is recognized that (gamma)-oryzanol has the effect which suppresses the increase of endoplasmic reticulum stress of an islet cell, normalizes the function of an islet cell, and suppresses secretion of glucagon.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress of islet cells to normalize the function of islet cells and suppressing the secretion of glucagon.

２．インスリン分泌促進効果 2. Insulin secretion promoting effect

（試験１）
γ−オリザノールによるインスリンの分泌促進効果について試験した。 (Test 1)
It tested about the secretion promotion effect of the insulin by (gamma) -oryzanol.

マウス（10週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）から採った膵島と、マウス膵β細胞由来の培養細胞株MIN6細胞（大阪大学;MTA11-155）を用いて、それぞれ培養液中にグルコースとγ−オリザノールを添加し、培養液中に分泌されたインスリンの量を調べた。 Using pancreatic islets taken from mice (10-week-old male, C57BL / 6J, Charles River Japan Co., Ltd.) and mouse pancreatic β cell-derived cultured cell line MIN6 cells (Osaka University; MTA11-155), Glucose and γ-oryzanol were added therein, and the amount of insulin secreted into the culture solution was examined.

グルコース（２．５ｍＭ）を加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、膵島に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群）、MIN6細胞に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群、１０μｇ／ｍｌ＝Orz10群）の前処置を各群に対して１時間行った。
その後、２．５ｍＭ、２５ｍＭのグルコースをそれぞれ加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、膵島に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群）、MIN6細胞に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群、１０μｇ／ｍｌ＝Orz10群）の各処置をし、１時間で緩衝液中に分泌されるインスリン量を調べた。
なお、γ-オリザノールは、ジメチルスルホキシド（DMSO）(ナカライテスク,京都)に溶かして添加した。
インスリンは、超高感度マウスインスリン測定キット(森永生化学研究所,神奈川)を用いて測定した。 No addition to the islets (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz 0.2 group, 2 μg / ml = Orz 2) in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer with glucose (2.5 mM) added Group), pretreatment with no addition to MIN6 cells (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz0.2 group, 2 μg / ml = Orz2 group, 10 μg / ml = Orz10 group) in each group For 1 hour.
Thereafter, in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer added with 2.5 mM and 25 mM glucose, respectively, no addition to the islets (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz 0.2 group, 2 μg) / Ml = Orz2 group), no treatment to MIN6 cells (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz0.2 group, 2 μg / ml = Orz2 group, 10 μg / ml = Orz10 group) And the amount of insulin secreted into the buffer in 1 hour was examined.
Γ-oryzanol was added after being dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Nacalai Tesque, Kyoto).
Insulin was measured using an ultrasensitive mouse insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Laboratory, Kanagawa).

膵島の結果を表７及び図１１に示す。
表７中の値は、平均値（ｎ＝９〜１５）±標準偏差を示す。 The results of islets are shown in Table 7 and FIG.
The values in Table 7 represent average values (n = 9 to 15) ± standard deviation.

MIN6細胞の結果を表８及び図１２に示す。
表８中の値は、平均値（ｎ＝６）±標準偏差を示す。
The results of MIN6 cells are shown in Table 8 and FIG.
The values in Table 8 represent mean values (n = 6) ± standard deviation.

２．５ｍＭグルコース下においては、膵島、MIN6細胞のいずれも、Veh群とOrz群との間に、インスリン分泌量の差は見られなかった。
しかし、２５ｍＭグルコース下においては、次のような違いが見られた。
膵島、MIN6細胞のいずれも、Orz群は、Veh群に比して、顕著にインスリン分泌量が増加している。
したがって、膵島、MIN6細胞のいずれも、Orz群は、グルコースに応答して、インスリンの分泌が促進されていることが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、グルコースに応答して、インスリンの分泌を促進する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島細胞、膵β細胞において、グルコースに応答してインスリンの分泌を促進するための医薬として効果があることが認められる。 Under 2.5 mM glucose, there was no difference in insulin secretion between the Veh group and the Orz group in both the islets and MIN6 cells.
However, the following differences were observed under 25 mM glucose.
In both the islets and MIN6 cells, the amount of insulin secretion is significantly increased in the Orz group compared to the Veh group.
Therefore, it can be confirmed that the Orz group is promoted to secrete insulin in response to glucose in both the islets and MIN6 cells.
From this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of promoting insulin secretion in response to glucose.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a pharmaceutical for promoting insulin secretion in response to glucose in pancreatic islet cells and pancreatic β cells.

