JP6094022B2

JP6094022B2 - Gene transfer vector and preparation method thereof

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Publication number: JP6094022B2
Application number: JP2009072745A
Authority: JP
Inventors: 敬一加藤; 龍彦宮▲崎▼; 憲史坂山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: JP2010193875A

Description

本発明は、生体内遺伝子導入効率に優れた遺伝子ベクターとしてのカチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルからなる二重ベシクルを用いる遺伝子導入技術に関する。The present invention relates to a gene transfer technique using a double vesicle comprising a Cationic Span (registered trademark) 80 vesicle as a gene vector excellent in in vivo gene transfer efficiency.

遺伝子治療などの生体内遺伝子導入を試みるとき、血中に遺伝子ベクターを投与することになる。この場合ベクターに固定化された遺伝子は血中のＤＮａｓｅなどの攻撃を受け分解され易い。そのため従来のような、遺伝子をベクター表面に固定化したものは生体内ではその有効性が低下する。さらに、細胞形質内に導入された遺伝子ベクターは、血中での攻撃を受けるため、細胞形質内での遺伝子ベクターとしての機能が低下する。また、エンドサイトーシスで導入された遺伝子ベクターでは、その遺伝子活性が低下する。そのため血中、および細胞形質内で有効に機能するベクターの開発が望まれている。 When attempting in vivo gene transfer such as gene therapy, a gene vector is administered into the blood. In this case, the gene immobilized on the vector is easily decomposed by an attack such as DNase in the blood. For this reason, the effectiveness of a conventional gene immobilized on a vector surface is reduced in vivo . Furthermore, since the gene vector introduced into the cell trait is attacked in blood, the function as the gene vector in the cell trait is reduced. In addition, the gene activity of a gene vector introduced by endocytosis decreases. Therefore, it is desired to develop a vector that functions effectively in blood and in cytoplasm .

特許公開２００３−００１０９７号公報Japanese Patent Publication No. 2003-001097

遺伝子導入に際して、導入効率の良い遺伝子ベクターを開発することを目的とする。従来のリポソームを用いた遺伝子導入では、リポソームの外表面に遺伝子を固定化しているため、血中ではその遺伝子がＤＮａｓｅなどの攻撃を受け、活性劣化する。また目的細胞に取り込まれる場合のメカニズムはエンドサイトーシス（細胞貪食）であるため、細胞形質内で遺伝子が核まで送達される効率が悪い。このような状況下、効率の良い遺伝子ベクターを用いた遺伝子導入技術の開発が望まれている。 The purpose is to develop a gene vector with good introduction efficiency for gene introduction. In conventional gene transfer using liposomes, the gene is immobilized on the outer surface of the liposome, so that the gene is attacked by DNase or the like in the blood, and the activity deteriorates. Moreover, since the mechanism in the case of taking in by the target cell is endocytosis (cell phagocytosis), the efficiency in which a gene is delivered to a nucleus within a cell trait is bad. Under such circumstances, it is desired to develop a gene transfer technique using an efficient gene vector .

遺伝子ベクターとして、表面に遺伝子を固定化したベシクル（小粒径ベシクル）を、そのベシクルよりもさらに大きいベシクル（大粒径ベシクル）に内包した、いわゆる二重ベシクルを調製する。これらのベシクルにはカチオン界面活性を混合させ、カチオニックなベシクルとして用い、目的細胞への親和性を増強させた。この二重ベシクルは、膜融合能に優れたＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルが基本となっており、高効率の生体内遺伝子導入が期待できる。この導入機能は以下の４段階からなる。▲１▼まず、上記の二重構造を有する大粒径のベシクルを血中に投与して、そのベシクルに内包した小粒径ベシクル表面の遺伝子を、血中のＤＮａｓｅなどの攻撃から保護した状態で、目的細胞まで送達する。▲２▼大粒径ベシクルが目的細胞に到達後は、その大粒径ベシクルが目的細胞と融合して、内包した遺伝子固定化小粒径ベシクルを細胞形質内に放出する。▲３▼その放出された小粒径ベシクルが、細胞形質内で遺伝子ベクターの役割を果して、遺伝子を核まで効率良く送達して、▲４▼核内への遺伝子導入を図る。As a gene vector, a so-called double vesicle is prepared in which a vesicle (small particle size vesicle) having a gene immobilized thereon is encapsulated in a vesicle larger than the vesicle (large particle size vesicle). These vesicles were mixed with cationic surfactants and used as cationic vesicles to enhance affinity for target cells. This double vesicle is based on the Span (registered trademark) 80 vesicle having excellent membrane fusion ability, and high-efficiency in vivo gene transfer can be expected. This introduction function consists of the following four stages. (1) First, the above-mentioned large particle size vesicle having a double structure is administered into the blood, and the gene on the surface of the small particle size vesicle encapsulated in the vesicle is protected from attacks such as DNase in the blood. And deliver to the target cell. (2) After the large particle size vesicle reaches the target cell, the large particle size vesicle is fused with the target cell, and the encapsulated gene-immobilized small particle size vesicle is released into the cytoplasm. (3) The released small particle size vesicle plays the role of a gene vector in the cell trait, efficiently delivers the gene to the nucleus, and (4) attempts to introduce the gene into the nucleus.

生体内遺伝子導入において、細胞との融合能、生体安全性に優れたＳｐａｎ（登録商標）８０のベシクルを用いて、血中と細胞形質内での二段構えの遺伝子送達機能を付与した。そのため、高効率で安全な遺伝子導入が実現できる。In in vivo gene transfer, a Span (registered trademark) 80 vesicle excellent in cell fusion ability and biological safety was used to provide a two-stage gene delivery function in blood and in cytoplasm. Therefore, highly efficient and safe gene transfer can be realized.