（試験２）
γ−オリザノールによるインスリンの分泌促進効果について試験した。 (Test 2)
It tested about the secretion promotion effect of the insulin by (gamma) -oryzanol.

マウス（20週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）に、γ−オリザノールを経口投与し、その直後に、ブドウ糖負荷試験を行い、血糖値及びインスリン分泌量を調べた。 Gamma-oryzanol was orally administered to mice (20-week-old male, C57BL / 6J, Nihon Charles River Co., Ltd.), and immediately thereafter, a glucose tolerance test was performed to examine blood glucose level and insulin secretion.

ブドウ糖負荷試験は、18時間絶食後、γ−オリザノールをゾンデを用いて経口投与（３２０μｇ／ｇ体重）したうえで、体重(kg)当たり2.0gのブドウ糖を腹腔内投与し、その後、2時間後までの血糖値、インスリン値を測定した。
γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。
血糖値の測定には、簡易血糖測定機(メディセーフミニ;テルモ,東京)を用いた。
インスリン値の測定には、超高感度マウスインスリン測定キット(森永生化学研究所、神奈川)を用いた。 In the glucose tolerance test, after fasting for 18 hours, γ-oryzanol was orally administered using a sonde (320 μg / g body weight), 2.0 g of glucose per body weight (kg) was intraperitoneally administered, and then 2 hours later Blood glucose level and insulin level were measured.
γ-oryzanol is suspended in a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 cP of 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).
A simple blood glucose meter (Medisafe Mini; Terumo, Tokyo) was used for blood glucose level measurement.
For the measurement of insulin level, an ultrasensitive mouse insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Research Institute, Kanagawa) was used.

血糖値の結果を表９及び図１３に示す。
表９中の値は、平均値（ｎ＝11〜14）±標準偏差を示す。 The results of blood glucose level are shown in Table 9 and FIG.
The values in Table 9 represent average values (n = 11 to 14) ± standard deviation.

インスリン値の結果を表１０及び図１４に示す。
表１０中の値は、平均値（ｎ＝11〜14）±標準偏差を示す。
The results of insulin values are shown in Table 10 and FIG.
The values in Table 10 represent average values (n = 11 to 14) ± standard deviation.

γ−オリザノールを経口投与したマウス（Oryzanol群）は、非投与マウス（Vehicle群）に比べて、血糖値の上昇が抑えられ、インスリンの分泌量が増加している。
この試験結果から、γ−オリザノールは、経口投与によって、インスリンの分泌を促進する効果があることが確認できる。
また、γ−オリザノールは、インスリンの分泌を促進する結果、血糖値の上昇を抑える効果があることが確認できる。
したがって、γ−オリザノールが、経口投与によって、血糖値の上昇抑制及びインスリンの分泌促進のための医薬として効果があることが認められる。 Mice to which γ-oryzanol was orally administered (Oryzanol group) had an increase in blood glucose level and increased insulin secretion compared to non-administered mice (Vehicle group).
From this test result, it can be confirmed that γ-oryzanol has an effect of promoting insulin secretion by oral administration.
Moreover, it can be confirmed that γ-oryzanol has an effect of suppressing an increase in blood glucose level as a result of promoting insulin secretion.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a pharmaceutical agent for suppressing an increase in blood glucose level and promoting insulin secretion by oral administration.

（試験３）
γ−オリザノールが、中枢神経を介さずに、膵臓に直接作用してインスリンの分泌を促進するか否かについて試験した。 (Test 3)
It was tested whether γ-oryzanol acts directly on the pancreas to promote insulin secretion without involving the central nerve.

迷走神経を切断したマウス（C57BL/6J,７週齢雄,日本チャールス・リバー株式会社）にγ-オリザノールを投与し、ブドウ糖負荷試験を行った。 Gamma-oryzanol was administered to mice (C57BL / 6J, 7-week-old male, Charles River Japan Co., Ltd.) from which the vagus nerve had been cut, and a glucose tolerance test was performed.