使用した遺伝子Gene used 種々のベシクル模型図Various vesicle model drawings プラスミド外付けベシクルを内包した二重ベシクル（ＶＰＶ）の位相差顕微鏡写真Phase contrast micrograph of a double vesicle (VPV) containing an external plasmid vesicle 種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒト骨肉腫細胞株（ＯＳＴ）の場合）Graph of relative gene expression by various vesicles (in case of human osteosarcoma cell line (OST)) 種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞（ＥＲＭ５−１細胞）の場合）Graph of relative gene expression by various vesicles (in the case of mouse cells incorporating human EGFR antigen (ERM5-1 cells))

１．使用した癌細胞
ＯＳＴ：ヒト骨肉腫細胞
ＥＲＭ５−１：ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞
２．使用したベシクル
ＶＰＶ：プラスミド外付けベシクルを内包したベシクル
ＩＶＰＶ：プラスミド外付けベシクルを内包したイムノベシクル
ＶＰ：プラスミド内包ベシクル
ＰＶ：プラスミド外付けベシクル
ＶＶ：ベシクル内包ベシクル
３．使用した遺伝子：ｐＥＧＦＰＬｕｃ
４．ＩＡＯＥ：ＩｓｏｃｙａｎｉｃＡｃｉｄＯｃｔａｄｅｃｙｌＥｓｔｅｒ
５．ＤＯＴＡＰ：カチオニック界面活性剤（化学式：Ｃ_４３Ｈ_８３ＮＯ_８Ｓ）
６．ＢｕｆｆｅｒＰ１：プラスミドＤＮＡ調製用の再懸濁バッファー、ＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＲＮａｓｅＡｎｏｔｉｎｃｌｕｄｅｄ）
７．ＢｕｆｆｅｒＰ２：プラスミドＤＮＡ調製用の溶解バッファー、ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ
８．ＢｕｆｆｅｒＰ３：プラスミドＤＮＡ調製用の中和バッファー、ＮｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ
９．ＢｕｆｆｅｒＱＣ：プラスミドＤＮＡ調製用の洗浄バッファー、ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ
１０．ＢｕｆｆｅｒＱＦ：プラスミドＤＮＡ調製用の溶出バッファー、ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ
１１．ＢｕｆｆｅｒＱＢＴ：プラスミドＤＮＡ調製用の平衡バッファー、ＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ 1. 1. Cancer cells used OST: human osteosarcoma cells ERM5-1: mouse cells incorporating human EGFR antigen Vesicles used: VPV: vesicles containing plasmid-external vesicles IVPV: immunovesicles containing plasmid-external vesicles VP: plasmid-encapsulating vesicles PV: plasmid-external vesicles VV: vesicle-encapsulating vesicles Gene used: pEGFPLuc
4). IAOE: Isocyclic Acid Octadecyl Ester
5. DOTAP: Cationic surfactant (Chemical formula: C ₄₃ H ₈₃ NO ₈ S)
6). BufferP1: Resuspension Buffer (RNase A not included) for resuspension buffer for plasmid DNA preparation
7). BufferP2: Lysis Buffer, a lysis buffer for preparing plasmid DNA
8). BufferP3: neutralization buffer for preparing plasmid DNA, Neutralization Buffer
9. BufferQC: Wash buffer for preparing plasmid DNA, Wash Buffer
10. BufferQF: Elution buffer for preparation of plasmid DNA, Election Buffer
11. BufferQBT: equilibration buffer for preparing plasmid DNA, Equilibration Buffer

レポーター遺伝子として、遺伝子導入されるとルシフェラーゼを産性するｐＥＧＦＰＬｕｃを用いて、そのプラスミドを大腸菌で培養して増殖させた。一方、二段階乳化法により調製する界面活性剤Ｓｐａｎ（登録商標）８０ベシクルを基本として、種々のベシクルを調製し、上記の遺伝子のベクターとして用いた。
このＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルには、膜強化剤として微量の大豆レシチンおよびコレステロールを混合し、さらにはカチオン界面活性剤であるＤＯＴＡＰを上記のＳｐａｎ（登録商標）８０中に２０ｗｔ％の割合で混合させ、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルとして用いた。このベシクル粒径はエクストルダーによる粒径制御や二次乳化後の長時間撹拌により、約１５０ｎｍ以下に調製した。
▲１▼この小粒径のカチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルの表面にｐ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎを媒体としてプラスミドを結合させて、いわゆるプラスミド外付けベシクル（ＰＶ）を調製した。▲２▼一方、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクル内にプラスミドを内包したベシクル（ＶＰ）も二段階乳化法により調製した。▲３▼さらに上記のＰＶを内包した二重ベシクル（ＶＰＶ）も調製した。▲４▼またこのＶＰＶベシクルの表面に抗体を固定化したＩＶＰＶも調製した。このような４種類のベシクルを用いて、以下の癌細胞に対する遺伝子導入実験を行った。使用した癌細胞はヒト骨肉腫細胞（ＯＳＴ）およびヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞（ＥＲＭ５−１）である。ＯＳＴ細胞の遺伝子導入実験に対しては、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶの三種類のベクターを、また、ＥＲＭ５−１に対する遺伝子導入実験では、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶ、ＩＶＰＶの４種類を用いた。ＩＶＰＶの抗体には、ＥＲＭ５−１細胞表面の抗原ＥＧＦＲを標的させるために、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた。
これらの実験から、二重ベシクルＶＰＶの内部に存在するＰＶが、ベシクルと細胞が融合した後、細胞形質内で核まで遺伝子を送達させるベクターとして機能し、遺伝子導入効率を上昇させることを実証した。As a reporter gene, pEGFPLuc, which produces luciferase when introduced, was used to grow the plasmid in E. coli. On the other hand, based on the surfactant Span (registered trademark) 80 vesicle prepared by the two-stage emulsification method, various vesicles were prepared and used as vectors for the above genes.
In this Span (registered trademark) 80 vesicle, a small amount of soybean lecithin and cholesterol were mixed as a membrane strengthening agent, and further, DOTAP, which is a cationic surfactant, was added at a rate of 20 wt% in the above Span (registered trademark) 80. mixed and was used as a cationic Span (R) 80 vesicles. The vesicle particle size was adjusted to about 150 nm or less by controlling the particle size with an extruder or stirring for a long time after secondary emulsification.
( 1 ) A plasmid was attached to the surface of this small particle size Cationic Span (registered trademark) 80 vesicle using p-L-Lysin as a medium to prepare a so-called plasmid external vesicle (PV). ( 2 ) On the other hand, a vesicle (VP) in which a plasmid was encapsulated in a cationic Span (registered trademark) 80 vesicle was also prepared by a two-stage emulsification method. (3) Further, a double vesicle (VPV) containing the above-mentioned PV was also prepared. (4) In addition, IVPV in which an antibody was immobilized on the surface of the VPV vesicle was also prepared. Using these four types of vesicles, gene transfer experiments for the following cancer cells were performed. The cancer cells used were human osteosarcoma cells (OST) and human EGFR antigen-incorporated mouse cells (ERM5-1). Three types of vectors PV, VP, and VPV were used for the OST cell gene transfer experiment, and four types of PV, VP, VPV, and IVPV were used for the ERM5-1 gene transfer experiment. An anti-EGFR antibody was used as the IVPV antibody in order to target the antigen EGFR on the ERM5-1 cell surface.
From these experiments, it was demonstrated that PV existing in the double vesicle VPV functions as a vector for delivering a gene to the nucleus within the cell trait after the vesicle and the cell are fused, and increases gene transfer efficiency. .

【実施例１】ＥＲＭ５−１細胞、ＯＳＴ細胞のメンテナンスは以下のように行った。
▲１▼細胞が入った１０ｍｌシャーレの上澄み液を除去し、５ｍｌの滅菌ＰＢＳで洗浄し、▲２▼０．０２５％トリプシンを１ｍｌ添加後、細胞をインキュベーターに移し、約３０秒インキュベートする。▲３▼その後、血清をトリプシンと同量添加して、６ｍｌのＤＭＥＭ培地で細胞をはがし、▲４▼遠心管にその細胞溶液を移して遠心処理する（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。▲５▼その上澄み液を除去する。▲６▼一方、新しいシャーレに血清１ｍｌ、ＤＭＥＭ培地８ｍｌを添加する。▲７▼（▲５▼）で沈殿した細胞を、希釈したい量の培地で懸濁する。▲８▼この細胞懸濁液１ｍｌを上記（▲６▼）のシャーレに添加し、▲９▼そのシャーレを速やかにインキュベーターに移す。Example 1 Maintenance of ERM5-1 cells and OST cells was performed as follows.
▲ 1 ▼ remove the supernatant of the cells containing 10ml dish, washed with sterile PBS 5 ml, ▲ 2 ▼ After 0.025% trypsin 1ml addition, cells were transferred to an incubator, and incubated for about 30 seconds. ▲ 3 ▼ Thereafter, serum was added trypsin and the same amount, peel the cells in DMEM medium 6 ml, ▲ 4 ▼ in the centrifuge tube were transferred to the cell solution to centrifugation (1000 rpm, 5min). ▲ 5 ▼ to remove the supernatant liquid. (6) On the other hand, 1 ml of serum and 8 ml of DMEM medium are added to a new petri dish. The cells precipitated in (7) ((5)) are suspended in the medium to be diluted. ( 8 ) 1 ml of this cell suspension is added to the petri dish of (6) above, and ( 9 ) the petri dish is immediately transferred to an incubator.

【実施例２】使用したプラスミドを図１に示す。プラスミド調製法は以下のように行った。▲１▼（ＬＢ培地の調製法）ＮａＣｌ１ｇ、ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１ｇ、ポリペプトン２ｇ、蒸留水２００ｍｌを加え攪拌する。オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）し、ある程度冷えたら冷蔵保存する。▲２▼（５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンの調製）カナマイシン５００ｍｇ、蒸留水１０ｍｇをビーカーに測り取り、攪拌する。ドラフト内でシリンジに移し、フィルターを通して、１５ｍｌ遠心管（３本）に分けて凍結保存する。▲３▼（ＬＢプレートの作成）ＬＢ培地３００ｍｌ、寒天４．５ｇを三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）後、６５℃近傍で５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン６００μｌを加える。その溶液を１０ｍｌシャーレに約１０ｍｌずつ分注し、固まったら冷蔵保存する。▲４▼（大腸菌の形質転換）試験管にＬＢ培地２ｍｌ、大腸菌培養液０．１ｍｌを入れる。３７℃で二時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。この大腸菌１．５ｍｌをエッペンチューブに移し、遠心処理後（１２０００ｒｐｍ，３０秒）、上澄み液を吸引除去して、５０ｍＭＣａＣｌ_２０．５ｍｌを加え、ボルテックスする。１００μｌをエッペンチューブに移し、目的のプラスミド１０μｌを加え、氷上に２０分間以上放置する。その後、試験管にＬＢ培地１ｍｌと上記放置の大腸菌を入れ、３７℃で１時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）