マウスをバルビタールで麻酔し開腹したのち、迷走神経を横隔膜下で切断して縫合した。
上記施術から１週間後、マウスにγ−オリザノールを経口投与し、その直後に、ブドウ糖負荷試験を行い、血糖値及びインスリン分泌量を調べた。
ブドウ糖負荷試験は、18時間絶食後、γ−オリザノールをゾンデを用いて経口投与（３２０μｇ／ｇ体重）したうえで、体重(kg)当たり2.0gのブドウ糖を腹腔内投与し、その後、2時間後までの血糖値、インスリン値を測定した。
γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。
血糖値の測定には、簡易血糖測定機(メディセーフミニ;テルモ,東京)を用いた。
インスリン値の測定には、超高感度マウスインスリン測定キット(森永生化学研究所、神奈川)を用いた。 After the mouse was anesthetized with barbital and laparotomized, the vagus nerve was cut under the diaphragm and sutured.
One week after the treatment, γ-oryzanol was orally administered to the mice, and immediately after that, a glucose tolerance test was conducted to examine the blood glucose level and the amount of insulin secretion.
In the glucose tolerance test, after fasting for 18 hours, γ-oryzanol was orally administered using a sonde (320 μg / g body weight), 2.0 g of glucose per body weight (kg) was intraperitoneally administered, and then 2 hours later Blood glucose level and insulin level were measured.
γ-oryzanol is suspended in a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 cP of 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).
A simple blood glucose meter (Medisafe Mini; Terumo, Tokyo) was used for blood glucose level measurement.
For the measurement of insulin level, an ultrasensitive mouse insulin measurement kit (Morinaga Biochemical Research Institute, Kanagawa) was used.

血糖値の結果を表１１及び図１５に示す。
表１１中の値は、平均値（ｎ＝8〜19）±標準偏差を示す。 The results of blood glucose level are shown in Table 11 and FIG.
The values in Table 11 represent average values (n = 8 to 19) ± standard deviation.

インスリン値の結果を表１２及び図１６に示す。
表１２中の値は、平均値（ｎ＝8〜19）±標準偏差を示す。
The results of insulin values are shown in Table 12 and FIG.
The values in Table 12 represent average values (n = 8 to 19) ± standard deviation.

γ−オリザノールの作用は、中枢神経を介して膵臓に作用する経路と、膵臓に直接作用する経路の２つが想定されていた。
しかし、迷走神経を切断したγ−オリザノール投与マウス（切断群-Orz）でも、迷走神経を切断していないγ−オリザノール投与マウス（sham-Orz）と同様にインスリンの分泌が促進され、血糖値の上昇が抑えられている。
この試験結果から、γ-オリザノールによる作用（本明細書における各試験の効果）は、中枢神経を介さずに膵臓に直接なされていることが確認できる。
したがって、本発明における医薬は、膵臓に局所投与しても有効であることを認めることができる。 The action of γ-oryzanol was assumed to be two pathways, one acting on the pancreas via the central nerve and the other acting directly on the pancreas.
However, γ-oryzanol-administered mice with cleaved vagus nerve (cleaved group-Orz) also promoted insulin secretion in the same way as γ-oryzanol-administered mice without cleaved vagus nerve (sham-Orz). The rise is suppressed.
From this test result, it can be confirmed that the action by γ-oryzanol (the effect of each test in this specification) is directly performed on the pancreas without involving the central nerve.
Therefore, it can be recognized that the medicament of the present invention is effective even when locally administered to the pancreas.

（試験４）
γ−オリザノールの有効投与量（摂取量）について試験した。 (Test 4)
The effective dose (intake) of γ-oryzanol was tested.

マウス（22週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）に、γ−オリザノールを経口投与し、その直後に、ブドウ糖負荷試験を行い、血糖値を調べた。 Gamma-oryzanol was orally administered to mice (22-week-old male, C57BL / 6J, Nihon Charles River Co., Ltd.), and immediately thereafter, a glucose tolerance test was performed to examine blood glucose levels.