ート一面にぬる。▲５▼（大腸菌培養）▲１▼１５ｍｌ遠心管にＬＢ培地２ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４μｌを入れる。▲２▼前日培養したシャーレ（上記ＬＢプレートにぬったもの）から大腸菌のコロニーをセルスクレーパを用いて採取し、（▲１▼）の培地に加える。▲３▼３７℃で１０〜２０時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。▲４▼ＬＢ培地２０ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４０μｌを入れた１００ｍｌ三角フラスコに、（▲３▼）の溶液を加える。▲５▼これを３７℃で７〜８時間振盪する（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）。▲６▼ＬＢ培地１０００ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン２ｍｌを入れた２Ｌ三角フラスコに、（▲５▼）の溶液を加える。▲７▼３７℃で１０〜２０時間振盪する。（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）▲６▼（Ｐｌａｓｍｉｄの調製）ＭａｘｉｐｒｅｐＫｉｔＰｒｏｔｃｏｌ（ＱＩＡＧＥＮＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔ，ｌｏｔＮｏ．４２１４７５３３）により、以下のようにした。▲１▼大腸菌の培養液を遠心管に移し、４℃で５０００×ｇ，１０分間遠心操作しバクテリア細胞を収集する。▲２▼遠心後、上澄み液を棄て、バクテリアペレットを１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ１でペレットが無くなるまで懸濁する。▲３▼これに１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ２を添加後、４〜６回静かに転倒混和して充分に混合し、５分間室温に放置する。▲４▼これに１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＰ３（４℃に冷却しておく）を添加後、直ちに４〜６回静かに転倒混和して充分に混合した後、２０分間氷上でインキュベートする。▲５▼これを、４℃，７０００×ｇ以上で３０分間遠心操作する。遠心後、プラスミドＤＮＡ（上澄み液）を素早く回収する。▲６▼回収した上澄み液を４℃，７０００×ｇ以上で１５分間再度遠心操作して、プラスミドＤＮＡを含む上澄み液を素早く回収する。▲７▼１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＢＴにより平衡化しておいたＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００（プラスミド精製用オープンカラム）に（▲６▼）で回収した上澄み液を添加し、自然落下により樹脂に浸透させる。▲８▼このＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００を２×３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＣで洗浄する。▲９▼その後、１５ｍｌのＢｕｆｆｅｒＱＦを用いてプラスミドＤＮＡを溶出する。▲１０▼この溶出液に、１０．５ｍｌの室温のイソプロパノールを添加し、よく混合した後、直ちに４℃、５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。遠心後、上澄み液を捨てる。▲１１▼ＤＮＡペレットを５ｍｌの室温７０％エタノールで洗浄し５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。▲１２▼上澄み液を捨て、５０００×ｇ以上で１分間遠心操作する。▲１３▼上澄み液をピペット

に溶解する。▲１５▼分光光度計によりこの溶液のプラスミドＤＮＡ濃度を測定し、濃度を１ｍｇ／ｍｌになるように調整する。Example 2 The plasmid used is shown in FIG. Plasmid preparation was performed as follows. (1) (Method for preparing LB medium) Add 1 g of NaCl, 1 g of BactoYeast Extract, 2 g of polypeptone, and 200 ml of distilled water, and stir. Autoclave sterilization (121 ° C., 20 min). (2) (Preparation of 50 mg / ml kanamycin) 500 mg of kanamycin and 10 mg of distilled water are measured in a beaker and stirred. Transferred to a syringe in a draft, through a filter, and stored frozen in portions 15ml centrifuge tubes (three). (3) (Preparation of LB plate) Put 300 ml of LB medium and 4.5 g of agar into an Erlenmeyer flask, sterilize by autoclave (121 ° C., 20 min), and then add 600 μl of 50 mg / ml kanamycin at around 65 ° C. Dispense about 10 ml of the solution into a 10 ml petri dish and store it in a refrigerator when it has solidified. (4) (Transformation of E. coli) Put 2 ml of LB medium and 0.1 ml of E. coli culture solution in a test tube. Shake for 2 hours at 37 ° C. (166 min ⁻¹ ). The E. coli 1.5ml was transferred to an Eppendorf tube, after centrifugation (12000 rpm, 30 seconds), then aspirated supernatant, added 50mMCaCl ₂ 0.5ml, vortex. Transfer 100 μl to an Eppendorf tube, add 10 μl of the desired plasmid, and leave it on ice for 20 minutes or longer. Thereafter, 1 ml of LB medium and the above-mentioned unsettled E. coli are placed in a test tube and shaken at 37 ° C. for 1 hour (166 min ⁻¹ ).

Apply to the whole surface. (5) (E. coli culture) (1) Add 2 ml of LB medium and 4 μl of 50 mg / ml kanamycin to a 15 ml centrifuge tube. {Circle around ( 2)} E. coli colonies are collected from the petri dish cultured on the previous day (stuffed on the above LB plate) using a cell scraper and added to the medium of (▲). (3) Shake at 37 ° C. for 10 to 20 hours (166 min ⁻¹ ). (4) Add the solution of (3) to a 100 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml of LB medium and 40 μl of 50 mg / ml kanamycin. (5) This is shaken at 37 ° C. for 7 to 8 hours (100 to 110 min ⁻¹ ). (6) Add the solution of (5) to a 2 L Erlenmeyer flask containing 1000 ml of LB medium and 2 ml of 50 mg / ml kanamycin. (7) Shake at 37 ° C. for 10 to 20 hours. (100 to 110 min ⁻¹ ) (6) (Preparation of Plasmid) Maxiprep Kit Protocol (QIAGEN Plasmid Maxi Kit, lot No. 42147533) was used as follows. (1) Transfer the culture solution of E. coli to a centrifuge tube, and centrifuge at 5000 × g for 10 minutes at 4 ° C. to collect bacterial cells. After ▲ 2 ▼ centrifuged, discarded the supernatant, suspending the bacteria pellet in Buffer P1 of 10ml until the pellet is eliminated. ▲ 3 ▼ this after adding Buffer P2 of 10 ml, thoroughly mixed by gentle inversion mix 4-6 times and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. ▲ 4 ▼ this after addition of Buffer P3 (previously cooled to 4 ° C.) of 10 ml, were mixed thoroughly by gentle inversion mix immediately 4-6 times, and incubate on ice for 20 min. (5) This is centrifuged at 4 ° C. and 7000 × g or more for 30 minutes. After centrifugation, plasmid DNA (supernatant) is quickly recovered. (6) The collected supernatant is centrifuged again at 4 ° C., 7000 × g or more for 15 minutes, and the supernatant containing the plasmid DNA is quickly collected. (7 ) Add the supernatant collected in (6 ) to QIAGEN-tip500 (open column for plasmid purification) equilibrated with 10 ml of Buffer QBT, and allow it to permeate the resin by natural fall. (8) The QIAGEN-tip 500 is washed with 2 × 30 ml of Buffer QC. (9) Thereafter, the plasmid DNA is eluted using 15 ml of Buffer QF. (10) Add 10.5 ml of room temperature isopropanol to this eluate and mix well, then immediately centrifuge at 4 ° C., 5000 × g or more for 60 minutes. After centrifugation, discard the supernatant . (11) The DNA pellet is washed with 5 ml of room temperature 70% ethanol and centrifuged at 5000 × g or more for 60 minutes. (12) Discard the supernatant and centrifuge at 5000 xg or more for 1 minute. ▲ 13 ▼ Pipette the supernatant

Dissolve in (15) The plasmid DNA concentration of this solution is measured with a spectrophotometer, and the concentration is adjusted to 1 mg / ml.

【実施例４】種々のベシクルの調製法を以下に示す。なおここで調製した遺伝子ベクターとしてのベシクルの模型図を図２に示す。

相を構成する溶液）の調整＞００１１段落で記載したプラスミド２０μｌ（濃度５００μｇ／ｍｌ）、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ７０μｌ、ＴＥｂｕｆｆｅｒ６０μｌを加えて、１５分間放置した。＜ベシクルの調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼（▲１▼）の茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼（▲３▼）の茶瓶（１）の溶液中に内水（Ｐｌａｓｍｉｄ溶液）１５０μｌを滴下しながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコの中に、（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加える。（ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する。＜ベシクルの精製＞▲１▼瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼そのベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。Example 4 A method for preparing various vesicles is shown below. In addition, the model figure of the vesicle as a gene vector prepared here is shown in FIG.

Preparation of phase)> 20 μl of the plasmid described in paragraph 0011 (concentration 500 μg / ml), Poly-L-Lycine 70 μl, TE buffer 60 μl were added and left for 15 minutes. <Preparation of vesicle> (1) Weigh out 52.8 mg of Span (registered trademark) 80 in a 5 ml tea bottle (1) and 24 mg of Tween 80 in a 5 ml tea bottle (2). Add 3.0 ml of TE buffer to the tea bottle (2) of (2) ((1)) and stir with a stirring bar. (3) (1) DOTAP 13.2 mg, cholesterol 3 mg, lecithin 6 mg, and hexane 2.0 ml are added to the tea bottle (1). (The amount of (cholesterol + lecithin) should be 12% of the total amount. Cholesterol: lecithin = 1: 2). While stirring 150 μl of internal water (plasmid solution) in the solution of tea bottle (1) of (4) (3), the mixture is stirred with a homogenizer. (Rotation speed is 10000 rpm, (15 seconds stirring + 15 seconds rest) 8 sets.) (5) Replace the tea bottle (1) with a rubbed eggplant flask while washing with hexane, and remove hexane with an evaporator. (6) Add the Tween 80 solution stirred in (2) to the eggplant flask. (The cream on the wall of the eggplant flask is scraped with a chopstick and dispersed.) (7) Disperse with a homogenizer. (Rotation speed 3500 rpm, 1 min) (8) Transfer to the previous tea bottle (2), put a stir bar and stir in the refrigerator all day and night. <Purification of vesicle> (1) Loosen the lid of the bottle and stir for about 15 minutes. (2) Transfer 3 ml of the vesicle solution to the centrifuge tube. (3) Centrifuge the vesicle solution. (50000 rpm, 2 hour, 4 ° C.) {circle around (4)} After centrifugation, the upper oil balls are removed.

瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ、５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする。）▲４▼この茶瓶（１）に内水（ＴＥｂｕｆｆｅｒ）１５０μｌを滴下しながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコの中に（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加え、ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし分散させる。▲７▼そのナスフラスコをホモジナイザー処理する（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）。▲８▼この処理した溶液を、上記の空の茶瓶（２）に戻し、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する（こうして長時間撹拌することにより、ベシクル粒径が約３０〜１５０ｎｍの小粒径のベシクルが調製される）。▲９▼均一なベシクルを調製するときは、１００ｎｍのメンブランを用いたエクストルダーを用いて粒径制御をして、約１００ｎｍのほぼ均一な小粒径ベシクルにした。＜ベシクルの精製＞▲１▼上記（▲８▼）の一昼夜撹拌保存した茶瓶（２）のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼このベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける（５００００ｒｐｍ，４ｈｏｕｒ，４℃）。▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除き、精製ベシクル（Ｖ）を調製する。▲５▼Ｐｌａｓｍｉｄ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ１５μｌ、（▲４▼）で精製したベシクル１０μｌをそれぞれエッペンチューブに加え、１５分間放置する。こうしてＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅを結合媒体として、ベシクル表面に、Ｐｌａｓｍｉｄを結合させたＰｌａｓｍｉｄ外付けベシクル（ＰＶ）を調製する。