ブドウ糖負荷試験は、18時間絶食後、γ−オリザノールをゾンデを用いて経口投与（５μｇ／ｇ体重）したうえで、体重(kg)当たり2.0gのブドウ糖を腹腔内投与し、その後、2時間後までの血糖値を測定した。
γ-オリザノールは、0.5w/v%メチルセルロース溶液400cP（和光純薬,大阪）を用いて2〜32mg/mlの濃度に懸濁している。
血糖値の測定には、簡易血糖測定機(メディセーフミニ;テルモ,東京)を用いた。 In the glucose tolerance test, after fasting for 18 hours, γ-oryzanol was orally administered using a sonde (5 μg / g body weight), 2.0 g of glucose per body weight (kg) was intraperitoneally administered, and then 2 hours later The blood glucose level was measured.
γ-oryzanol is suspended in a concentration of 2 to 32 mg / ml using 400 cP of 0.5 w / v% methylcellulose solution (Wako Pure Chemicals, Osaka).
A simple blood glucose meter (Medisafe Mini; Terumo, Tokyo) was used for blood glucose level measurement.

血糖値の結果を表１３及び図１７に示す。
表１３中の値は、平均値（ｎ＝6）±標準偏差を示す。 The results of blood glucose level are shown in Table 13 and FIG.
The values in Table 13 represent mean values (n = 6) ± standard deviation.

γ−オリザノールを経口投与したマウスは、血糖値において、非投与マウス（Vehicle）と差がないことが確認できる。
この試験結果から、γ−オリザノールは、１日５μｇ／ｇ体重の投与量では、血糖値を低下させる効果は認められないことが確認できる。
したがって、γ−オリザノールは、本明細書における各試験において効果が確認できている１日当たり２０μｇ／ｇ体重以上の投与量が有効である。 It can be confirmed that mice orally administered with γ-oryzanol have no difference in blood glucose level from non-administered mice (Vehicle).
From this test result, it can be confirmed that γ-oryzanol has no effect of lowering blood glucose level at a daily dose of 5 μg / g body weight.
Therefore, γ-oryzanol is effective at a dose of 20 μg / g body weight or more per day, which has been confirmed to be effective in each test herein.

３．グルカゴン分泌抑制効果 3. Glucagon secretion inhibitory effect

γ−オリザノールによるグルカゴン分泌抑制効果について試験した。 It tested about the glucagon secretion inhibitory effect by (gamma) -oryzanol.

（試験１）
マウス（10週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）から採った膵島の培養液中にグルコースとγ−オリザノールを添加し、培養液中に分泌されたグルカゴン量を調べた。 (Test 1)
Glucagon and the amount of glucagon secreted in the culture solution were examined by adding glucose and γ-oryzanol to the culture solution of islets taken from mice (10-week-old male, C57BL / 6J, Charles River Japan Co., Ltd.).

グルコース（２．５ｍＭ）を加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、膵島に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群）の前処置を各群に対して１時間行った。
その後、２．５ｍＭ、２５ｍＭのグルコースをそれぞれ加えたクレブス・リンガー・重炭酸緩衝液中で、膵島に無添加（Veh群）とγ−オリザノール添加（０．２μｇ／ｍｌ＝Orz0.2群、２μｇ／ｍｌ＝Orz2群）の各処置をし、１時間で緩衝液中に分泌されるグルカゴン量を調べた。
γ-オリザノールは、ジメチルスルホキシド（DMSO）(ナカライテスク,京都)に溶かして添加した。
グルカゴンは、ラットグルカゴンELISAキットワコー（和光純薬,大阪）を用いて測定した。 No addition to the islets (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz 0.2 group, 2 μg / ml = Orz 2) in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer with glucose (2.5 mM) added Group) was pre-treated for 1 hour for each group.
Thereafter, in Krebs-Ringer-bicarbonate buffer added with 2.5 mM and 25 mM glucose, respectively, no addition to the islets (Veh group) and γ-oryzanol addition (0.2 μg / ml = Orz 0.2 group, 2 μg) / Ml = Orz2 group), and the amount of glucagon secreted into the buffer in 1 hour was examined.
γ-Oryzanol was added after being dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Nacalai Tesque, Kyoto).
Glucagon was measured using rat glucagon ELISA kit Wako (Wako Pure Chemicals, Osaka).

結果を表１４及び図１８に示す。
表１４中の値は、平均値（ｎ＝９〜１５）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 14 and FIG.
The values in Table 14 represent average values (n = 9 to 15) ± standard deviation.