The Span (R) 80 to the bottle (1) 52.8 mg, take Tween 80 24 mg weighed into teapot (2) of 5 ml. (2) Add 3.0 ml of TE buffer to the tea bottle (2) and stir with a stirring bar. (3) (1) DOTAP 13.2 mg, cholesterol 3 mg, lecithin 6 mg, and hexane 2.0 ml are added to the tea bottle (1). (The amount of (cholesterol + lecithin) should be 12% of the total amount. Cholesterol: lecithin should be 1: 2.) (4) 150 μl of internal water (TE buffer) was added to this tea bottle (1). Stir with a homogenizer while dropping. (Rotation speed is 10000 rpm, (15 seconds stirring + 15 seconds rest) 8 sets.) (5) The solution in the tea bottle (1) is replaced with a scrubbing eggplant flask while washing with hexane, and hexane is removed with an evaporator. (6) Add the Tween 80 solution stirred in (2) to the eggplant flask and scrape the cream on the wall of the eggplant flask with a chopstick to disperse. (7) The eggplant flask is homogenized (rotation speed: 3500 rpm, 1 min). (8) Return the treated solution to the above empty tea bottle (2), put a stirring bar and stir in the refrigerator all day and night (in this way, by stirring for a long time, small particles having a vesicle particle size of about 30 to 150 nm) Diameter vesicles are prepared). (9) When preparing a uniform vesicle, the particle size was controlled using an extruder using a 100 nm membrane to obtain a substantially uniform small particle size vesicle of about 100 nm. <Purification of vesicles> (1) Loosen the lid of the tea bottle (2) that has been stirred and stored overnight (8) above and stir for about 15 minutes. (2) Transfer 3 ml of this vesicle solution to a centrifuge tube. (3) Centrifuge the vesicle solution (50000 rpm, 4 hour, 4 ° C.). (4) After centrifugation, the upper oil balls are removed, and a purified vesicle (V) is prepared. (5) Add 4.2 μl of Plasmid, 15 μl of Poly-L-Lysine, and 10 μl of vesicle purified in (4) to the Eppendorf tube and leave for 15 minutes. In this way, Plasmid external vesicle (PV) in which Plasmid is bound to the vesicle surface is prepared using Poly-L-Lycine as a binding medium.

の調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼内水（００１３段落で調製したｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル懸濁液）を１５０μｌ入れながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼（▲３▼）の茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗い落としながら、すり付きナスフラスコに移し、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液をそのナスフラスコに加える。（ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし溶解させる。）▲７▼そのナスフラスコの溶液をホモジナイザーで分散させる（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）。▲８▼これを茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌して、ヘキサンを完全除去し、一昼夜冷蔵庫で保存する。こうして比較的大粒径のＶＰＶベシクル（平均粒径で３００ｎｍであるが、マイクロサイズのベシクルも生成する）が調製される。＜ベシクルの精製＞▲１▼（▲８▼）の一昼夜撹拌保存した茶瓶（２）のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼このベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し、▲３▼そのベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除き、Ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクルを内包するベシクル（ＶＰＶ）を調製する。＜二重ベシクルの確認＞▲１▼このようにして調製したＶＰＶのベシクルの顕微鏡写真を図３に示すが、大粒径ベシクル内に小粒径ベシクルが存在している様子が確認できる。実際には、蛍光物質ＦＩＴＣを内包させた小粒径ベシクルを調製して、それを大粒径ベシクルに内包させた。蛍光測定により、その小粒径ベシクルが大粒径ベシクル内に内包されている事を確認した。

Preparation (1) Weigh out 52.8 mg of Span (registered trademark) 80 in a 5 ml tea bottle (1) and 24 mg of Tween 80 in a 5 ml tea bottle (2). (2) Add 3.0 ml of TE buffer to the tea bottle (2) and stir with a stirring bar. (3) Add DOTAP 13.2 mg, cholesterol 3 mg, lecithin 6 mg, and hexane 2.0 ml to the tea bottle (1) of (3) (1) (the amount of (cholesterol + lecithin) is 12% of the total amount.) : Lecithin = 1: 2) (4) Stir with a homogenizer while adding 150 μl of internal water (plasmid external vesicle suspension prepared in paragraph 0013). (Rotation speed is 10000 rpm, (15 seconds stirring + 15 seconds rest) 8 sets.) While washing the solution of tea bottle (1) of (5) ((3)) with hexane, it is transferred to a scrubbing eggplant flask and hexane is removed by an evaporator. Remove. Add the Tween 80 solution stirred in (6) ((2)) to the eggplant flask. (The cream on the wall of the eggplant flask is scraped and dissolved with chopsticks.) (7) The eggplant flask solution is dispersed with a homogenizer (rotation speed 3500 rpm, 1 min). (8) Transfer this to the tea bottle (2) and stir for 3 hours to completely remove hexane and store it in the refrigerator all day and night. Thus, VPV vesicles having a relatively large particle size (average particle size is 300 nm, but micro size vesicles are also produced) are prepared. <Purification of vesicles> Loosen the lid of the tea bottle (2) which has been stirred and stored overnight (1) (8) and stir for about 15 minutes. (2) Transfer 3 ml of the vesicle solution to a centrifuge tube, and (3) centrifuge the vesicle solution. (50000 rpm, 2 hour, 4 ° C.) {circle around (4)} After centrifugation, the upper oil balls are removed to prepare a vesicle (VPV) containing a plasmid external vesicle. <Confirmation of Double Vesicle> (1) A micrograph of the VPV vesicle prepared in this way is shown in FIG. 3, and it can be confirmed that small particle vesicles are present in the large particle vesicle. Actually, a small particle size vesicle encapsulating the fluorescent material FITC was prepared and encapsulated in the large particle size vesicle. It was confirmed by fluorescence measurement that the small particle size vesicles were encapsulated in the large particle size vesicles.

ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ調製＞▲１▼エッペンチューブにｐｒｏｔｅｉｎＡ１００μｌ，Ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ１００μｌを採取して攪拌する。▲２▼別のエッペンチューブにＩＡＯＥ１０ｍｇ，Ｎ−Ｎジメチルホルムアミド１〜２滴を入れ、（▲１▼）の溶液を５０μｌ加える。▲３▼湯槽上で２時間放置する（３０分毎に攪拌）。＜ベシクル調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を１３２ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を４８ｍｇ計り取る。▲２▼（▲１▼）の茶瓶（２）にｐＨ９．０Ｃａｒｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌ，ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ５０μｌを加え撹拌子を入れて撹拌する。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ２６．４ｍｇ、コレステロール６ｍｇ，レシチン１２ｍｇ，ヘキサン３．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼その茶瓶（１）にベシクルの内水となる水溶液を３００μｌ滴下しながらマイクロホモジナイザーで攪拌する（回転数２００００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）。▲５▼（▲４▼）の茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗い落としながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコに、（▲２▼）で撹拌しておいた、茶瓶（２）のＴｗｅｅｎ８０溶液、およびＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎの混合溶液を加え、ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし溶解させる。▲７▼そのナスフラスコ中の溶液をホモジナイザー処理した後（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）、▲８▼（▲６▼）の空になった茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌してヘキサンを除去する。▲９▼その後、蔵庫内で保存し、残ったヘキサンを除去する。＜ベシクルの精製＞▲１▼その一昼夜保存の瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼そのベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し変える。▲３▼それを遠心にかける（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）。▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除いた後、▲５▼ＥＧＦＲ抗体を７５μｌ加え、冷蔵庫内で４８時間放置する。こうして、ベシクル表面にその抗体を固定化して、ＩＶＰＶを調製する。

Preparation of IAOE-protein A> (1) Collect 100 μl of protein A and 100 μl of carbonate buffer in an Eppendorf tube and stir. (2) Add 10 mg of IAOE and 1 to 2 drops of NN dimethylformamide to another Eppendorf tube, and add 50 μl of the solution of (1). (3) Leave in a water bath for 2 hours (stir every 30 minutes). <Vesicle Preparation> (1) Weigh out 132 mg of Span (registered trademark) 80 in a 5 ml tea bottle (1) and 48 mg of Tween 80 in a 5 ml tea bottle (2). Add 3.0 ml of pH 9.0 Carbonate buffer and 50 μl of IAOE-protein A to the tea bottle (2) of (2) (1), and stir with a stir bar. Add 36.4 mg of DOTAP, 6 mg of cholesterol, 12 mg of lecithin, and 3.0 ml of hexane to the tea bottle (1) of (3) (1). (The amount of (cholesterol + lecithin) should be 12% of the total amount. Cholesterol: lecithin = 1: 2). {Circle around (4)} To the tea bottle (1), 300 μl of an aqueous solution serving as the inner water of the vesicle is dropped and stirred with a microhomogenizer (rotation speed 20000 rpm, 3 min). (5) (4) The tea bottle (1) solution is washed with hexane and replaced with a scrubbing eggplant flask, and the hexane is removed with an evaporator. (6) To the eggplant flask, add the Tween 80 solution in tea bottle (2) and IAOE-protein mixed solution, which were stirred in (2), and scrape off the cream on the wall of the eggplant flask with chopsticks. Dissolve. (7) After the solution in the eggplant flask was homogenized (rotation speed: 3500 rpm, 1 min), transferred to the empty tea bottle (2) of (8) ((6)), and stirred for 3 hours. Remove. {Circle around (9)} Then, store in the warehouse and remove the remaining hexane. <Purification of vesicle> (1) Loosen the lid of the bottle that is stored all day and night, and stir for about 15 minutes. (2) Transfer 3 ml of the vesicle solution to a centrifuge tube. (3) It is centrifuged (50000 rpm, 2 hours, 4 ° C.). (4) After centrifugation, the upper oil balls are removed, (5) 75 μl of EGFR antibody is added, and left in the refrigerator for 48 hours. Thus, the antibody is immobilized on the vesicle surface to prepare IVPV.