２．５ｍＭグルコース下においては、Veh群とOrz群との間に、グルカゴン分泌量の差は見られなかった。
しかし、２５ｍＭグルコース下においては、Orz群は、Veh群に比して、顕著にグルカゴン分泌量が少ない。
高脂肪食下や糖尿病の病態では、膵α細胞からのグルカゴン分泌が抑えられない状態になることが知られている。
しかし、この試験結果から、上記病態下にあっても、γ−オリザノールは、グルカゴンの分泌を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、膵島細胞において、グルカゴンの分泌を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 Under 2.5 mM glucose, there was no difference in glucagon secretion between the Veh group and the Orz group.
However, under 25 mM glucose, the Orz group has significantly less glucagon secretion than the Veh group.
It is known that glucagon secretion from pancreatic α cells cannot be suppressed under high fat diet or diabetes.
However, from this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing glucagon secretion even under the above pathological condition.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing glucagon secretion in islet cells.

（試験２）
マウス（8週齢雄,C57BL/6J,日本チャールス・リバー株式会社）に10週間、高脂肪食（Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ)、１日１１ｋｃａｌ）を給餌したVeh群と、高脂肪食（同）に加えてγ−オリザノール（和光純薬,大阪、１日２０、８０、３２０μｇ／ｇ体重）をゾンデを用いて連日経口投与したOrz群（20、80、320）によるグルカゴン濃度を測定した。 (Test 2)
Veh group fed high-fat diet (Western diet (Research Diet, New Brunswick, NJ), 11 kcal / day) to mice (8-week-old male, C57BL / 6J, Charles River Japan) for 10 weeks, Glucagon concentration by Orz group (20, 80, 320) orally administered daily with a sonde in addition to fat diet (same) γ-oryzanol (Wako Pure Chemicals, Osaka, 20, 80, 320 μg / g body weight per day) Was measured.

４時間絶食後、採血して、抗凝固剤EDTAとタンパク分解阻害剤アプロチニンで処理して血漿を分離し、血漿中のグルカゴン濃度を測定した。
測定には、ラットグルカゴンELISAキットワコー（和光純薬,大阪）を用いた。 After fasting for 4 hours, blood was collected, treated with the anticoagulant EDTA and the proteolytic inhibitor aprotinin to separate plasma, and the glucagon concentration in the plasma was measured.
Rat glucagon ELISA kit Wako (Wako Pure Chemicals, Osaka) was used for the measurement.

結果を表１５及び図１９に示す。
表１５中の値は、平均値（ｎ＝８）±標準偏差を示す。 The results are shown in Table 15 and FIG.
The values in Table 15 represent average values (n = 8) ± standard deviation.

γ−オリザノールを経口投与したマウス（Orz群）では、非投与マウス（Veh群）に比べて、血漿中のグルカゴン濃度が低い。
高脂肪食下や糖尿病の病態では、膵α細胞からのグルカゴン分泌が抑えられない状態になることが知られている。
しかし、この試験結果から、上記病態下にあっても、γ−オリザノールは、グルカゴンの分泌を抑制する効果があることが認められる。
したがって、γ−オリザノールが、経口投与によって、グルカゴンの分泌を抑制するための医薬として効果があることが認められる。 Mice (Orz group) to which γ-oryzanol was orally administered had lower glucagon concentrations in plasma than non-administered mice (Veh group).
It is known that glucagon secretion from pancreatic α cells cannot be suppressed under high fat diet or diabetes.
However, from this test result, it is recognized that γ-oryzanol has an effect of suppressing glucagon secretion even under the above pathological condition.
Therefore, it is recognized that γ-oryzanol is effective as a medicine for suppressing glucagon secretion by oral administration.

上記１乃至３の試験結果から、γ−オリザノールの優れた効果が確認できるが、このγ−オリザノールを、小胞体ストレス亢進抑制剤、小胞体ストレスが生じることによって発現するChop、ERdj4、スプライス型Xbp1(Xbp1s)のいずれか１以上の遺伝子に対する発現抑制剤、膵β細胞に対するアポトーシス抑制剤、膵β細胞の新生または再生を促進するための医薬、インスリン分泌促進剤、グルカゴン分泌抑制剤、血糖値上昇抑制剤、糖尿病治療薬の有効成分として利用することで、これらヒトまたは動物用の医薬において優れた効果が発揮される。 From the above test results 1 to 3, the excellent effect of γ-oryzanol can be confirmed, but this γ-oryzanol is expressed as an endoplasmic reticulum stress enhancer, Chop, ERdj4, spliced Xbp1 (Xbp1s) expression inhibitor for one or more genes, pancreatic β-cell apoptosis inhibitor, pancreatic β-cell neoplasia or regeneration, insulin secretagogue, glucagon secretion inhibitor, blood glucose level increase By using as an active ingredient of an inhibitor or a therapeutic drug for diabetes, an excellent effect is exhibited in these human or animal medicines.