【実施例３】ＥＲＭ５−１細胞およびＯＳＴ細胞への遺伝子導入をする方法を以下に示す。▲１▼（遺伝子外付けベシクル（ＰＶ）の場合） ▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、６穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞をプレーティングしておく。▲２▼また遠心管にＰｌａｓｍｉｄ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ１５μｌ，ＤＭＥＭ培地１．５ｍｌをそれぞれ混合し、１５分間室温に放置する。▲３▼その後、あらかじめ調製しておいたＤＯＴＡＰ含有ベシクル液（００１３段落の＜ベシクル精製＞の▲４▼に記載）６μｌを（▲２▼）のプラスミド溶液にそれぞれ添加して、１５分間室温に放置し、ＰＶ溶液を調製する。▲４▼上記の（▲１▼）で予めプレーティングしておいたＥＲＭ５−１細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、そのＥＲＭ５−１細胞に上記（▲３▼）のＰＶ液を１穴あたり０．５ｍｌ添加する。▲５▼３７℃、５％ＣＯ_２下で３時間保温後、水溶液を全て吸い取った後、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて培地交換する。さらに２４時間培養して、遺伝子導入実験を行った。▲２▼ＰＶ以外のベシクル（ＶＰ，ＶＰＶ，ＩＶＰＶ）は下記の方法によった。▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、１２穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞を１ｍｌずつプレーティングする。▲２▼プレートの上澄みを除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を０．５０ｍｌ入れた後、予め濁度調整しておいた各ベシクルサンプルを、上記の細胞に２５μｌ添加する。▲３▼３時間後、水溶液を全て吸い取った後、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて培地交換する。その後、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベートする。こうして上記種々のベシクルによる遺伝子導入実験を行う。▲３▼＜Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙ（ｐＥＧＦＰ−ｌｕｃ）＞なお、この方法は本件の全ての遺伝子導入量の評価に用いた。▲１▼各ｗｅｌｌをＰＢＳで二回洗浄後Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ５００μｌ加え、上記の遺伝子導入された細胞を溶解する。▲２▼この細胞溶解液をセルスクレーパーで１．５ｍｌのチューブに回収し、氷上におく。▲３▼ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲを立ち上げ、基質投入管を蒸留水で洗浄後、基質（ルシフェリン）でリンスする。▲４▼その氷上のサンプルを遠心処理（１３０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ）して、不溶物を除去して、上澄みを９６ｗｅｌｌプレートに２０μｌずつ加え波長５６２ｎｍでＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒにより発光量を測定する。こうして、遺伝子導入量を評価した。 [Example 3] A method for introducing a gene into ERM5-1 cells and OST cells is described below. (1) (External gene vesicle (PV)) (1) The day before conducting the gene transfer experiment, ERM5-1 cells adjusted to about 2 × 10 ⁵ cells / ml are plated in a 6-well plate. . ▲ 2 ▼ The mixed Plasmid into a centrifuge tube 4.2μl, Poly-L-Lysine 15μl , DMEM medium 1.5ml respectively, allowed to stand at room temperature for 15 minutes. ▲ 3 ▼ thereof after, the addition respectively (<vesicles purification> of ▲ 4 ▼ described in 0013 paragraph) 6 [mu] l pre-prepared DOTAP containing vesicles solution had been (▲ 2 ▼) plasmid solution, for 15 minutes at room temperature And prepare a PV solution . ( 4 ) ERM5-1 cells previously plated in (1) above were washed once with PBS, and then the PV solution (3) above was added to the ERM5-1 cells in one well. Add 0.5 ml per tube. ▲ 5 ▼ 37 ° C., after 3 hours incubated under 5% CO _2, after Tsu blotter all aqueous solution and the medium replaced by the addition of DMEM medium 1 ml. The cells were further cultured for 24 hours , and a gene transfer experiment was conducted. ( 2 ) Vesicles other than PV (VP, VPV, IVPV) were obtained by the following method. {Circle around (1)} On the day before the gene transfer experiment, 1 ml of ERM5-1 cells adjusted to about 2 × 10 ⁵ cells / ml are plated on a 12-well plate. ▲ 2 ▼ plates supernatant was removed, and cells were washed with PBS, and after putting 0.50ml of 10% FBS-DMEM medium, 25 [mu] l of each vesicle samples previously turbidity adjusted, the above cell Added. ▲ 3 ▼ 3 hours after, after taking suck all aqueous solution, to medium exchange DMEM medium was added 1 ml. Then, incubate for 24 hours at 37 ° C., 5% CO ₂ . In this way, gene transfer experiments using the above-described various vesicles are performed . < 3 > < Luciferase assay (pEGFP-luc) > This method was used for the evaluation of all gene transfer amounts in this case. (1) Each well is washed twice with PBS, and then 500 μl of lysis buffer is added to lyse the above-introduced cells . ▲ 2 ▼ The cell lysate was collected with a cell scraper in 1.5ml tubes, placed on ice. {Circle around (3)} Luminescence sensor JNR is started up, and the substrate inlet tube is washed with distilled water and rinsed with substrate (luciferin) . ▲ 4 ▼ centrifugal process samples on ice (13000rpm, 4 ℃, 1min) to, to remove insoluble material, measuring the amount of light emission by Luminescenser at wavelength 562nm added in 20μl of supernatant to 96well plates. Thus, the amount of gene transfer was evaluated.

【実施例４】
上記のようにして行ったＯＳＴ細胞への遺伝子導入実験の結果を図４に、またＥＲＭ５−１への遺伝子導入の結果を図５に示す。図４では、二重ベシクルのＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約４倍、ＰＶの約４０倍になり、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子ベクターとしての優位性が示された。一方、図５に示すように、ＥＲＭ５−１細胞では、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約２．７倍、ＰＶの１．５倍となり、やはりＶＰＶの優位性が示された。さらには、外側のベシクルに抗体を取り付けたＩＶＰＶではＶＰＶの約２．８倍となり、抗体固定化の効果が明らかになった。[Example 4]
FIG. 4 shows the result of the gene introduction experiment into the OST cell performed as described above, and FIG. 5 shows the result of the gene introduction into ERM5-1. In FIG. 4, the gene transfer of the double vesicle VPV was about 4 times that of VP and 40 times that of PV, indicating the superiority of the double vesicle VPV as a gene vector. On the other hand, as shown in FIG. 5, in ERM5-1 cells, the gene transfer of the double vesicle VPV was about 2.7 times that of VP and 1.5 times that of PV, indicating the superiority of VPV. Furthermore, IVPV with an antibody attached to the outer vesicle was about 2.8 times that of VPV, revealing the effect of antibody immobilization.

Claims

The gene is immobilized on the surface of the vesicle, the vesicle is included in the inner aqueous phase of the vesicle having a larger particle size, and the included vesicle provides freedom of movement in the inner aqueous phase of the vesicle having a larger particle size. A gene transfer vector that is a dual-structure vesicle, characterized in that both vesicles are cationic Span (registered trademark) 80 vesicles comprising Span (registered trademark) 80 as a main component and containing a cationic surfactant. A vector .

The vector according to claim 1, wherein an antibody is immobilized on the surface of a vesicle having a large particle size .

A small particle size vesicle prepared by mixing Span (registered trademark) 80 and a cationic surfactant and having a gene immobilized on the surface of a cationic Span (registered trademark) 80 vesicle, and a larger particle size vesicle A method for preparing a double vesicle for inclusion.

A small particle size vesicle with a gene immobilized on the surface of a cationic Span (registered trademark) 80 vesicle prepared by mixing Span (registered trademark) 80 and a cationic surfactant, and an antibody immobilized on the surface A method for preparing a double immunovesicle encapsulated in a particle size vesicle .