なお、上記した各医薬は、医薬組成物であってもよい。
医薬または医薬組成物の投与方法として、例えば、経口、経管及び経腸などの方法で投与することができ、これらの投与方法または治療目的に応じて、一般的な医薬製剤の形態として、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等を選択できる。
製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の一般的に医薬組成物に用いられている種々の添加剤を使用できる。 In addition, each above-mentioned pharmaceutical may be a pharmaceutical composition.
As a method of administering a pharmaceutical or a pharmaceutical composition, for example, it can be administered by a method such as oral, tube, enteral, etc., and depending on these administration methods or therapeutic purposes, as a general pharmaceutical formulation, , Tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, and the like.
In formulating, for example, various excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, solvents for injections and the like, which are generally used in pharmaceutical compositions. Additives can be used.

また、γ−オリザノールは、上記試験結果から明らかなとおり、経口投与によっても優れた効果を有することが認められるが、天然由来のものでは、米（米糠等）から得られる米油から容易に抽出または精製することができ、安全性と有効性が保障された天然食品由来であることから、これを食品または飲料に含有もしくは添加することができ、例えば、γ−オリザノールを含有するヒトまたは動物用の機能性食品（飲料を含む）や食品添加物（液状や粉状など、その性状は問わない）として利用できる。 In addition, as is apparent from the above test results, γ-oryzanol is recognized to have an excellent effect even by oral administration, but naturally derived ones are easily extracted from rice oil obtained from rice (rice bran, etc.). Or it can be purified and it is derived from natural foods that ensure safety and effectiveness, so it can be contained or added to foods or beverages, for example for humans or animals containing γ-oryzanol Can be used as functional foods (including beverages) and food additives (regardless of their properties such as liquid or powder).

また、γ−オリザノールの有効投与量については、ブドウ糖負荷試験による血糖値の測定結果のみではあるが、γ−オリザノールを５μｇ／ｇ体重の量を経口投与したマウスでは、血糖値を低下させる効果が認められず、他の各試験では１日２０μｇ／ｇ体重以上の投与量（添加量）で効果を確認できた。
したがって、γ−オリザノールの有効投与量もしくは有効摂取量は、経口投与もしくは摂食の場合、患者（摂食対象者）であるヒトまたは動物の年齢等によっても異なるが、１日２０μｇ／ｇ体重以上が好ましい。 In addition, the effective dose of γ-oryzanol is only the result of measuring the blood glucose level by the glucose tolerance test, but in mice to which γ-oryzanol was orally administered at an amount of 5 μg / g body weight, the effect of lowering the blood glucose level was exhibited. In each of the other tests, the effect could be confirmed at a dose (addition amount) of 20 μg / g body weight or more per day.
Therefore, the effective dose or effective intake amount of γ-oryzanol is 20 μg / g body weight or more per day, although it varies depending on the age of the human being or patient (subject) in the case of oral administration or feeding. Is preferred.

Claims

A medicament for suppressing the enhancement of endoplasmic reticulum stress in human or animal pancreatic β cells , comprising γ-oryzanol as an active ingredient, by local administration to the pancreas of a human or animal.

Suppresses expression of one or more genes of Chop, ERdj4, and splice type Xbp1 (Xbp1s) expressed by endoplasmic reticulum stress in human or animal pancreatic β cells by local administration to human or animal pancreas Medicine to do.

An apoptosis inhibitor for suppressing pancreatic β cell death caused by increased endoplasmic reticulum stress in humans or animals , comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of humans or animals.

A medicament for promoting neoplasia or regeneration of human or animal pancreatic β cells , comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of a human or animal.

An insulin secretagogue for humans or animals comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of humans or animals.

A glucagon secretion inhibitor for humans or animals comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of humans or animals.

An agent for suppressing an increase in blood glucose level for humans or animals , comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of humans or animals.

A therapeutic agent for diabetes for humans or animals comprising γ-oryzanol as an active ingredient by local administration to the pancreas of humans or animals.